Obrazowanie fluorescencyjne i bioluminescencyjne subkomórkowego Ca2+ w starzejących się neuronach hipokampa
1 grudnia 2015
Wewnątrzkomórkowa przebudowa Ca2+ w procesie starzenia się może przyczyniać się do ekscytotoksyczności i uszkodzenia neuronów, procesów, w których pośredniczy przeciążenie Ca2+. Naszym celem było zbadanie przebudowy Ca2 + w starzejącym się mózgu za pomocą obrazowania fluorescencyjnego i bioluminescencyjnego cytozolowego i mitochondrialnego Ca2 + w długoterminowych hodowlach neuronów hipokampa szczura, modelu starzenia się neuronów.
Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie przebudowy wapnia w starzejącym się mózgu za pomocą obrazowania fluorescencyjnego i bioluminescencyjnego cytozolowego i mitochondrialnego wapnia w długoterminowych kulturach neuronów hipokampa, który jest uważany za model starzenia się neuronów. Metoda ta może pomóc w zrozumieniu kluczowych pytań w dziedzinie starzenia, takich jak to, w jaki sposób przebudowa wewnątrzkomórkowego wapnia przyczynia się do ekscytotoksyczności i uszkodzenia neuronów, związanych z przeciążeniem wapniem. Główną zaletą tej techniki jest to, że możliwe jest dokładne śledzenie przebudowy wapnia w poszczególnych neuronach przy użyciu kultur w różnych DYS in vitro z tej samej próbki, powielania tej techniki, przebijania się lub terapii udaru lub choroby komórek ja, ponieważ zmienna nowy cel związany z przeciążeniem wapnia w chorobach związanych z tym czynnikiem.
Po obejrzeniu tego filmu Jezus dobrze rozumie, jak wykonywać obrazowanie fluorescencyjne i reminiscencyjne cytozolowego i mitochondrialnego wapnia w krótko- i długoterminowych hodowlach neuronów hipokampa szczura. Aby rozpocząć tę procedurę, rozprowadź szkiełka nakrywkowe na pasku paraformy na szalce Petriego. Następnie nałóż 200 mikrolitrów poli D lycine w ilości jednego miligrama na mililitr na każdy szkiełko nakrywkowe i traktuj przez noc.
Następnego dnia myj szkiełka nakrywkowe podwójnie destylowaną sterylną wodą co 15 minut przez 90 minut w sterylnych warunkach. Umieść szkiełka nakrywkowe w multi i przechowuj je w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 do momentu użycia. Aby wyizolować neurony hipokampa, otwórz czaszkę nowonarodzonych szczeniąt szczurów sterylnymi nożyczkami, wyekstrahuj mózg szpatułką i szybko umyj go w pożywce F 12 szynki.
Następnie wykonaj ukośne cięcie skalpelem w każdej półkuli i przenieś je pod mikroskopem na szalkę Petriego zawierającą podłoże z szynkami F 12. Wyrzuć opony mózgowe. Ostrożnie zidentyfikuj hipokamp w charakterystycznym wklęsłym miejscu nad korą mózgową.
Następnie oddziel hipokamp od kory, ostrożnie go odciągając i usuwając za pomocą nożyczek do oczu. Następnie przenieś kawałki hipokampa do fiolki zawierającej 1,8 mililitra wstępnie przefiltrowanego roztworu pepanu. Inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza, od czasu do czasu delikatnie potrząsając przez 15 minut.
Następnie dodaj 90 mikrolitrów jednego roztworu DNA. Dodaj 50 mikrogramów na mililitr i inkubuj je przez kolejne 15 minut. Następnie przenieś tkankę do 10-mililitrowej probówki wirówkowej i umyj fragmenty świeżą pożywką do hodowli neuro basen.
Uzyskaj zawiesinę komórek, przepuszczając fragmenty tkanki przez pięciomililitrową plastikową pipetę. Następnie odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 160 G przez pięć minut. Następnie usunąć supinat za pomocą plastikowej sterylnej pipety pastwiskowej i ostrożnie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki do hodowli neuro za pomocą automatycznej pipety o pojemności jednego mililitra.
Następnie zmierz gęstość komórek za pomocą komory zliczającej Neubauera. Dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórek i policz liczbę komórek pod mikroskopem. Następnie wykonaj odpowiednie obliczenia, aby uzyskać od 40 do 80 mikrolitrów zawiesiny komórek, która zawiera około 30 000 komórek.
