Kwantyfikacja przerzutów do raka jajnika do zatrzewnej

Przerzuty raka jajnika charakteryzują się licznymi rozlanymi zmianami wewnątrzotrzewnowymi, tak że dokładne wizualne określenie obciążenia guzem jest trudne. W niniejszym artykule opisano metodę ilościowego oznaczania obciążenia guzem przerzutowym in situ i ex vivo przy użyciu komórek nowotworowych znakowanych białkiem czerwonej fluorescencji (RFP) i obrazowania optycznego.

Ogólnym celem tego eksperymentu jest określenie względnego obciążenia guzem przerzutów do raka jajnika do zastawki otrzewnowej w syngenicznym ortotopowym modelu mysim ksenoprzeszczepu. Ta nowatorska metoda obrazowania i ilościowego określania względnego obciążenia guzem może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące regulacji przerzutów raka jajnika. Podstawową zaletą tej techniki jest to, że poprzez rozmieszanie widm fluorescencyjnych, autofluorescencja tkanek jest usuwana z obrazów, co umożliwia pomiar standaryzowanego, względnego obciążenia guza.

Technika ta dostarcza informacji na temat przerzutów do ludzkiego raka jajnika, co ma wpływ na monitorowanie skuteczności terapii. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ łączymy solidną technikę obrazowania z procedurą analityczną w celu wyodrębnienia danych ilościowych z obrazów. Dzisiejszą procedurę zademonstruje Yueying Liu, kierownik programu laboratoryjnego w Stack Lab.

Po 10 tygodniach wzrostu komórek nowotworowych umieść ciało każdej znieczulonej myszy w systemie obrazowania optycznego dla małych zwierząt, pojedynczo. Skanuj wszystkie myszy w kohorcie w każdym punkcie czasowym. Aby obserwować znakowane fluorescencyjnie komórki nowotworowe, wykonaj akwizycję wielospektralną, aby zebrać łącznie pięć obrazów.

Wybierz standardową ekspozycję 15 sekund, binning dwa na dwa, pole widzenia 16 centymetrów i przysłonę 1,1. Następnie uzyskaj obraz odbicia całego zwierzęcia za pomocą białego światła z otwartego filtra wzbudzenia, otwartego filtra emisyjnego, standardowej ekspozycji 0,2 sekundy z binningiem dwa na dwa i pola widzenia 16 centymetrów, z przysłoną F 2,8. Po eutanazji użyj ostrych nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć skórę z przodu wzdłuż brzusznej linii środkowej myszy, od górnej części ud do dolnej części klatki piersiowej.

Delikatnie oddziel skórę od tkanki otrzewnej, uważając, aby nie przebić ściany otrzewnej. Następnie przeciąć na boki, zarówno wzdłuż dolnej części klatki piersiowej, jak i górnej części ud, aby utworzyć dwa płaty skóry. Umieść mysz na brzusznej stronie w skanerze, tak aby jama otrzewnej była skierowana w dół z otwartymi płatkami skóry.

Zeskanuj mysz z jej narządami in situ, używając tych samych parametrów, które były wcześniej używane dla żywej myszy. Teraz kontynuuj sekcję myszy, ekstrahując wątrobę, sieć osie, trzustkę, żołądek, przeponę oraz jelito cienkie i grube przy użyciu standardowych technik. Usuń również lewą i prawą otrzewną, jajniki, nerki, krezkę, a na końcu poduszeczkę tłuszczową.

Obserwuj, policz i zapisz każdy z widocznych guzów na narządach. Użyj suwmiarki, aby zmierzyć średnicę każdego guza. Oznacz guzy o średnicy mniejszej niż dwa milimetry jako małe, od dwóch do pięciu milimetrów jako średnie i większe niż pięć milimetrów jako duże.

Następnie umieść narządy na szablonie do skanowania narządów, który znajduje się na rysunku czwartym dołączonego protokołu tekstowego, i użyj go do uporządkowania lokalizacji każdego narządu podczas następnego skanowania. Użyj PBS, aby utrzymać narządy wilgotne. Zeskanuj każdy arkusz narządów za pomocą systemu obrazowania optycznego dla małych zwierząt i parametrów, które były wcześniej używane.

Po zeskanowaniu umieść narządy w 10% formaldehydzie i przetwórz je do histologii przy użyciu standardowych technik. Aby zmniejszyć ilość autofluorescencji w każdym skanowaniu wielospektralnym, najpierw załaduj czerwone białko fluorescencyjne in vivo spectral file, a następnie auto floor in vivo red file w oknie obrazów niezmieszanych i wybierz opcję un-mix. Następnie wyeksportuj pliki z kropką w 16-bitowym, nieskalowanym formacie dot tif i załaduj je do obrazu J, przechodząc do file, otwórz, a następnie wybierając odpowiedni 16-bitowy plik dot tif.

Następnie przejdź do menu obrazu i wybierz dostosuj, a następnie kontrast jasności i ustaw minimalną wyświetlaną wartość na zero, a maksymalną wyświetlaną wartość na plus 35353. Następnie ponownie w menu obrazu przejdź do wyszukiwania tabel i wybierz pozycję Red Hot. Różne modele zwierzęce będą wymagały różnych poziomów jasności, ale ważne jest, aby utrzymać stałą jasność przez całe badanie.

Korzystając z narzędzia do zaznaczania z wolnej ręki, narysuj dowolny obszar zainteresowania wokół każdego narządu. Obszar zainteresowania o swobodnym kształcie powinien być przyciągnięty blisko granic narządów. Następnie wpisz control i M, aby użyć narzędzia miary do obliczenia pola powierzchni każdego narządu.

Zapisz te dane w arkuszu kalkulacyjnym. Po narysowaniu obszaru zainteresowania, który został narysowany wokół każdego narządu, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz duplikat, aby uwzględnić tylko narząd. Następnie pod obrazem przejdź do dostosowania, a następnie próg i ustaw dolny poziom progu na plus 1 200, a górny poziom progu na plus 1 700.

Sprawdź także ciemne tło, a następnie wybierz w porządku. Spowoduje to wybranie tylko najjaśniejszych obszarów fluoryzujących. Obrazy mogą wymagać ręcznej manipulacji suwakami progów na obrazie J, tak aby poprzednio najjaśniejsze obszary zostały wybrane do kroku analizy, jak pokazano powyżej.

Różne modele chorób będą wymagały różnych ograniczeń progowych, ale ważne jest, aby poziomy progowe były spójne przez całe badanie. W obszarze Analizuj wybierz pozycję Analizuj cząstki i zmień rozmiar piksela podniesionego do kwadratu na 10 do nieskończoności. Wybierz opcję wyświetlania konspektów i zaznacz opcję Wyświetlaj tylko wyniki, a następnie kliknij przycisk OK.

Pozwoli to zmierzyć zarówno obszary, jak i surowe zintegrowane gęstości jasnych obszarów uznanych za nowotwory. Zapisz wartości pola powierzchni i surowej zintegrowanej gęstości każdego wyboru guza razem w tym samym arkuszu kalkulacyjnym zawierającym obszary powierzchni narządu. Następnie w obszarze Analizuj wybierz narzędzia i przejdź do paska kalibracji.

Dodaj pasek skali kalibracji do obrazów narządów. Montaże mogą zawierać większą lub mniejszą liczbę narządów, zgodnie z danym badaniem. Następnie w obszarze plik przejdź do Zapisz jako i zapisz montaż zarówno jako kropkę tif, jak i kropkę jpeg.

Następnie otwórz plik jpeg z kropkami organów i przejdź do menu wstawiania, aby dodać pole tekstowe do każdego obrazu. Dodaj etykiety narządów, tworząc pole tekstowe poniżej każdego z trzech rzędów narządów. Otwórz każdy z 16-bitowych plików dot tif skanów całego ciała na obrazie J w kolejności liczby myszy.

Następnie przejdź do menu obrazu i wybierz dostosuj, a następnie kontrast jasności. Ustaw minimalną wyświetlaną wartość na zero, a maksymalną wyświetlaną wartość na plus 35353. Następnie wróć do menu obrazu i wyszukaj tabele, a następnie wybierz pozycję rozgrzany do czerwoności.

Po zakończeniu zapisz montaż zarówno jako plik z kropką, jak i z kropką jpeg. Linia komórkowa mysiego raka jajnika ID8, którą wstrzykuje się myszom 10 tygodni przed obrazowaniem, fluoryzuje w kanale czerwonym i kontynuuje to przez cały wzrost. Obrazowanie na żywo przy użyciu systemu obrazowania optycznego małych zwierząt jest w stanie zobaczyć rozszerzające się komórki ID8 u myszy i zapewnia dokładniejsze podejście niż zwykłe ważenie myszy w celu oceny obciążenia nowotworem.

Po eutanazji i usunięciu brzusznej warstwy skóry nienaruszone narządy można obejrzeć bardziej szczegółowo. Jednak poszczególne narządy umieszczone na szablonie skanowania narządów wyraźnie pokazują obciążenie guzem w każdym narządzie. Obciążenie guzem sieci i trzustki, jajników i krezki myszy pokazanej po lewej stronie jest znacznie większe niż tych samych narządów u myszy pokazanej po prawej.

Obserwacja zróżnicowanego obciążenia guzem jest potwierdzona ilościowo zarówno pod względem obszaru obsługi guza, jak i intensywności sygnału nowotworowego. Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do obrazowania do 18 żywych myszy na godzinę. Sekcja i obrazowanie ex vivo poszczególnych narządów trwa około 20 minut na próbkę.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak ilościowy rezonans magnetyczny, w celu rozwiązania hipotez, takich jak wpływ otyłości na przerzuty raka jajnika, jak pokazano w naszym artykule badawczym z 2015 roku.