2.9: Indukowana pluripotencja

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, takie jak ludzkie embrionalne komórki macierzyste, mogą różnicować się w prawie każdą komórkę w organizmie i dlatego są bardzo obiecujące w dziedzinie medycyny regeneracyjnej.

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) są pozyskiwane z zarodków przedimplantacyjnych, podczas gdy w pełni zróżnicowane komórki somatyczne są wykorzystywane do wytwarzania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, które są również określane jako iPSC.

W tym filmie dowiesz się o podstawowych zasadach generowania iPSC, protokole krok po kroku indukującym pluripotencję w zróżnicowanych komórkach oraz o niektórych z wielu dalszych zastosowań i modyfikacji tego protokołu.

Zacznijmy od omówienia zasad powstawania iPSC z typów komórek somatycznych.

Zróżnicowane komórki, takie jak komórki skóry lub neurony, są tymi, których los jest przesądzony. Są zobowiązani do pełnienia określonej funkcji. Z drugiej strony, pluripotencjalne komórki macierzyste to te, których los jest nierozstrzygnięty i mogą różnicować się w dowolny typ komórek.

Proces zmiany tożsamości już zróżnicowanej komórki na stan pluripotencjalny nazywa się przeprogramowaniem komórkowym. Wiąże się to ze zmianą wzorca ekspresji genów w komórce, ponieważ liczba i rodzaje białek wytwarzanych przez komórkę odgrywają główną rolę w definiowaniu tożsamości komórki.

Jednym ze sposobów wywołania przeprogramowania komórkowego jest indukowanie ekspresji pewnych czynników transkrypcyjnych. Czynniki transkrypcyjne to białka, które wiążą się z sekwencjami regulatorowymi w genie. Niektóre z tych sekwencji nazywane są "promotorami" i dlatego promują transkrypcję genu. Kilka czynników transkrypcyjnych może wpływać na ekspresję wielu genów, co ma ogromny wpływ na tożsamość komórki.

Cztery klasyczne czynniki transkrypcyjne, które, jak wykazano, indukują pluripotencję, to Oct4, Sox2, cMyc i Klf4. Czynniki te są również znane jako czynniki Yamanaka, od nazwiska badacza, który odkrył ich efekty przeprogramowania.

Do indukowania ekspresji tych czynników transkrypcyjnych można zastosować wiele metod. Najczęstszą i najskuteczniejszą metodą jest wykorzystanie zmodyfikowanego wirusa do dostarczenia genów czynnika transkrypcyjnego do jądra, gdzie zintegrują się one z genomem.

W tej metodzie geny kodujące cztery czynniki Yamanaka są indywidualnie pakowane w różne retrowirusy i dodawane do zróżnicowanych komórek. Kiedy komórki są wystawione na działanie zmodyfikowanych wirusów, niewielka część zróżnicowanych komórek zostaje zainfekowana wszystkimi czterema wirusami przenoszącymi czynniki transkrypcyjne. Zaczynają się deróżnicować, aż do momentu powstania dużych kulistych skupisk pluripotencjalnych komórek macierzystych. Tworzenie klastrów pomaga iPSC stworzyć mikrośrodowisko, które jest podobne do komórek macierzystych in vivo, a tym samym pomaga im w utrzymaniu pluripotencji.

Ponieważ rozumiesz już podstawowe zasady rządzące generowaniem iPSC, przejdźmy do ogólnego protokołu indukcji pluripotencji w mysich fibroblastach embrionalnych lub MEF, przy użyciu systemu transdukcji wirusa.

Przed rozpoczęciem tej procedury należy pamiętać, że wirusy mogą infekować komórki w organizmie, dlatego niezwykle ważne jest przestrzeganie wytycznych dotyczących bezpieczeństwa.

Aby rozpocząć proces transfekcji, pożywkę hodowlaną wyjmuje się z płytki zawierającej MEF-y o dużej gęstości, a komórki przemywa się roztworem buforowym. Następnie dodaje się roztwór zawierający enzym rozkładający białka, taki jak trypsyna, aby podnieść komórki z dna naczynia. Pożywkę hodowlaną dodaje się następnie do płytki, a oderwane komórki przenosi się do probówki wirówkowej.