W czterodołkowej płytce zawierającej 500 mikrolitrów podłoża neuropodstawowego, rozegrano około 30 000 komórek do każdej studzienki zawierającej szklane szkiełka nakrywkowe. Trzymaj je w inkubatorze przez dwa do pięciu dni in vitro w przypadku młodych neuronów lub ponad 15 dni in vitro w przypadku starych neuronów. W tej procedurze inkubuj komórki z mniejszą ilością 2:00 w nocy przez 60 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
Następnie przenieś szkiełka nakrywkowe do komory obfitości. Następnie umieść komorę obfitości z szkiełkiem nakrywkowym w uchwycie na odwróconym mikroskopie. Wybierz pole mikroskopijne i perfuzuj komórki w sposób ciągły za pomocą wstępnie podgrzanego HBS.
Następnie epi oświetla komórki na 340 i 380 nanometrach. Na przemian rejestruj światło emitowane na długości 520 nanometrów co pięć do 10 sekund za pomocą kamery fluorescencyjnej, która jest filtrowana przez zwierciadło fira two diiczne. Aby przeanalizować zarejestrowane obrazy fluorescencyjne, najpierw otwórz plik eksperymentu za pomocą oprogramowania Aqua Cosmos, kliknij proporcje i wybierz żądany zakres proporcji.
Oblicz stosunek piksel po pikselu na wynikowych obrazach, aby uzyskać sekwencję obrazów o proporcjach. Następnie odejmij tło, dostosowując przycisk usuwania tła. Następnie naciśnij rozpocznij obliczenia.
Następnie naciśnij przycisk sekwencji całego czasu i usuń starożytne ROI w celu analizy ilościowej poszczególnych komórek. Ustal nowe ROI lub ROI odpowiadające poszczególnym neuronom. Aby wyświetlić wykres poszczególnych nagrań, wyeksportuj wartości fluorescencji współczynnika odpowiadające każdemu zwrotowi z inwestycji do programu laboratoryjnego Origin, klikając wykres.
Następnie kliknij oblicz i zapisz plik TXT. Następnie wykonaj odpowiednie obliczenia, aby oszacować wielkość wzrostu współczynnika fluorescencji w odpowiedzi na każdą stymulację w celu transfekcji neuronów z hodowlą zmutowanego plazmidu MIT. Najpierw należy przygotować 50 mikrolitrów roztworu A zawierającego odczynnik do transfekcji w fiolce.
Następnie przygotuj 50 mikrolitrów roztworu B zawierającego plazmid MIT ute w fiolce. Dodać roztwór B do roztworu A i inkubować przez 20 minut. Następnie przenieś szkiełka nakrywkowe zawierające neurony hipokampa do nowych szalek wielofunkcyjnych zawierających 200 mikrolitrów świeżego neuro podstawowego TF. Następnie dodać 100 mikrolitrów roztworu A i B kropla po kropli na każde szkiełko nakrywkowe i inkubować przez 30 minut.
Po 30 minutach usuń podłoże. Umyj komórki świeżym neuro basal tf. Po powrocie szkiełka nakrywkowe do oryginalnej pożywki do hodowli neuropodstawowej i hodowli komórek przez 24 godziny po transfekcji, aby umożliwić skuteczną ekspresję i ukierunkowanie sondy.
Następnie dodaj cztery mikrolitry szczeliwa TEREZIN N do 200 mikrolitrów HBS, aby uzyskać końcowe stężenie czterech mikromolowych. Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w ciemności. Po dwóch godzinach przenieś szkiełka nakrywkowe do komory perfuzyjnej i ciągle przeglądaj wstępnie ciepłym roztworem HBS.
Aby zarejestrować obrazy bioluminescencyjne stężenia wapnia w mitochondriach, wybierz pole mikroskopowe zawierające komórki wyrażające korynę APO, jak pokazano na podstawie emisji fluorescencji. Następnie wyłącz światło mikroskopu. Usunąć pudełko zawierające dichroik znajdujący się na ścieżce światła.
Następnie wyłącz światło wzbudzenia i zamknij ciemne pudełko, aby uzyskać całkowitą ciemność. Perfuzja komórek za pomocą pożywki HBS, z roztworami testowymi lub bez nich podgrzanych do 37 stopni Celsjusza. Następnie rejestruj obrazy emisji fotonicznej co 10 sekund za pomocą kamery zliczającej fotony obsługiwanej przez procesor obrazu.
Następnie dodaj dig toin, aby uwolnić wszystkie pozostałe fotony Aby przeanalizować obrazy bioluminescencyjne odzwierciedlające mitochondrialny wapń. Otwórz obraz fluorescencji GFP. Wybierz poszczególne ROI, rysując wokół transfekowanych komórek.
Następnie skopiuj i wklej te same ROI na każdym obrazie sekwencji. Zrzuty ekranu. Następnie wyeksportuj wartości emisji fotonicznej dla każdego zwrotu z inwestycji do określonego oprogramowania w celu obliczenia wykresu kliknięcia.
Aby obliczyć wartości dla każdego ROI, wybierz wartość całkowitą i użyj bieżącego ROI dla wszystkich obrazów. Następnie naciśnij Oblicz, zapisz plik tekstowy i wyeksportuj dane. Następnie wykonaj odpowiednie obliczenia, aby oszacować wielkość wzrostu wapnia w mitochondriach w odpowiedzi na każdy pokazany bodziec.
Oto reprezentatywne obrazy jasnego pola i pseudo kolorów krótko- i długoterminowych kultur neuronów hipokampa przed i po stymulacji 100 mikromolami i MDA, cieplejsze kolory odzwierciedlają podwyższone stężenie wapnia cytozolowego. Ślady te pokazują reprezentatywne zapisy stężenia wapnia w cytozolu w pojedynczych komórkach w odpowiedzi na 100 mikromolów i MDA w krótkotrwałych i długoterminowych hodowlach neuronów hipokampa. Należy zauważyć, że wzrost stężenia wapnia w cytozolach jest znacznie większy w długim okresie niż w krótkotrwałych neuronach hodowanych.
W tym eksperymencie hodowane neurony hipokampa transfekowano koryną o niskim powinowactwie skierowaną do mitochondriów połączonej z GFP, inkubowaną z czterema mikromolowymi uszczelniaczami terezyny i poddano bioluminescencyjnemu obrazowaniu stężenia wapnia w mitochondriach. Tutaj nagrania, które pokazują uwalnianie emisji foto odbijających mitochondrialny wapń w krótko- i długoterminowych hodowanych neuronach hipokampa. Mikromol MDA 100 zwiększył stężenie wapnia w mitochondriach w starzejących się neuronach, ale nie w młodych hodowanych neuronach hipokampa Po tej procedurze.
Inne metody, takie jak sprawiedliwa ocena po lewej stronie, można połączyć z obrazowaniem fluorescencyjnym i bioluminescencyjnym w tych samych komórkach, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak podatność na komórki neuronalne, ołów związany z neurodegeneracją starzenia się i niedokrwieniem.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje przebudowę gospodarki wapniowej w starzejącym się mózgu, koncentrując się na tym, w jaki sposób przyczynia się ona do ekscytotoksyczności i uszkodzeń neuronów. Wykorzystując obrazowanie fluorescencyjne i bioluminescencyjne, praca bada poziom wapnia cytozolowego i mitochondrialnego w długoterminowych kulturach neuronów hipokampa szczura.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- biologia komórki
- badania nad starzeniem
Wprowadzenie
- Przeładowanie wapniem jest powiązane z ekscytotoksycznością i uszkodzeniem neuronów.
- Zrozumienie przebudowy gospodarki wapniowej jest kluczowe dla poznania zmian neuronalnych związanych ze starzeniem się.
- Neurony hipokampa szczura służą jako model do badania starzenia się neuronów.
- Techniki obrazowania fluorescencyjnego i bioluminescencyjnego umożliwiają szczegółową obserwację dynamiki wapnia.
Cel badania
- Zbadanie roli wewnątrzkomórkowego remodelowania wapnia w procesach starzenia.
- Zbadanie, w jaki sposób dynamika wapnia przyczynia się do ekscytotoksyczności.
- Wykorzystanie technik obrazowania do badania długoterminowych kultur neuronalnych.
Zastosowane metody
- Obrazowanie fluorescencyjne wapnia cytozolowego.
- Obrazowanie bioluminescencyjne wapnia mitochondrialnego.
- Długoterminowe hodowle neuronów hipokampa szczura.
- Ocena przebudowy wapniowej na różnych etapach rozwoju in vitro.
Główne wyniki
- Zidentyfikowano wzorce przebudowy poziomu wapnia w starzejących się neuronach.
- Wykazano związek między przeładowaniem wapniem a uszkodzeniem neuronów.
- Przedstawiono wgląd w mechanizmy ekscytotoksyczności w procesie starzenia.
- Wykazano skuteczność technik obrazowania w badaniu pojedynczych neuronów.
Wnioski
- Przebudowa gospodarki wapniowej odgrywa istotną rolę w starzeniu się neuronów.
- Zrozumienie tych procesów może pomóc w wyznaczeniu celów terapeutycznych dla chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem.
- Techniki obrazowania są cenne w badaniu dynamiki wapnia w neuronach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Zrozumienie przebudowy wapnia w starzejących się neuronach zapewnia pewność prognostyczną w zakresie walidacji celów w programach badawczych nad chorobami neurodegeneracyjnymi. Metoda ta umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez powiązanie wewnątrzkomórkowej dynamiki wapnia z ekscytotoksycznością i uszkodzeniami neuronów. Wspiera ona wczesne decyzje w procesie odkrywania leków poprzez modelowanie patofizjologicznych reakcji związanych z wiekiem w kontrolowanym systemie in vitro.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących przeciążenia wapniem w szlakach ekscytotoksyczności.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez monitorowanie w czasie rzeczywistym przepływów wapnia w cytozolu i mitochondriach.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję portfolio poprzez identyfikację związków modulujących zależne od wieku odpowiedzi wapniowe.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane układy neuronalne do późniejszego przesiewu związków w kierunku toksyczności zależnej od wapnia.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje odczyty fluorescencyjne i bioluminescencyjne w celu uzyskania powtarzalnych ilościowych pomiarów wapnia.
- Wartość skalowalności: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy w modelach neuronalnych młodych i starych w celu opracowania analiz porównawczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zgodność z systemami istotnymi dla przebiegu choroby poprzez modelowanie starzejących się neuronów hipokampa in vitro.
- Wartość translacyjna: Połączenie fazy odkryć z walidacją przedkliniczną dzięki ciągłości w mechanizmach dysregulacji wapnia.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Dostarcza informacji dla decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o profile odpowiedzi wapniowej w neuronach starzejących się w porównaniu z młodymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, umożliwiając testowanie hipotez dotyczących związków modulujących poziom wapnia w modelach neuronalnych związanych z procesami starzenia.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego w badaniach nad celami ekscytotoksyczności zależnej od wapnia.
- Przesiewanie: Dostarcza systemów gotowych do analizy ze standaryzowanymi odczytami strumienia wapnia w celu oceny związków.
- Analityka: Zapewnia ilościowe wyniki fluorescencji ratiometrycznej oraz bioluminescencji z liczeniem fotonów do porównywania warunków.
- Badania translacyjne: Łączy z ciągłością przedkliniczną poprzez modelowanie fenotypów starzenia i wzorców przebudowy gospodarki wapniowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do podłużnych badań dynamiki wapnia w różnych etapach dojrzewania neuronów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej w walidacji celu poprzez mechanistyczny wgląd w przebudowę poziomu wapnia.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dwumodalnego obrazowania wapnia w pierwotnych kulturach neuronów.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez redukcję biologicznego ryzyka na późnych etapach programów dotyczących neurodegeneracji.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja związków z uwzględnieniem ryzyka na podstawie ich skuteczności w modelach odpowiedzi wapniowej w dojrzałych neuronach.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli pierwotnych neuronów, transfekcji oraz obrazowaniu żywych komórek.
- Zależne od mikroskopii fluorescencyjnej, kamer liczących fotony oraz oprogramowania do obrazowania ratiometrycznego.
- Konieczna jest standaryzacja pomiędzy zespołami w celu uzyskania spójnych modeli starzenia opartych na DIV oraz protokołów stymulacji.
- Wymaga rozważenia adaptacji przy przenoszeniu wyników na inne podtypy neuronów lub modele chorób.
- Ograniczone przez charakter modelu in vitro, który może nie w pełni oddawać złożoność starzenia in vivo.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:22
Short and Long-term Culture of Rat Hippocampal Neurons
4:59
Fluorescence Imaging of Cytosolic Ca2+ Concentration
7:23
Biolumninescence Imaging of Mitochondria Ca2+ Concentration
11:17
Results: NMDA Increases Cytosolic [Ca2+] and Induces Mitochondrial Ca2+ Overload in Hippocampal Neurons
12:52
Conclusion
