Ocena przerzutów do płuc w modelach guza sutka myszy za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie ilości specyficznego MRNA z komórek nowotworowych w płucach, jako metoda analizy przerzutów. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to ilościowa miara przerzutów. Aby przeprowadzić sekcję guza płuca, po eutanazji myszy przy użyciu śmiertelnej dawki izofluoru zgodnie z protokołem tekstowym, umieść mysz na piankowej desce na plecach z rozłożonymi kończynami i użyj szpilek preparacyjnych, aby przymocować ją do deski.

Po użyciu etanolu do spryskania myszy, użyj kleszczy, aby chwycić dolną część zwierzęcia pośrodku, a nożyczkami przetnij w górę w kierunku szyi przez skórę, uważając, aby nie przebić jamy otrzewnej myszy. Teraz chwyć otrzewną na dolnym końcu zwierzęcia i zacznij ciąć w górę w kierunku podstawy szyi. Ostrożnie przeciąć wzdłuż lewej i prawej strony klatki piersiowej, uważając, aby nie przeciąć żadnych naczyń krwionośnych, które mogą krwawić do klatki piersiowej.

Usuń kości żeber, przecinając w lewo i w prawo, przez przeponę i górną część klatki piersiowej. Następnie za pomocą kleszczy chwyć tchawicę myszy i pociągnij do przodu, a następnie użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć tchawicę przed usunięciem płuc myszy. Użyj PBS, aby delikatnie umyć tkankę płucną.

Następnie, po ogólnej ocenie tkanki płucnej zgodnie z protokołem tekstowym, jeśli płuca mają być natychmiast przeanalizowane, przystąp do izolacji RNA. Aby wyizolować RNA z tkanki, zacznij od homogenizacji tkanki przy użyciu jednej z metod wymienionych w protokole tekstowym. Przygotuj bufor do lizy z zestawu do izolacji RNA i dodaj 20 mikrolitrów kaptoetanolu guza do każdego mililitra buforu do lizy.

Ponownie zawiesić każde 30 gramów tkanki w 300 mikrolitrach buforu do lizy, a za pomocą sonikatora ustawionego na 30% amplitudy, sonikować tkankę przez 10 sekund. Dodać 10 mikrolitrów protynazy K do 590 mikrolitrów buforu TE i dodać 600 mikrolitrów buforu do 300 mikrolitrów sonikowanej tkanki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Następnie odwirować próbki z prędkością większą lub równą 13 000 razy G przez 10 minut, aby usunąć zanieczyszczenia. Następnie przenieść supernatant do nowych probówek. Dodaj 450 mikrolitrów etanolu do każdych 900 mikrolitrów supernatantu, aby wytrącić RNA.

Następnie przenieś 700 mikrolitrów mieszaniny etanolu lizatu do kolumny RNA. Wiruj ponownie z prędkością większą lub równą 13 000 razy G przez jedną minutę, aby związać RNA z kolumną. Następnie wyrzuć odpady płynne i dodaj pozostały supernatant do kolumny i ponownie odwiruj.

Następnie dodaj 350 mikrolitrów pierwszego buforu do przemywania do górnej części kolumny i odwiruj próbki przez 30 sekund. Wyrzuć odpady płynne i wymień kolumnę w rurze. Przygotuj DNazę, mieszając pięć jednostek DNazy, jednego enzymu z pięcioma mikrolitrami 10-krotnego buforu DNazy i 40 mikrolitrami wody wolnej od RNazy DNazy na każdą próbkę.

Dodaj 50 mikrolitrów mieszanki DNazy do każdej kolumny i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie dodać 350 mikrolitrów pierwszego buforu płuczącego do kolumn i odwirowywać próbki przez 30 sekund. Po wyrzuceniu roztworu odpadowego dodaj 600 mikrolitrów buforu do płukania dwa i wiruj przez dodatkowe 30 sekund.

