8 grudnia 2015
Ulepszona mikroskopia ciemnego pola i obrazowanie hiperspektralne z mapowaniem spektralnym umożliwiają badania, lokalizację i identyfikację materiałów w skali nano w próbkach histologicznych z większą szybkością i dokładnością w porównaniu z tradycyjnymi metodami. Celem niniejszej pracy jest przedstawienie metod obrazowania w ciemnym polu i mapowania hiperspektralnego nanocząstek tlenków metali w próbkach histologicznych.
Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja nanocząstek tlenku metalu w próbkach histologicznych za pomocą mikroskopii ciemnego pola i mapowania hiperspektralnego. W tym celu należy najpierw zidentyfikować obszar zainteresowania w pozytywnej próbce kontrolnej zawierającej nanocząstki i uchwycić obraz ciemnego pola. Drugim krokiem jest stworzenie obrazu hiperspektralnego lub kostki danych obszaru zainteresowania za pomocą kamery hiperspektralnej.
Następnie tworzona jest referencyjna biblioteka spektralna z kostki danych kontroli pozytywnej, która jest filtrowana pod kątem kontroli ujemnej w celu usunięcia wszelkich wyników fałszywie dodatnich. Ostatnim krokiem jest wykorzystanie referencyjnej biblioteki spektralnej do mapowania próbek eksperymentalnych w celu zidentyfikowania i zlokalizowania nanocząstek o tym samym składzie. Ostatecznie ulepszona mikroskopia ciemnego pola i mapowanie hiperspektralne są wykorzystywane do identyfikacji nanocząstek tlenków metali w próbkach histologicznych w sposób szybszy i mniej zasobożerny niż inne techniki, takie jak mikroskopia elektronowa.
Metoda ta ma kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnymi technikami obrazowania i charakteryzowania nanomateriałów, takimi jak mikroskopia elektronowa. W tym przypadku przygotowanie próbki jest zazwyczaj minimalne i nieniszczące. Akwizycja i analiza obrazu jest mniej czasochłonna i kosztowna, a ponadto może być stosowana do obrazowania nanocząstek w różnych matrycach.
Osoby, które znały tę metodę, czasami mają trudności, ponieważ tworzenie odpowiednich próbek kontroli pozytywnej i referencyjnych bibliotek spektralnych jest zarówno trudne, jak i czasochłonne. Ale po zakończeniu tych początkowych kroków próbki eksperymentalne można dość szybko ocenić. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w przenikanie nanocząstek przez skórę, można ją również zastosować do innych próbek biologicznych, takich jak płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe i rozmazy krwi, a także próbek niebiologicznych, takich jak filtry stosowane w ocenach narażenia zawodowego.
Technikę tę zademonstruje Plar Sosa, student medycyny z mojego laboratorium Begin by Plug-in i Turn in oraz włączenie źródła światła, kontrolera sceny, kamery optycznej, kamery hiperspektralnej i systemu komputerowego. Następnie podnieś stolik i skraplacz do pozycji roboczej i ostrożnie nałóż od trzech do pięciu kropli olejku immersyjnego typu A na soczewkę skraplacza. Jeśli utworzą się bąbelki, zetrzyj olej i ponownie nałóż go na soczewkę.
Następnie umieść próbkę na stoliku i powoli podnieś skraplacz, aż olejek immersyjny zetknie się ze spodem szkiełka. Będzie to zauważalne przez szybko rozjaśniający się pierścień oświetlenia w miejscu, w którym olej styka się ze szkiełkiem. Gdy kondensator jest na miejscu, przełącz się na obiektyw 10x, a następnie ustaw ostrość i wyrównaj kondensator, aby zmaksymalizować jasność, w razie potrzeby wyreguluj pokrętła wyrównania kondensatora, aby wyśrodkować jasny punkt.
Otwórz oprogramowanie do obrazowania optycznego. Ustaw ostrość próbki za pomocą precyzyjnego pokrętła ostrości obiektywu. Następnie znajdź interesujący Cię region.
W razie potrzeby wyreguluj ostrość kondensora, aby zrównoważyć oświetlenie. Kliknij kartę ustawień na pasku menu i kliknij przycisk przechwytywania obrazu. Dla zdarzenia przechwytywania.
Wybierz żądany format obrazu i przypisz nazwę pliku do obrazu. Dodatkowo wybierz domyślną wartość upływową czasu, a na koniec kliknij OK. Następnie przejdź do menu ekspozycji i wybierz ustawienia ekspozycji, które tworzą obraz o najwyższym kontraście.
Tutaj poziom jest ustawiony na 0.0%Wzmocnienie jest ustawione na 2.8 decybeli, a czas otwarcia migawki jest ustawiony na 56 milisekund sekundy. Przechwyć obraz, klikając przycisk obrazu na pasku menu. Zmień obiektyw na 40 x i 100 x.
Rejestrując obrazy przy większych powiększeniach, upewnij się, że światłowód jest skierowany do kamery hiperspektralnej, a następnie otwórz oprogramowanie do obrazowania hiperspektralnego w celu uzyskania kostek danych HSI w oprogramowaniu, otwórz mikroskop hiperspektralny na pasku menu i wybierz elementy sterujące mikroskopu HSI. Tutaj ustaw powiększenie obiektywu i bezpieczną ścieżkę. Następnie zmień przechwytywanie obszaru w ustawieniach i zmień liczbę linii.
W tym badaniu użyliśmy 720 ustawionych czasów naświetlania. Tutaj użyliśmy 0,25 sekundy. Pozostaw wszystko inne jako domyślne i kliknij podgląd HSI, aby wyświetlić obraz.
Obserwuj wynikowy wykres intensywności przedstawiający natężenie najwyższej długości fali, gdy użytkownik porusza się po osi x środka pola kamery. Przesuń kursor, aby wygenerować dokładny kontur wykresu. Spowoduje to, że po lewej stronie pojawi się numeryczny wskaźnik intensywności.
Ustaw ostrość obrazu na podstawie tego podglądu, dostosowując precyzyjną ostrość obiektywu, aby wyostrzyć szczyty na tym obrazie. Następnie zoptymalizuj natężenie światła, dostosowując jasność źródła, kondensator, ostrość lub anuluj podgląd i dostosuj czas ekspozycji w oprogramowaniu. Kliknij przechwyć i obserwuj jako cztery nowe okna z dostępnymi nazwami.
Lista pasm. Zoom numer jeden. Pojawia się numer jeden, przewijanie i pasmo RGB numer jeden.
Zmaksymalizuj okno pasma RGB numer jeden, ponieważ jest to kostka danych, która będzie używana dla wszystkich przyszłych odniesień. Prawy? Kliknij ten moduł danych, zapisz go jako plik TIFF i kliknij przycisk OK. Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie obrazu kostki danych i kliknij lewym przyciskiem myszy spektrum profilu Z.
Gdy po lewej stronie pojawi się wyskakujące okno profilu spektralnego, kliknij interesujące Cię piksele w miejscu docelowym kostki danych. Najjaśniejsze z nich to te, które można z całą pewnością zidentyfikować jako reprezentujące materiał będący przedmiotem zainteresowania. W menu analizy cząstek wybierz narzędzie filtru cząstek, aby zidentyfikować cząstki obecne w kostce danych.
W nowym zestawie wyskakujących okien maksimum widma musi przekraczać wartość, więc jest wyższe niż piksele tła, ale niższe niż interesujące materiały. Maksymalna liczba prawidłowych danych to 16 000. W oknie narzędzia do przeglądu filtrów cząstek kliknij przycisk Zaznacz wszystko.
Następnie kliknij przycisk eksportuj do biblioteki spektralnej i przypisz nazwę swojej biblioteki spektralnej. Po wybraniu próbki, która ma służyć jako kontrola ujemna, należy uzyskać kilka kostek danych z próbki. Korzystając z kamery hiperspektralnej, wymagany jest co najmniej jeden, ale można uchwycić więcej.
Aby zwiększyć selektywność przy otwartej kostce danych kontroli ujemnej, kliknij przycisk Filtruj bibliotekę spektralną W menu analizy znajdującym się na głównym pasku narzędzi programu kliknij otwórz nowy plik i wybierz bibliotekę spektralną utworzoną wcześniej dla kontroli dodatniej jako plik wejściowy, kliknij przycisk OK. W oknie biblioteki spektralnej filtru cyto viva. Kliknij obraz i wybierz nazwę pliku wyjściowego dla referencyjnej biblioteki spektralnej, a następnie kliknij OK.
Następnie kliknij nazwę pliku swojej kostki danych kontroli negatywnej jako obraz źródłowy. Oprogramowanie przeanalizuje bibliotekę spektralną i usunie każde widmo, które pasuje do dowolnego widma kostki danych kontroli negatywnej. Uzyskaj moduły danych z próbek eksperymentalnych z otwartym modułem danych eksperymentalnych.
Kliknij menu spektralne w podmenu metod mapowania Otwórz mapowanie kąta spektralnego. Wybierz nazwę eksperymentalnego modułu danych w wyskakującym okienku, a następnie kliknij przycisk OK. Jeśli na liście nie ma żadnych nazw plików, kliknij przycisk Otwórz nowy plik i wybierz moduł danych eksperymentalnych.
Następnie kliknij w porządku w wyskakującym okienku o nazwie Kolekcja elementów końcowych, SAM, kliknij importuj na pasku menu. Następnie wybierz z pliku Spectral Library. Otwórz utworzoną wcześniej referencyjną bibliotekę spektralną i kliknij przycisk OK.
W nowym wyskakującym oknie o nazwie Input Spectral Library kliknij zaznacz wszystkie elementy, kliknij OK. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy kolor i wybierz. Zastosuj domyślne kolory do wszystkich, kliknij Zaznacz wszystko, a następnie Zastosuj, a następnie wybierz nazwę pliku wyjściowego i kliknij OK.
Otwórz menu nakładki w oknie modułu danych i wybierz klasyfikację. Następnie przejdź do nazwy pliku wyjściowego i kliknij OK. W menu interaktywnego okna narzędzi klasy otwórz menu opcji i wybierz klasy scalania, aby utworzyć ujednolicony schemat kolorów.
Aby ułatwić analizę danych za pomocą innego oprogramowania, wybierz pojedyncze widmo z listy klas bazowych. Następnie wybierz wszystkie klasy z wyjątkiem niesklasyfikowanych, aby połączyć je z bazą. Następnie kliknij OK.
Następnie kliknij wybrany kolor bazowy, a wszystkie pasujące widma zostaną pokazane w tym kolorze. Aby uzyskać obraz amatyczny, który pokaże pasujące widma na czarnym tle, kliknij pole niesklasyfikowanych kolorów, które jest czarne Domyślnie najważniejszą zaletą tej techniki jest jej zdolność do identyfikacji nanocząstek tlenku metalu w próbkach histologicznych za pomocą mikroskopii ciemnego pola i mapowania hiperspektralnego. Obrazy te pokazują ten proces przy użyciu histologicznych próbek skóry.
Podczas gdy niektóre cząstki są łatwo widoczne w ciemnym polu, obraz optyczny, dodatkowe cząstki są wykrywane za pomocą obrazowania hiperspektralnego. Pokazana jest tkanka skóry świni w warstwie naskórka, która została wystawiona na działanie nanocząsteczek Illumina. Stwierdzono skupisko nanocząstek o wysokim kontraście osadzone na warstwie rogówki w warstwie skórnej, która została wystawiona na działanie nanocząstek krzemionki.
Na tkance łącznej można zaobserwować wiele nanocząstek o wysokim kontraście. Wreszcie w tkance podskórnej, która została wystawiona na działanie nanocząsteczek syryjskich. Za pomocą tej metody można zaobserwować wiele rozproszonych nanocząstek o wysokim kontraście zdeponowanych wzdłuż identyfikacji nanocząstek adipocytów.
W innych próbkach tkanek, takich jak płuca, wątroba, śledziona, nerki i węzły chłonne. Po tej procedurze można przeprowadzić analizę obrazu w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak liczba cząstek i lokalizacja cząstek. Pewne względy i wady, takie jak potrzeba wysoce wyspecjalizowanych kontroli i ograniczenia rozdzielczości obrazowania fotonicznego, muszą być ważone z tymi stosowanymi w przypadku metod konwencjonalnych.
Wybierając najodpowiedniejsze techniki analityczne do zbadania konkretnych pytań badawczych, zdecydowaliśmy się zademonstrować to konkretne zastosowanie, ponieważ ma ono potencjał, aby uzupełnić obecne i przyszłe badania w zakresie toksykologii nano. Może również informować o badaniach dotyczących wchłaniania, dystrybucji, metabolizmu i wydalania nanocząstek w narządach i tkankach.
To badanie przedstawia ulepszone techniki mikroskopi jasnościowej i obrazowania hiperspektralnego do identyfikacji nanocząstek tlenków metali w próbkach histologicznych. Te metody poprawiają szybkość i dokładność lokalizowania nanocząstek w porównaniu z tradycyjnymi technikami obrazowania.
Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral mapping address the growing need for rapid, cost-effective identification of metal oxide nanoparticles in biological matrices, reducing reliance on resource-intensive electron microscopy. This approach supports early-stage nanomaterial safety assessment by enabling localization and characterization in histological samples with minimal sample preparation. The method provides translational value for nanotoxicology studies by delivering spatially resolved data on nanoparticle distribution across tissues.
The technique fits within the discovery continuum from early nanomaterial screening to preclinical safety evaluation, providing imaging-based readouts that inform lead identification and risk assessment decisions.