Name: Walidacja modelu mysiego w celu rozbicia kompleksów LINC w sposób specyficzny dla komórki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Poznaj model myszy transgenicznej do indukowalnej ekspresji EGFP-KASH2 w komórkach Purkinjego móżdżku. Ta metoda umożliwia badanie roli kompleksów LINC w pozycjonowaniu jądra komórkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują pracownikom Centrum Morfologii i Obrazowania, Centrum Genetyki Molekularnej (Wydział Okulistyki i Nauk Wizualnych) oraz Rdzenia Genetyki Myszy na Uniwersytecie Waszyngtońskim w St. Louis School of Medicine. Autorzy są wspierani przez program małych grantów z The McDonnell Center for Cellular and Molecular Neurobiology, Hope Center for Neurological Disorders, National Eye Institute (#R01EY022632 do D.H.), National Eye Institute Center Core Grant (#P30EY002687) oraz nieograniczony grant z Research to Prevent Blindness dla Wydziału Okulistyki i Nauk Wizualnych.

Oświadczenie etyczne: Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Waszyngtońskim w St. Louis.
1. Hodowla i genotypowanie myszy
<ol>
	<li>Hoduj myszy Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) z myszami Tg (PCP2-Cre) w celu wytworzenia Tg (PCP2CreCAG-EGFP / KASH2) 19,20. Uwaga: Podczas gdy pozostała część tego protokołu koncentruje się na wykorzystaniu linii myszy Tg (PCP2-Cre) w celu ograniczenia ekspresji EGFP-KASH2 do komórek Purkinjego w móżdżku, podobną procedurę można zastosować w przypadku każdej innej myszy Tg (Cre) (Figura 2A).</li>
	<li>Wykonaj genotypowanie w celu zidentyfikowania młodych posiadających zarówno transgeny EGFP, jak i Cre, jak opisano wcześniej 19.</li>
</ol>
2. Przygotowanie materiałów do sekcji i pobrania tkanek
<ol>
	<li>Przygotować 100 ml 30% sacharozy w PBS (30 g sacharozy/100 ml 1x PBS) i przechowywać w temperaturze -20°C. W dniu pobrania tkanek rozmrozić i załadować ~30-35 ml roztworu sacharozy do strzykawki o pojemności 35 ml do perfuzji przezsercowych.</li>
	<li>Przygotować 40 ml 4% PFA w PBS (10 ml 16% paraformaldehydu i 30 ml PBS). Załaduj ~30-35 ml 4% PFA do strzykawki o pojemności 35 ml do perfuzji przezsercowych.</li>
	<li>Wypełnić 10-centymetrową płytkę do hodowli tkankowej 10 ml PBS w celu wypreparowania tkanki.</li>
	<li>Przygotuj koktajl ketamina/ksylazyna składający się z 16 mg/ml ketaminy i 3 mg/ml ksylazyny.</li>
	<li>Do rozbioru przygotuj roztwór 70% etanolu.</li>
</ol>
3. Sekcja i pobieranie tkanek
<ol>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wstrzyknąć 500 μl koktajlu ketamina/ksylazyna na 25 gramów masy ciała i odczekać ~15 min. Alternatywnie można zastosować inną, zatwierdzoną przez instytucję metodę sedacji, która jest odpowiednia dla danego systemu biologicznego.</li>
	<li>Po uspokojeniu delikatnie uszczypnij tylną łapę, aby potwierdzić brak reakcji na ból, przypnij wszystkie łapy do styropianowej tacki grzbietową stroną myszy skierowaną w dół.</li>
	<li>Spryskaj brzuch 70% etanolem i wykonaj nacięcie od dolnej części brzucha do górnej części klatki piersiowej, aby uzyskać dostęp do serca.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku serca i włóż strzykawkę zawierającą 30% roztwór sacharozy do lewej komory serca.</li>
	<li>Roztworu należy ukrwić z szybkością ~2-5 ml na minutę. Po opróżnieniu wyjmij strzykawkę i powtórz czynność z 4% roztworem PFA.</li>
	<li>Odepnij mysz od styropianowej tacki i odetnij głowę, aby uzyskać dostęp do mózgu.</li>
	<li>Usuń skórę wokół głowy zwierzęcia za pomocą kleszczy i nożyczek. Zrób igłą otwór w tylnej części czaszki i ostrożnie usuń czaszkę nożyczkami i kleszczami preparacyjnymi.</li>
	<li>Gdy mózg będzie wyraźnie dostępny, użyj kleszczy, aby usunąć móżdżek i umieścić go w PBS. Przeciąć móżdżek w płaszczyźnie strzałkowej na pół za pomocą skalpela i przenieść do 30% roztworu sacharozy przez noc w temperaturze 4°C. Uwaga: Aby przygotować skrawki parafiny, należy utrwalić móżdżek przez noc w temperaturze 4°C w 4% PFA przed zatopieniem tkanki i sekcją.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie i cięcie tkanek
<ol>
	<li>Przygotuj zawiesinę z suchego lodu i 2-metylobutanu. Pozwól, aby temperatura kąpieli wyrównała się przez 5 minut.</li>
	<li>Napełnij kriomold związkiem OCT i umieść połowę przeciętego móżdżku w formie.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu preparacyjnego i kleszczy ustaw móżdżek tak, aby przecięta na pół powierzchnia (w pobliżu linii środkowej móżdżku) była skierowana do góry.</li>
	<li>Przenieś kriomold do zawiesiny suchego lodu na 5 minut, aż związek OCT utworzy stałą białą matrycę wokół próbki tkanki. Uwaga: W razie potrzeby zamrożoną próbkę można teraz przechowywać w temperaturze -20°C.</li>
	<li>Oznacz wstępnie obrobione szkiełka polilizynowe do pobierania skrawków tkanek i przygotuj kriostat zgodnie z instrukcjami producenta w celu pobrania 15 μm skrawków móżdżku. Aby zebrać sekcje, ostrożnie zetknij sekcję OCT ze stroną szkiełka pokrytą polilizyną. Aby zachować orientację sekcji, nie obracaj suwaka na tym etapie.</li>
	<li>Skrawki tkanek należy przechowywać w temperaturze -20°C do czasu przystąpienia do barwienia i obrazowania.</li>
</ol>
5. Barwienie i obrazowanie skrawków móżdżku
<ol>
	<li>Przed barwieniem tkanek należy przygotować następujące roztwory: 
	~50 ml PBS 
	~5-10 ml 4% PFA w PBS 
	~10-20 ml 0,5% Triton X-100, 10% surowicy osła w PBS</li>
	<li>Rozmrozić odcinki móżdżku. Co ważne, zminimalizuj ich ekspozycję na jakiekolwiek źródło ciągłego i intensywnego światła, aby zapobiec blaknięciu EGFP.</li>
	<li>Za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego narysuj prostokąt wokół odcinków tkanki.</li>
	<li>Po utrwaleniu skrawków 4% PFA przez 5 minut. Użyj wystarczającej ilości płynu, aby pokryć cały obszar wyznaczony przez barierę hydrofobową (zwykle ~500 μl). Za pomocą odkurzacza lub pipety usuń utrwalacz, zwracając szczególną uwagę, aby nie naruszyć skrawków tkanki.</li>
	<li>Za pomocą pipety delikatnie nałóż PBS na szkiełko, nie naruszając skrawków tkanki. Po 5 minutach użyj odkurzacza lub pipety, aby ostrożnie usunąć płyn. Powtórz płukanie PBS w sumie trzy razy.</li>
	<li>Za pomocą pipety ostrożnie nanieść odpowiednie rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych (3 μl przeciwciała Calbindin i/lub Nesprin2 na 900 μl roztworu) w 0,5% Triton X-100, 10% surowicy osła w PBS. Inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. 
	Uwaga: EGFP-KASH2 będzie widoczny pod bezpośrednią mikroskopią fluorescencyjną na zamrożonych skrawkach i nie jest konieczne stosowanie przeciwciała anty-EGFP. Jeśli jednak wycinki parafiny zostały przygotowane, obrazowanie EGFP-KASH2 wymaga immunodetekcji przeciwciałem anty-EGFP.</li>
	<li>Usunąć roztwór przeciwciał i trzykrotnie spłukać PBS.</li>
	<li>Przygotuj 1:1,000 rozcieńczeń przeciwciał drugorzędowych Alexa-Fluor w 0,5% Triton X-100, 10% surowicy osła w PBS i przechowuj w ciemności.</li>
	<li>Delikatnie usuń ostatnie płukanie PBS i nałóż wtórne rozcieńczenie przeciwciał na godzinę w ciemności.</li>
	<li>Usunąć wtórny roztwór przeciwciała, spłukać i umyć sekcję trzy razy. W razie potrzeby nałóż barwnik jądrowy, taki jak DAPI (~300nM), podczas pierwszej aplikacji PBS.</li>
	<li>Całkowicie usuń roztwór PBS z okolic tkanki i umieść ~5-7 μl podłoża montażowego na wycinku tkanki. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na chusteczce i odstaw na ~15-30 min w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Użyć mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w odpowiednie filtry, aby uwidocznić EGFP i wszelkie inne długości fal odpowiednie dla przeciwciał drugorzędowych użytych w krokach 5.8/5.9. W wycinkach móżdżku użyj obiektywu 20X, aby zobaczyć obrzeża jądrowe EGFP-KASH2.</li>
</ol>

<ol><li>Hutchison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins%3A+building+blocks+or+regulators+of+gene+expression%3F+Nature+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).</li>
<li>Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+lamins%3A+their+structure%2C+assembly%2C+and+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions.</a> Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).</li>
<li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm%3A+role+of+the+LINC+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).</li>
<li>Haque, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUN1+interacts+with+nuclear+lamin+A+and+cytoplasmic+nesprins+to+provide+a+physical+connection+between+the+nuclear+lamina+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton.</a> Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).</li>
<li>Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sun2+is+a+novel+mammalian+inner+nuclear+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein.</a> The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).</li>
<li>Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KASH+and+SUN+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">KASH and SUN proteins.</a> Current biology : CB. 21, R414-R415 (2011).</li>
<li>Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprins+LINC+the+nucleus+and+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton.</a> Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).</li>
<li>Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+and+dynein+at+the+nuclear+envelope+mediate+the+bidirectional+migrations+of+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei.</a> The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).</li>
<li>Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNC-83+is+a+nuclear-specific+cargo+adaptor+for+kinesin-1-mediated+nuclear+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration.</a> Development. 136, 2725-2733 (2009).</li>
<li>Padmakumar, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enaptin%2C+a+giant+actin-binding+protein%2C+is+an+element+of+the+nuclear+membrane+and+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton.</a> Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).</li>
<li>Roux, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin+4+is+an+outer+nuclear+membrane+protein+that+can+induce+kinesin-mediated+cell+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).</li>
<li>Wilhelmsen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+outer+nuclear+membrane+protein%2C+associates+with+the+cytoskeletal+linker+protein+plectin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin.</a> The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).</li>
<li>Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprins+anchor+kinesin-1+motors+to+the+nucleus+to+drive+nuclear+distribution+in+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells.</a> Development. 142, 218-228 (2015).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KASH+protein+Syne-2%2FNesprin-2+and+SUN+proteins+SUN1%2F2+mediate+nuclear+migration+during+mammalian+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development.</a> Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syne-1+and+Syne-2+play+crucial+roles+in+myonuclear+anchorage+and+motor+neuron+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation.</a> Development. 134, 901-908 (2007).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin+1+is+critical+for+nuclear+positioning+and+anchorage%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage.</a> Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).</li>
<li>Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+assembly+of+LINC+complexes+and+their+function+in+cellular+mechanical+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness.</a> Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUN1%2F2+and+Syne%2FNesprin-1%2F2+complexes+connect+centrosome+to+the+nucleus+during+neurogenesis+and+neuronal+migration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice.</a> Neuron. 64, 173-187 (2009).</li>
<li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+tissue-specific+disruption+of+LINC+complexes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo.</a> Genesis. 52, 359-365 (2014).</li>
<li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+Nesprin1+giant+devoid+of+KASH+domain+underlies+the+molecular+etiology+of+autosomal+recessive+cerebellar+ataxia+type+I%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I.</a> Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).</li>
<li>Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+mediate+the+positioning+of+cone+photoreceptor+nuclei+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina.</a> PloS one. 7, e47180(2012).</li>
<li>Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+linkers+of+the+nucleoskeleton+to+the+cytoskeleton+during+mouse+postnatal+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis.</a> Nucleus. 4, 399-409 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najważniejszym krokiem do pomyślnego zbadania roli kompleksów LINC in vivo przy użyciu modelu Tg(CAG-LacZ/EGFP-KASH2) jest zidentyfikowanie odpowiedniej linii (linii) myszy Cre. Rzeczywiście, jeśli Cre jest aktywny w innych typach komórek zaangażowanych w podobne szlaki, może to skomplikować interpretację wyników. Dlatego ważne jest, aby zbadać pobliskie komórki, jak pokazano tutaj w warstwach komórek molekularnych i ziarnistych móżdżku (ryc. 2B). Podobnie, aby zmaksymalizować wszelkie fizjologi...

Otoczka jądrowa (NE) oddziela nukleoplazmę od cytoplazmy. Składa się z wewnętrznej i zewnętrznej błony jądrowej (odpowiednio INM i ONM), które łączą się w porach jądrowych. Światło wyznaczone przez obie błony nazywane jest przestrzenią okołojądrową (PNS). ONM jest przedłużeniem szorstkiej retikulum endoplazmatycznego (ER), a INM przylega do blaszki jądrowej, siatki jądrowych włókien pośrednich typu V reprezentowanych przez blaszki typu A i B 1,2. Ogniwa kompleksów nukleoszkieletu i cytoszkieletu (LINC) to zespoły makromolekularne, które obejmują całą otoczkę jądrową, aby fizycznie połączyć wnętrze jądra z włóknami cytoszkieletu i silnikami molekularnymi (ryc. 1A). Składają się one z interakcji między ewolucyjnie zachowanymi motywami, które charakteryzują dwie rodziny integralnych białek transbłonowych NE: białka Słońca (Sad1/Unc84) i Nesprins (Nuclear Envelope SPectRINS). U ssaków Sun1 i Sun2 są transbłonowymi białkami INM, których N-końcowy region nukleoplazmatyczny oddziałuje bezpośrednio z laminami typu A i B 3-5. Po drugiej stronie INM, w obrębie PNS, białka słoneczne zawierają ewolucyjnie konserwatywny odcinek ~150 C-końcowych aminokwasów zwanych domeną SUN. Domeny SUN oddziałują bezpośrednio z ewolucyjnie zachowaną domeną KASH (Klarsicht/Anc-1, Syne Homology), molekularną sygnaturą Nesprins. Domeny KASH składają się z odcinka ~ 30 C-końcowych aminokwasów, które wystają do PNS, a następnie domeny transbłonowej 6. Co najmniej cztery odrębne geny Nesprin (Nesprin1-4) kodują białka zawierające KASH, które lokalizują się w NE 7. Regiony cytoplazmatyczne Nesprins, których rozmiary wahają się od ~50 kDa (Nesprin4) do zdumiewających 1000 kDa (gigant Nesprin1), zawierają wiele powtórzeń spektryny, a także specyficzne motywy umożliwiające ich interakcję ze składnikami cytoszkieletu, takimi jak aktyna, pektyna i silniki molekularne8-13.
Badania na kręgowcach i bezkręgowcach wykazały, że silniki Lamin/Sun/Nesprin/molekularne stanowią ewolucyjnie zachowaną "oś" kontrolującą migrację jądrową i zakotwiczenie. Opisano kilka mysich modeli knock-out (KO) składników kompleksu LINC, które odegrały zasadniczą rolę w zrozumieniu ról białek Sun i Nesprin w NE podczas rozwoju ssaków 9,14,15. Modele te mają jednak kilka istotnych wad, przede wszystkim: 1) trudności w interpretacji fenotypów z powodu nieautonomicznych efektów komórkowych, 2) trudności w rozróżnieniu fenotypowych wkładów izoform Nesprin zawierających KAS i bezKASH16, 3) funkcjonalna redundancja białek Sun i Nesprin w NE w wielu typach komórek wymaga złożonych schematów hodowlanych w celu dezaktywacji wszystkich interakcji SUN-KASH u myszy 17 oraz 4) letalność okołoporodowa myszy z niedoborem domeny KAS zarówno Nesprins1, jak i 2 wyklucza analizę dorosłych fenotypów 18.
Ten protokół opisuje nowatorski model myszy, zaprojektowany do zakłócania wszystkich interakcji SUN-KASH in vivo, w sposób autonomiczny i regulowany rozwojowo, omijając w ten sposób wiele wad opisanych powyżej. Ten mysi model oparty na Cre/lox opiera się na dwóch ważnych koncepcjach: 1) domena KASH dowolnego znanego białka Nesprin jest wystarczająca do kierowania EGFP na NE w systemach hodowli komórkowych oraz 2) domeny SUN oddziałują promiskuitywnie z domenami KASH, więc nadekspresja dowolnej domeny KASH nasyci wszystkie endogenne domeny SUN i dezaktywuje kompleksy LINC w sposób dominująco-ujemny 17 (Figura 1B). Protokół ten opisuje etapy pobierania i przetwarzania tkanek stosowane w celu potwierdzenia zakłócenia wszystkich interakcji SUN-KASH w komórkach Purkinjego móżdżku.

<table><tbody><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>16% roztwór paraformaldehydu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka adhezyjne</td><td>StatLab</td><td>M1000W</td><td></td></tr><tr><td>Serum dla osła</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>ImmuEdge Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-kalbindynowe</td><td>Przeciwciało anty-EGFP Sigma Aldrich</td><td>C9848</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-EGFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało</td><td></td><td></td> anty-Nesprin2 <td>Wcześniej opisane w ref. 21</td></tr><tr><td>Montaż fluorescencyjny Media</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>2-metylobutan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3551</td><td></td></tr></tbody></table>

walidacja modelu mysiego w celu rozbicia kompleksów linc w sposób specyficzny dla komórki

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Migracja jądrowa i zakotwiczenie w rozwijających się i dorosłych tkankach opiera się głównie na dużych makromolekularnych zespołach białkowych zwanych LInkers kompleksów nukleoszkieletu i cytoszkieletu (LINC). Te rusztowania białkowe obejmują otoczkę jądrową i łączą wnętrze jądra ze składnikami otaczającego cytoszkieletu cytoplazmatycznego. Kompleksy LINC składają się z dwóch ewolucyjnie konserwatywnych rodzin białek, białek Sun i Nesprins, które zawierają C-końcowe motywy sygnatury molekularnej zwane odpowiednio domenami SUN i KASH. Białka słoneczne są białkami transbłonowymi wewnętrznej błony jądrowej, których N-końcowa domena nukleoplazmatyczna oddziałuje z blaszką jądrową, podczas gdy ich C-końcowe domeny SUN wystają w przestrzeń okołojądrową i oddziałują z domeną KASH Nesprins. Kanoniczne izoformy Nesprin mają N-koniec o zmiennej wielkości, który wystaje do cytoplazmy i oddziałuje ze składnikami cytoszkieletu. Protokół ten opisuje walidację strategii myszy transgenicznej dominująco-ujemnej, która zakłóca endogenne interakcje SUN / KASH w sposób specyficzny dla typu komórki. Nasze podejście opiera się na systemie Cre/Lox, który omija wiele wad, takich jak letalność okołoporodowa i nieautonomiczne fenotypy komórek, które są związane z modelami linii zarodkowej inaktywacji kompleksu LINC. Z tego powodu model ten stanowi użyteczne narzędzie do zrozumienia roli kompleksów LINC podczas rozwoju i homeostazy w szerokim zakresie tkanek.

Niniejszy protokół ilustruje użyteczność modelu mysiego Tg(CAG-LacZ/EGFP-KASH2) w celu ograniczenia ekspresji EGFP-KASH2 do komórek Purkinjego w móżdżku przy użyciu myszy Tg(PCP2-Cre). U potomstwa Tg(PCP2CreCAG-EGFP/KASH2) otwarta ramka odczytu LacZ/V5 zostaje wycięta w dniu P6 przez rekombinazę Cre, co prowadzi do ekspresji EGFP-KASH2 ukierunkowanej specyficznie na komórki Purkinjego (Ryc. 2A). Zgodnie z oczekiwaniami, EGFP-KASH2 jest kierowane do otoczki jądrowej, co potwierdza obserwowany w...

Białka otoczki jądrowej odgrywają kluczową rolę w wielu podstawowych procesach biologicznych i są związane z różnymi chorobami ludzkimi. Protokół ten opisuje nowy model myszy oparty na Cre/Lox, który pozwala na czasoprzestrzenną kontrolę zakłóceń kompleksów LINC.

Walidacja modelu mysiego w celu rozbicia kompleksów LINC w sposób specyficzny dla komórki

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest zilustrowanie użyteczności transgenicznego modelu mysiego, który umożliwia indukowalną i celowaną ekspresję znakowanego fluorescencyjnie EGFP cache two peptide in vivo oraz wynikającą z tego perturbację endogennych kompleksów link. W tym eksperymencie ekspresja znakowanego fluorescencyjnie cache two zostanie skierowana do komórek Purkinjego w móżdżku. To podejście genetyczne pozwala na rozstrzygnięcie kluczowych pytań dotyczących roli kompleksów link w pozycjonowaniu jądra w różnych tkankach mysich.Indukowalna i celowana ekspresja E-G-F-P-K dwa oferuje kilka zalet. Po pierwsze, wymaga ona jedynie jednego schematu krzyżowania myszy cay z dowolną istniejącą linią cruise. Po drugie, podejście to pozwala uniknąć śmiertelności okołoporodowej obserwowanej w modelach mysich z mutacjami w linii zarodkowej komponentów kompleksu link.Wreszcie, metoda ta pozwala na badanie fizjologii kompleksów łączących w konkretnych komórkach lub tkankach in vivo. Chloe Potter, członkini laboratorium, zaprezentuje poszczególne kroki niezbędne do wizualizacji E-G-F-P-K two w komórkach Purkinjego móżdżku.Aby rozpocząć, należy skrzyżować myszy clac Z z myszami PCP two CRE, aby uzyskać myszy PCP two CAG C two, zgodnie z opisem w poprzednich publikacjach. Po narodzinach potomstwa należy przeprowadzić genotypowanie. Aby zidentyfikować osobniki posiadające transgeny EGFP i Cree, zgodnie z wcześniejszym opisem, należy przygotować 50 ml 30% roztworu sacharozy w PBS i przechowywać go w temperaturze -20 °C do dnia pobrania tkanek. Po osiągnięciu odpowiedniego wieku należy przeprowadzić transkardialną perfuzję myszy w znieczuleniu w celu przygotowania tkanki mózgowej do sekcji, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Wypreparowany mózg należy umieścić w 10 cm płytce hodowlanej z 10 ml PBS i oddzielić móżdżek od mózgowia.Następnie za pomocą skalpela wykonaj cięcie móżdżku w płaszczyźnie strzałkowej, a otrzymane przekroje przenieś do 30% roztworu sacharozy i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsius overnight. Przygotuj zawiesinę z suchego lodu i 2-metylobutanu. Pozostaw kąpiel na pięć minut w celu wyrównania temperatury.Następnie wypełnij formę do mrożenia związkiem OCT i za pomocą mikroskopu sekcyjnego oraz pęsety umieść w formie połowę wypreparowanego móżdżku. Ustaw móżdżek tak, aby powierzchnia przecięcia znajdująca się w pobliżu linii środkowej móżdżku była skierowana ku górze w formie. Następnie przenieś formę do suchej zawiesiny chłodzącej na pięć minut, aż związek OCT utworzy wokół preparatu tkankowego stałą białą macierz.Przechowywać zatopioną próbkę w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Oznakować wstępnie potraktowane polilizyną szkiełka do zbierania przekrojów tkankowych i zamocować blok tkanek móżdżku w uchwycie do tkanek, używając świeżego OCT. Po stabilnym przymocowaniu bloku, zamontować uchwyt do tkanek i ścinać plastry o grubości 40 µm, aby usunąć nadmiar OCT, aż do momentu dotarcia do tkanki.Ustaw grubość na 15 µm i zbierz skrawki, ostrożnie przykładając skrawek OCT do strony slajdu pokrytej polilizyną. Przechowuj skrawki tkanki w temperaturze -20 °C do momentu przystąpienia do barwienia i obrazowania. Po przygotowaniu do dalszych etapów rozmroź skrawki móżdżku w ciemności, aby zapobiec blaknięciu białek fluorescencyjnych.Używając pisaka do tworzenia barier hydrofobowych, narysuj prostokąt wokół obwodu skrawków tkanek. Dodaj około 500 µL 4% paraformaldehydu do skrawków na pięć minut, aby utrwalić tkankę. Następnie odessij utrwalacz za pomocą pompy próżniowej, zachowując szczególną ostrożność, aby nie naruszyć skrawków tkanek pipetą.Ostrożnie nanieś PBS na szkiełko, aby nie naruszyć skrawków tkanki. Po pięciu minutach użyj pipety próżniowej, aby starannie usunąć płyn, a następnie powtórz płukanie PBS łącznie trzy razy. Następnie dodaj na szkiełka około 500 µL roztworu blokującego i inkubuj je przez 10 minut.Usunąć roztwór blokujący, a następnie zastąpić go tym samym roztworem zawierającym rozcieńczenie od 1:1 do 1:300 przeciwciał przeciwko calbindingowi lub nesinowi 2. Następnie usunąć roztwór przeciwciał i wypłukać preparaty trzykrotnie w PBS. Inkubować preparaty przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.Następnie przygotować rozcieńczenie 1:1000 przeciwciał anty-US Alexa Fluor 594 dla slajdów z oznakowaniem wiązania cow oraz przeciwciał anty Alexa Fluor 594 dla slajdów z oznakowaniem Nesprin 2 w roztworze blokującym i przechowywać roztwory w ciemności do momentu ich użycia. Ostrożnie usunąć końcowy płukanie PBS i przykryć skrawki rozcieńczonymi przeciwciałami wtórnymi na jedną godzinę w ciemności. Po inkubacji usunąć roztwór przeciwciał wtórnych.Następnie zastosuj barwienie jąder, np. przy użyciu DPI w stężeniu 300 nanomolar w PBS przez pięć minut. Po tym czasie przepłucz przekroje jeszcze dwukrotnie w PBS. Usuń jak największą ilość roztworu PBS i zakryj przekrój tkanki jedną kroplą medium montażowego.Na przekrój tkanki nałożyć szkiełko nakrywkowe, unikając powstania pęcherzyków powietrza, i odstawić na 15 do 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie, używając mikroskopu fluorescencyjnego, zwizualizować barwienie przeciwciałami oraz białka fluorescencyjne. W przypadku skrawków móżdżku należy użyć obiektywu 20 x lub 40 x.Aby zaobserwować dwa obwody jądrowe E-G-F-P-C two, tak jak pokazano tutaj, można bezpośrednio zwizualizować E-G-F-P-C two w skrawkach móżdżku w kanale Fitzy. Ponadto kolokalizacja EGFP z wiązaniem krowim, które specyficznie znakuje komórki Perkina, potwierdza, że ekspresja E-G-F-P-C two jest ograniczona do komórek Perkina w obrębie komórek Perkina. EGFP cache two jest skierowane do otoczki jądrowej, co wskazują obserwowane wokół jądra wzorce przypominające obwód dodatnie dla EGFP.W tym przykładzie ekspresję EGFP cache two wykryto w ponad 70% komórek Perkin dodatnich pod względem wiązania cow. EGFP cache two wypiera endogenną nesprynę z otoczki jądrowej poprzez nasycenie dostępnych domen sun. W związku z tym endogenna NESIN two jest wypierana z otoczki jądrowej komórek Perkin wykazujących ekspresję EGFP cache two.Podczas gdy komórki Perkin, które nie wykazują ekspresji E-G-F-P-C two, zachowują endogenną nesynę two w otoczce jądrowej zgodnie z oczekiwaną kontrolą wewnętrzną, komórki, które nie wykazują ekspresji rekombinazy CRE, wykazują obecność NESIN two w otoczce jądrowej w całej populacji komórek bikini One. Zatem dostępne są bloki tkanek CT. E-G-F-P-K two można zwizualizować w ciągu około czterech godzin.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że stopień utrwalania PFF oraz warunki zatapiania mogą drastycznie wpływać na antygenowość badanego epitopu. Dlatego bardzo ważne jest określenie optymalnych warunków utrwalania, które zachowają specyficzny epitop. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania transgenicznego modelu mysiego CK two w celu ukierunkowania ekspresji VGFP cashew na konkretne tkanki.

validation-mouse-model-to-disrupt-linc-complexes-cell-specific

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje procedurę nokautu genu docelowego za pomocą systemu rekombinazy Cre indukowanego tamoksyfenem po dootrzewnowym wstrzyknięciu tamoksyfenu w modelu mysim.

Inaktywacja genu docelowego oparta na systemie CreER-LoxP: indukowany tamoksyfenem system rekombinazy Cre do docelowego nokautu genu w modelu mysim

Ten film przedstawia generowanie ogniskowego modelu myszy demielinizacji przy użyciu dwupunktowego wstrzyknięcia lizofosfatydylocholiny (LPC). Czaszka znieczulonej myszy jest odsłonięta. Określane są współrzędne iniekcji i wiercony jest otwór, aby umożliwić wstrzyknięcia LPC w docelowych miejscach. LPC indukuje ogniskową demielinizację neuronów poprzez stan zapalny, podczas gdy dwupunktowe wstrzyknięcie zapewnia jego trwałość.

Ustalenie ogniskowego modelu myszy demielinizacji poprzez dwupunktowe wstrzyknięcie lizofosfatydylocholiny

MikroRNA odgrywają znaczącą rolę w strukturze i funkcjonowaniu mózgu. Tutaj opisujemy metodę wymuszania nadmiernej ekspresji miRNA w hipokampie za pomocą stereotaktycznego wstrzykiwania zmodyfikowanego lentiwirusa wykazującego ekspresję miRNA. Podejście to może służyć jako stosunkowo szybki sposób oceny skutków in vivo nadmiernej ekspresji miRNA w określonych regionach mózgu.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusów eksprymujących mikroRNA do regionu CA1 hipokampa myszy i ocena wyniku behawioralnego

Wektory wirusowe pozwalają na celową manipulację genami. Demonstrujemy metodę warunkowej ekspresji genów lub ablacji w rdzeniu kręgowym myszy, wykorzystując stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego do rogu grzbietowego, widocznego miejsca kontaktu synaptycznego między pierwotnymi aferentami somatosensorycznymi a neuronami ośrodkowego układu nerwowego.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego w celu warunkowej manipulacji genami w rdzeniu kręgowym myszy

Tutaj opisujemy test mutagenezy in vivo dla małej liczby oczyszczonych komórek krwiotwórczych przy użyciu transgenicznego modelu myszy LacI. Gen LacI może być wyizolowany w celu określenia częstotliwości, lokalizacji i rodzaju mutantów DNA spontanicznie powstałych lub po ekspozycji na genotoksyny.

Identyfikacja mutacji DNA w oczyszczonych hematopoetycznych komórkach macierzystych/progenitorowych

Designerskie nukleazy, takie jak nukleazy palców cynkowych (ZFN) i aktywatory transkrypcji podobne do efektorów (TALENs) mogą być używane do modyfikacji genomu mysich zarodków preimplantacyjnych poprzez aktywowanie zarówno szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), jak i homologicznej rekombinacji (HR). Postępy te umożliwiają szybkie generowanie myszy z precyzyjnymi modyfikacjami genetycznymi.

Inżynieria genomu myszy przy użyciu nukleaz projektanta

Tutaj opisujemy procedurę opartą na wykorzystaniu cząsteczek lentiwirusowych do długoterminowej modyfikacji genetycznej nerwowych komórek macierzystych i/lub ich sąsiadujących komórek wyściółkowych w dorosłej komorowo-podkomorowej niszy neurogennej, która pozwala na oddzielną analizę autonomicznych i nieautonomicznych, zależnych od niszy efektów na neuronalne komórki macierzyste.

Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych

Autonomiczne funkcje genów w mózgu mogą być badane poprzez wywoływanie utraty lub utraty funkcji w rzadkich populacjach komórek. Tutaj opisujemy elektroporację in utero w celu dostarczenia rekombinazy Cre do rzadkich populacji rozwijających się neuronów korowych z floksowanymi genami, aby spowodować utratę funkcji in vivo.

Indukowanie rekombinacji Cre-lox w korze mózgowej myszy poprzez elektroporację in utero

W miarę jak warianty genetyczne związane z chorobami ludzkimi zaczynają być odkrywane, coraz ważniejsze staje się opracowanie systemów, za pomocą których można szybko ocenić biologiczne znaczenie tych zidentyfikowanych wariantów. Protokół ten opisuje metody oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy żeńskiej I przy użyciu mysich oocytów.

Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I

Tutaj opisujemy protokół generowania realnego modelu samicy mysiej z nielosową inaktywacją chromosomu X, tzn. chromosom X odziedziczony po matce jest nieaktywny w 100% komórek. Opisujemy również protokół testowania wykonalności, tolerancji i bezpieczeństwa farmakologicznej reaktywacji nieaktywnego chromosomu X in vivo.

Nielosowy mysi model do farmakologicznej reaktywacji Mecp2 na nieaktywnym chromosomie X

Ten protokół opisuje mikroiniekcję i elektroporację in vivo dla regionalnie ograniczonej edycji genomu za pośrednictwem CRISPR w jajowodzie myszy.

Somatyczne modele myszy z inżynierią genomu przy użyciu mikroiniekcji in vivo i elektroporacji

Poznaj model myszy transgenicznej do indukowalnej ekspresji EGFP-KASH2 w komórkach Purkinjego móżdżku. Ta metoda umożliwia badanie roli kompleksów LINC w pozycjonowaniu jądra komórkowego.

Walidacja modelu mysiego w celu rozbicia kompleksów LINC w sposób specyficzny dla komórki

Przeglądaj więcej filmów