Laserowe śledzenie neuronów w eksplantatach mózgu

Ogólnym celem tej metody jest znakowanie neuronów i ich projekcji aksonalnych w celu prześledzenia ich połączeń z docelowymi lub źródłowymi jądrami mózgu. Metoda ta pomaga w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuronauki, takie jak wzorce łączności między różnymi obszarami lub subpopulacjami neuronów w mózgu, a także ich znaczenie funkcjonalne dla danego obwodu neuronalnego. Główną zaletą tej techniki jest zwiększona precyzja celowania podczas iniekcji tracerów.

Osiąga się to poprzez wykorzystanie podstawowego sprzętu optycznego do wizualizacji jądra mózgu znakowanych fluorescencyjnie. Inną zaletą tej metody jest to, że umożliwia ona nieinwazyjne genotypowanie młodych myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych pod kontrolą promotorów neuronalnych. Podczas genotypowania młodych osobników należy sprawdzić ekspresję odpowiednich markerów fluorescencyjnych, używając wskaźnika laserowego o właściwej długości fali wzbudzenia.

Jednocześnie należy założyć gogle z filtrem, które blokują długość fali wzbudzenia, ale przepuszczają długość fali emisji. Skieruj laser na tył głowy lub rdzeń kręgowy danego szczenięcia. Należy uważać, aby nie świecić laserem w oczy zwierzęcia i ograniczyć czas ekspozycji na laser do minimum.

Wzbudzone markery fluorescencyjne powinny być widoczne przez skórę. U starszych myszy możliwe jest zidentyfikowanie pojedynczych neuronów w pobranych tkankach. Po znieczuleniu myszy i sprawdzeniu braku odruchów, należy usunąć skórę znad czaszki, przecinając ją wzdłuż tyłu głowy do środkowej części czaszki.

U jeszcze starszych myszy, powyżej jednego miesiąca, fluorescencję można zaobserwować przez oczy zwierzęcia. Następnie, używając lodowatego PBS, przeprowadź perfuzję przezsercową zwierzęcia wykazującego obecność markera za pomocą igły o rozmiarze 30 G; po pięciu do 10 minut większość krwi zostanie usunięta. Następnie wyjmij mózg i wypreparuj obszar zainteresowania.

Tutaj ciało trapezowate, stanowiące dwie wyraźne wypukłości w brzusznej części mózgu, zawiera obszar zainteresowania. Przygotowanie jąder brzusznych ciała trapezowatego (VNTB) rozpoczyna się od przeniesienia wyekstrahowanego obszaru mózgu do naczynia z natlenionym roztworem do sekcji. Następnie eksplant należy unieruchomić za pomocą igieł strzykawki o rozmiarze 30 G w taki sposób, aby obszar wstrzyknięcia był dostępny od góry.

Do iniekcji należy użyć szklanych pipet iniekcyjnych z borokrzemianu, wytworzonych w trzech lub czterech cyklach wyciągania. Pipetę należy napełnić następującym roztworem: podjednostką B toksyny cholery sprzężoną z Alexa FLUORA 4 5 55, stosowaną głównie do transportu retrogradnego.

Po zamontowaniu i przygotowaniu do pracy wskaźnika laserowego oraz pipet do iniekcji, należy skierować wiązkę na oznaczoną obszar mózgu lub komórki, w które ma zostać wykonana iniekcja. Obserwując pole widzenia przez gogle z filtrem pasmowym, należy zidentyfikować neurony, które będą celem iniekcji. Następnie, za pomocą mikromanipulatora, należy ustawić pipetę w obszarze zainteresowania.

Następnie, używając injektora ciśnieniowego ustawionego na podawanie impulsów trwających 50 milisekund przy ciśnieniu 15 PS, wstrzykuję substancję śledzącą w dwóch do 10 impulsach. Odczekuję od 10 do 15 sekund pomiędzy impulsami, aby wstrzyknięty barwnik mógł się rozprzestrzenić. Podczas wstrzykiwania tetraetylorubydyny stymuluję elektrycznie ten obszar za pomocą elektrody stymulującej podającej impulsy TTL.

Upewnij się, że elektroda jest uziemiona w roztworze kąpieli. Podaj osiem impulsów TTL o napięciu 8 V każdy, o czasie trwania 50 ms i odstępach 50 ms. Stymuluj dany obszar, powtarzając serię impulsów od 10 do 20 razy w ciągu kilku minut.

Jądra mózgu różnią się wielkością, gęstością neuronalną i typami komórek. Oznacza to, że czas trwania oraz liczba impulsów ciśnieniowych i/lub elektrycznych mogą wymagać dostosowania, aby uzyskać optymalne wyniki znakowania dla danego regionu mózgu. Używając lasera i gogli, należy sprawdzić sygnał fluorescencyjnego znacznika.

Barwnik powinien zostać pobrany przez komórki i rozprzestrzenić się wokół miejsca wstrzyknięcia. Po iniekcji inkubować pnie mózgu w napowietrzonym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym w temperaturze pokojowej przez jedną do czterech godzin. Podczas inkubacji należy zachować napowietrzanie, a następnie utrwalić tkankę w 4%paraform aldehyde.

Po całonocnej inkubacji w PBS w temperaturze 4 °C, następnego dnia tkankę można pokroić i zamontować, wykonując zastrzyk śródstopniowy do jądra brzusznego ciała trapezowatego (VNTB). Zastosowanie dekstryny tetraetylorodynowej wykazuje, że projekcje z VNTB rozciągają się do jądra przyśrodkowego ciała trapezowatego (MNTB). Następnie do MNTB wstrzyknięto cholinę, podjednostkę B, co spowodowało silne znakowanie wsteczne VNTB.

Większe szczegóły wykazały, że następnie oznakowane zostały ciała komórek glikowych VNTB w układzie jelitowym. Do MNTB wstrzyknięto znakownik retrogradny dekstryna tri. W przeciwieństwie do punktowego wzorca znakowania CTB, znakowanie dekstryną trit było gęste i przypominało GOGI.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak znakować neurony oraz ich wypustki z zwiększoną dokładnością. Przedstawiona technika pomaga w identyfikacji obszarów mózgu i subpopulacji neuronalnych uczestniczących w danym obwodzie neuronowym; po opanowaniu metody procedura wstrzykiwania może zająć około 30 minut, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Procedurę tę można łatwo połączyć z innymi metodami, takimi jak immunochemia lub utrwalanie i przezrocznienie tkanki mózgowej (brain clearing), aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące morfologii, kierunkowości lub funkcjonalności projekcji neuronalnych i innych struktur neuronalnych.