Hodowla i różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych

Embrionalne komórki macierzyste, czyli komórki ES, mają szereg unikalnych właściwości, które odróżniają je od zwykłych komórek dorosłych. Dlatego naukowcy opracowali specjalne techniki hodowli, aby utrzymać lub wykorzystać te właściwości. Przy prawidłowej hodowli komórki ES mogą dzielić się w nieskończoność, aby zrobić więcej z siebie. W tym samym czasie, zmieniając warunki hodowli, komórki ES mogą być kierowane do różnicowania się w prawie każdy typ komórek występujący w naszym ciele; ta zdolność komórek ES nazywana jest "pluripotencją".

W tym filmie dowiesz się, jak hodować i pasażować komórki ES, aby zachowały swoje unikalne właściwości, jak indukować różnicowanie w komórkach ES w celu utworzenia określonych typów komórek oraz w jaki sposób techniki hodowli i różnicowania komórek ES są obecnie wykorzystywane i udoskonalane przez naukowców.

Zanim przejdziemy do szczegółów procedur utrzymania komórek ES, ważne jest, aby najpierw zrozumieć, co zapobiega lub napędza różnicowanie komórek ES. Aby komórki ES zachowały swoje unikalne właściwości pluripotencji i samoodnowy, muszą być hodowane z określonymi czynnikami w pożywce wzrostowej, które hamują spontaniczne różnicowanie.

Najczęściej odbywa się to poprzez hodowlę komórek ES na warstwie "karmników", zwykle mysich fibroblastów embrionalnych lub MEF. Komórki karmiące "karmią" komórki ES pewnymi czynnikami, takimi jak aktywina A, które pomagają utrzymać komórki ES w ich niezróżnicowanym stanie.

Ostatnio naukowcy opracowali również metody hodowli bez karmienia, w których komórki ES są hodowane w pożywkach z niezbędnymi czynnikami dodanymi do określonej receptury. Takie podejście zmniejsza zmienność i usuwa składnik nieludzki z hodowli komórek ES, co jest warunkiem wstępnym dla zastosowań klinicznych.

Inną cechą charakterystyczną komórek ES jest to, że naturalnie rosną one w skupiskach lub koloniach i mają tendencję do niskiego wskaźnika przeżycia, gdy są dysocjowane na pojedyncze komórki, zwłaszcza ludzkie komórki ES. W rezultacie, pasażowanie ludzkich komórek ES na ogół wymaga utrzymania ich w nienaruszonych grudkach poprzez mechaniczne "wybieranie".

Kiedy komórki ES są hodowane w warunkach nieprzylegających, tworzą agregaty 3D znane jako ciała embrionoidalne lub EB, w których komórki ES różnicują się w różne typy komórek. Zmieniając warunki różnicowania, takie jak dodawanie określonych czynników wzrostu do pożywki, naukowcy opracowują metody kierowania różnicowania komórek ES na określone typy komórek.

Teraz, gdy rozumiesz zasady utrzymania i różnicowania komórek ES, przyjrzyjmy się, jak hodować i pasażować komórki ES na karmnikach MEF.

MEF są pozyskiwane z zarodków myszy we wczesnym stadium rozwoju, a następnie są inaktywowane przez chemikalia lub promieniowanie, aby zapobiec ich dalszemu podziałowi. Inaktywowane MEF-y należy rozsiać na zżelatynizowanych szalkach do hodowli tkankowych co najmniej jeden dzień przed rozpoczęciem hodowli komórek ES. Gdy karmniki są w pełni osadzone, komórki ES są rozmrażane i wysiewane na płytki.

W ciągu najbliższych kilku dni komórki ES wyrosną na duże kolonie. Zanim kolonie zaczną się stykać i łączyć, kultura ES powinna zostać pasażowana. Należy obserwować morfologię komórek ES, aby sprawdzić, czy wykazują oznaki różnicowania. Niezróżnicowane kolonie ES na ogół wyglądają na dobrze zdefiniowane i jednorodne, podczas gdy zróżnicowane komórki wyglądałyby jak matowa, nieregularna "kostka brukowa".

Jeśli kolonie wykazują 70% lub więcej zróżnicowania lub jeśli są rzadkie, mechanicznie wytnij niezróżnicowane kolonie i przenieś je na nową płytkę podającą. W przeciwnym razie po prostu usuń zróżnicowane obszary lub kolonie i kontynuuj przechodzenie.

Po oczyszczeniu zróżnicowanych kolonii dodaje się enzymy proteolityczne, takie jak kolagenaza, w celu wyjęcia komórek z płytki z inkubacją w temperaturze 37°C przez odpowiedni czas. Następnie dodaje się świeże pożywki ES w celu zatrzymania reakcji enzymatycznych. Kolonie są mechanicznie usuwane z płytki i przenoszone do probówki wirówkowej, gdzie są rozbijane na pożądane rozmiary za pomocą delikatnego pipetowania. Komórki ES są zbierane przez wirowanie, ponownie zawieszane w pożywce ES i platerowane na przygotowanych płytkach podających.

Po nauczeniu się, jak pasować komórki ES, przyjrzyjmy się jednej z bardziej powszechnych technik stosowanych do różnicowania komórek ES w ciała embrionalne - metodzie wiszącej kropli.

Na początek komórki ES są odłączane za pomocą enzymów proteolitycznych, takich jak kolagenaza, i rozcieńczane do pożądanego stężenia w pożywkach zawierających czynniki różnicujące specyficzne dla linii. Zawiesina komórek ES jest następnie umieszczana w kroplach na pokrywie bakteryjnej szalki Petriego. Pokrywka jest szybko odwracana i umieszczana na naczyniu, dzięki czemu krople pożywki zwisają do góry nogami i umożliwiają rozwój ciał zarodkowych.

Po około dwóch dniach krople z EB można zebrać i posiać na nieprzylegających płytkach w celu dalszej hodowli. W odpowiednim punkcie czasowym dla pożądanej linii komórkowej, ciała zarodków są posiewane z powrotem na żelatynizowanych przylegających szalkach do hodowli tkanek w celu dalszego różnicowania.

Teraz, gdy omówiliśmy podstawowe techniki hodowli i różnicowania komórek ES, przyjrzyjmy się, w jaki sposób są one dostosowane do konkretnych potrzeb eksperymentalnych.

Jak wspomniano wcześniej, komórki ES mogą być kierowane do różnicowania się w określone typy komórek w różnych warunkach hodowli. W tym eksperymencie naukowcy wyprodukowali neurony ruchowe z ludzkich komórek ES. Dokonano tego najpierw poprzez dodanie czynników do różnicujących się ciał embrionalnych, które kierują je w kierunku linii neuronalnej, a następnie substancji chemicznych i warunków posiewu, które przekształcają te komórki w neurony ruchowe. Stosując podobne metody, naukowcom udało się zróżnicować komórki ES w rytmicznie bijące komórki mięśnia sercowego.

Ponieważ różnicujące się komórki ES naśladują zdarzenia, które zachodzą w miarę naturalnego rozwoju zarodków, możemy je również wykorzystać do badania biologii wczesnego rozwoju embrionalnego. Jednym z badanych zjawisk jest inaktywacja chromosomu X lub XCI, kluczowy proces, w którym jeden z dwóch chromosomów X jest wyciszany w każdej komórce samicy ssaka. Wizualizując rozkład określonych RNA i białek w rozwijających się EB, naukowcy uzyskali cenne informacje na temat biologii XCI.

Wreszcie, aby zwiększyć spójność i wydajność eksperymentów z komórkami ES, naukowcy nieustannie starają się opracować lepsze techniki hodowli komórek ES. Jednym z podejść jest hodowanie komórek ES w jednej warstwie, co nazywa się hodowlą jednowarstwową bez kolonii lub NCM.

Pamiętasz, że ludzkie komórki ES są zwykle nieszczęśliwe, gdy nie rosną jako agregaty 3D? Naukowcy wykazali, że substancje chemiczne znane jako inhibitory ROCK zwiększają przeżywalność zdysocjowanych komórek ES, co pozwala im na pasażowanie w postaci zawiesin jednokomórkowych i powlekanie ich w dużej gęstości. Zaletą techniki NCM jest to, że każda komórka będzie bardziej równomiernie narażona na czynniki wzrostu i składniki odżywcze w pożywce, zmniejszając niejednorodność w hodowli, jednocześnie ułatwiając hodowlę komórek ES w dużych ilościach.

Właśnie obejrzałeś film JoVE o tym, jak hodować i różnicować embrionalne komórki macierzyste. Powinieneś teraz wiedzieć, jakie czynniki są ważne dla utrzymania komórek ES w ich niezróżnicowanym stanie i jak możemy wykorzystać pluripotencję komórek ES do generowania określonych typów komórek w naczyniu. W przyszłości naukowcy będą pracować nad opracowaniem bardziej wydajnych i dobrze zdefiniowanych warunków hodowli i różnicowania w celu wytworzenia wyspecjalizowanych typów komórek, które można wykorzystać w medycynie regeneracyjnej. Dzięki za oglądanie!