Name: Ocena przerzutów do płuc w modelach guza sutka myszy za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Poznaj ilościowy PCR w czasie rzeczywistym do oceny przerzutów guza sutka w płucach myszy. Ta metoda pozwala wykryć nawet 10 komórek nowotworowych i precyzyjnie zmierzyć poziom mRNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratorium Yeh jest wspierane przez finansowanie badań z grantu American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG-97-219-14) przyznanego Hollings Cancer Center w MUSC, przez finansowanie badań z grantu Departamentu Obrony (W81XWH-11-2-0229) w MUSC, oraz przez nagrodę od Concern Foundation (dla ESY).

Protokół jest zgodny z wytycznymi i standardami opieki nad zwierzętami Uniwersytetu Medycznego Karoliny Południowej (MUSC) i jego Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC).
1. Rozwarstwienie płuc
<ol>
	<li>Rozwarstwienie guza sutka (opcjonalne w zależności od celów badania i tego, czy przeprowadzono pierwotną analizę guza, czy wstrzyknięcie żyły ogonowej).
	<ol>
		<li>Eutanazja myszy przy użyciu śmiertelnej dawki znieczulenia izofluranem zgodnie z IACUC i przepisami uniwersyteckimi. Potwierdź eutanazję przez chirurgiczne zwichnięcie. </li>
		<li>Na płycie piankowej przypiąć szpilki z kołkami preparacyjnymi, kładąc mysz na grzbiecie z rozłożonymi kończynami.</li>
		<li>Spryskaj mysz 70% etanolem.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy chwyć dolną część zwierzęcia pośrodku.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek przetnij w górę w kierunku szyi przez skórę, uważając, aby nie przebić jamy otrzewnej myszy.</li>
		<li>Odetnij skórę na kończynach, aby odsłonić tkankę nowotworową.</li>
		<li>Wypreparuj tkankę nowotworową i zachowaj preferowaną metodą, taką jak zamrażanie lub utrwalanie, do dalszej analizy (nie omówione dalej w tym protokole). </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwarstwienie tkanki płucnej.
	<ol>
		<li>Jeśli tkanka nowotworowa została pobrana zgodnie z powyższym opisem, przypnij nadmiar skóry.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy chwyć otrzewną na dolnym końcu zwierzęcia i zacznij ciąć w górę w kierunku podstawy szyi.</li>
		<li>Ostrożnie przeciąć wzdłuż lewej i prawej strony klatki piersiowej, uważając, aby nie przeciąć naczyń krwionośnych, które mogą krwawić do klatki piersiowej. Usuń kości żeber, przecinając w lewo i w prawo przeponę i górną część klatki piersiowej.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy chwyć tchawicę myszy i pociągnij do przodu.</li>
		<li>Odetnij tchawicę nożyczkami preparacyjnymi i usuń płuca myszy. 
		Uwaga: Serce może pozostać przyczepione do płuca. Jeśli tak się stanie, ostrożnie wypreparuj serce z dala od płuc, uważając, aby zebrać wszystkie pięć płatów (patrz ryc. 1).</li>
		<li>Delikatnie przemyć PBS, aby usunąć nadmiar krwi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ogólna ocena tkanki płucnej.
	<ol>
		<li>Opcja 1: Obrazowanie in vivo.
		<ol>
			<li>W przypadku obrazowania lucyferazy, ~ 10 minut przed obrazowaniem, podaj zwierzętom dawkę 150 mg / kg lucyferyny we wstrzyknięciu dootrzewnowym (i.p.). Obraz płuc in vivo u znieczulonych zwierząt lub po usunięciu po sekcji (ryc. 2) 5.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Opcja 2: Ocena brutto.
		<ol>
			<li>Zbadaj płuca pod mikroskopem stereoskopowym, aby uwidocznić guzki nowotworowe. Uwaga: Jeśli komórki są znakowane GFP, stereomikroskop z możliwością fluorescencji zawierający sześcian świetlny o odpowiednich maksimach wzbudzenia/emisji (np. w pobliżu 470/510 nm) do wykrywania GFP może być użyty do stereoskopowego badania płuc pod kątem fluorescencji przed przetwarzaniem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Jeśli płuca mają być natychmiast przeanalizowane, przejdź do sekcji "Izolacja RNA". W przeciwnym razie zamroź tkankę za pomocą ciekłego azotu lub suchego lodu. Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolacja RNA