Po odwirowaniu osad jest ponownie zawieszany w pożywce hodowlanej. Następnie komórki są zliczane, a stężenie dostosowywane tak, aby optymalna liczba komórek mogła zostać zainfekowana wirusem następnego dnia. Inkubuj komórki przez noc.

Po tym, jak komórki osiądą na nowym szalisku, stare pożywki są zastępowane świeżymi pożywkami, a zmodyfikowane wirusy zawierające pożądane czynniki transkrypcyjne są dodawane do płytki. Komórki są następnie inkubowane z wirusami przez wystarczająco długi czas, aby umożliwić infekcję. Po inkubacji pożywka zawierająca wolne wirusy jest usuwana i zastępowana świeżą pożywką z embrionalnych komórek macierzystych.

Przez 2-3 tygodnie po przemianie komórki powinny być hodowane w inkubatorze w temperaturze 37°, a pożywki hodowlane powinny być wymieniane codziennie.

Po tym okresie kolonie iPSC, które wyglądają podobnie do kolonii embrionalnych komórek macierzystych, powinny stać się wystarczająco duże, aby można je było zebrać. Kolonie można przenieść na świeżą płytkę zawierającą podłoże z odpowiednimi czynnikami wzrostu i pozostawić do dalszego wzrostu. Aby potwierdzić pluripotencję, część populacji komórek jest barwiona markerami pluripotencji.

Teraz, gdy już wiesz, jak generować iPSC ze zróżnicowanych komórek, przyjrzyjmy się niektórym dalszym zastosowaniom i modyfikacjom tej bardzo przydatnej metody.

Ważną cechą iPSC jest to, że można je wykorzystać do wytworzenia prawie każdej komórki w organizmie. Ten przykład pokazuje generowanie komórek mięśnia sercowego, zwanych kardiomiocytami, z iPSC. W tym celu iPSC są przenoszone na nieprzylegające płytki, które umożliwiają im tworzenie ciał embrionalnych, które są agregatami pluripotencjalnych komórek macierzystych. Ciała zarodków są hodowane w specjalistycznej pożywce zawierającej surowicę i kwas askorbinowy, co zwiększa różnicowanie serca. Pomyślne różnicowanie można łatwo zaobserwować, gdy niektóre komórki zaczynają bić.

Ponieważ iPSC mogą potencjalnie różnicować się w dowolny typ komórek, mogą również tworzyć cały organizm, jak mysz. Można to zrobić za pomocą testu zwanego komplementacją tetraploidalną. Po pierwsze, zarodek tetraploidalny, zarodek zawierający cztery zestawy chromosomów, powstaje w wyniku połączenia dwóch komórek wczesnego zarodka za pomocą pola elektrycznego. Zarodek tetraploidalny może rozwijać się do stadium blastocysty. IPSC są następnie wstrzykiwane do blastocysty, która jest następnie przeszczepiana samicy biorcy w celu zajścia w ciążę. Komórki tetraploidalne są zdolne do tworzenia struktur pozaembrionalnych, takich jak łożysko, więc zwierzęta powstałe w wyniku tej metody pochodzą wyłącznie z iPSC.

Niektórzy badacze modyfikują procedurę przeprogramowywania, aby proces identyfikacji pomyślnie przeprogramowanych komórek był bardziej wydajny. Na przykład w tym eksperymencie MEF-y ze zdolnością do ekspresji białka zielonej fluorescencji pod wpływem promotora Oct4 pomogły naukowcom łatwo zidentyfikować komórki, które nabyły pluripotencję.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. W tym filmie omówiono zasady stojące za tą procedurą oraz protokół krok po kroku do generowania iPSC ze zróżnicowanych komórek. Sprawdziliśmy również, w jaki sposób ta metoda może być stosowana lub modyfikowana w eksperymentach laboratoryjnych.

Odkrycie iPSC wywarło ogromny wpływ na dziedzinę biologii komórek macierzystych, ponieważ ma ono ogromny potencjał w zakresie opracowywania terapii, które mogą być stosowane w leczeniu chorób zwyrodnieniowych. Chociaż poczyniono znaczne postępy w zakresie iPSC, przeszkodą, którą nadal należy pokonać, jest związane z tym ryzyko zachorowania na raka. Obecne procedury przeprogramowania mogą potencjalnie spowodować nieuregulowany wzrost komórek, co może prowadzić do raka. Dlatego potrzebne są dalsze badania, aby faktycznie wykorzystać iPSC klinicznie. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!