Name: Identyfikacja nanocząstek tlenków metali w próbkach histologicznych za pomocą ulepszonej mikroskopii ciemnego pola i mapowania hiperspektralnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji nanocząstek tlenków metali w próbkach histologicznych za pomocą ulepszonej mikroskopii ciemnego pola i mapowania hiperspektralnego. Technika ta umożliwia szybszą i mniej kosztowną analizę niż tradycyjne metody.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Günterowi Oberdörsterowi, DVM oraz dr Alison Elder (University of Rochester) i dr Mary Frame (Stony Brook University) za współpracę badawczą na zwierzętach, która zaowocowała próbkami tkanek do analizy. Dodatkowo autorzy dziękują: Christina Rotondi (Albany Medical College Histology Core); dr Rani Sellers i dr Barbara Cannella (Albert Einstein College of Medicine, Histologia i Patologia Porównawcza); Leonardo Bezerra i Ahlam Abuawad (członkowie zespołu badawczego Brenner); oraz Leslie Krauss, Byron Cheatham i Elyse Johnson (CytoViva). Praca ta była częściowo wspierana przez grant CDC-NIOSH OH-009990-01A1 oraz NanoHealth and Safety Center, stan Nowy Jork, przyznany S.B.

<ol><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+a+single+mesoporous+silica+nanoparticle+into+a+human+lung+cancer+cell+observed+by+differential+interference+contrast+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Che%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of a single mesoporous silica nanoparticle into a human lung cancer cell observed by differential interference contrast microscopy.</a> Anal Bioanal Che. 391 (6), 2119-2125 (2008).</li>
<li>Anselme, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+cells+and+bacteria+with+surfaces+structured+at+the+nanometre+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomate%22%5BJournal%5D)">The interaction of cells and bacteria with surfaces structured at the nanometre scale.</a> Acta Biomate. 6 (10), 3824-3846 (2010).</li>
<li>Anshup, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+gold+nanoparticles+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Langmui%22%5BJournal%5D)">Growth of gold nanoparticles in human cells.</a> Langmui. 21 (25), 11562-11567 (2005).</li>
<li>Weinkauf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+dark+field+microscopy+for+rapid+artifact+free+detection+of+nanoparticle+binding+to+Candida+albicans+cells+and+hyphae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Enhanced dark field microscopy for rapid artifact free detection of nanoparticle binding to Candida albicans cells and hyphae.</a> Biotechnol. 4 (6), 871-879 (2009).</li>
<li>Sondi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+nanoparticles+as+antimicrobial+agent%3A+a+case+study+on+E+coli+as+a+model+for+Gram+negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Colloid+Interface+Sc%22%5BJournal%5D)">Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E coli as a model for Gram negative bacteria.</a> J Colloid Interface Sc. 275 (1), 177-182 (2004).</li>
<li>Berry, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+exploitation+of+magnetic+nanoparticle+cell+interaction+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Chem%22%5BJournal%5D)">Possible exploitation of magnetic nanoparticle cell interaction for biomedical applications.</a> J Mater Chem. 15 (5), 543-547 (2005).</li>
<li>Chithrani, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+mechanism+of+cellular+uptake+and+removal+of+protein+coated+gold+nanoparticles+of+different+sizes+and+shapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Elucidating the mechanism of cellular uptake and removal of protein coated gold nanoparticles of different sizes and shapes.</a> Nano Lett. 7 (6), 1542-1550 (2007).</li>
<li>Chithrani, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+size+and+shape+dependence+of+gold+nanoparticle+uptake+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells.</a> Nano Lett. 6 (4), 662-668 (2006).</li>
<li>Elechiguerra, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+silver+nanoparticles+with+HIV+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Interaction of silver nanoparticles with HIV 1.</a> J Nanobiotechnol. 3 (6), 1-10 (2005).</li>
<li>Carlson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+cellular+interaction+of+silver+nanoparticles+size+dependent+generation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Unique cellular interaction of silver nanoparticles size dependent generation of reactive oxygen species.</a> J Phys Chem. 112 (43), 13608-13619 (2008).</li>
<li>Roth, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+microscopy+as+an+analytical+tool+for+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Nanomed+Nanobiotechnol+In+Press%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral microscopy as an analytical tool for nanomaterials.</a> WIREs Nanomed Nanobiotechnol In Press. , (2015).</li>
<li>Williams, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+kernel+hardness+classification+by+near+infrared+%28NIR%29+hyperspectral+imaging+and+multivariate+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Act%22%5BJournal%5D)">Maize kernel hardness classification by near infrared (NIR) hyperspectral imaging and multivariate data analysis.</a> Anal Chim Act. 653 (2), 121-130 (2009).</li>
<li>Ziph Schatzberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+imaging+enables+industrial+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Industrial+Photonic%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral imaging enables industrial applications.</a> Industrial Photonic. , (2014).</li>
<li>Sun, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSun%2C+DW+%22Hyperspectral+imaging+for+food+quality+analysis+and+contro%22">Hyperspectral imaging for food quality analysis and contro</a>. , Elsevier. (2010).</li>
<li>ElMasry, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+imaging+for+nondestructive+determination+of+some+quality+attributes+for+strawberry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+En%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral imaging for nondestructive determination of some quality attributes for strawberry.</a> J Food En. 81 (1), 98-107 (2007).</li>
<li>Mortimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+hyperspectral+imaging+microscopy+for+semi+quantitative+analysis+of+nanoparticle+uptake+by+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Techno%22%5BJournal%5D)">Potential of hyperspectral imaging microscopy for semi quantitative analysis of nanoparticle uptake by protozoa.</a> Environ Sci Techno. 48, 8760-8767 (2014).</li>
<li>Sarlo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+20+nm+100+nm+and+1000+nm+fluorescent+polystyrene+latex+nanospheres+following+acute+systemic+or+acute+and+repeat+airway+exposure+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Toxico%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of 20 nm 100 nm and 1000 nm fluorescent polystyrene latex nanospheres following acute systemic or acute and repeat airway exposure in the rat.</a> Toxico. 263, 117-126 (2009).</li>
<li>Husain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+instillation+of+low+doses+of+titanium+dioxide+nanoparticles+in+mice+leads+to+particle+retention+and+gene+expression+changes+in+the+absence+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pulmonary instillation of low doses of titanium dioxide nanoparticles in mice leads to particle retention and gene expression changes in the absence of inflammation.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 269, 250-262 (2013).</li>
<li>Meyer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+uptake+and+associated+toxicity+of+silver+nanoparticles+in+Caenorhabditis+elegan%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Intracellular uptake and associated toxicity of silver nanoparticles in Caenorhabditis elegan.</a> Aquatic Toxicol. 100, 140-150 (2010).</li>
<li>Badireddy, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((characterization+and+abundance+of+engineered+nanoparticles+in+complex+waters+by+hyperspectral+imagery+with+enhanced+darkfield+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">characterization and abundance of engineered nanoparticles in complex waters by hyperspectral imagery with enhanced darkfield microscopy.</a> Environ Sci Technol. 46 (18), 10081-10088 (2012).</li>
<li>Dettmeyer, R. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDettmeyer%2C+RF+%22Staining+techniques+and+microscopy+Forensic+histopathology+fundamentals+and+perspectives%22">Staining techniques and microscopy Forensic histopathology fundamentals and perspectives</a>. , Springer Verlag. Berlin Heidelberg. vol 26 issue 453 370 (2011).</li>
<li>Titford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+development+of+microscopical+techniques+for+diagnostic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histotechnol%22%5BJournal%5D)">Progress in the development of microscopical techniques for diagnostic pathology.</a> J Histotechnol. 32 (1), 9-19 (2009).</li>
<li>Kumar, G. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKumar%2C+GL+%22Special+stains+and+H%26E%22">Special stains and H&E</a>. , Dako North America. Carpinteria, California. (2014).</li>
<li>Manolakis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+image+processing+for+automatic+target+detection+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lincoln+Laboratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral image processing for automatic target detection applications.</a> Lincoln Laboratory Journal. 14 (1), 79-116 (2003).</li>
<li>Mercer, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+fibrotic+response+to+aspiration+of+multi+walled+carbon+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Pulmonary fibrotic response to aspiration of multi walled carbon nanotubes.</a> Part Fibre Toxicol. 8 (1), 21(2011).</li>
<li>Kim, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+reflectance+and+fluorescence+imaging+system+for+food+quality+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22T+Am+Soc+Ag+En%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral reflectance and fluorescence imaging system for food quality and safety.</a> T Am Soc Ag En. 44 (3), 721-730 (2001).</li>
<li>Mercer, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrapulmonary+transport+of+MWCNT+following+inhalation+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Fibre+Toxico%22%5BJournal%5D)">Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure.</a> Part Fibre Toxico. 10 (1), 38(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W przypadku próbek tkanek, które zostały poddane konwencjonalnemu barwieniu histologicznemu, identyfikację i analizę nanocząstek tlenku metalu można osiągnąć poprzez połączenie technik EDFM, mapowania HSI i analizy obrazu. Chociaż istnieje elastyczność w przygotowywaniu próbek do badań histologicznych lub immunohistochemicznych (np. przy użyciu utrwalonych lub zamrożonych tkanek; rodzaj barwienia), ważne jest, aby próbki były cięte na sekcje do grubości 5-10 μm w celu optymalnej wizualizacji. Użyte tu próbki utrwalono w formalinie i zatopiono w parafinie przed cięciem za pomocą mikrotomu obrotowego o grubości 6 μm, zamontowano na szklanych szkiełkach mikroskopowych, wybarwiono hematoksyliną i eozyną oraz nakryto. W tym badaniu wykorzystano tkanki skóry świń pochodzące z współpracy w zakresie toksykologii penetracji skóry ex vivo . Tkanki poddano działaniu nanocząstek tlenków metali (tlenek glinu, krzemionka, tlenek tlenku) w zawiesinach wodnych. Wykrywanie obszarów zainteresowania (elementów o wysokim kontraście) za pomocą EDFM jest krytycznym pierwszym krokiem, który ułatwia późniejsze mapowanie i analizę HSI. Dodatnie i ujemne próbki kontrolne muszą być najpierw zobrazowane i przeanalizowane w celu stworzenia biblioteki spektralnej w celach informacyjnych. Zebrane widma z kontroli dodatniej są eksportowane do biblioteki spektralnej kontroli dodatniej. Następnie wszystkie widma z obrazów kontroli ujemnej są odejmowane od biblioteki spektralnej kontroli pozytywnej w celu poprawy swoistości (zmniejszenia liczby wyników fałszywie dodatnich). Wynikowa filtrowana biblioteka spektralna jest uważana za RSL, który służy do analizy materiałów będących przedmiotem zainteresowania. Wszystkie próbki tkanek poddawane są temu samemu procesowi obrazowania i są mapowane względem RSL. Wynikowy obraz będzie zawierał tylko obszary z elementami zainteresowania na czarnym tle. Obraz ten można następnie przeanalizować za pomocą ImageJ przy użyciu funkcji analizy progowej i cząstek, aby uzyskać obszar zmapowanych cząstek w polu widzenia. Dane liczbowe uzyskane z ImageJ można wyeksportować do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.
Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że ponieważ próbki biologiczne z natury różnią się od siebie, a metody barwienia mogą wpływać na wizualizację za pomocą EDFM i HSI, ustawienia ekspozycji powinny być określone zgodnie z tym, co daje najlepszy obraz o wysokim kontraście dla określonego rodzaju próbki. Chociaż redukcję wyników fałszywie dodatnich można osiągnąć poprzez filtrację bibliotek spektralnych, kluczowe znaczenie ma uzyskanie wiarygodnych kontroli ujemnych, które pozwoliły uniknąć zanieczyszczenia pierwiastkiem będącym przedmiotem zainteresowania, ponieważ widma odpowiadające temu zanieczyszczeniu mogą być potencjalnie filtrowane z biblioteki spektralnej kontroli pozytywnej, zwiększając odsetek wyników fałszywie ujemnych. Ponadto zakres intensywności widma, który jest wykrywalny za pomocą oprogramowania do obrazowania hiperspektralnego, nie może przekroczyć limitu konkretnego oprogramowania (w tym badaniu jest to 16 000 jednostek): obszary z dużą liczbą nagromadzonych cząstek, które wytwarzają intensywność widmową powyżej limitu intensywności, są pomijane w bibliotece spektralnej ze względu na ryzyko zwiększenia liczby wyników fałszywie ujemnych.
Chociaż system HSI ma wiele zalet w porównaniu z tradycyjnymi metodami, istnieją pewne wady i ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę. Jednym z nich jest to, że duża ilość gromadzonych danych optycznych może wymagać znacznej mocy obliczeniowej. Innym jest to, że HSI może być czasochłonne, szczególnie na początkowych etapach, kiedy tworzone są referencyjne biblioteki spektralne. Ponadto czas obrazowania może wymagać kilku minut na przechwycenie obrazu, co czyni go wolniejszym niż proste obrazowanie w ciemnym polu; Jest to jednak nadal szybsze niż przygotowanie i wizualizacja próbek za pomocą mikroskopii elektronowej. Dodatkowo, złożone systemy mogą skutkować wieloma widmami charakterystycznymi, co wymaga opracowania wysoce wyspecjalizowanych kontroli i utrudnia tworzenie znormalizowanych, uniwersalnych bibliotek referencyjnych26. Wreszcie, technika ta skutkuje niższą rozdzielczością niż techniki mikroskopii sondowej lub elektronowej, takie jak mikroskopia sił atomowych lub transmisyjna mikroskopia elektronowa, które mogą rozdzielić pojedyncze atomy. Rozdzielczość tej techniki jest ograniczona ze względu na jej fotoniczny charakter, co sprawia, że nie jest ona precyzyjnym narzędziem do pomiaru rozmiarów cząstek na poziomie nanometrów lub do precyzyjnego lokalizowania materiałów na poziomie submikronowym. Chociaż technika ta może być w stanie wskazać cząstki w określonych przedziałach tkankowych lub organellach komórkowych większych niż 1 μm (takich jak jądra komórkowe), mniejsze organelle lub cechy są trudne do dokładnej wizualizacji za pomocą tej metody. Warto również zauważyć, że ze względu na rozdzielczość przestrzenną metoda ta nie jest w stanie rozróżnić pojedynczych nanocząstek i aglomeratów11.
Inne kwestie obejmują: niektóre materiały (takie jak metale szlachetne) mają znacznie wyższy współczynnik odbicia i wyraźne profile spektralne, co może ułatwić ich analizę i mapowanie spektralne za pomocą tego narzędzia. Inne, takie jak tlenki półmetaliczne badane w tym badaniu i nanomateriały na bazie węgla24, 27, mogą być trudniejsze ze względu na ich skład pierwiastkowy, kształt i zależność od matrycy. W dwóch badaniach nad inhalacją mysią przeprowadzonym przez Mercera i wsp., system podobny do tego zastosowanego w tym badaniu został wykorzystany w celu zlokalizowania nanorurek węglowych w płucach i narządach wtórnych w oparciu o ich niezwykle wysoki kontrast z otaczającymi tkankami. Jednak mapowanie hiperspektralne nie zostało wykazane w żadnym z badań, prawdopodobnie dlatego, że unikalny kształt włókien węglowych był wystarczającą cechą do identyfikacji. Inna kwestia odnosi się w szczególności do tkanek: ponieważ osadzanie się nanocząstek będących przedmiotem zainteresowania w określonych narządach w wyniku normalnych procesów biofizycznych jest nieprzewidywalne (i często samo w sobie jest przedmiotem badań), określenie mającego zastosowanie kontroli dodatniej może być trudne i wymaga rozważenia, w jaki sposób wytwarzanie kontroli może wpłynąć na stan materiału będącego przedmiotem zainteresowania. Na przykład, jeśli biblioteka spektralna jest tworzona z nieskazitelnych nanocząstek będących przedmiotem zainteresowania, mapowanie biblioteki do tych samych nanocząstek w tkankach lub komórkach może być trudne ze względu na zmiany widm wynikające ze zmiany cząstki (np. z powodu zmiany pH, rozpuszczania, aglomeracji, wiązania białek) i całego mikrośrodowiska lub matrycy. Wreszcie, technika ta ma ograniczony charakter półilościowy: może być tylko tak ilościowa, jak inne techniki mikroskopii dwuwymiarowej o podobnej rozdzielczości, co oznacza, że nie można jej łatwo wykorzystać do wykonywania zadań, takich jak scharakteryzowanie całkowitego obciążenia narządów materiału.
Ogólnie rzecz biorąc, EDFM i HSI mają kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnymi technikami obrazowania i charakteryzowania nanomateriałów, takimi jak TEM, HAADF i DIC. EDFM/HSI pozwala na szybszą akwizycję i analizę obrazu, co pozwala zaoszczędzić czas i koszty w porównaniu z bardziej intensywnymi technikami konwencjonalnymi. Dodatkowo, przygotowanie próbki do EDFM/HSI jest zazwyczaj zarówno minimalne, jak i nieniszczące, co oszczędza czas, a także pozwala na bardziej elastyczną analizę danej próbki, ponieważ może być następnie wykorzystana do innych technik. Co więcej, HSI jest wszechstronny, pozwalając na analizę materiałów w nanoskali o wielu składach i w różnych matrycach. Zespół badawczy pracuje nad udoskonaleniem opisanej tu metody dla innych materiałów i typów próbek, w tym nad dogłębną oceną specyfiki technologii. Kolejnym kluczowym krokiem badanym przez zespół badawczy jest walidacja tych technik w odniesieniu do tradycyjnych standardów złota (np. Raman, TEM, SEM) dla materiałów i typów tkanek będących przedmiotem zainteresowania.

Ponieważ nanomateriały są coraz częściej używane w różnych branżach i zastosowaniach, istnieje zapotrzebowanie na metody obrazowania i charakteryzacji w nanoskali, które są szybsze, tańsze i wygodniejsze niż tradycyjne metody, takie jak mikroskopia elektronowa. Aby zobrazować interakcje nanocząstek (NP) z komórkami, tkankami i żywymi systemami, zastosowano wiele technik optycznych, w tym mikroskopię kontrastu interferencyjnego (DIC)1 oraz podejścia oparte na polu ulotnym, takie jak całkowite odbicie wewnętrzne (TIR) lub skaningowa mikroskopia optyczna bliskiego pola (NSOM)2,3. Są to jednak wysokiej klasy podejścia analityczne, poza zasięgiem większości laboratoriów niespecjalistycznych4. Mikroskopia elektronowa, w tym transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), została również wykorzystana do badania interakcji NP z komórkami5,6,7,8. Skaningowa skaningowa mikroskopia elektronowa w ciemnym polu pierścieniowym o wysokim kącie (HAADF) została wykorzystana do zbadania interakcji nanocząsteczek z wirusami9. Mikroskopia konfokalna jest kolejną popularną techniką stosowaną do badania interakcji NP-komórek10.
W ostatnich latach, techniki obrazowania hiperspektralnego (HSI) oparte na ciemnym polu były używane jako obiecujące narzędzie analityczne do badania nanocząsteczek w matrycach biologicznych11. Systemy HSI generują trójwymiarową reprezentację danych przestrzennych i spektralnych, znaną jako hipersześcian lub kostka danych12. Mapa przestrzenna zmienności spektralnej służy do identyfikacji materiałów. Profile spektralne znanych materiałów mogą być generowane i wykorzystywane jako biblioteki referencyjne do porównania z nieznanymi próbkami. Jedną z głównych zalet systemów HSI jest ich zdolność do łączenia obrazowania ze spektroskopią, ustalając w ten sposób lokalizację i rozmieszczenie nieznanych nanocząsteczek in vivo lub ex vivo, a także łącząc je z inną cząstką referencyjną o znanym, podobnym składzie.
Istnieje kilka zalet korzystania z systemów HSI w porównaniu z konwencjonalnymi technikami obrazowania: wymagane jest minimalne przygotowanie próbki; przygotowanie próbki jest zazwyczaj nieniszczące; akwizycja i analiza obrazu jest szybsza; technika jest opłacalna13; a rozkład przestrzenny i analiza związków o mieszanym składzie i/lub w złożonych matrycach jest łatwiejszado osiągnięcia 14.
Dla badań nad nanomateriałami z udziałem cennych próbek, jednym z najważniejszych czynników jest dostępność metody obrazowania nieniszczącego, która pozwala na wielokrotne badanie próbek za pomocą jednej lub więcej metod. Wielokrotne lub wielokrotne analizy mogą być pożądane w celu opracowania kompleksowych zbiorów danych, które nie byłyby dostępne przy użyciu jednej metody. W związku z tym badanie jego właściwości optycznych jest najbezpieczniejszym sposobem analizy próbki. Dzięki zastosowaniu mikroskopu wzmocnionego ciemnego pola (EDFM) i systemu HSI do badania odpowiedzi optycznej próbki – a mianowicie współczynnika odbicia, ale także absorbancji i transmitancji – można przeprowadzić identyfikację i charakterystykę cech15. Potencjalne punkty końcowe charakterystyki obejmują ocenę względnej wielkości i kształtu nanocząstek lub aglomeratów oraz rozmieszczenie nanocząstek w próbce.
W tym artykule opisujemy metody mapowania nanocząstek tlenku metalu w tkance pośmiertnej za pomocą systemu HSI opartego na algorytmie dopasowania pikselowo-spektralnego, zwanym mapowaniem kąta widmowego (SAM). Wybraliśmy to konkretne zastosowanie, ponieważ ma ono potencjał, aby uzupełnić obecne i przyszłe badania nanatoksykologiczne in vivo, w których modele zwierzęce są wykorzystywane do oceny skutków zdrowotnych narażenia na zmodyfikowane nanomateriały. Zastosowanie tej metody może również dostarczyć informacji na temat badań nad dostarczaniem leków w nanoskali, które wykorzystują modele tkankowe lub zwierzęce. Za pomocą tego systemu można w szczególności badać absorpcję, dystrybucję, metabolizm i wydalanie nanocząstek w narządach i tkankach. Badanych jest wiele różnych zastosowań pod kątem wykorzystania w badaniach biomedycznych11 .
Ta metoda może być wykorzystana do oceny różnych próbek biologicznych (takich jak różne typy tkanek, próbki płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i rozmazy krwi), które zostały wystawione na działanie nanocząsteczek o różnych składach pierwiastkowych16-19. Ponadto metoda ta jest przydatna do badania biodystrybucji nanocząstek in vivo i in vitro, co jest istotne dla badań nad dostarczaniem leków w nanoskali11. Poza próbkami biologicznymi, EDFM i HSI mogą być wykorzystywane do oceny nanocząstek w próbkach środowiskowych, takich jak ścieki20. Zastosowanie tej techniki może również ułatwić ocenę narażenia zawodowego, ponieważ może ona być wykorzystywana do oceny skuteczności środków ochrony indywidualnej w zapobieganiu przenikaniu nanocząstek. Ponadto zespół badawczy opracowuje obecnie podobny protokół EDFM i HSI do oceny próbek nanocząstek w mediach filtracyjnych pobranych z oceny narażenia zawodowego. Chociaż przygotowanie tych różnych typów próbek dla EDFM i HSI może się różnić, ważne jest, aby były one przygotowane w taki sposób, aby mogły być łatwo zobrazowane przez układ optyczny. Zazwyczaj próbka powinna być przygotowana tak, jakby była wizualizowana za pomocą tradycyjnej mikroskopii jasnego pola. Na rynku dostępnych jest kilka systemów obrazowania hiperspektralnego11.

<table><tbody><tr><td>Jednostka CytoViva 150 (kondensator)</td><td>CytoViva (Auburn, AL)</td><td></td><td>zamontowana na mikroskopie Olympus BX43</td></tr><tr><td>Mikroskop Olympus BX43 - Szczelina analizatora - HSI z 10-krotnymi i 40-krotnymi obiektywami powietrznymi oraz 100-krotnym obiektywem zanurzeniowym</td><td>uzyskanym przez CytoViva (Auburn, AL)</td><td></td><td>do użytku z kondensatorem CytoViva 150</td></tr><tr><td>Unit Dagexcel-M Cyfrowa kamera Firewire - chłodzona; zawiera oprogramowanie</td> <td>Exponent 7uzyskany za pomocą CytoViva (Auburn, AL)</td><td></td> <td>ulepszonej kamery i oprogramowania do ciemnego pola</td></tr><tr><td>System obrazowania hiperspektralnego CytoViva 1.4; zawiera kamerę hiperspektralną Pixelfly, kontroler stopnia XY, oprogramowanie do obrazowania hiperspektralnego ENVI</td> uzyskane za pomocą <td>kamery hiperspektralnej</td><td>CytoViva (Auburn, AL)</td><td></td> i oprogramowania</tr> do czyszczenia szkła mikroskopowego w <tr><td>pomieszczeniach czystych (szkiełka szklane B)</td><td>Schott NEXTERION</td><td>1025087</td><td>Zmniejszona ilość zanieczyszczeń i artefaktów w porównaniu z konwencjonalnymi szklanymi szkiełkami mikroskopowymi dla optymalnego obrazowania Szkiełka</td></tr><tr><td>nakrywkowe do mikroskopu z czyszczonego szkła w pomieszczeniach czystych (#1.0; 22 mm x 22 mm x&nbsp; 1,45 mm)</td><td>Schott NEXTERION</td><td>niestandardowo</td><td>zredukowane zanieczyszczenia i artefakty w porównaniu z konwencjonalnymi szklanymi szkiełkami nakrywkowymi dla optymalnego obrazowania</td></tr><tr><td>Olejek immersyjny do mikroskopii typu A</td><td>Fisher Scientific</td><td>12368B</td><td>wielu dostawców</td></tr><tr><td>70% izopropanolu w woda</td><td></td><td></td><td>wielu dostawców</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td></td><td>bezpłatne oprogramowanie typu open source do pobrania online</td></tr><tr><td>nanocząstki tlenku metalu</td><td>dostarczone zespołowi badawczemu przez partnerów</td><td></td> przemysłowych <td>nanocząstki tlenku glinu, krzemionki i tlenku ceru w zawiesinach wodnych. Ze względu na umowę o zachowaniu poufności między autorami a partnerami branżowymi, dalsze informacje o produkcie nie mogą być ujawniane.</td></tr></tbody></table>

identyfikacja nanocząstek tlenków metali w próbkach histologicznych za pomocą ulepszonej mikroskopii ciemnego pola i mapowania hiperspektralnego

Identification of Metal Oxide Nanoparticles in Histological Samples by Enhanced Darkfield Microscopy and Hyperspectral Mapping

Nanomateriały są coraz bardziej rozpowszechnione w przemyśle, produkcji i badaniach biomedycznych. Rośnie zapotrzebowanie na narzędzia i techniki, które pomagają w identyfikacji, lokalizacji i charakterystyce materiałów w nanoskali w próbkach biologicznych. Obecnie dostępne metody, takie jak mikroskopia elektronowa, zwykle wymagają dużych zasobów, co sprawia, że ich stosowanie jest zaporowe dla dużej części społeczności naukowej. Ulepszona mikroskopia ciemnego pola uzupełniona o system obrazowania hiperspektralnego może stanowić rozwiązanie tego wąskiego gardła, umożliwiając szybką i tańszą charakterystykę nanocząstek w próbkach histologicznych. Metoda ta pozwala na obrazowanie w nanoskali o wysokim kontraście, a także identyfikację nanomateriałów. W przypadku tej techniki histologiczne próbki tkanek przygotowuje się tak, jak w przypadku mikroskopii świetlnej. Najpierw analizuje się dodatnie próbki kontrolne w celu wygenerowania widm referencyjnych, które umożliwią wykrycie materiału będącego przedmiotem zainteresowania w próbce. Kontrole ujemne bez materiału będącego przedmiotem zainteresowania są również analizowane w celu poprawy swoistości (zmniejszenia liczby wyników fałszywie dodatnich). Próbki mogą być następnie obrazowane i analizowane przy użyciu metod i oprogramowania do mikroskopii hiperspektralnej lub dopasowywane do tych widm referencyjnych w celu dostarczenia map lokalizacji materiałów będących przedmiotem zainteresowania w próbce. Technika ta szczególnie dobrze nadaje się do materiałów o bardzo unikalnych widmach odbicia, takich jak metale szlachetne, ale ma również zastosowanie do innych materiałów, takich jak tlenki półmetaliczne. Technika ta dostarcza informacji, które są trudne do uzyskania z próbek histologicznych bez użycia technik mikroskopii elektronowej, które mogą zapewnić wyższą czułość i rozdzielczość, ale są znacznie bardziej zasobochłonne i czasochłonne niż mikroskopia lekka.

Mikroskopia hiperspektralna jest użyteczna ze względu na zdolność do identyfikacji materiałów w sposób podobny do spektrofotometrii. Jak wskazano na Rysunku 1, każdy materiał posiada kilka charakterystycznych widm oraz unikalny ogólny kształt odbicia. Ponadto Rysunek 1 ilustruje zależność profili spektralnych od matrycy: profile spektralne dla każdego z trzech tlenków metali w próbkach tkanek histologicznych (panel górny) różnią się od profili spektralnych dla tych samych trzech tlenków metali w zawiesinie wodnej (panel dolny). Poprzez mapowanie charakterystycznych profili spektralnych na nieznane próbki w tej samej matrycy, technika ta jest przydatna do określania obecności lub braku materiału, a także może służyć do półilościowego porównywania względnych ilości materiału w próbkach.
Referencyjne biblioteki widm stworzone z próbek skóry kontroli pozytywnej są odpowiednie do mapowania próbek skóry eksperymentalnej. Jak widać na Rysunku 2, referencyjne biblioteki widm dobrze mapują się do odpowiadających im kontroli pozytywnych i nie mapują się do odpowiadających im kontroli negatywnych.
Największą zaletą tej techniki jest zdolność do wykrywania niskich stężeń analizowanych materiałów w próbkach, a także możliwość odróżnienia ich od zanieczyszczeń. Na przykład, pojedyncze nanorurki mogą być obserwowane w płucach podczas inhalacji dawek tak niskich jak 40 µg u szczura o masie 20-30 g25. Rycina 3 demonstruje to na histologicznych próbkach skóry: podczas gdy niektóre cząsteczki są wyraźnie widoczne na obrazie optycznym w ciemnym polu (kolumna 2), inne są wykrywane przy użyciu obrazowania hiperspektralnego (kolumna 3), a które mogły zostać pominięte podczas stosowania mikroskopii w jasnym polu (kolumna 1) lub innych metod. Zastosowanie HSI w ciemnym polu służy również poprawie swoistości w porównaniu do zwykłej mikroskopii w jasnym polu. Obrazy te mogą następnie zostać poddane bardziej ilościowym formom analizy, w szczególności analizie cząsteczek za pomocą programu ImageJ.
Udoskonalona mikroskopia w ciemnym polu znajduje wiele różnych zastosowań, nawet w przypadku braku obrazowania hiperspektralnego. Pierwszym z nich jest zdolność do generowania wysokiej jakości obrazów o wysokim kontraście. Najlepiej demonstruje to Rysunek 3, na którym badane cząsteczki są łatwo identyfikowalne w porównaniu z ich odpowiednikami w jasnym polu. Obrazy te mogą być również poddane ilościowej analizie cząsteczek, choć w przypadku braku mapowania hiperspektralnego należy zachować ostrożność, aby nie pomylić cząsteczki zanieczyszczenia z badaną cząsteczką.
<img alt="Wykresy biblioteki widmowej dla tlenku glinu, krzemionki, tlenku ceru; długość fali vs intensywność; wykres porównawczy." src="/files/ftp_upload/53317/53317fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Porównanie referencyjnych bibliotek widmowych (matryca tkankowa) z bibliotekami widmowymi (nanocząstki w zawiesinie). Rysunek ten obrazuje znaczenie tworzenia referencyjnej biblioteki widmowej z nanomateriałów będących przedmiotem badania w tej samej matrycy, co próbki eksperymentalne. Pierwszy wiersz przedstawia referencyjną bibliotekę widmową (RSL) dla każdego z materiałów użytych w niniejszym badaniu (tlenku glinu, krzemionki i tlenku ceru). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Ta biblioteka referencyjna widm (RSL) została utworzona metodą opisaną w niniejszym protokole, w której próbki tkanek kontroli pozytywnej zostały przefiltrowane względem próbek tkanek kontroli negatywnej. Drugi wiersz przedstawia biblioteki widmowe (SL) utworzone z badanych nanocząsteczek w zawiesinie ciekłej na szkiełku przedmiotowym. W przypadku tlenku glinu w RSL stwierdzono bimodalny pik przy długościach fal 500 i 650, podczas gdy w SL zawiesiny NP tlenku glinu zaobserwowano bardziej zakrzywiony i mniej wyraźny pik w okolicach 600. Dla krzemionki w RSL obecny był pik przy długości fali około 650, natomiast w SL zawiesiny NP krzemionki zaobserwowano bardziej zakrzywiony i mniej wyraźny pik w okolicach 600. W przypadku tlenku ceru w RSL stwierdzono bimodalny pik przy długościach fal 520 i 620, podczas gdy w SL zawiesiny NP tlenku ceru zaobserwowano mniej wyraźny pik w okolicach 560. Sugeruje to, że matryca, w której osadzone są NP, powoduje przesunięcie widm, które może być znaczne przy wyborze kontroli do utworzenia SL dla konkretnego eksperymentu.
<img alt="Wykresy biblioteki widmowej; analizy macierzy tkankowej dla tlenku glinu, krzemionki i tlenku ceru z porównaniami kontrolnymi." src="/files/ftp_upload/53317/53317fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Referencyjne biblioteki widmowe (macierz tkankowa) zmapowane na dodatnią i ujemną kontrolę tkanki skóry świni. Rycina ta służy jako potwierdzenie, że RSL są odpowiednie do mapowania na próbki eksperymentalne, ponieważ każda RSL (lewa kolumna) dobrze mapuje się na odpowiadającą jej kontrolę dodatnią (środkowa kolumna) i nie mapuje się na odpowiadającą jej kontrolę ujemną (prawa kolumna). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza w polu jasnym, EDFM, HSI i mapowanie tlenku glinu, krzemionki oraz tlenku ceru w badaniu mikroskopii histologicznej." src="/files/ftp_upload/53317/53317fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Mapowanie hiperspektralne eksperymentalnej tkanki skóry świńskiej eksponowanej na nanocząsteczki tlenków metali. Wiersze od góry do dołu odpowiadają różnym warstwom skóry, od najbardziej powierzchownej do najgłębszej: odpowiednio naskórkowi, skórze właściwej i tkance podskórnej. Pierwszy wiersz przedstawia stratum corneum naskórka z próbki skóry eksponowanej na nanocząsteczki tlenku glinu w zawiesinie; drugi wiersz przedstawia ekspozycję na nanocząsteczki krzemionki w zawiesinie, a trzeci na nanocząsteczki tlenku ceru w zawiesinie. Każda kolumna przedstawia ten sam obszar skóry obrazowany różnymi technikami. Pierwsza kolumna odpowiada mikroskopii w polu jasnym (powiększenie 40X; pasek skali = 50 µm), gdzie obszar zamknięty w czerwonym kwadracie został powiększony (powiększenie 100X; pasek skali = 10 µm) za pomocą ulepszonej mikroskopii w polu ciemnym (EDFM) w drugiej kolumnie, w której białe strzałki wskazują wysokokontrastowe nanocząsteczki. Trzecia kolumna została uzyskana za pomocą kamery hiperspektralnej (HSI), pokazując te same wysokokontrastowe nanocząsteczki (białe strzałki). Obrazy EDFM i HSI wykonano przy powiększeniu 100X; pasek skali = 10 µm. Czwarta kolumna przedstawia obraz HSI zmapowany względem odpowiedniego RSL dla każdej grupy ekspozycji, gdzie nanocząsteczki tlenku glinu są pokazane na zielono, nanocząsteczki krzemionki na czerwono, a nanocząsteczki tlenku ceru na żółto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Ulepszona mikroskopia ciemnego pola i obrazowanie hiperspektralne z mapowaniem spektralnym umożliwiają badania, lokalizację i identyfikację materiałów w skali nano w próbkach histologicznych z większą szybkością i dokładnością w porównaniu z tradycyjnymi metodami. Celem niniejszej pracy jest przedstawienie metod obrazowania w ciemnym polu i mapowania hiperspektralnego nanocząstek tlenków metali w próbkach histologicznych.

Identyfikacja nanocząstek tlenków metali w próbkach histologicznych za pomocą ulepszonej mikroskopii ciemnego pola i mapowania hiperspektralnego

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja nanocząstek tlenków metali w próbkach histologicznych za pomocą mikroskopii w ciemnym polu oraz mapowania hiperspektralnego. Jest to realizowane poprzez wstępne wyznaczenie obszaru zainteresowania w próbce kontrolnej pozytywnej zawierającej nanocząstki i wykonanie obrazu w ciemnym polu. Drugim krokiem jest utworzenie obrazu hiperspektralnego lub kostki danych obszaru zainteresowania przy użyciu kamery hiperspektralnej.Następnie, na podstawie kostki danych kontroli pozytywnej, tworzona jest referencyjna biblioteka widmowa, która jest filtrowana względem kontroli negatywnej w celu usunięcia wyników fałszywie dodatnich. W ostatnim kroku referencyjna biblioteka widmowa służy do mapowania próbek eksperymentalnych, aby zidentyfikować i zlokalizować nanocząstki o tym samym składzie. Ostatecznie ulepszona mikroskopia w ciemnym polu oraz mapowanie hiperspektralne są wykorzystywane do identyfikacji nanocząstek tlenków metali w próbkach histologicznych w sposób szybszy i mniej zasobochłonny niż w przypadku innych technik, takich jak mikroskopia elektronowa.Metoda ta oferuje kilka zalet w porównaniu do konwencjonalnych technik obrazowania i charakterystyki nanomateriałów, takich jak mikroskopia elektronowa. Przygotowanie próbek jest zazwyczaj minimalne i niedestrukcyjne. Pozyskiwanie i analiza obrazów są mniej czasochłonne i kosztowne, a metodę tę można zastosować do obrazowania nanocząsteczek w różnych matrycach.Osoby znające tę metodologię czasami napotykają trudności, ponieważ tworzenie odpowiednich próbek kontroli pozytywnej oraz referencyjnych bibliotek widm jest zarówno wymagające, jak i czasochłonne. Jednak po zakończeniu tych wstępnych etapów, próbki eksperymentalne mogą być oceniane bardzo szybko. Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat przenikania nanocząstek przez skórę, można ją również zastosować do innych próbek biologicznych, takich jak płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe i rozmazy krwi, a także do próbek niebiologicznych, np. filtrów stosowanych w ocenie narażenia zawodowego.Technikę tę zaprezentuje Plar Sosa, student medycyny z mojego laboratorium. Należy rozpocząć od podłączenia do zasilania i włączenia źródła światła, sterownika stolika, kamery optycznej, kamery hiperspektralnej oraz systemu komputerowego. Następnie należy podnieść stolik i kondensor do pozycji roboczej, a następnie ostrożnie nanieść od trzech do pięciu kropli oleju immersyjnego typu A na soczewkę kondensora. W przypadku powstania pęcherzyków powietrza, należy zetrzeć olej i ponownie nanieść go na soczewkę.Następnie umieść próbkę na stoliku i powoli podnoś kondensor, aż olej immersyjny zetknie się z dolną stroną szkiełka. Będzie to zauważalne dzięki szybko rozjaśniającemu się pierścieniowi oświetlenia w miejscu styku oleju ze szkiełkiem. Po ustawieniu kondensora przełącz na obiektyw 10 x, a następnie ustaw ostrość i wycentruj kondensor, aby zmaksymalizować jasność; w razie potrzeby użyj pokręteł regulacji kondensora, aby wyśrodkować jasny punkt.Otwórz oprogramowanie do obrazowania optycznego. Ustaw ostrość próbki za pomocą pokrętła mikrometrycznego obiektywu. Następnie znajdź obszar zainteresowania.W razie potrzeby wyreguluj ogniskową kondensora, aby wyrównać oświetlenie. Kliknij kartę ustawień na pasku menu, a następnie kliknij przycisk przechwytywania obrazu. W celu wykonania przechwytywania.Wybierz pożądany format obrazu i przypisz nazwę pliku dla obrazu. Następnie wybierz domyślną wartość odstępu czasowego dla sekwencji time lapse, a na koniec kliknij OK. Dalej przejdź do menu ekspozycji i wybierz ustawienia ekspozycji, które zapewnią obraz o najwyższym kontraście.W tym przypadku poziom jest ustawiony na 0.0%. Wzmocnienie wynosi 2.8 decybeli, a czas naświetlania jest ustawiony na 56 milisekund. Należy zarejestrować obraz, klikając przycisk obrazu na pasku menu. Następnie należy zmienić obiektyw na 40 x oraz 100 x.Podczas rejestrowania obrazów przy większych powiększeniach należy upewnić się, że światłowód jest skierowany do kamery hiperspektralnej, a następnie uruchomić oprogramowanie do obrazowania hiperspektralnego w celu pozyskania kostek danych HSI; w oprogramowaniu należy wybrać opcję „hyperspectral microscope” na pasku menu, a następnie przejść do „HSI microscope controls”. W tym miejscu należy ustawić powiększenie obiektywu oraz bezpieczną ścieżkę (safe path). Następnie w ustawieniach należy zmienić obszar przechwytywania (area capture) oraz liczbę linii.W niniejszym badaniu czas naświetlania ustawiono na 720. W tym przypadku zastosowano 0,25 sekundy. Pozostałe parametry pozostawiono w ustawieniach domyślnych, a następnie kliknięto przycisk „preview HSI”, aby wyświetlić obraz.Obserwuj otrzymany wykres intensywności reprezentujący intensywność najdłuższej fali podczas przesuwania się użytkownika wzdłuż osi x w centrum pola widzenia kamery. Przesuwaj kursor, aby wygenerować dokładny obrys wykresu. Spowoduje to pojawienie się numerycznego wskaźnika intensywności po lewej stronie.Ustaw ostrość obrazu na podstawie tego podglądu, regulując precyzyjną ostrość obiektywu, aby wyostrzyć piki na obrazie. Następnie zoptymalizuj natężenie światła, regulując jasność źródła lub ostrość kondensora, bądź anuluj podgląd i dostosuj czas ekspozycji w oprogramowaniu. Kliknij przycisk rejestracji i obserwuj, jak pojawiają się cztery nowe okna z dostępnymi nazwami.Lista pasm. Powiększenie numer jeden. Pojawia się pasmo numer jeden, przewijanie i pasmo RGB numer jeden.Powiększ okno pierwszego pasma RGB, ponieważ jest to kostka danych, która będzie wykorzystywana w dalszej części. Kliknij prawym przyciskiem myszy tę kostkę danych, zapisz ją jako plik tiff i kliknij OK. Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie obrazu kostki danych i kliknij lewym przyciskiem myszy opcję Z profile spectrum.Gdy po lewej stronie pojawi się okno z profilem widmowym, kliknij interesujące Cię piksele na celu w kostce danych. Najjaśniejsze z nich to te, które można z pewnością zidentyfikować jako reprezentujące badany materiał. W menu analizy cząstek (particle analysis) wybierz narzędzie filtra cząstek (particle filter), aby zidentyfikować cząstki obecne w kostce danych.W nowym wyskakującym oknie należy ustawić wartość spectral max tak, aby przekraczała ona wartość tła, ale była niższa od wartości interesujących nas materiałów. Maksymalna wartość poprawnych danych wynosi 16 000. W oknie narzędzia do przeglądania filtra cząsteczek kliknij zaznacz wszystko.Następnie kliknij eksport do biblioteki widm i przypisz nazwę dla swojej biblioteki widm. Po wybraniu próbki, która będzie służyć jako kontrola negatywna, uzyskaj kilka kostek danych z tej próbki. Przy użyciu kamery hiperspektralnej wymagana jest co najmniej jedna kostka, ale można ich zarejestrować więcej.Aby zwiększyć selektywność przy otwartym kostce danych kontroli negatywnej, kliknij filter spectral library. W menu analizy znajdującym się na głównym pasku narzędzi programu kliknij open new file i jako plik wejściowy wybierz bibliotekę spektralną utworzoną wcześniej dla kontroli pozytywnej, a następnie kliknij okay. W oknie filter cyto viva spectral library kliknij image, wybierz nazwę pliku wyjściowego dla referencyjnej biblioteki spektralnej i kliknij okay.Następnie kliknij nazwę pliku kostki danych kontroli negatywnej jako obrazu źródłowego. Oprogramowanie przeanalizuje bibliotekę spektralną i usunie każde widmo, które odpowiada dowolnemu widmu z kostki danych kontroli negatywnej. Uzyskaj kostki danych z próbek eksperymentalnych przy otwartej kostce danych eksperymentalnych.Kliknij menu widmowe w podmenu metod mapowania i otwórz mapowanie kąta widmowego (spectral angle mapper). W oknie pop-up wybierz nazwę eksperymentalnej kostki danych i kliknij OK. Jeśli na liście nie ma żadnych nazw plików, kliknij otwórz nowy plik i wybierz eksperymentalną kostkę danych.Następnie kliknij OK w oknie pop-up o nazwie End Member collection, SAM, a następnie kliknij import na pasku menu. Wybierz opcję Spectral Library file. Otwórz wcześniej utworzoną referencyjną bibliotekę spektralną i kliknij OK.W nowym oknie wyskakującym o nazwie Input Spectral Library kliknij „select all items”, a następnie kliknij „okay”. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy na „color” i wybierz „Apply default colors to all”, kliknij „select all”, a potem „apply”; na koniec wybierz nazwę pliku wyjściowego i kliknij „okay”.Otwórz menu nakładki w oknie kostki danych i wybierz klasyfikację. Następnie przejdź do nazwy pliku wyjściowego i kliknij OK. W menu okna interaktywnego narzędzia do klasyfikacji otwórz menu opcji i wybierz scalanie klas, aby utworzyć jednolity schemat kolorów.Aby ułatwić analizę danych przy użyciu innego oprogramowania, wybierz jedno widmo z listy klasy bazowej. Następnie zaznacz wszystkie klasy z wyjątkiem niezaklasyfikowanych (unclassified), aby połączyć je z klasą bazową. Na koniec kliknij OK.Następnie kliknij wybrany kolor bazowy, a wszystkie pasujące widma zostaną wyświetlone w tym kolorze. Aby uzyskać obraz automatyczny, który pokaże pasujące widma na czarnym tle, kliknij pole kolorów niezaklasyfikowanych, które domyślnie jest czarne. Najistotniejszą zaletą tej techniki jest możliwość identyfikacji nanocząsteczek tlenków metali w próbkach histologicznych za pomocą mikroskopii w ciemnym polu i mapowania hiperspektralnego. Obrazy te demonstrują ten proces z wykorzystaniem histologicznych próbek skóry.Podczas gdy niektóre cząsteczki są wyraźnie widoczne w obrazowaniu w ciemnym polu, dodatkowe cząsteczki wykryto przy użyciu obrazowania hiperspektralnego. Przedstawiono tutaj tkankę skóry świń w warstwie naskórka, która została poddana działaniu nanocząsteczek Illumina. Wysokokontrastowy skupisk nanocząsteczek stwierdzono w warstwie rogowej naskórka w warstwie skóry właściwej, która została poddana działaniu nanocząsteczek krzemionki.Można zauważyć liczne nanocząstki o wysokim kontraście osadzone na tkance łącznej. Wreszcie, w tkance podskórnej, która została poddana działaniu nanocząstek Syria, widoczne są liczne, rozproszone nanocząstki o wysokim kontraście osadzone wzdłuż adipocytów; identyfikacja nanocząstek z wykorzystaniem tej metody.Możliwe jest zastosowanie tej metody w innych próbkach tkanek, takich jak płuca, wątroba, śledziona, nerki i węzły chłonne. Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać analizę obrazu w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak liczba cząsteczek i ich lokalizacja. Pewne kwestie i ograniczenia, takie jak konieczność stosowania wysoce specjalistycznych kontroli oraz ograniczenia w rozdzielczości obrazowania fotonicznego, należy rozważyć w odniesieniu do metod konwencjonalnych.Wybierając najbardziej odpowiednie techniki analityczne do zbadania konkretnych pytań badawczych, zdecydowaliśmy się zaprezentować to konkretne zastosowanie, ponieważ posiada ono potencjał do uzupełnienia obecnych i przyszłych badań z zakresu nanotoksykologii. Może ono również dostarczyć informacji na temat absorpcji, dystrybucji, metabolizmu i wydalania nanocząsteczek w narządach i tkankach.

identification-metal-oxide-nanoparticles-histological-samples

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W tym filmie opisujemy technikę mikroskopii ciemnego pola (DFM) połączoną z analizą śledzenia pojedynczych cząstek (SPT) w celu monitorowania interakcji plazmonicznych nanoprętów złota z błoną komórkową określonej linii komórkowej. Połączona analiza DFM i SPT pozwala na wizualizację ruchu nanoprętów przez błonę komórkową z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną.

Mikroskopia ciemnego pola do wizualizacji dynamiki dyfuzyjnej nanoprętów na błonie komórkowej

Laserowa spektroskopia rozpadu przeprowadzona na cienkich narządach i tkankach nowotworowych skutecznie wykryła naturalne pierwiastki i sztucznie wstrzyknięty gadolin (Gd), emitowany z nanocząstek opartych na Gd. Obrazy pierwiastków chemicznych osiągnęły rozdzielczość 100 μm i czułość ilościową poniżej mM. Kompatybilność zestawu ze standardową mikroskopią optyczną podkreśla jego potencjał do dostarczania wielu obrazów tej samej tkanki biologicznej.

Spektroskopia rozpadu indukowanego laserem: nowe podejście do mapowania i kwantyfikacji nanocząstek w tkance narządowej

Ze względu na znaczenie i szerokie zastosowanie palladu, złota i kobaltu w sprzęcie high-tech, ich odzysk i recykling stanowią ważne wyzwanie przemysłowe. Opisany w niniejszym dokumencie system odzysku metali jest prostym, tanim sposobem na skuteczne wykrywanie, usuwanie i odzysk tych metali z kopalni miejskiej.

Wykrywanie i odzyskiwanie palladu, złota i metali kobaltowych z kopalni miejskiej przy użyciu nowatorskich czujników/adsorbentów oznaczonych nanoskalowymi porami w kształcie koła wagonowego

Opisano metodę, dzięki której nanocząstki kropek kwantowych (QD) mogą być używane do korelacyjnych badań immunocytochemicznych osadzonych w żywicy epoksydowej ludzkiej tkance patologicznej. Stosujemy komercyjne QD sprzężone z fragmentami przeciwciał, które są wizualizowane za pomocą szerokokątnej fluorescencyjnej mikroskopii świetlnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa z wykorzystaniem nanocząstek kropek kwantowych

Opisujemy procedurę wykrywania pierwiastków chemicznych obecnych in situ w komórkach ludzkich, jak również ich kwantyfikację in vitro. Metoda ta jest odpowiednia dla każdego typu komórek i jest szczególnie przydatna do ilościowych analiz chemicznych w pojedynczych komórkach po ekspozycji na nanocząstki tlenku metalu in vitro.

In Situ Wykrywanie i kwantyfikacja pojedynczych komórek nanocząstek tlenków metali za pomocą analizy mikrosondy jądrowej

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania dyskretnych klastrów tlenu metali, polioksometalanów (POM), na granicy pojedynczej cząsteczki za pomocą biologicznej platformy elektronicznej opartej na nanoporach. Metoda ta stanowi komplementarne podejście do tradycyjnych narzędzi chemii analitycznej stosowanych w badaniu tych cząsteczek.

Charakterystyka fizyczna pojedynczych nanocząstek metalicznych w wysokiej rozdzielczości

Celem tego protokołu jest szczegółowe przedstawienie sprawdzonego podejścia do przygotowania próbek plazmonicznych nanocząstek i przeprowadzenia na nich spektroskopii pojedynczych cząstek za pomocą mikroskopii z kontrastem różnicowym interferencyjnym (DIC).

Wykonywanie spektroskopii nanocząstek plazmonicznych za pomocą transmisyjnej mikroskopii kontrastowej interferencyjnej typu Nomarskiego

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania luminescencyjnych danych obrazowania hiperspektralnego oraz do analizy cech anizotropii optycznej monokryształów na bazie lantanowców za pomocą Systemu Obrazowania Hiperspektralnego.

Obrazowanie hiperspektralne jako narzędzie do badania anizotropii optycznej w monokryształach molekularnych na bazie lantanowców

Tutaj pokazujemy użycie tradycyjnej mikroskopii ciemnego pola do monitorowania dynamiki nanoprętów złota (AuNR) na błonie komórkowej. Lokalizacja i orientacja pojedynczych AuNR są wykrywane za pomocą ImageJ i MATLAB, a stany dyfuzyjne AuNR są charakteryzowane przez analizę śledzenia pojedynczych cząstek.

Wizualizacja dynamiki dyfuzyjnej nanoprętów złota na błonie komórkowej przy użyciu mikroskopii ciemnego pola pojedynczych nanocząstek

Ten artykuł przedstawia integrację modułu spektralnego ogniskowania i lasera impulsowego o podwójnym wyjściu, umożliwiającego szybkie obrazowanie hiperspektralne nanocząsteczek złota i komórek rakowych. Praca ta ma na celu zademonstrowanie szczegółów multimodalnych nieliniowych technik optycznych na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym.

Obrazowanie biomolekularne wychwytu komórkowego nanocząstek przy użyciu multimodalnej nieliniowej mikroskopii optycznej

Tutaj prezentujemy protokół prezentujący optycznie przezroczyste i płaskie podłoże do usprawnionego wychwytywania i analizy cząstek zanieczyszczających w wodzie pitnej. Przedstawiono tutaj Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP): elastyczny rurociąg do wychwytywania, kwantyfikacji i identyfikacji cząstek w ciekłych mediach.

Multimodalna analiza mikroplastiku w wodzie pitnej przy użyciu rurociągu do analizy nanomembran krzemowych

Poznaj metodę identyfikacji nanocząstek tlenków metali w próbkach histologicznych za pomocą ulepszonej mikroskopii ciemnego pola i mapowania hiperspektralnego. Technika ta umożliwia szybszą i mniej kosztowną analizę niż tradycyjne metody.

Identyfikacja nanocząstek tlenków metali w próbkach histologicznych za pomocą ulepszonej mikroskopii ciemnego pola i mapowania hiperspektralnego (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja nanocząstek tlenków metali w próbkach histologicznych za pomocą ulepszonej mikroskopii ciemnego pola i mapowania hiperspektralnego

Przeglądaj więcej filmów