Uwaga: Dla reprezentatywnej analizy, RNA zostało wyizolowane za pomocą zestawu do izolacji RNA (zobacz Lista materiałów). Podczas gdy obecna analiza wykorzystuje produkt jednego konkretnego producenta, dostępne są różne zestawy izolacyjne od kilku renomowanych dostawców. Dodatkowo opcjonalnie dostępne są również metody wirowania bez zestawu. cDNA należy również przygotować z próbki RNA kontroli dodatniej, takiej jak linia komórkowa lub plazmid, do analizy krzywej standardowej. Alternatywnie można zakupić kontrolę pozytywną specyficzną dla zestawu sond starterowych (patrz Lista materiałów).
<ol>
	<li>Jeśli używasz wcześniej zamrożonej tkanki, zbierz zamrożoną tkankę na suchym lodzie.</li>
	<li>Homogenizuj tkanki przy użyciu jednej z następujących metod, takich jak: mielenie moździerza i tłuczka wykonywane ręcznie na suchym lodzie po zamrożeniu tkanki w ciekłym azocie; homogenizator tkankowy lub mechaniczne urządzenie dysocjujące zgodnie z sugestią producenta; sonikacja lub inna preferowana metoda. 
	Uwaga: Do celów analizy reprezentatywnej preferowaną metodą homogenizacji jest sonikacja.
	<ol>
		<li>Do analizy przedstawionej na rysunku 3 należy przygotować bufor do lizy (znajdujący się w zestawie do izolacji RNA) i 2-merkaptoetanol w proporcji 20 μl 2-merkaptoetanolu na każdy 1 ml buforu do lizy. Ponownie zawiesić tkankę w buforze do lizy o pojemności 300 μl uzupełnionym 2-merkaptoetanolem na każde 30 g tkanki i sonikować przez 10 sekund za pomocą sonikatora ustawionego na 30% amplitudy.</li>
		<li>W przypadku użycia moździerza i tłuczka, po zmieleniu ponownie zawiesić zmieloną tkankę w buforze do lizy o pojemności 300 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 10 μl proteinazy K do 590 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA). Dodać 600 μl roztworu proteinazy K na każde 300 μl (tj. na każde 30 mg) tkanki. Inkubować przez 10 minut w temperaturze RT. 
	Uwaga: Czas trawienia może się różnić. </li>
	<li>Odwirować próbki o masie 13 000 g ≥ przez 10 minut w celu usunięcia zanieczyszczeń.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowych probówek.</li>
	<li>Dodaj 450 μl etanolu (96%-100%) na każde 900 μl supernatantu, aby wytrącić RNA.</li>
	<li>Przenieść 700 μl mieszaniny lizatu i etanolu do kolumny.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie ≥13 000 g przez 1 minutę w celu związania RNA z kolumną.</li>
	<li>Wyrzuć odpady płynne i dodaj pozostały supernatant do kolumny i ponownie odwiruj.</li>
	<li>Po odwirowaniu całego lizatu przez kolumnę dodać 350 μl buforu płuczącego 1 do górnej części kolumny i odwirować próbki o masie ≥13 000 g przez 30 sekund.</li>
	<li>Wylej płyn z kolumny i zastąp górną część.</li>
	<li>Przygotować DNazę, mieszając 5 jednostek enzymu DNazy I z 5 μl 10x DNazy i 40 μl wody wolnej od DNazy/RNaz na próbkę (całkowita objętość 50 μl/próbkę).</li>
	<li>Dodać 50 μl mieszanki DNazy do każdej kolumny i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 350 μl buforu płuczącego 1 do kolumny i odwirować próbki o masie 13 000 g ≥ przez 30 sekund.</li>
	<li>Wylej płyn z kolumny i zastąp górną część.</li>
	<li>Dodać 600 μl buforu płuczącego 2 do kolumny i wirować przez 30 sekund w temperaturze ≥13 000 g.</li>
	<li>Wylej płyn z kolumny i zastąp górną część.</li>
	<li>Dodać 250 μl buforu do płukania 2 i wirować przez 2 minuty przy ≥13 000 g.</li>
	<li>Włóż część kolumny do nowej probówki zbiorczej i wyrzuć starą probówkę zbiorczą.</li>
	<li>Dodać 50-100 μl wody wolnej od RNaz/DNaz do kolumny i inkubować przez 1 min.</li>
	<li>Wiruj przez 1 minutę w ≥ 13 000 g.</li>