Wylej płyn przed dodaniem 250 mikrolitrów buforu do płukania dwa, a następnie wiruj przez dwie minuty. Przenieś kolumnę do nowej probówki zbiorczej i dodaj do kolumny od 50 do 100 mikrolitrów wody wolnej od RNaz DNazy. Po jednej minucie inkubacji wirować przez minutę.

Ponownie przepuść zebrany eluat przez kolumnę, aby zwiększyć wydajność RNA. W celu natychmiastowego użycia próbki należy przechowywać na lodzie. Do późniejszego użycia zamroź błyskawicznie na suchym lodzie lub ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie potrzebny.

Za pomocą spektrofotometru określ ilościowo RNA. Następnie, w sterylnych probówkach lub płytkach PCR wolnych od RNazy, użyj 0,5 do 2 mikrogramów całkowitego RNA do przygotowania mieszaniny reakcyjnej do pierwszej transsyntezy, jak pokazano w tej tabeli. Wymieszaj i delikatnie odwiruj, a następnie zaprogramuj standardową maszynę do PCR za pomocą programu pokazanego tutaj.

Po zakończeniu reakcji użyj sterylnej, wolnej od nukleaz wody, aby rozcieńczyć gotową reakcję do pożądanej objętości. Aby przeprowadzić PCR w czasie rzeczywistym, użyj dodatniego kontrolnego DNA C, takiego jak ludzki HER2, aby ustawić krzywą wzorcową dla każdego zestawu starterów, przygotowując od jednego do czterech seryjnych rozcieńczeń DNA C w celu wygenerowania pięciu wzorców. Następnie oblicz liczbę wszystkich próbek, która powinna obejmować krzywą standardową i próbki eksperymentalne.

Następnie, w sterylnych probówkach wolnych od RNaz DNazy, przygotuj mieszankę wzorcową dla każdego eksperymentalnego genu będącego przedmiotem zainteresowania, a także kontrolę wewnętrzną, taką jak gapdh. Przygotować płytkę testową zawierającą jeden mikrolitr C DNazy dla każdej próbki wzorcowej lub doświadczalnej. Przydziel co najmniej jedną próbkę DNA C na studzienkę dla każdej sondy starterowej.

Dodaj 19 mikrolitrów mastermixu na dołek dla każdej sondy startera. Ten eksperyment bioluminescencyjny pokazuje, że płuca myszy leczone ACT1, który jest ukierunkowany na białko połączenia szczelinowego Connexin 43, wydają się ujemne pod względem aktywności lucyferazy, co sugeruje brak komórek nowotworowych w tkance. Jednak analiza skrawków H&E tkanki płucnej pokazuje mikroprzerzuty, które nie zostały oświetlone przez lucyferazę, co sugeruje, że obrazowanie lucyferazy nie jest wystarczająco czułe, aby wykryć małą liczbę komórek nowotworowych.

Pokazano tutaj wyniki eksperymentu qRT-PCR, przy użyciu sondy specyficznej dla HER2, w celu wykrycia ludzkich komórek nowotworowych HER2 i JIMT1 w tkance płucnej z komórek pierwotnie przeszczepionych do mysiej poduszki tłuszczowej pamięci. Chociaż nie zaobserwowano rażąco widocznych przerzutów do żadnego z płuc, w dwóch z 11 próbek qRT-PCR wykrył przerzuty. Na tym rysunku przygotowano analizę krzywej standardowej w celu określenia względnych poziomów HER2 znormalizowanych do luki w płucach myszy w serii liczb komórek.

Wyniki wskazują, że qRT-PCR, przy użyciu sondy HER2, był wystarczająco czuły, aby wykryć poziomy HER2 w zaledwie 10 komórkach. Wreszcie, ta analiza regresji pokazuje względną liczbę komórek w każdej próbce płuc, w tym w kontrolach pozytywnych i ujemnych. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu sześciu do ośmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zachowaniu środków ostrożności w celu zachowania integralności RNA podczas izolacji RNA i reakcji odwrotnej transkryptazy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykrywać przerzuty w całej tkance płucnej za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym.