Walidacja modelu mysiego w celu rozbicia kompleksów LINC w sposób specyficzny dla komórki

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zilustrowanie użyteczności transgenicznego modelu myszy, pozwalającego na indukowaną i ukierunkowaną ekspresję fluorescencyjnie znakowanej pamięci podręcznej EGFP, dwóch peptydów in vivo i wynikające z tego rozerwanie endogennych kompleksów połączeń. W tym eksperymencie ekspresja fluorescencyjnie znakowanej pamięci podręcznej dwie będzie ukierunkowana na móżdżkowe komórki Perkina. To podejście genetyczne może odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące roli kompleksów powiązań w pozycjonowaniu jądrowym w różnych tkankach.

Indukowana i ukierunkowana ekspresja E-G-F-P-K dwa ma kilka zalet. Po pierwsze, wymaga jednego schematu hodowli myszy cay z dowolnym istniejącym szczepem rejsowym. Po drugie, podejście to pomija zaobserwowaną w mysich modelach mutacji linii zarodkowej składników kompleksu łączącego.

Wreszcie, metoda ta pozwala na badanie fizjologii kompleksów połączeń w obrębie określonych komórek lub tkanek. In vivo. Chloe Potter, członkini laboratorium, pokaże ci różnicę w krokach wymaganych do wizualizacji E-G-F-P-K dwa w móżdżku Burkina G.

Aby rozpocząć, należy wyhodować myszy Clac Z z PCP, dwie myszy CRE, aby wyprodukować PCP, dwie myszy CAG, C, dwie myszy, jak opisano w poprzednich publikacjach. Kiedy urodzą się powstałe szczenięta, wykonaj genotypowanie. W celu zidentyfikowania tych, którzy są nosicielami zarówno EGFP, jak i Transgenów Cree, jak opisano wcześniej, należy przygotować 50 mililitrów 30% roztworu sacharozy w PBS i przechowywać go w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do dnia pobrania tkanek w odpowiednim wieku, przeprowadzić trans kardioperfuzję myszy pod narkozą w celu przygotowania tkanki mózgowej do sekcji, jak opisano w pisemnym protokole, umieść wypreparowany mózg na 10-centymetrowej płytce do hodowli tkankowej z 10 mililitrami PBS i oddziel móżdżek od móżdżku.

Następnie za pomocą skalpela rozetnij móżdżek w płaszczyźnie strzałkowej i przenieś skrawki do 30% roztworu sacharozy i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Przygotuj zawiesinę z suchego lodu i dwóch metylobutanów. Pozwól, aby temperatura kąpieli wyrównała się przez pięć minut.

Następnie napełnij formę kriogeniczną związkiem OCT i umieść połowę wypreparowanego móżdżku w formie za pomocą mikroskopu preparacyjnego i kleszczy. Ustaw móżdżek tak, aby podwójnie rozcięta powierzchnia, która znajduje się w pobliżu linii środkowej móżdżku, była skierowana do góry w formie. Następnie przenieś formę kriogeniczną do zawiesiny suchego oka na pięć minut, aż związek OCT utworzy stałą białą matrycę wokół próbki tkanki.

Osadzoną próbkę należy przechowywać w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza do czasu, gdy będzie potrzebna. Oznacz wstępnie poddane obróbce szkiełka polilizynowe do pobierania skrawków tkanek i zamontuj blok tkanek móżdżku na uchwycie tkanek świeżym OCT. Po mocnym przymocowaniu bloku zamontuj uchwyt na chusteczki i ogol plastry o wielkości 40 mikrometrów, aby usunąć nadmiar OCT, aż do dotarcia do tkanki.

Ustaw grubość na 15 mikrometrów i zbierz sekcje, ostrożnie stykając sekcję OCT ze stroną szkiełka pokrytą polilizyną. Przechowuj skrawki tkanki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu przystąpienia do barwienia i obrazowania. Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, rozmroź sekcje móżdżku w ciemności, aby zapobiec blaknięciu białek fluorescencyjnych.

Za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego narysuj prostokąt na obwodzie odcinków tkanki. Dodaj około 500 mikrolitrów 4% aldehydu paraform do skrawków przez pięć minut, aby postfiksować tkankę. Następnie użyj podciśnienia do odessania utrwalacza, zwracając szczególną uwagę, aby nie naruszyć skrawków tkanki pipetą.

Delikatnie nałóż PBS na szkiełko, nie naruszając skrawków tkanki. Po pięciu minutach użyj pipety próżniowej, aby ostrożnie usunąć płyn, powtórz płukanie PBS w sumie trzy razy. Następnie dodaj około 500 mikrolitrów roztworu blokującego do szkiełek i inkubuj je przez 10 minut.

Wyjąć, a następnie zastąpić roztwór blokujący tym samym roztworem zawierającym od jednego do 300 rozcieńczeń przeciwciał wiążących kal lub dwóch nezyny. Następnie usunąć roztwór przeciwciała i przepłukać szkiełka PB S3 razy. Inkubuj szkiełka przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.

Następnie przygotuj jedno do 1000 rozcieńczeń anty-US Alexa floor 5 94 dla szkiełek z etykietą dla krów i anty Alexa Fluor 5 94 dla dwóch oznakowanych szkiełek Nesprin w roztworze blokującym i przechowuj roztwory w ciemności, aż będą potrzebne. Delikatnie usuń ostatnie płukanie PBS i przykryj skrawki rozcieńczonymi przeciwciałami drugorzędowymi na godzinę w ciemności. Po inkubacji usunąć drugorzędowy roztwór przeciwciała.

Następnie nałóż barwnik jądrowy, taki jak DPI o temperaturze 300 nanomolowych w PBS przez pięć minut. Następnie przepłucz skrawki jeszcze dwukrotnie w PBS. Usunąć jak najwięcej roztworu PBS i pokryć wycinek tkanki jedną kroplą podłoża montażowego.

Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na chusteczce, unikając pęcherzyków powietrza i odstaw na 15 do 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby uwidocznić barwienie przeciwciał i białka fluorescencyjne. W przypadku plastrów móżdżku użyj obiektywu 20x lub 40x.

Aby zobaczyć dwie obręcze jądrowe E-G-F-P-C, jak pokazano tutaj, E-G-F-P-C dwa można bezpośrednio zwizualizować w wycinkach móżdżku w kanale Fitzy'ego. Co więcej, kolokalizacja EGFP z wiązaniem krowy, która specyficznie oznacza komórki Perkin, potwierdza, że ekspresja E-G-F-P-C two jest ograniczona do komórek Perkin w komórkach Perkin. Druga pamięć podręczna EGFP jest ukierunkowana na otoczkę jądrową, na co wskazują wzorce podobne do EGFP dodatnie RIM obserwowane wokół jądra.

W tym przykładzie drugie wyrażenie pamięci podręcznej EGFP wykryto w ponad 70% dodatnich komórek Perkina wiążących krowy. Druga pamięć podręczna EGFP wypiera endogenną nesprinę z otoczki jądrowej poprzez nasycenie dostępnych domen słonecznych. W związku z tym endogenna NESIN dwa jest przemieszczana z otoczki jądrowej komórek Perkin wyrażających drugą pamięć podręczną EGFP.

Podczas gdy komórki Perkin, które nie wykazują ekspresji E-G-F-P-C dwa, zachowują endogenną nezynę dwa na otoczce jądrowej zgodnie z oczekiwaniami, kontrola interaktywuje, która nie wykazuje ekspresji rekombinazy CRE, wyświetla NESIN dwa w otoczce jądrowej całej populacji komórek bikini jeden. Tak więc bloki CT tkanek są dostępne. E-G-F-P-K dwa można zobrazować w ciągu około czterech godzin.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że stopień utrwalenia PFF i/lub warunki osadzenia mogą drastycznie wpłynąć na antygenowość epitopu. Dlatego bardzo ważne jest określenie optymalnych warunków utrwalania, które pozwolą zachować określony epitop. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać transgenicznego modelu myszy CK two do kierowania ekspresji nerkowców VGFP do określonych tkanek.