	<li>Ponownie uruchom zebrane eluacje przez kolumnę, aby zwiększyć wydajność RNA.</li>
	<li>W celu natychmiastowego użycia należy przechowywać próbki na lodzie i przystąpić do oznaczania ilościowego. Do późniejszego użycia zatrzaskowo zamrozić na suchym lodzie lub ciekłym azocie. Przechowywać w temperaturze -80 °C w zamrażarce do czasu, gdy będzie potrzebny.</li>
</ol>
3. Synteza pierwszej nici
Uwaga: Dla reprezentatywnej analizy, reakcja odwrotnej transkryptazy (RT) została przeprowadzona za pomocą zestawu do syntezy cDNA pierwszej nici przeznaczonego do QRT-PCR (patrz Lista Materiałów).
<ol>
	<li>Jeśli próbki zostały wcześniej pobrane, rozmrozić probówki na lodzie.</li>
	<li>Zmierzyć ilość RNA za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Używając 0,5-2 μg całkowitego RNA, przeprowadź syntezę pierwszej nici przy użyciu odwrotnej transkryptazy w celu wygenerowania zapasu cDNA.
	<ol>
		<li>W sterylnych probówkach/płytkach do PCR wolnych od RNaz/DNaz przygotować mieszaninę reakcyjną (tabela 1). Delikatnie wymieszaj i odwiruj. Zaprogramować standardową maszynę do PCR (Tabela 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć gotową reakcję do pożądanej objętości (zwykle 50-100 μl) za pomocą sterylnej wody wolnej od nukleaz.</li>
</ol>
4. PCR w czasie rzeczywistym
Uwaga: Do analizy reprezentatywnej użyto koloru zielonego SYBR. Jednak każda preferowana metoda może zostać zastąpiona według uznania użytkownika.
<ol>
	<li>Korzystając z cDNA kontroli pozytywnej, ustaw krzywą wzorcową dla każdego zestawu starterów.
	<ol>
		<li>Do analizy pokazanej na rysunku 3 należy przygotować krzywą wzorcową dla ludzkiego HER2, stosując zalecane przez producenta cDNA kontroli dodatniej (patrz Wykaz materiałów). W przypadku mysiego gapdh użyj cDNA płuc kontroli ujemnej, aby wygenerować krzywą standardową. Dla każdej sondy należy seryjnie rozcieńczyć cDNA w stosunku 1:4, aby wygenerować 5 wzorców.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczyć całkowitą liczbę próbek, która powinna obejmować krzywą wzorcową i próbki doświadczalne. 
	Uwaga: W opisanej tutaj analizie przeanalizowano 2-3 powtórzenia eksperymentalne na próbkę. Przeprowadzono analizę krzywej standardowej w celu wygenerowania prostego modelu regresji liniowej, który można zastosować do określenia względnej ilości HER2 i gapdh na próbkę w celu obliczenia końcowej znormalizowanej ilości. Analiza ta zapewni również, że skuteczność podkładu jest odpowiednia do przeprowadzanej analizy.</li>
	<li>W sterylnej probówce wolnej od RNaz/DNaz przygotować mieszankę wzorcową (Tabela 3).
	<ol>
		<li>Oblicz ilość mieszanki wzorcowej na próbkę. Skalowanie w górę dla więcej niż jednej próbki. Użyj mieszanki głównej dla każdego genu eksperymentalnego będącego przedmiotem zainteresowania, a także kontroli wewnętrznej, takiej jak gapdh. Stosować podkłady do gapdh w końcowym stężeniu 200 nM. 
		Uwaga: Kontrola wewnętrzna jest szczególnie przydatna przy próbie rozróżnienia pochodzenia komórek ludzkich i myszy. 
		Uwaga: Stężenie podkładu dla HER2 zostało zoptymalizowane i określone przez producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować płytkę testową zawierającą 1 μl cDNA odpowiadającą każdej próbce wzorcowej lub doświadczalnej. Przydziel co najmniej 1 próbkę cDNA / studzienkę dla każdej sondy starterowej. Dodać 19 μl mieszanki wzorcowej na dołek dla każdej sondy startera. 
	Uwaga: W przypadku reprezentatywnych danych na rysunku 3, próbki cDNA analizowano w dwóch egzemplarzach dla każdej sondy starterowej i przedstawiono na wykresie jako średnią z dwóch próbek.</li>
	<li>Uruchom reakcję w maszynie QRT-PCR przy użyciu zalecanego lub wcześniej przetestowanego protokołu PCR. Patrz tabela 4 dla protokołu PCR zastosowanego dla reprezentatywnych danych na rys. 3 i rys. 4. </li>
</ol>

<ol><li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metastasis%3A+building+a+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li>
<li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metastasis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li>
<li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li>
<li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li>
<li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li>
<li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today+Dis+Models%22%5BJournal%5D)">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li>
<li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li>
<li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+living+subjects%3A+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li>
<li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li>
<li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li>
<li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li>
</ol>

ESY i MAA nie są zatrudnione przez FirstString Research Inc. i nie posiadają żadnych udziałów finansowych w spółce. Firma FirstString Research Inc. dostarczyła dane obrazowania lucyferazy, które zostały przedstawione w tym manuskrypcie. GSG jest prezesem i dyrektorem generalnym FirstString Research. CLG jest pracownikiem FirstString Research. GSG i CLG posiadają opcje na akcje wystawione przez FirstString Research.

Protokół ten opisuje zastosowanie QRT-PCR do oceny przerzutów komórek nowotworowych sutka do płuc przy użyciu mysiego modelu ksenoprzeszczepu. Uznaje się, że dostępne są inne techniki, w tym obrazowanie bioluminescencyjne, które są również skuteczne w wykrywaniu przerzutów, mimo że mają swoje własne wartości i ograniczenia. Przedstawione dane sugerują, że QRT-PCR stanowi skuteczną miarę wykrywania mRNA pochodzącego z guza w tkance płucnej w celu ilościowego określenia całkowitych przerzutów. Proponuje się, aby analiza QR...

Analiza QRT-PCR jest proponowana jako metoda oceny przerzutów nowotworowych. Metoda ta jest proponowana jako alternatywa dla użytkowników, którzy są zainteresowani oceną przerzutów, ale mogą nie mieć dostępu do określonego sprzętu, takiego jak sprzęt do obrazowania in vivo lub stereoskop z możliwością fluorescencji. Przedstawiono dyskusję na temat powszechnie stosowanych metod, a następnie zademonstrowano, w jaki sposób analiza QRT-PCR może być stosowana jako oddzielna lub towarzysząca metoda oceny przerzutów. Procedura ta może potencjalnie zapewnić ilościową analizę obciążenia przerzutowego.
Standardowe metody analizy ogólnej, w tym wizualizacja płuc pod mikroskopem stereoskopowym, jak również seryjne sekcje, a następnie barwienie tkanki płucnej hematoksyliną i eozyną (H&E), są policzalne, ale w dużej mierze opierają się na zdefiniowanych przez użytkownika parametrach do liczenia 2-5. Podczas oceny całych płuc za pomocą mikroskopu stereoskopowego widoczne są tylko przerzuty na dużej powierzchni, a analiza wymaga od badacza rozsądnej wiedzy na temat budowy anatomicznej płuc w celu określenia, co stanowi zmianę przerzutową. Znakowanie fluorescencyjne komórek nowotworowych markerem, takim jak GFP, i użycie mikroskopu stereoskopowego, który zawiera sześcian światła o odpowiednich maksimach wzbudzenia/emisji (np. w pobliżu 470/510 nm dla GFP) pomaga w tym procesie, ale wykrywalne są tylko guzki guzka guza na powierzchni. Dodatkowo fluorescencja z zanieczyszczenia krwi, która jest widoczna przy tych samych parametrach co GFP, może prowadzić do fałszywej identyfikacji ewentualnych zmian przerzutowych.
Cięcie płuca, a następnie barwienie H&E w celu wizualizacji przerzutów do płuc jest użyteczną metodą oceny mikroprzerzutów i innych procesów mikroskopowych, w tym infiltracji komórek odpornościowych, ale często wymaga użycia całej tkanki płucnej do procedur osadzania, cięcia i barwienia parafiny. W związku z tym dalsze procedury nie są idealne po zastosowaniu tej metody. Chociaż procedura ta jest kwantyfikowalna, wymaga od badacza oceny dużej liczby barwionych odcinków płuc na zwierzę, aby upewnić się, że analiza uwzględnia całą strukturę 3D płuc. W związku z tym ten rodzaj badania jest czasochłonny, może prowadzić do błędu liczenia, a analiza w dużej mierze zależy od uznania badacza.
Kilka technik obrazowania in vivo (np. MRI, PET, SPECT) jest obecnie używanych do przeprowadzania lub testowania procesów biologicznych w eksperymentalnych modelach gryzoni 8. Obrazowanie bioluminescencyjne in vivo jest powszechną metodą stosowaną w celu uzyskania ogólnego obrazu przerzutów 9. Technika ta jest powszechnie stosowana do oceny obecności aktywności reporterowej lucyferazy z powodu akumulacji komórek nowotworowych, które są zaprojektowane tak, aby zawierały element odpowiedzi lucyferazy, które znajdują się w określonych narządach, takich jak gruczoł sutkowy po implantacji komórek nowotworowych i płuco po spontanicznych przerzutach 10. Wizualizacja aktywności reporterowej lucyferazy jest indukowana przez obecność substratu lucyferyny (D-lucyferyny). Lucyferazy katalizuje oksydacyjną dekarboksylację D-lucyferyny do oksylucyferyny, generując bioluminescencję. Chociaż metoda ta ma charakter informacyjny, jest ograniczona przez kilka czynników, w tym stabilność substratu (tj. krótki okres półtrwania), odpowiednią dystrybucję substratu, która zależy od sposobu jego dostarczania zwierzętom doświadczalnym, oraz niską czułość wykrywania 9. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona nieinwazyjna, może być wykonywana na żywych zwierzętach i może prowadzić do wykrycia przerzutów komórek nowotworowych w wielu narządach, które mogły nie zostać normalnie pobrane podczas sekcji 9,10.
Pozytywnym aspektem technik obrazowania in vivo jest to, że tkanka płucna jest nienaruszona, co pozwala na wtórne procedury, takie jak zatapianie parafiny lub, jak to tutaj prezentowano, analiza QRT-PCR. Ponieważ jednak QRT-PCR jest teoretycznie bardziej czułą miarą wykrywania, ogólna ocena może nie ujawnić niskiej liczby komórek nowotworowych obecnych w płucach. Opisane powyżej techniki obrazowania, choć przydatne, mogą być zastąpione lub uzupełnione obecnie opisaną metodą QRT-PCR. QRT-PCR może potencjalnie zapewnić czułą miarę mRNA pochodzącego z guza w płucu.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Fisher</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji RNA GeneJet</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0732</td><td></td></tr><tr><td>iScript Supermix z odwrotną transkrypcją do QRT-PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5121&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Test PrimePCR SYBR Green: ERBB2, Człowiek&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25636&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Szablon PrimePCR do zielonego testu SYBR: ERBB2, Human&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25716&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sekwencja</td><td></td><td></td> starterów <td>gapdh dla-ATGGTGAAGGTCGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td></tr></tbody></table>

ocena przerzutów do płuc w modelach guza sutka myszy za pomocą ilościowego pcr w czasie rzeczywistym

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Choroba przerzutowa to rozprzestrzenianie się złośliwych komórek nowotworowych z głównego miejsca raka do odległego narządu i jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem 1. Typowe miejsca rozprzestrzeniania się przerzutów to płuca, węzły chłonne, mózg i kości 2. Mechanizmy napędzające przerzuty są intensywnymi obszarami badań nad rakiem. W związku z tym skuteczne testy do pomiaru obciążenia przerzutami w odległych miejscach przerzutów mają zasadnicze znaczenie dla badań nad rakiem. Ocena przerzutów do płuc w modelach guza sutka jest na ogół przeprowadzana poprzez ogólną obserwację jakościową tkanki płucnej po sekcji. Ilościowe metody oceny przerzutów są obecnie ograniczone do technik opartych na obrazowaniu ex vivo i in vivo, które wymagają parametrów zdefiniowanych przez użytkownika. Wiele z tych technik odbywa się na poziomie całego organizmu, a nie na poziomie komórkowym 3-6. Chociaż nowsze metody obrazowania wykorzystujące mikroskopię wielofotonową są w stanie ocenić przerzuty na poziomie komórkowym 7, te wysoce eleganckie procedury są bardziej odpowiednie do oceny mechanizmów rozprzestrzeniania się niż ilościowej oceny obciążenia przerzutami. W tym artykule przedstawiono prostą metodę in vitro do ilościowej oceny przerzutów. Za pomocą ilościowego PCR W CZASIE RZECZYWISTYM (QRT-PCR) można wykryć mRNA specyficzne dla komórek nowotworowych w tkance płucnej myszy.

Poza czasem potrzebnym na przeprowadzenie początkowej inokulacji komórek nowotworowych do zwierzęcia doświadczalnego, w przypadku wykonywania pierwotnej analizy nowotworu in vivo, pobranie tkanek, izolacja RNA i analiza QRT-PCR są procedurami trwającymi od 1 do 2 dni (Rysunek 1).
Przykładem analizy makroskopowej jest obrazowanie bioluminescencyjne służące do oceny komórek nowotworowych w obrębie tkanki ...

Protokół ten opisuje, jak używać ilościowego PCR W CZASIE RZECZYWISTYM (QRT-PCR) do wykrywania mRNA specyficznego dla komórek nowotworowych reprezentującego przerzuty w tkance płucnej myszy.

Ocena przerzutów do płuc w modelach guza sutka myszy za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest oznaczenie ilości konkretnego mRNA z komórek nowotworowych płuca jako metoda analizy przerzutów. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona ilościowy pomiar przerzutowania. Aby przeprowadzić sekcję guza płuca, po uśpieniu myszy za pomocą śmiertelnej dawki izofluranu zgodnie z protokołem tekstowym, umieść mysz na plecach na piance, rozczapierzając kończyny i zabezpieczając je do podkładu za pomocą szpilek sekcyjnych.Po spryskaniu myszy etanolem, za pomocą pęsety chwyć dolną część ciała zwierzęcia w jego centrum, a następnie nożyczkami wykonaj cięcie w górę w kierunku szyi przez skórę, uważając, aby nie przebić jamy otrzewnej myszy. Następnie chwyć otrzewną w dolnej części ciała zwierzęcia i zacznij ciąć w górę w stronę podstawy szyi. Ostrożnie przetnij lewą i prawą stronę klatki piersiowej, dbając o to, aby nie przeciąć żadnych naczyń krwionośnych, z których krew mogłaby wylać się do jamy klatki piersiowej.Usunąć żebra, przecinając tkanki po lewej i prawej stronie, przez przeponę oraz górne części klatki piersiowej. Następnie, używając pincety, chwycić tchawicę myszy i pociągnąć ją do przodu, a za pomocą nożyczek anatomicznych przeciąć tchawicę przed usunięciem płuc z organizmu myszy. Użyć PBS do delikatnego przemycia tkanki płucnej.Następnie, po ocenie makroskopowej tkanki płuc zgodnie z protokołem tekstowym, jeśli płuca mają zostać przeanalizowane niezwłocznie, należy przejść do izolacji RNA. Aby wyizolować RNA z tkanki, należy rozpocząć od homogenizacji tkanki jedną z metod wymienionych w protokołe tekstowym. Przygotować bufor lizujący z zestawu do izolacji RNA, a następnie dodać 20 µL tumor captoethanol do każdego mililitra buforu lizującego.Każde 30 gramów tkanki resuspender w 300 µL buforu do lizy, a następnie poddać sonikacji przez 10 sekund przy amplitudzie sonikatora ustawionej na 30%. Do 590 µL buforu TE dodać 10 µL proteinazy K, a następnie dodać 600 µL tak przygotowanego buforu do 300 µL zsonikowanej tkanki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Następnie odwiruj próbki z prędkością większą lub równą 13 000 ×g przez 10 minut, aby usunąć zanieczyszczenia. Następnie przenieś nadsącz do nowych probówek. Do każdych 900 µL nadsączu dodaj 450 µL etanolu w celu wytrącenia RNA.Następnie przenieś 700 µL mieszaniny lizatu z etanolem do kolumny RNA. Ponownie wiruj z prędkością ≥ 13 000 ×g przez jedną minutę, aby związać RNA z kolumną. Następnie odlej ciecz odpadową, dodaj pozostały nadsącz do kolumny i ponownie wiruj.Następnie do górnej części kolumny należy dodać 350 µL buforu do mycia jeden i wirować próbki przez 30 s. Odrzucić ciecz odpadową i umieścić kolumnę z powrotem w probówce. Przygotować DNazę, mieszając 5 jednostek enzymu DNaza jeden z 5 µL 10X buforu do DNazy oraz 40 µL wody wolnej od DNaz i RNaz dla każdej próbki.Do każdej kolumny należy dodać 50 µL mieszaniny DNazy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie do kolumn dodaje się 350 µL buforu płuczącego one i wiruje próbki przez 30 sekund. Po odlaniu odpadu dodaje się 600 µL buforu płuczącego two i ponownie wiruje przez 30 sekund.Odrzuć ciecz przed dodaniem 250 µL buforu płuczącego dwa, a następnie wiruj przez dwie minuty. Przenieś kolumnę do nowej probówki do zbierania i dodaj do kolumny od 50 do 100 µL wody wolnej od RNazy i DNazy. Po inkubacji przez jedną minutę wiruj przez jedną minutę.Ponownie przepuść zebrany eluat przez kolumnę, aby zwiększyć wydajność RNA. W przypadku natychmiastowego użycia przechowywać próbki w lodzie. Do późniejszego zastosowania zamrozić szybko w suchym lodzie lub ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80°C do momentu użycia.Za pomocą spektrofotometru należy określić ilość RNA. Następnie, w sterylnych probówkach lub płytkach PCR wolnych od RNaz i DNaz, należy użyć od 0,5 do 2 mikrogramów całkowitego RNA do przygotowania mieszaniny reakcyjnej dla pierwszej transsyntezy, zgodnie z przedstawioną tabelą. Po wymieszaniu i delikatnym odwirowaniu należy zaprogramować standardowy termocykler zgodnie z programem pokazanym tutaj.Po zakończeniu reakcji należy użyć sterylnej wody wolnej od nukleaz, aby rozcieńczyć gotową reakcję do pożątej objętości. W celu przeprowadzenia PCR w czasie rzeczywistym należy użyć pozytywnej kontroli cDNA, takiej jak ludzki HER2, aby stworzyć krzywą wzorcową dla każdego zestawu starterów, przygotowując od jednego do czterech rozcieńczeń seryjnych cDNA w celu otrzymania pięciu wzorców. Następnie należy obliczyć całkowitą liczbę próbek, która powinna obejmować krzywą wzorcową oraz próbki eksperymentalne.Następnie w sterylnych probówkach wolnych od RNazy i DNazy przygotuj mieszaninę master mix dla każdego badanego genu oraz dla kontroli wewnętrznej, takiej jak gapdh. Przygotuj płytkę testową zawierającą 1 µL cDNA dla każdej próbki standardowej lub badanej. Przypisz co najmniej jedną próbkę cDNA na każdą studzienkę dla każdej pary starterów i sondy.Do każdej studzienki dodaj 19 µL mastermixu dla każdej sondy starterowej. Ten eksperyment z wykorzystaniem bioluminescencji wykazuje, że płuca myszy traktowane ACT1, który celuje w białko połączeń szczelinowych Connexin 43, wykazują brak aktywności lucyferazy, co sugeruje brak komórek nowotworowych w tkance. Jednak analiza przekrojów tkanki płucnej barwionych H&E ujawnia mikroprzerzuty, których nie wykryto za pomocą lucyferazy, co sugeruje, że obrazowanie lucyferazą nie jest wystarczająco czułe, aby wykryć niską liczbę komórek nowotworowych.Przedstawione tutaj wyniki eksperymentu qRT-PCR z wykorzystaniem sondy specyficznej dla HER2 służą do wykrywania ludzkich komórek nowotworowych HER2 plus JIMT1 w tkance płuc pobranej z komórek pierwotnie przeszczepionych do podskórnej tkanki tłuszczowej myszy. Pomimo że w żadnych płucach nie zaobserwowano widocznych makroskopowo przerzutów, w dwóch z 11 próbek metoda qRT-PCR wykryła przerzuty. Na tym rysunku przygotowano analizę krzywej wzorcowej w celu określenia względnych poziomów HER2 znormalizowanych do mysiego gapdh w płucach w serii z różną liczbą komórek.Wyniki wskazują, że qRT-PCR z użyciem sondy HER2 był wystarczająco czuły, aby wykryć poziomy HER2 w próbkach zawierających zaledwie 10 komórek. Wreszcie, analiza regresji ta pokazuje względną liczbę komórek w każdej próbce płuc, w tym w kontrolach pozytywnych i negatywnych. Po opanowaniu techniki, w przypadku prawidłowego wykonania, procedura ta zajmuje od sześciu do ośmiu godzin.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o zachowaniu środków ostrożności w celu utrzymania integralności RNA podczas izolacji RNA oraz reakcji odwrotnej transkrypcji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykrywać przerzuty w całej tkance płucnej za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym.

evaluation-lung-metastasis-mouse-mammary-tumor-models-quantitative

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten ortotopowy model ludzkiego raka prostaty pozwala na ilościowe określenie wielkości guza, krążących komórek nowotworowych i tworzenie wyraźnych przerzutów do płuc. Ponieważ komórki muszą uciec z narządu pierwotnego, dostać się do krwiobiegu i zagnieździć się w miejscu wtórnym, model ten skutecznie podsumowuje scenariusz u ludzi.

Ortotopowy mysi model przerzutów ludzkiego raka prostaty

Celem tego protokołu jest badanie nowotworów piersi. Dzięki tej technice guzy sutka myszy są usuwane, a komórki pierwotne są przygotowywane z guzów. Dołączony jest protokół ekstrakcji płuc do badania przerzutów do płuc. Ponadto dołączono inny protokół analizy fibroblastów embrionalnych myszy z zarodka myszy.

Guz pierwotny i izolacja komórek MEF w celu zbadania przerzutów do płuc

Opisujemy metodę wykrywania rozwoju guzka guza w płucach mysiego modelu gruczolakoraka za pomocą mikrotomografii komputerowej i jej użycie do monitorowania zmian wielkości guzka w czasie i w odpowiedzi na leczenie. Dokładność oceny potwierdzono kwantyfikacją histologiczną punktu końcowego.

Wykorzystanie mikrotomografii komputerowej do oceny rozwoju guza i obserwacji odpowiedzi na leczenie w mysim modelu raka płuc

Tutaj opisujemy model i podejście do badania funkcji makrofagów pęcherzyków płucnych w przerzutach raka. Aby zademonstrować rolę tych komórek w przerzutach, wykorzystano syngeniczny (4T1) model raka piersi w połączeniu z wyczerpaniem makrofagów pęcherzykowych za pomocą liposomów klodronianowych.

Badanie roli makrofagów pęcherzykowych w przerzutach raka piersi

Brakuje modeli przedklinicznych oceniających terapię adjuwantową ukierunkowaną na przerzuty raka piersi. Aby temu zaradzić, opracowaliśmy mysi model przerzutów de novo gruczolakoraka sutka do płuc, w którym terapie stosowane w trybie adjuwantowym (pooperacyjna resekcja guzów pierwotnych) mogą być oceniane pod kątem skuteczności w oddziaływaniu na wcześniej zasiane przerzuty do płuc.

Procedury chirurgiczne i metodyka przedklinicznego mysiego modelu przerzutów raka sutka de novo

Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu protokołu testu przerzutów do płuc (PuMA). Model ten pozwala naukowcom badać wzrost komórek kostniakomięsaka z przerzutami (OS) w tkance płucnej za pomocą szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.

Praktyczne rozważania w badaniu przerzutowej kolonizacji płuc w kostniakomięsaku przy użyciu testu przerzutów do płuc

Wprowadzamy mysi ortotopowy model raka piersi i model radykalnej mastektomii z technologią bioluminescencji, aby określić ilościowo obciążenie guza, aby naśladować postęp ludzkiego raka piersi.

Generowanie mysiego ortotopowego modelu raka piersi z przerzutami i wykonywanie radykalnej mastektomii u myszy

Ta praca wstępnie ustawia zaawansowany protokół do dokładnej oceny obciążenia guza poprzez detekcję zielonego białka fluorescencyjnego i sygnałów bioluminescencji, a także integrację ilościowej techniki wykrywania molekularnego.

Badanie potrójnie ujemnego raka piersi przy użyciu ortotopowego modelu raka piersi

Opisane podejście łączy eksperymentalne testy przerzutów do żył ogonowych z obrazowaniem żywych zwierząt in vivo, aby umożliwić monitorowanie w czasie rzeczywistym powstawania i wzrostu przerzutów raka piersi, a także ilościowe określenie liczby i wielkości przerzutów w płucach.

Łączne wykorzystanie testów przerzutów do żył ogonowych i obrazowania in vivo w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia kolonizacji przerzutowej raka piersi i obciążenia płuc

Dożylne wstrzykiwanie komórek rakowych jest często stosowane w badaniach nad przerzutami, ale obciążenie guzem przerzutowym może być trudne do analizy. W tym artykule demonstrujemy model przerzutów do iniekcji żyły ogonowej i uwzględniamy nowatorskie podejście do analizy wynikającego z przerzutowego obciążenia guzem płuc.

Analiza patologiczna przerzutów do płuc po bocznym wstrzyknięciu komórek nowotworowych do żyły ogonowej

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Poznaj ilościowy PCR w czasie rzeczywistym do oceny przerzutów guza sutka w płucach myszy. Ta metoda pozwala wykryć nawet 10 komórek nowotworowych i precyzyjnie zmierzyć poziom mRNA.

Ocena przerzutów do płuc w modelach guza sutka myszy za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów