Name: Kwantyfikacja przerzutów do raka jajnika do zatrzewnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji przerzutów raka jajnika w modelu mysim z wykorzystaniem obrazowania fluorescencyjnego RFP. Technika ta eliminuje autofluorescencję tkanek, umożliwiając precyzyjne pomiary obciążenia nowotworowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty badawcze RO1CA109545 i RO1CA086984 dla M.S.S. przez National Institutes of Health/National Cancer Institute oraz przez nagrodę od Leo and Ann Albert Charitable Trust (dla M.S.S.).

Wszystkie badania in vivo zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Notre Dame i wykorzystywały samice myszy C57/BL6J.
1. Hodowla komórek raka jajnika u myszy
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę do hodowli komórek raka jajnika ID8 w następujący sposób: 1 l zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) uzupełnionego 4% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% penicyliną/streptomycyną, 5 μg/ml insuliny, 5 μg/ml transferyny i 5 ng/ml seleninu sodu.</li>
	<li>Transdukcja mysiego raka jajnikaID8 13 w celu ekspresji białka czerwonej fluorescencji (RFP) przy użyciu komercyjnie pozyskiwanych cząstek lentiwirusowych wykazujących ekspresję RFP i markera selekcyjnego (gen blastycydyny). Należy pamiętać, że można użyć białka zielonej fluorescencji, ale zapewnia słabszy sygnał fluorescencyjny.
	<ol>
		<li>Bezpośrednio przed transdukcją hodować komórki do 50 - 70% zbiegu i dodać świeżą pożywkę (bez penicyliny/streptomycyny), która zawiera 1 ml polibrenu (5 μg/ml stężenia końcowego).</li>
		<li>Delikatnie pipetować RFP-lentivirus (20 μl) kroplami do naczynia i inkubować w temperaturze 37 oC przez 72 godziny. Usunąć pożywkę i inkubować ze świeżą pożywką przez 24 godziny. Rozpocząć selekcję transdukowanych komórek od dodania blasticydyny do pożywki hodowlanej (5 μg/ml) i monitorować obecność krwinek czerwonych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (ryc. 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hoduj komórki oznaczone RFP w pożywce ID8, umieszczając około10-6 komórek w naczyniu do hodowli tkankowej i codziennie wizualizując za pomocą mikroskopu świetlnego, aż monowarstwa komórki zacznie się zlewać.</li>
	<li>W przypadku zlewania się zbierz komórki za pomocą trypsyny (0,25%, 3 min) i włóż kolbę z powrotem do inkubatora o temperaturze 37 oC, aż komórki zostaną odłączone.</li>
	<li>Zneutralizować trypsynę za pomocą 6 ml pożywki hodowlanej ID8 zawierającej surowicę. Pipetować w górę i w dół do dna naczynia, a następnie przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować z prędkością 1 200 obr./min przez 2 minuty, a następnie odessać pożywkę za pomocą szklanej pipety.</li>
	<li>Przemyć komórki roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), delikatnie ponownie zawieszając w 6 ml ciepłego PBS i odwirowując, jak w 1.5 powyżej. Zawiesić ponownie w PBS do końcowego stężenia 5 x 106 komórek/ml. Utrzymywać komórki w cieple (37 °C) do momentu wstrzyknięcia.</li>
</ol>
2. Dootrzewnowe wstrzyknięcie komórek ID8 i obrazowanie in vivo
<ol>
	<li>Wstrzyknij każdej myszy 2 ml ciepłego roztworu ID8-PBS, co daje łącznie 10 milionów komórek poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.). Pozwól komórkom nowotworowym rosnąć in vivo przez około 10 tygodni z cotygodniowym obrazowaniem na żywo.</li>
	<li>Bezpośrednio po wstrzyknięciu, a następnie co tydzień, należy zważyć myszy, a następnie znieczulić każdą mysz za pomocą izofluoranu (2,5% natężenie przepływu przy przepływie 0,5 l/minO2). Uwaga: Myszy zostały zważone nie jako ilościowa miara obciążenia guza, ale raczej bardziej ogólna miara postępu fizycznego poszczególnych myszy w trakcie badania. Masy myszy porównano z ich własnymi poprzednimi wartościami wagi.  
	<ol>
		<li>Znieczulenie myszy poprzez umieszczenie w komorze izofluoranowej. Utrzymuj stałe znieczulenie podczas skanowania, umieszczając głowę myszy w stożku nosowym, aby przez cały czas trwania zabiegu była narażona na działanie izofluoranu o natężeniu przepływu 2,5%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj kremu do depilacji, aby usunąć włosy na tułowiu i brzuchu każdej myszy, ponieważ czarne włosy spowodują osłabienie sygnału fluorescencji. Myszy po nałożeniu kremu do depilacji kąpie się w ciepłej wodzie i osusza ręcznikami papierowymi RT.  </li>
	<li>Podczas znieczulenia zeskanuj całe ciało każdej myszy za pomocą systemu obrazowania optycznego dla małych zwierząt. Skanuj wszystkie myszy w kohorcie w każdym punkcie czasowym. Użyj następującego dwuetapowego protokołu (Rysunek 2A):
	<ol>
		<li>W kroku 1, aby zaobserwować znakowane fluorescencyjnie (RFP) komórki nowotworowe, wykonaj akwizycję wielospektralną, aby zebrać łącznie 5 obrazów przy użyciu filtrów wzbudzenia 440 nm, 460 nm, 480 nm, 520 nm i 540 nm oraz filtra emisyjnego 600 nm. Użyj następujących parametrów akwizycji: standardowa ekspozycja 15 sekund, binning 2 x 2, pole widzenia 160 mm iprzysłona 1,1.</li>
		<li>W kroku 2, aby obserwować całe zwierzę, uzyskaj obraz odbicia za pomocą otwartego filtra wzbudzenia (światło białe), otwartego filtra emisyjnego, standardowej ekspozycji 0,2 sekundy z binningiem 2 x 2 i polem widzenia 16 cm. Uwaga: Rzeczywisty czas obrazowania wynosi ~1 min. </li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza myszy i akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Gdy obrazowanie na żywo wykaże obecność rozległej choroby wewnątrzotrzewnowej lub zwierzęta wykazują nagromadzenie wodobrzusza (o czym świadczy wzdęcie brzucha), utrata lub przyrost masy ciała większy niż 20%, letarg lub inne oznaki niepokoju, należy poddać każdą mysz eutanazji za pomocą znieczulenia CO2, a następnie zwichnięcia szyjki macicy.</li>
	<li>Przetnij skórę z przodu wzdłuż brzusznej linii środkowej myszy, używając spiczastych nożyczek preparacyjnych, od górnej części ud do dołu klatki piersiowej. Zachowaj szczególną ostrożność, aby przeciąć tylko warstwę skóry (ryc. 2Bi). Delikatnie oddziel skórę od tkanki otrzewnej, uważając, aby nie przebić ściany otrzewnej.</li>
	<li>Za pomocą spiczastych nożyczek preparacyjnych przeciąć bocznie zarówno wzdłuż dolnej części klatki piersiowej, jak i górnej części ud, aby utworzyć dwa płaty skóry (ryc. 2B ii,iii).</li>
	<li>Umieść każdą mysz na jej brzusznej stronie (jama otrzewnej skierowana w dół) z otwartymi płatkami skóry i zeskanuj każdą mysz z jej narządami in situ za pomocą systemu obrazowania optycznego dla małych zwierząt (ryc. 3A,B).
	<ol>
		<li>Należy użyć tych samych parametrów akwizycji obrazu, jak opisano w pkt 2.4.1.-2.4.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuuj sekcję myszy, ekstrahując poszczególne narządy otrzewnej, w tym wątrobę, sieć / trzustkę, żołądek, przeponę, jelito cienkie, jelito grube, lewą i prawą otrzewną, jajniki, nerki, krezkę i poduszeczkę tłuszczową.
	<ol>
		<li>Obserwuj, policz i rejestruj widoczne guzy na każdym narządzie. Użyj suwmiarki, aby zmierzyć średnicę każdego guza.</li>
		<li>Oznacz guzy o średnicy mniejszej niż 2 mm jako małe, od 2 do 5 mm jako średnie, a większe niż 5 mm jako duże.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść narządy na szablonie do skanowania narządów (ryc. 4), który identyfikuje z góry określoną lokalizację dla każdego narządu. Użyj PBS, aby utrzymać wilgotność narządów.</li>
	<li>Zeskanuj każdy arkusz narządów za pomocą systemu obrazowania optycznego dla małych zwierząt (ryc. 3C,D).
	<ol>
		<li>Użyj tych samych parametrów akwizycji obrazu, które opisano w kroku 2.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zeskanowaniu umieść narządy w 10% formaldehydzie, aby umożliwić późniejsze przetworzenie do histologii.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja obciążenia guzem na obrazach fluorescencyjnych
<ol>
	<li>Aby zmniejszyć ilość autofluorescencji w każdym skanowaniu wielospektralnym, najpierw rozmieszaj pliki za pomocą oprogramowania dostępnego z systemem obrazowania małych zwierząt.
	<ol>
		<li>Najpierw załaduj plik spektralny RFP: In Vivo, a następnie plik Autofluor: In Vivo Red w oknie Unmixed Images i wybierz Unmix.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyeksportuj pliki .bip w formacie 16-bitowym .tiff (nieskalowanym).</li>
	<li>Użyj oprogramowania ImageJ (narządy ex vivo, a następnie całe ciało myszy z narządami in situ).
	<ol>
		<li>Użyj opcji Otwórz > pliku, aby otworzyć 16-bitowe pliki .tiff plików szablonów skanowania narządów w ImageJ.</li>
		<li>W obszarze Image > Adjust > Brightness/Contrast (Jasność/Kontrast) wybierz opcję Ustaw Minimum wyświetlane wartości na 0 i Maksymalną wyświetlaną wartość na +35353, a następnie w obszarze Image > Lookup Tables (Tabele przeglądowe obrazu ) wybierz opcję Red Hot (Rozgrzany do czerwoności). Uwaga: Różne modele zwierzęce będą wymagały różnych poziomów jasności, ale ważne jest, aby jasność była stała przez cały czas trwania badania.</li>
<li>Korzystając z narzędzia Zaznaczanie odręczne, narysuj obszar zainteresowania o dowolnym kształcie (ROI) wokół każdego narządu i użyj narzędzia Zmierz (CTRL+M), aby obliczyć powierzchnię każdego narządu; zapisz powierzchnię każdego narządu w arkuszu kalkulacyjnym.</li>
		<li>Po narysowaniu ROI wokół każdego narządu, kliknij prawym przyciskiem myszy w ROI i wybierz Duplikuj, aby uwzględnić tylko narząd.</li>
		<li>Patrząc na pojedynczy organ, w obszarze Obraz > Dostosuj próg > wybierz opcję Ustaw próg obrazu na Dolny poziom progu + 1200 i Górny poziom progu + 1700, aby wybrać tylko najjaśniej fluorescencyjne regiony i sprawdź, czy chcesz wybrać Ciemne tło; wybierz OK. Uwaga: Obrazy mogą wymagać ręcznej manipulacji suwakami progów w ImageJ, tak aby poprzednio najjaśniejsze obszary zostały wybrane do kroku analizy, jak pokazano powyżej. Różne modele chorób będą wymagały różnych ograniczeń progowych, ale ważne jest, aby poziomy progowe były spójne przez całe badanie.</li>
		<li>W obszarze Analizuj > Analizuj cząstki zmień Rozmiar (piksele ^ 2) na 10-Nieskończoność, wybierz opcję Pokaż: Kontury, zaznacz tylko opcję "Wyświetl wyniki" i kliknij OK, aby zmierzyć zarówno obszary, jak i surowe zintegrowane gęstości tych jasnych obszarów, uznanych za guzy.</li>
		<li>Zapisz wartości powierzchni i surowej zintegrowanej gęstości każdego wyboru guza wyświetlanego w tabeli wyników w tym samym arkuszu kalkulacyjnym zawierającym obszary powierzchni narządu.</li>
		<li>W obszarze Narzędzia do analizy > > pasek kalibracji dodaj pasek skali kalibracji do obrazów narządów. Uwaga: W tym przykładzie dokonano tego poprzez zmianę lokalizacji na prawy górny róg, koloru wypełnienia na , koloru etykiety na biały, liczby etykiet na 5, miejsc dziesiętnych na 0, rozmiaru czcionki na 12 i współczynnika powiększenia na 4,0 oraz włączenia opcji Pogrubienie tekstu.</li>
		<li>W obszarze Plik > Zapisz jako..., zapisz montaż jako plik . Tiff oraz . Format JPEG.</li>
		<li>Użyj polecenia Plik > Otwórz, aby otworzyć plik .jpeg narządów, a następnie w obszarze Wstaw > pole tekstowe dodaj etykiety narządów, tworząc pole tekstowe poniżej każdego z trzech rzędów narządów.</li>
		<li>Użyj opcji Otwórz > pliku, aby otworzyć każdy z 16-bitowych plików .tiff skanowania całego ciała w ImageJ w kolejności liczby myszy.</li>
		<li>W obszarze Image > Adjust > Brightness/Contrast (Jasność/Kontrast) wybierz opcję Ustaw Minimalną wyświetlaną wartość na 0, a Maksymalną wyświetlaną wartość na + 35353, a następnie w obszarze Image > Lookup Tables (Tabele przeglądowe obrazu ) wybierz opcję Red Hot (Rozgrzany do czerwoności).</li>
		<li>W obszarze Plik > Zapisz jako... zapisz montaż jako plik . Tiff oraz . Format JPEG.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Dodaj odpowiednio obszary wyboru guza i surowe zintegrowane gęstości dla każdego narządu każdej myszy i zapisz całkowity obszar guza narządu dla każdej myszy.</li>
	<li>Znormalizuj zarejestrowane wartości obszaru i surowej zintegrowanej gęstości dla wielkości każdego narządu, dzieląc całkowitą powierzchnię guza i całkowite wartości surowej zintegrowanej gęstości przez odpowiednią powierzchnię narządu (Tabela 1).</li>
	<li>Oblicz i wykreśl średnią zarówno znormalizowanych obszarów powierzchni guza, jak i znormalizowanych wartości surowej zintegrowanej gęstości (Rysunek 5A,B).</li>
	<li>Porównaj te średnie wartości z tymi uzyskanymi przez wizualne zliczanie guzów, które były widoczne gołym okiem podczas badania każdego narządu pod kątem zmian przerzutowych.</li>
</ol>

<ol><li>American Cancer Society. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cancer.org/cancer/ovariancancer/overviewguide/ovarian-cancer-overview-key-statistics">http://www.cancer.org/cancer/ovariancancer/overviewguide/ovarian-cancer-overview-key-statistics</a> (2015).</li>
<li>Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+development+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer development and metastasis.</a> American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).</li>
<li>Halkia, E., Spiliotis, J., Sugarbaker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+peritoneal+metastases+from+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology+Research+and+Practice%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of peritoneal metastases from ovarian cancer.</a> Gastroenterology Research and Practice. 2012, 541842-541854 (2012).</li>
<li>Barbolina, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+ovarian+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treatment+and+Research%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of ovarian cancer metastasis.</a> Cancer Treatment and Research. 149, 319-334 (2009).</li>
<li>Lengyel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+ovarian+cancer+experimental+models%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Epithelial ovarian cancer experimental models.</a> Oncogene. 33 (28), 3619-3633 (2014).</li>
<li>Harter, P., duBois, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+surgery+in+ovarian+cancer+with+special+emphasis+on+cytoreductive+surgery+for+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">The role of surgery in ovarian cancer with special emphasis on cytoreductive surgery for recurrence.</a> Current Opinion in Oncology. 17 (5), 505-514 (2005).</li>
<li>Bristow, R. E., Puri, I., Chi, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoreductive+surgery+for+recurrent+ovarian+cancer%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Cytoreductive surgery for recurrent ovarian cancer: a meta-analysis.</a> Gynecologic Oncology. 112 (1), 265-274 (2009).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+metastatic+cancer+with+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins.</a> Cell Death and Differentiation. 9, 786-789 (2002).</li>
<li>Sweeney, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+kinetics+of+tumor-cell+clearance+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Visualizing the kinetics of tumor-cell clearance in living animals.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 96, 12044-12049 (1999).</li>
<li>Chishima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+invasion+and+micrometastasis+visualized+in+live+tissue+by+green+fluorescent+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer invasion and micrometastasis visualized in live tissue by green fluorescent protein expression.</a> Cancer Research. 57, 2042-2047 (1997).</li>
<li>Bouvet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optical+imaging+of+primary+tumor+growth+and+multiple+metastatic+events+in+a+pancreatic+cancer+orthotopic+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model.</a> Cancer Research. 62, 1534-1540 (2002).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Multiples+Uses+of+Fluorescent+Proteins+to+Visualize+Cancer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Multiples Uses of Fluorescent Proteins to Visualize Cancer in vivo.</a> Nature Reviews. 5, 796-806 (2005).</li>
<li>Roby, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+syngeneic+mouse+model+for+events+related+to+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Development of a syngeneic mouse model for events related to ovarian cancer.</a> Carcinogenesis. 21 (4), 585-591 (2000).</li>
<li>Rampurwala, M., Ravoori, M. K., Wei, W., Johnson, V. E., Vikram, R., Kundra, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+quantification+of+intraperitoneal+tumors+by+in+vivo+computed+tomography+using+negative+contrast+enhancement+strategy+in+a+mouse+model+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Visualization and quantification of intraperitoneal tumors by in vivo computed tomography using negative contrast enhancement strategy in a mouse model of ovarian cancer.</a> Translational Oncology. 2 (2), 96-106 (2009).</li>
<li>Kim, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+and+antivascular+effects+of+AVE8062+in+ovarian+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Antitumor and antivascular effects of AVE8062 in ovarian carcinoma.</a> Cancer Research. 67, 9337-9345 (2007).</li>
<li>Picchio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+ovarian+carcinoma%3A+usefulness+of+%5B%2818%29F%5DFDG-PET+in+combination+with+CT+for+lesion+detection+after+primary+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Advanced ovarian carcinoma: usefulness of [(18)F]FDG-PET in combination with CT for lesion detection after primary treatment.</a> Quarterly Journal of Nuclear Medicine. 47, 77-84 (2003).</li>
</ol>

Ten artykuł jest częścią specjalnego wydania na temat multimodalnego obrazowania przedklinicznego, sponsorowanego przez Bruker Biospin.

W przeciwieństwie do badań z wykorzystaniem ludzkich komórek raka jajnika, które muszą być przeprowadzone na myszach z obniżoną odpornością, opisany powyżej protokół wykorzystuje immunokompetentne myszy C57 / Bl6 i syngeniczne mysie komórki raka jajnika. Chociaż umożliwia to ocenę potencjalnej roli nacieków immunologicznych w progresji guza i przerzutach, obecność ciemnych włosów na powierzchni brzucha sprawia, że obrazowanie jest mniej czułe. Stosowanie depilatora do usuwania włosów przed obrazowaniem poprawia akwizycję...

Nabłonkowy rak jajnika (EOC) jest najczęstszą przyczyną zgonów z powodu nowotworu ginekologicznego, z szacunkową liczbą 21 290 nowych diagnoz w USA w 2015 roku i szacunkową liczbą 14 180 zgonów1. U zdecydowanej większości (> 75%) kobiet rozpoznaje się późne stadium choroby (stadium III lub IV), charakteryzujące się rozlanymi przerzutami do otrzewnowej i złym rokowaniem. Nawrót choroby w jamie otrzewnej po chemioterapii pierwszego rzutu jest również powszechny i stanowi główną przyczynę śmiertelności2,3. EOC daje przerzuty w wyniku unikalnego mechanizmu obejmującego zarówno bezpośrednie rozciągnięcie od guza pierwotnego do sąsiednich narządów otrzewnej, jak i dysocjację lub zrzucanie komórek z powierzchni guza pierwotnego w postaci pojedynczych komórek lub agregatów wielokomórkowych. Komórki są wydalane do jamy otrzewnej, gdzie są odporne na apoptozę wywołaną odwarstwieniem4. Nagromadzenie wodobrzusza otrzewnej jest powszechne, ponieważ zrzucone komórki nowotworowe blokują drenaż limfatyczny otrzewnej, a guzy wytwarzają czynniki wzrostu, które zmieniają przepuszczalność naczyń. Część wyrzuconych komórek nowotworowych przyczepia się do powierzchni narządów i struktur otrzewnej, w tym jelita, wątroby, sieci i krezki, po czym zakotwiczają się i namnażają, tworząc wiele szeroko rozsianych zmian wtórnych3,5. Przerzuty krwiopochodne występują rzadko. W związku z tym postępowanie kliniczne zwykle składa się z chirurgii cytoredukcyjnej, w tym "optymalnego odciążenia", zdefiniowanego jako resekcja całego widocznego guza (bez względu na to, jak małego). Całkowita cytoredukcja wiąże się ze znacznym wydłużeniem czasu przeżycia całkowitego6,7 i wiąże się z wyzwaniem identyfikacji i usunięcia zmian < 0,5 cm.
Małe modele zwierzęce okazały się użyteczne w badaniach nad rakiem jajnika, poprawiając nasze zrozumienie postępu choroby, a także w identyfikacji biomarkerów prognostycznych i testowaniu nowych metod chemioterapii lub terapii skojarzonej. Ponieważ głównym miejscem występowania raka jajnika i przerzutów jest jama otrzewnowa, ortotopowe modele przerzutów EOC obejmują analizę i charakterystykę choroby wewnątrzotrzewnowej. Chociaż w ostatnim czasie nastąpiła poprawa w zdolności obrazowania komórek nowotworowych, nawet na poziomie pojedynczej komórki, nadal istnieją znaczne trudności w ilościowym określeniu obciążenia przerzutami guza EOC. Wyzwania te wynikają z liczby, wielkości i lokalizacji anatomicznej zmian przerzutowych. Ponadto istnieje potrzeba znakowania komórek rakowych w celu odróżnienia ich od normalnych komórek gospodarza. W poprzednich badaniach wykorzystano protokoły znakowania oparte na przeciwciałach lub transfekcję komórek nowotworowych lucyferazy8,9. Bezpośrednie znakowanie fluorescencyjne komórek rakowych zostało po raz pierwszy zgłoszone przez Chishimę i współpracowników w 1997roku. Znaczniki fluorescencyjne nie wymagają dodawania substratu egzogennego i zapewniają znakomitą specyficzność komórek nowotworowych, zapewniając bardziej skuteczny sposób śledzenia przerzutów raka11,12.
Tutaj opisujemy metodę obrazowania optycznego do analizy ilościowej choroby przerzutowej przy użyciu syngenicznego ortotopowego modelu ksenoprzeszczepu składającego się z oznaczonych czerwonym białkiem fluorescencyjnym (RFP) mysich komórek raka jajnika ID813 i immunokompetentnych myszy C57/Bl6. Przedstawiono nowatorską metodę kwantyfikacji względnego obciążenia nowotworem łączącą obrazowanie in vivo i ex vivo z usunięciem autofluorescencji tkankowej. Podejście to może być potencjalnie użyteczne w badaniach mających na celu ocenę wpływu określonych modyfikacji genetycznych, epigenetycznych lub mikrośrodowiskowych i/lub metod leczenia na przerzuty raka jajnika specyficzne dla narządów.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Corning</td><td>10-014-CM</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>penicylina/streptomycyna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suplement pożywki insulina-transferyna-selenin sodu</td><td>Sigma</td><td>I-1884</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania małych zwierząt Bruker Xtreme</td><td>Bruker Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie multispektralne Bruker</td><td>Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cząstki lentiwirusowe z białkiem czerwonej fluorescencji</td><td>GenTarget, Inc.</td><td>LVP023</td><td></td></tr><tr><td>trypsyna do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>krem do depilacji (taki jak Nair Hair Remover Lotion)</td><td>zakupy w drogerii&nbsp;</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowania ImageJ&nbsp;</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/&nbsp;</td><td></td><td>bezpłatne pobieranie</td></tr><tr><td>narzędzi presektoryjnych (kleszczy)</td><td>Narzędzie chirurgiczne Roboz</td><td>&nbsp; Narzędzia preparacyjne RS 5130</td><td></td></tr><tr><td>(nożyczki)</td><td>Narzędzie chirurgiczne Roboz RS</td><td>5910</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja przerzutów do raka jajnika do zatrzewnej

Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Nabłonkowy rak jajnika (EOC) jest główną przyczyną zgonów z powodu nowotworów ginekologicznych w Stanach Zjednoczonych. Śmiertelność wynika z rozpoznania 75% kobiet w późnym stadium choroby, kiedy przerzuty są już obecne. EOC charakteryzuje się rozlanymi i szeroko rozsianymi przerzutami do otrzewnowej. Komórki złuszczone z guza pierwotnego zakotwiczają się w międzybłonku wyściełającym jamę otrzewnej, a także w sieci komórkowej, powodując wieloogniskowe przerzuty, często w obecności wodobrzusza otrzewnej. Wysiłki w naszym laboratorium są ukierunkowane na bardziej szczegółowe zrozumienie czynników regulujących powodzenie przerzutów EOC. Jednak ilościowe określenie obciążenia guzem z przerzutami stanowi poważne wyzwanie techniczne ze względu na dużą liczbę, mały rozmiar i szerokie rozmieszczenie zmian w otrzewnej. W niniejszym artykule opisano metodę analizy przerzutów EOC przy użyciu komórek znakowanych białkiem czerwonej fluorescencji (RFP) w połączeniu z obrazowaniem wielospektralnym in vivo. Po dootrzewnowym wstrzyknięciu komórek nowotworowych znakowanych RFP, myszy są obrazowane co tydzień, aż do czasu ofiary. W tym czasie jama otrzewnej jest odsłaniana chirurgicznie, a narządy są obrazowane in situ. Wypreparowane narządy są następnie umieszczane na oznaczonym przezroczystym szablonie i obrazowane ex vivo. Usunięcie autofluorescencji tkankowej podczas przetwarzania obrazu za pomocą wielospektralnego rozmieszania umożliwia dokładne ilościowe określenie względnego obciążenia guza. Metoda ta ma zastosowanie w wielu zastosowaniach, w tym w badaniach terapeutycznych mających na celu ocenę związków, które mogą hamować przerzuty, a tym samym poprawiać całkowite przeżycie.

Mechanizm przerzutowania raka jajnika charakteryzuje się wysoce rozproszonymi przerzutami wewnątrzbrzusznymi, składającymi się z licznych zmian o różnej wielkości, w tym wielu małych zmian (&lt; 2mm). W związku z tym zastosowanie komórek nowotworowych znakowanych RFP (Rycina 1) oraz obrazowanie optyczne stanowi alternatywną metodę dla ręcznego liczenia i pomiaru wielkości zmian. Rozwój masy guza w czasie można określić poprzez cotygodniowe ważenie myszy oraz pomiar obwodu...

Przerzuty raka jajnika charakteryzują się licznymi rozlanymi zmianami wewnątrzotrzewnowymi, tak że dokładne wizualne określenie obciążenia guzem jest trudne. W niniejszym artykule opisano metodę ilościowego oznaczania obciążenia guzem przerzutowym in situ i ex vivo przy użyciu komórek nowotworowych znakowanych białkiem czerwonej fluorescencji (RFP) i obrazowania optycznego.

Kwantyfikacja przerzutów do raka jajnika do zatrzewnej

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States.  Mortality is due to diagnosis of 75% of ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest określenie względnego obciążenia nowotworowego w przypadku przerzutów raka jajnika do otrzewnej w syngenicznym ortotopowym modelu ksengraftu mysiego. Ta nowatorska metoda obrazowania i ilościowego wyznaczania względnego obciążenia nowotworowego może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące regulacji przerzutowania raka jajnika. Podstawową zaletą tej techniki jest to, że dzięki rozdzieleniu widm fluorescencyjnych autofluorescencja tkanki zostaje usunięta z obrazów, co umożliwia pomiar ustandaryzowanego, względnego obciążenia nowotworowego.Technika ta pozwala na lepsze zrozumienie przerzutów raka jajnika u ludzi, co ma istotne znaczenie dla monitorowania skuteczności terapii. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ łączymy w niej zaawansowaną technikę obrazowania z procedurą analityczną służącą do wyodrębniania danych ilościowych z obrazów. Procedurę tę zaprezentuje Yueying Liu, kierownik programu laboratoryjnego w Stack Lab.Po 10 tygodniach wzrostu komórek nowotworowych umieść ciało każdej zanestezjowanej myszy w systemie obrazowania optycznego dla małych zwierząt, kolejno jedna po drugiej. Skanuj wszystkie myszy w kohorcie w każdym punkcie czasowym. Aby zaobserwować fluorescencyjnie znakowane komórki nowotworowe, przeprowadź akwizycję wielospektralną w celu zebrania łącznie pięciu obrazów.Wybierz standardowy czas ekspozycji wynoszący 15 sekund, binning 2x2, pole widzenia wynoszące 16 centymetrów oraz wartość przysłony f/1,1. Następnie wykonaj obraz odbiciowy całego zwierzęcia, używając białego światła z otwartym filtrem wzbudzenia, otwartym filtrem emisji, standardowego czasu ekspozycji 0,2 sekundy z binningiem 2x2 oraz pola widzenia 16 centymetrów przy wartości przysłony f/2,8. Po eutanazji użyj ostrych nożyczek sekcyjnych, aby rozciąć skórę w części przedniej wzdłuż brzusznej linii środkowej myszy, od górnej części ud do dolnej krawędzi klatki piersiowej.Delikatnie oddziel skórę od tkanki otrzewnej, uważając, aby nie przebić ściany otrzewnej. Następnie wykonaj cięcia boczne, zarówno wzdłuż dolnej krawędzi klatki piersiowej, jak i górnej części ud, aby stworzyć dwie płaty skóry. Umieść mysz stroną brzuszną w skanerze, tak aby jama otrzewna była skierowana w dół, a płaty skóry były odchylone na boki.Przeprowadź skanowanie myszy z organami in situ, stosując te same parametry, które były wcześniej użyte dla żywej myszy. Następnie kontynuuj sekcję myszy, wycinając wątrobę, sieciówkę, trzustkę, żołądek, przeponę oraz jelita cienkie i grube, korzystając ze standardowych technik. Usuń również lewe i prawe otrzewną, jajniki, nerki, krezkę, a na koniec poduszkę tłuszczową.Zaobserwuj, policz i zarejestruj każdy z widocznych guzów na organach. Za pomocą suwmiarki zmierz średnicę każdego guza. Guzy o średnicy mniejszej niż dwa milimetry zaklasyfikuj jako małe, od dwóch do pięciu milimetrów jako średnie, a powyżej pięciu milimetrów jako duże.Następnie umieść organy na szablonie do skanowania organów, przedstawionym na rysunku cztery w towarzyszącym protokole tekstowym, i wykorzystaj go do uporządkowania rozmieszczenia każdego organu podczas kolejnego skanowania. Użyj PBS, aby utrzymać organy w stanie wilgotnym. Zeskanuj każdy arkusz z organami, korzystając z systemu obrazowania optycznego małych zwierząt i parametrów zastosowanych wcześniej.Po skanowaniu umieść organy w 10% formaldehydzie i poddaj je obróbce histologicznej przy użyciu standardowych technik. Aby zredukować autofluorescencję w każdym skanie wielospektralnym, załaduj najpierw plik widmowy dla czerwonego białka fluorescencyjnego in vivo, a następnie plik autofluorescencji in vivo w kolorze czerwonym w oknie obrazów niemieszanych (unmixed images) i wybierz opcję un-mix. Następnie wyeksportuj pliki dot bip w 16-bitowym, nieskalowanym formacie dot tif i załaduj je do programu Image J, przechodząc do menu file, open, a następnie wybierając odpowiedni 16-bitowy plik dot tif.Następnie przejdź do menu obrazu, wybierz opcję dostosuj, a następnie jasność i kontrast, i ustaw minimalną wyświetlaną wartość na zero oraz maksymalną wyświetlaną wartość na +35353. Następnie ponownie w menu obrazu przejdź do tabel kolorów i wybierz opcję red hot. Różne modele zwierzęce mogą wymagać różnych poziomów jasności, jednak ważne jest zachowanie spójności jasności w obrębie danego badania.Używając narzędzia do swobodnego zaznaczania, obrysuj obszar zainteresowania o dowolnym kształcie wokół każdego narządu. Obszar zainteresowania powinien być wyrysowany blisko granic narządu. Następnie naciśnij Ctrl + M, aby uruchomić narzędzie pomiarowe i obliczyć powierzchnię każdego narządu.Zapisz te dane w arkuszu kalkulacyjnym. Przy obszarze zainteresowania (ROI) wyznaczonym wokół każdego organu, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję duplikuj, aby uwzględnić tylko dany organ. Następnie w menu obraz przejdź do opcji dostosuj, potem do progu i ustaw dolny poziom progu na +1 200 oraz górny poziom progu na +1 700.Następnie należy zaznaczyć opcję ciemnego tła (dark background), a potem wybrać OK. Pozwoli to na zaznaczenie tylko obszarów o najwyższej fluorescencji. Obrazy mogą wymagać ręcznej manipulacji suwakami progu w programie Image J, aby dla etapu analizy wybrano obszary, które wcześniej były najjaśniejsze, tak jak pokazano powyżej.Różne modele chorób będą wymagały różnych ograniczeń progu, jednak ważne jest zachowanie spójności poziomów progowych w obrębie danego badania. W menu Analyze wybierz Analyze Particles i zmień zakres rozmiaru w pikselach kwadratowych na od 10 do nieskończoności. Wybierz opcję Show Outlines, zaznacz Display Results i kliknij OK.Pozwoli to na pomiar zarówno pól powierzchni, jak i surowych zintegrowanych gęstości jasnych obszarów uznanych za guzy. Zapisz wartości pola powierzchni i surowej zintegrowanej gęstości dla każdego wybranego guza w tym samym arkuszu kalkulacyjnym, który zawiera pola powierzchni narządów. Następnie w menu analyze wybierz tools, a następnie przejdź do calibration bar.Dodaj skalę kalibracyjną do obrazów organów. Montaże mogą zawierać większą lub mniejszą liczbę organów, zgodnie z wymogami danego badania. Następnie w menu plik wybierz opcję zapisz jako i zapisz montaż w formacie .tif oraz .jpeg.Następnie otwórz plik jpeg z kropkami organów i przejdź do menu wstawiania, aby dodać pole tekstowe do każdego obrazu. Dodaj etykiety organów, tworząc pole tekstowe pod każdym z trzech rzędów organów. Otwórz każdy z 16-bitowych plików tif z kropkami skanów całego ciała w programie Image J w kolejności numerów myszy.Następnie przejdź do menu obrazu, wybierz opcję dostosuj, a następnie jasność i kontrast. Ustaw minimalną wyświetlaną wartość na zero, a maksymalną wyświetlaną wartość na +35353. Następnie wróć do menu obrazu, przejdź do tabel wyszukiwania i wybierz opcję red hot.Po zakończeniu tej czynności zapisz montaż w formie pliku dot tif oraz dot jpeg. Linia komórkowa raka jajnika mysiego ID8, która została wstrzyknięta myszom na 10 tygodni przed obrazowaniem, fluorescuje w kanale czerwonym i utrzymuje tę cechę przez cały okres wzrostu. Obrazowanie na żywo z wykorzystaniem optycznego systemu obrazowania małych zwierząt pozwala na obserwację rozrastających się komórek ID8 u myszy i stanowi dokładniejszą metodę oceny obciążenia nowotworem niż proste ważenie myszy.Po eutanazji i usunięciu brzusznej warstwy skóry można dokładniej obejrzeć nienaruszone organy. Jednakże poszczególne organy umieszczone na szablonie do skanowania organów wyraźnie ukazują stopień obciążenia nowotworowego w każdym z nich. Obciążenie nowotworowe w sieci, trzustce, jajnikach i krezce myszy pokazanej po lewej stronie jest znacznie większe niż w tych samych organach myszy pokazanej po prawej stronie.Obserwacja różnic w obciążeniu nowotworowym została potwierdzona ilościowo zarówno pod kątem powierzchni nowotworu, jak i intensywności sygnału nowotworowego. Po opanowaniu techniki ta może być wykorzystywana do obrazowania do 18 żywych myszy na godzinę. Disekcja i obrazowanie ex vivo poszczególnych organów zajmuje około 20 minut na jeden preparat.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak ilościowy rezonans magnetyczny, aby zweryfikować hipotezy dotyczące np. wpływu otyłości na przerzuty raka jajnika, co zostało przedstawione w naszym artykule z 2015 roku dotyczącym badań nad rakiem.

quantitation-of-intra-peritoneal-ovarian-cancer-metastasis

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisany tutaj test oczyszczania mezotelium wykorzystuje komórki znakowane fluorescencyjnie oraz mikroskopię wideo poklatkową do wizualizacji i ilościowego pomiaru interakcji między wielokomórkowymi sferoidami raka jajnika a monowarstwami komórek mezoteliów. Test ten modeluje wczesne etapy przerzutowania raka jajnika.

Test oczyszczania mezotelialnego in vitro modelujący wczesne etapy przerzutowania raka jajnika

W tym filmie demonstrujemy rozwój trójwymiarowego modelu in vitro wyściółki jamy otrzewnej. Ta kultura organotypowa może pomóc w badaniu adhezji, inwazji i proliferacji komórek raka jajnika.

Modelowanie przerzutów raka jajnika w błonie śluzowej jamy otrzewnej: metoda tworzenia modelu 3D wyściółki otrzewnej in vitro

Inwazja komórek raka jajnika w błonie międzybłonkowej otrzewnej jest procesem dynamicznym w czasie. Wykorzystując analizator w czasie rzeczywistym, zdolność inwazyjną komórek raka jajnika w modelu kohodowli komórek sferoidalnych i międzybłonka można określić ilościowo w dłuższych okresach czasu, zapewniając wgląd w czynniki regulujące proces przerzutowy.

Ocena przyczepu sferoidalnego raka jajnika i inwazji komórek międzybłonka w czasie rzeczywistym

Opisujemy nieinwazyjną platformę obrazowania zwierząt, która pozwala na wykrywanie, kwantyfikację i monitorowanie wzrostu i nawrotów raka jajnika. Ten model ksenoprzeszczepu dootrzewnowego naśladuje profil kliniczny pacjentek z rakiem jajnika.

Mysi model do nieinwazyjnego obrazowania w celu wykrywania i monitorowania nawrotu raka jajnika

Przedstawiamy protokół, który implementuje zarówno podejścia in vivo, jak i ex vivo do badania kolonizacji tkanki tłuszczowej otrzewnowej przez raka jajnika, szczególnie sieci komórkowej. Ponadto przedstawiamy protokół ilościowego i analitycznego oznaczania struktur komórek odpornościowych w sieci znanych jako plamki mleczne, które sprzyjają przerzutom tkanki tłuszczowej otrzewnej.

Metody in vivo i ex vivo do badania przerzutowej kolonizacji raka jajnika struktur mlecznej w tkance tłuszczowej otrzewnej

Tutaj prezentujemy protokół do budowy trójwymiarowego modelu in vitro wyściółki jamy otrzewnej, składającego się z pierwotnych ludzkich komórek międzybłonka i fibroblastów pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową, jako narzędzie do badania adhezji, inwazji i proliferacji komórek raka jajnika.

Modelowanie wczesnych etapów rozsiewu raka jajnika w organotypowym posiewie ludzkiej jamy otrzewnowej

Aby wyjaśnić wieloetapowy proces rozprzestrzeniania się raka jajnika w otrzewnej, obecne badanie przedstawia mysi eksperymentalny model pierwotnego rozwoju guza i przerzutów do otrzewnej poprzez ortotopową inokulację tymi komórkami nowotworowymi.<br...

Mysi eksperymentalny model pierwotnego rozwoju guza i przerzutów do otrzewnej za pomocą ortotopowej inokulacji komórkami raka jajnika

Rak jajnika tworzy przerzuty w całej jamie otrzewnej. W tym miejscu przedstawiamy protokół tworzenia i stosowania nanosond rozpraszających Ramana z rezonansem wzmocnionym powierzchniowo, ukierunkowanych na receptor kwasu foliowego, które ujawniają te zmiany z wysoką swoistością za pomocą obrazowania ratiometrycznego. Nanosondy podaje się dootrzewnowo żywym myszom, a uzyskane obrazy dobrze korelują z histologią.

Nanosonda rezonansowa o zwiększonym rezonansie powierzchniowym i nanosonda rozpraszania Ramana do wykrywania mikroskopijnego raka jajnika poprzez celowanie w receptor kwasu foliowego

Ten protokół opisuje ustanowienie trójwymiarowego (3D) modelu ex vivo interakcji komórka rakowa - sieć komórkowa. Model ten stanowi platformę do wyjaśnienia mechanizmów pronowotworowych w niszy tkanki tłuszczowej oraz do testowania nowych terapii.

Model ex vivo przerzutów do otrzewnej raka jajnika z wykorzystaniem ludzkiej sieci

Wykorzystując ilościową PCR, demonstrujemy, w jaki sposób uznany model CAM kurczaka może być użyty do ilościowej analizy przerzutowania ludzkich komórek nowotworowych do odległych narządów.

Ilościowa analiza przerzutów nowotworowych z wykorzystaniem modelu zarodka ptaka

Poznaj metodę kwantyfikacji przerzutów raka jajnika w modelu mysim z wykorzystaniem obrazowania fluorescencyjnego RFP. Technika ta eliminuje autofluorescencję tkanek, umożliwiając precyzyjne pomiary obciążenia nowotworowego.

Kwantyfikacja przerzutów do raka jajnika do zatrzewnej

Przeglądaj więcej filmów