Name: Laserowe śledzenie neuronów w eksplantatach mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Poznaj technikę etykietowania neuronów i ich projekcji aksonalnych w eksplantatach mózgu myszy. Ta metoda zwiększa dokładność iniekcji znaczników przy użyciu podstawowego sprzętu optycznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Obsługiwane przez NIH/NIDCD R01 DC 011582. Eksperymenty obrazowe przeprowadzono w University of Colorado Anschutz Medical Campus Advanced Light Microscopy Core, wspieranym częściowo przez NIH/NCRR Colorado CTSI Grant Number UL1 RR025780 oraz Rocky Mountain Neurlogical Disorders Core Grant NIH P30NS048154. Dr Sascha du Lac z Instytutu Salka dostarczył nam myszy GlyT2-GFP.

1. Genotypowanie optyczne
1. Genotypowanie optyczne szczeniąt myszy
<ol>
	<li>Sprawdzić ekspresję odpowiedniego markera fluorescencyjnego za pomocą wskaźnika laserowego o odpowiedniej długości fali wzbudzenia (405 nm w opisanych tutaj doświadczeniach) i odpowiednich gogli filtrujących blokujących długość fali wzbudzenia, ale przechodzących przez długość fali emisyjnej (450 - 700 nm w opisanych tutaj doświadczeniach). Skieruj wskaźnik laserowy na tył głowy lub rdzeń kręgowy szczeniaka myszy (patrz rysunek 1). Unikaj świecenia laserem w oczy i długotrwałej ekspozycji skóry na światło lasera.</li>
</ol>
2. Genotypowanie optyczne starszych zwierząt
<ol>
	<li>Głęboko znieczulić mysz (w wieku od p14 do p138 w opisanych tutaj eksperymentach) przedawkowaniem pentobarbitalu poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (120 mg/kg masy ciała). Potwierdź prawidłowe znieczulenie, sprawdzając odruchy zwierzęcia (krótko uszczypnij czubek ucha lub jedną z tylnych nóg, aby wywołać odruch wycofania ucha lub nogi). </li>
	<li>Uwaga: Pomimo przedawkowania pentobarbitalu (120 mg/kg masy ciała) procedurę wstrzyknięcia nazywamy "głębokim znieczuleniem" zamiast eutanazji, ponieważ w idealnym przypadku zwierzę jest jeszcze żywe (tj. jego serce nadal bije), gdy rozpoczyna się operacja i perfuzja. Zapewnia to bardziej efektywną perfuzję narządów wewnętrznych, w tym mózgu. </li>
	<li>Gdy zwierzę nie wykazuje żadnych odruchów, ostrożnie usuń skórę pokrywającą czaszkę (ryc. 2A), wykonując nacięcie w skórze pokrywającej tył głowy i przecinając do środkowej części czaszki. Wystaw odsłoniętą czaszkę na działanie światła laserowego i obserwuj fluorescencję przez gogle filtrujące, jak opisano powyżej. Jeśli zaobserwuje się pozytywny sygnał GFP, przejdź do kroku 2, jeśli nie, uśmierc zwierzę poprzez ścięcie głowy (druga/zapewniająca forma eutanazji zgodnie z naszymi przepisami IACUC). </li>
</ol>
Uwaga: U jeszcze starszych myszy ( >1 miesiąc) fluorescencję można zaobserwować oczami zwierzęcia.
2. Perfuzja przezsercowa i preparacja mózgu
<ol>
	<li>Perfuzja przezsercowa lodowato zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS; NaCl: 137 mM, KCl: 2,7 mM, KH2PO4: 1,76 mM, Na2HPO4: 10 mM) za pomocą igły strzykawkowej 30 G, aby w znacznym stopniu usunąć krew ze zwierzęcia.
	<ol>
		<li>Najpierw ostrożnie otwórz klatkę piersiową ostrymi nożyczkami, a następnie wepchnij igłę do lewej komory serca. Zacznij pompować PBS do serca i aorty, a natychmiast po tym kroku otwórz prawe przedsionki serca nożyczkami, aby umożliwić krew wydostanie się z organizmu. Uwaga: Perfuzja trwa 5 - 10 minut w zależności od wielkości zwierzęcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wykrwawieniu przez perfuzję należy odciąć głowę zwierzęciu, zabezpieczyć jego głowę igłami (lub igłami strzykawkowymi 30 G), przekłuwając je przez oczodoły w naczyniu do przygotowywania i usunąć mózg z czaszki.
	<ol>
		<li>Najpierw użyj ostrych nożyczek, aby odciąć skórę pokrywającą czaszkę: wykonaj małe nacięcie z tyłu głowy, następnie przeciąć wzdłuż linii środkowej po grzbietowej stronie głowy, przyciąć na boki tuż doogonowo od oczu zwierzęcia i na koniec przeciąć w kierunku ogonowym, aby całkowicie usunąć płaty skóry z tyłu głowy.</li>
		<li>Następnie powtórz ten sam wzór cięcia dla samej czaszki, upewnij się, że usunąłeś oba ślimaki w tym procesie, ponieważ znacznie uprości to usunięcie pnia mózgu w końcu. Po tym zabiegu ogonowa połowa mózgu powinna leżeć całkowicie odsłonięta.</li>
		<li>W kolejnym kroku za pomocą ostrej żyletki lub skalpela przeciąć całe przodomózgowie pod kątem około 45° i około 2 mm rostral od móżdżku. Wyciągnij oddzieloną przednią połowę mózgu za pomocą zgiętej szpatułki.</li>
		<li>Użyj szpatułki, aby podnieść ogonową połowę mózgu na jej rostralnym końcu, a następnie przeciąć nerwy czaszkowe, które są nadal połączone z pniem mózgu po jego brzusznej stronie. W efekcie końcowym ogonowa połowa mózgu, w tym pień mózgu, powinna swobodnie opadać z reszty przygotowanej głowy zwierzęcia.</li>
		<li>Odwróć usuniętą ogonową połowę mózgu, aby odsłonić jej brzuszną stronę i przeciąć wzdłuż płaszczyzny koronalnej tylko rostralnie (w przypadku iniekcji następczych) lub tylko ogonowej (w przypadku wstrzyknięć wstecznych) brzusznie położonych "bańek" zawierających ciało trapezoidalne (patrz krok 2.3).
		<ol>
			<li>Do procedury cięcia zawsze używaj ostrej żyletki lub skalpela, aby zminimalizować śmierć komórek spowodowaną nadmiernym obciążeniem mechanicznym tkanki. W rezultacie powinien zostać uzyskany eksplant mózgu o długości około 1 cm i zawierający kompletny górny kompleks oliwarów wzdłuż innych obszarów mózgu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Uwaga: Ten protokół demonstruje procedurę wstrzykiwania znacznika do ciała trapezoidalnego znajdującego się w słuchowym pniu mózgu. W razie potrzeby dostosuj położenie i orientację płaszczyzn cięcia i miejsc iniekcji. Jeśli fluorescencyjne obszary mózgu będące przedmiotem zainteresowania leżą wystarczająco blisko powierzchni mózgu, tak że można je zidentyfikować i wstrzyknąć bez przecinania mózgu (patrz Rysunek 2B), wówczas etap cięcia koronalnego można pominąć.
<ol start="3">
	<li>Zidentyfikuj ciało trapezoidalne jako dwie wydatne brzuszne "bańki" zawierające jądro brzuszne ciała trapezoidalnego (VNTB).</li>
</ol>
Uwaga: Aby uzyskać więcej informacji anatomicznych na temat przybliżonego stereotaktycznego położenia tych płaszczyzn cięcia, zobacz Franklin & Paxinos, 2008. Panel 78 atlasu, Bregma ~ -5,7 mm pokazuje przyśrodkowe jądro ciała trapezoidalnego (=MNTB) oznaczone jako "Tz". Panel 69 przedstawia jądro brzuszne ciała trapezoidalnego (VNTB) oznaczone jako "MVPO" (jądro okołooliwarowe przyśrodkowo-brzuszne)19.
3. Śledzenie wsteczne/wsteczne
Uwaga: Wykonaj wszystkie poniższe procedury przy temperaturze RT (25°C).
<ol>
	<li>Po przecięciu umieścić eksplant pnia mózgu w naczyniu przygotowawczym zawierającym natleniony (95%O2, 5% CO2) roztwór preparacyjny (NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl2: 1 mM, CaCl2: 0,1 mM, glukoza: 25 mM, NaH2PO4: 1,25 mM, NaHCO3: 25 mM, kwas askorbinowy: 0,4 mM, mio-inozytol: 3 mM, kwas pirogronowy: 2 mM), zabezpieczając go igłami strzykawkowymi 30 G. Upewnij się, że obszar wstrzyknięcia jest skierowany do góry.</li>
	<li>Wyciągnąć pipety iniekcyjne ze szkła borokrzemianowego i napełnić je jednym z następujących trzech roztworów: a) roztworem 1,0 mg/ml podjednostki b cholesteroleratoksyny sprzężonym z fluoroforem Alexa 555 w PBS12-13 (używanym głównie do transportu wstecznego), b) 1% rozcieńczeniem w 0,9% soli fizjologicznej dekstranu tetrametylorodaminy 555 (3 000 MW, stosowany głównie do transportu wstecznego) lub c) 1% rozcieńczeniem w 0,9% soli fizjologicznej dekstranu-TRITC 555 o mocy 10 000 MW (stosowany głównie do transportu następczego).
	<ol>
		<li>Upewnij się, że rezystancja pipet iniekcyjnych wynosi od 2,5 do 3,5 MOhm i że są one produkowane w 3-4 cyklach ciągnięcia. W przypadku opisanych tutaj eksperymentów należy to osiągnąć, wybierając wstępnie zaprogramowany algorytm ciągnięcia na ściągaczu do pipet.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oświetlić eksplant mózgu za pomocą statycznie zamontowanego wskaźnika laserowego o odpowiedniej długości fali (pozycja nr 2 na rysunku 3A; długość fali 405 nm w opisanych tutaj eksperymentach). Użyj wskaźnika laserowego jako przewodnika do wstrzyknięć i skieruj wiązkę laserową na znakowane fluorescencyjnie jądro mózgu lub komórki będące przedmiotem zainteresowania, które zostaną wstrzyknięte.</li>
	<li>Znajdź i obserwuj oświetlony obszar docelowy za pomocą mikroskopu dwuokularowego, nosząc kompatybilne gogle filtrujące (filtr pasmowo-przepustowy 450 - 700 nm w opisanych tutaj eksperymentach). Wprowadzić elektrodę iniekcyjną za pomocą mikromanipulatora w obszar zainteresowania.</li>
	<li>Wstrzyknąć substancję znacznikową. Zastrzyki składają się z 2 - 10 impulsów ciśnienia o ciśnieniu 15 psi przez 50 ms każdy, za pomocą urządzenia do wstrzykiwania ciśnienia, skierowanych prostopadle do obszaru zainteresowania (ROI) w sekcji mózgu. Podawaj każdy impuls ciśnienia w odstępach 10 - 15 sekund, aby umożliwić rozprowadzenie barwnika.</li>
	<li>W przypadku iniekcji tetrametylorodaminy (TRITC) należy dodatkowo stymulować elektrycznie w celu zwiększenia wychwytu barwnika poprzez elektroporację z elektrodą umieszczoną w obszarze mózgu będącym przedmiotem zainteresowania (MNTB i VNTB w opisanych tutaj eksperymentach).
	<ol>
		<li>Użyj 8 impulsów TTL o napięciu 8 V przez 50 ms z interwałami międzyimpulsowymi 50 ms, napędzanych stymulatorem i wzmacnianych do 55 V za pomocą izolatora stymulacji (pozycje nr 7 i 9 na rysunku 3B). Stosować 10 - 20 powtórzeń tego protokołu, podawanych przez kilka minut7,8. Upewnij się, że elektroda jest prawidłowo uziemiona - przewód uziemiający powinien być podłączony do roztworu wanny!</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdzić, czy wstrzyknięcie zakończyło się powodzeniem. Ponieważ znacznik fluorescencyjny o dłuższej długości fali emisyjnej emituje również sygnał fluorescencyjny po wzbudzeniu laserowym krótszymi długościami fal, należy wizualnie sprawdzić absorpcję/rozprzestrzenianie się barwnika w wstrzykniętym obszarze docelowym, oświetlając obszar laserem i obserwując przez gogle filtrujące.</li>
</ol>
4. Inkubacja
<ol>
	<li>Po wstrzyknięciu należy inkubować pnie mózgu w natlenionym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (ACSF; NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl2: 1 mM, CaCl2: 2 mM, glukoza: 25 mM, NaH2PO4: 1,25 mM, NaHCO3: 25 mM, kwas askorbinowy: 0,4 mM, mio-inozytol: 3 mM, kwas pirogronowy: 2 mM, bąbelkowany 95% O2 - 5% CO2) w temperaturze pokojowej (RT, 25° C) przez 1 - 4 godziny, podczas transportu barwnika. Bąbelkować roztwór przez cały okres inkubacji.</li>
	<li>Następnie przenieś pnie mózgu w 4% paraformaldehydzie (PFA) rozpuszczonym w PBS (ok. 100 ml; pH 7 dla mieszanki PFA/PBS) i inkubuj je w temperaturze 4° C, aby umożliwić późniejsze utrwalenie przez noc (O/N).</li>
</ol>
5. Krojenie i montaż tkanek
<ol>
	<li>Następnego dnia umyj pień mózgu trzy razy w PBS (5 minut na każdy etap mycia), przykryj go 4% agarem, a następnie pokrój w plastry o grubości 50 - 80 μm na wibratomie. Plastry namontować za pomocą podłoża montażowego na szkiełku podstawowym i szkiełku nakrywkowym.</li>
	<li>Opcjonalnie oznacz sekcje fluorescencyjnym Nisslem przez 25 minut (na przykład niebieskim Nisslem w rozcieńczeniu 1:100 w pożywce AB).
	<ol>
		<li>Aby przygotować pożywkę AB, zmieszać 250 ml 0,2 M buforu fosforanowego (PB; 51 mM KH2PO4, 150 mM Na2HPO4), 15 ml 5 M NaCl, 15 ml 10% Triton-X, 220 ml ddH2O i 5 g albuminy surowicy bydlęcej.</li>
		<li>Poprzedz i zakończ etap etykietowania Nissl o 3 etapy mycia w PBS (10 min każdy).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Uwaga: W przypadkach, gdy grubsze odcinki muszą być zamontowane i przeanalizowane (w opisanych tutaj eksperymentach takie plastry miały grubość 100 - 500 mikronów, aby zachować połączenia aksonalne na większe odległości), technika ta może być połączona z oczyszczaniem tkanek. Stwierdziliśmy, że ClearT212 jest udany20. Gdy dołączony jest etap oczyszczania tkanki, wykonaj go przed zamontowaniem sekcji.

<ol><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+the+sections+of+glossopharyngeal+and+hypoglossal+nerves+of+the+frog+and+observations+of+the+alterations+produced+thereby+in+the+structure+of+their+primitive+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond%22%5BJournal%5D)">Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).</li>
<li>Fink, R. P., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+for+selective+silver+impregnation+of+degenerating+axons+and+their+synaptic+endings+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Two methods for selective silver impregnation of degenerating axons and their synaptic endings in the central nervous system.</a> Brain Res. 4, 369-374 (1967).</li>
<li>Nauta, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+silver+impregnation+of+degenerating+axons+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technol%22%5BJournal%5D)">Selective silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system.</a> Stain Technol. 27, 175-179 (1952).</li>
<li>Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l'Homme et des vertébrés. , Maloine, Paris. (1911).</li>
<li>Kristensson, K., Olsson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+retrograde+transport+of+peroxidase+in+hypoglossal+neurons.+Electron+microscopical+localization+in+the+neuronal+perikaryon%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Uptake and retrograde transport of peroxidase in hypoglossal neurons. Electron microscopical localization in the neuronal perikaryon.</a> Acta Neuropathol. 19, 1-9 (1971).</li>
<li>Kristensson, K., Olsson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+axonal+transport+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Retrograde axonal transport of protein.</a> Brain Res. 29, 363-365 (1971).</li>
<li>Burger, R. M., Cramer, K. S., Pfeiffer, J. D., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+superior+olivary+nucleus+provides+divergent+inhibitory+input+to+parallel+auditory+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Avian superior olivary nucleus provides divergent inhibitory input to parallel auditory pathways.</a> J. Comp. Neurol. 481, 6-18 (2005).</li>
<li>Ford, M. C., Grothe, B., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fenestration+of+the+calyx+of+Held+occurs+sequentially+along+the+tonotopic+axis%2C+is+influenced+by+afferent+activity%2C+and+facilitates+glutamate+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Fenestration of the calyx of Held occurs sequentially along the tonotopic axis, is influenced by afferent activity, and facilitates glutamate clearance.</a> J. Comp. Neurol. 514, 92-106 (2009).</li>
<li>Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dextran+amines+used+as+axonal+tracers+in+the+nervous+system+of+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dextran amines used as axonal tracers in the nervous system of chicken embryo.</a> J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).</li>
<li>Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Gonatas, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugates+of+horseradish+peroxidase+%28HRP%29+with+cholera+toxin+and+wheat+germ+agglutinin+are+superior+to+free+HRP+as+orthograde+transported+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Conjugates of horseradish peroxidase (HRP) with cholera toxin and wheat germ agglutinin are superior to free HRP as orthograde transported markers.</a> Brain Res. 223, 381-385 (1981).</li>
<li>Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Steiber, A., Gonatas, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horseradish+peroxsidase+%28HRP%29+conjugates+of+cholera+toxin+and+lectins+are+more+sensitive+retrograde+transported+markers+than+free+HRP%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Horseradish peroxsidase (HRP) conjugates of cholera toxin and lectins are more sensitive retrograde transported markers than free HRP.</a> Brain Res. 231, 33-50 (1982).</li>
<li>Conte, W. L., Kamishina, H., Corvin, J. V., Reep, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+in+the+projections+of+lateral+posterior+thalamus+with+cingulate+and+medial+agranular+cortex+in+relation+to+circuitry+for+directed+attention+and+neglect%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Topography in the projections of lateral posterior thalamus with cingulate and medial agranular cortex in relation to circuitry for directed attention and neglect.</a> Brain Res. 1240, 87-95 (2008).</li>
<li>Conte, W. L., Kamishina, H., Reep, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+neuroanatomical+tract-tracing+using+fluorescent+Alexa+Fluor+conjugates+of+cholera+toxin+subunit+B+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Multiple neuroanatomical tract-tracing using fluorescent Alexa Fluor conjugates of cholera toxin subunit B in rats.</a> Nat. Protoc. 4, 1157-1166 (2009).</li>
<li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-+from+single+cells+to+the+entire+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo- from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li>
<li>Zeilhofer, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycinergic+neurons+expressing+enhanced+green+fluorescent+protein+in+bacterial+artificial+chromosome+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice.</a> J. Comp. Neurol. 482, 123-141 (2005).</li>
<li>Poyatos, I., Ponce, J., Aragön, C., Giménez, C., Zafra, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glycine+transporter+GLYT2+is+a+reliable+marker+for+glycine-immunoreactive+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res.+Mol.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The glycine transporter GLYT2 is a reliable marker for glycine-immunoreactive neurons.</a> Brain. Res. Mol. Brain Res. 49, 63-67 (1997).</li>
<li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li>
<li>Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bac+to+the+future%3A+the+use+of+BAC+transgenic+mice+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bac to the future: the use of BAC transgenic mice for neuroscience research.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2, 861-870 (2001).</li>
<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 3rd ed, Elsevier/Academic Press. New York. (2008).</li>
<li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140, 1364-1368 (2013).</li>
<li>Wouterlood, F. G., Jorritsma-Byham, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anterograde+neuroanatomical+tracer+biotinylated+dextran+amine%3A+comparison+with+the+tracer+PHA-L+in+preparations+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine: comparison with the tracer PHA-L in preparations for electron microscopy.</a> J. Neurosci. Methods. 48, 75-87 (1993).</li>
<li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+half+century+of+experimental+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">A half century of experimental neuroanatomical tracing.</a> J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).</li>
<li>Rodriguez-Contreras, A., Silvio, J., van Hoeve, S., Habets, L. P., Locher, H., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+development+of+the+calyx+of+Held+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Dynamic development of the calyx of Held synapse.</a> PNAS. 105 (14), 5603-5608 (2008).</li>
<li>Albrecht, O., Dondzillo, A., Mayer, F., Thompson, J. A., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+projections+from+the+ventral+nucleus+of+the+trapezoid+body+to+the+medial+nucleus+of+the+trapezoid+body+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Inhibitory projections from the ventral nucleus of the trapezoid body to the medial nucleus of the trapezoid body in the mouse.</a> Front. Neural Circuits. 8, 83(2014).</li>
<li>Benson, D. A., Teas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+unit+of+binaural+interaction+in+the+auditory+cortex+of+the+chinchilla%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Single unit of binaural interaction in the auditory cortex of the chinchilla.</a> Brain Res. 103, 313-338 (1976).</li>
<li>Koka, K., Jones, H. G., Thornton, J. L., Lupo, J. E., Tollin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sound+pressure+transformations+by+the+head+and+pinnae+of+the+adult+Chinchilla+%28Chinchilla+lanigera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Sound pressure transformations by the head and pinnae of the adult Chinchilla (Chinchilla lanigera).</a> Hear Res. 272 (1-2), 135-147 (2011).</li>
<li>Ryan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+sensitivity+of+the+mongolian+gerbil%2C+Meriones+unguiculatus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Acoust.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Hearing sensitivity of the mongolian gerbil, Meriones unguiculatus.</a> J. Acoust. Soc. Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).</li>
<li>Zwicker, E., Fastl, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZwicker%2C+E+%22Psychoacoustics+Facts+and+Models%22">Psychoacoustics Facts and Models</a>. , Springer. (1990).</li>
<li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).</li>
<li>Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrically+induced+DNA+uptake+by+cells+is+a+fast+process+involving+DNA+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis.</a> Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).</li>
<li>Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+Slice+Culture+of+E18+Rat+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains.</a> J. Vis. Exp. (6), e235(2007).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li>
<li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Ogólną zaletą elektroporacji znacznikowej in vitro , w przeciwieństwie do badań śledzenia in vivo , jest to, że daje ona naukowcom lepszy dostęp do obszaru zainteresowania mózgu, a zatem nie wymaga drogiego sprzętu stereotaktycznego (i często elektrofizjologicznego). Ponadto, okres przeżycia wymagany dla eksplantatów mózgu obejmuje tylko kilka godzin (1 - 4) zamiast dni lub nawet tygodni w przypadku wstrzyknięć znacznikowych in vivo (patrz szczegółowy przegląd stosowania amin dekstranu i innych...

Aby zdefiniować pewien (mikro)obwód neuronalny, należy zacząć od znalezienia różnych uczestników tego obwodu i ich wzorca połączeń. Od czasu publikacji Wallera na temat śledzenia włókien nerwowych poprzez uszkodzenie1 ustalono wiele różnych technik śledzenia neuroanatomicznego. Niektóre z tych technik mogą być stosowane w utrwalonej tkance post mortem2-4, inne polegają na aktywnym transporcie barwnika w żywych neuronach, jak odkryto w 1971 roku5-6. Te ostatnie można dalej podzielić na dwie grupy, rozróżniając metody wykorzystujące aktywną retrogradację (od wstrzykiwanego obszaru do źródła danej projekcji, czyli somatów neuronów, które rzutują na ten obszar) i aktywnego następczego (od wstrzykiwanego obszaru do celu danej projekcji, tj. wypustki aksonalne i zakończenia aksonalne znakowanych neuronów) transport. Ponadto w niektórych przypadkach materiał znacznikowy jest wstrzykiwany żywym zwierzętom, które następnie przeżywają wstrzyknięcie przez kilka dni lub tygodni (wstrzyknięcia znacznikowe in vivo), podczas gdy w innych przypadkach eksplantowane mózgi są wstrzykiwane i inkubowane przez kilka godzin po wstrzyknięciu w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (wstrzyknięcia znacznikowe in vitro).
W tym protokole zmodyfikowaliśmy istniejącą technikę elektroporacji in vitro 7-8, aby oznaczyć neuronalne somaty i procesy w eksperymentach śledzenia następczego i wstecznego przy użyciu podjednostki cholesterolotoksyny b i dekstranu tetrametylorodaminy jako substancji śledzących. Ogólnym celem tego protokołu jest dostarczenie neurobiologom skutecznego narzędzia do śledzenia wzorców połączeń neuronalnych między różnymi jądrami mózgu, przy jednoczesnym wykorzystaniu dostępnych linii myszy transgenicznych i podstawowego sprzętu optycznego w celu zwiększenia dokładności celowania podczas wstrzykiwań znacznika. Chociaż metoda śledzenia następczego i wstecznego przy użyciu choleratoksyny i aminy dekstranu oraz ich odpowiednich fluorescencyjnie znakowanych koniugatów nie jest nowa9-13 (podobnie jak metoda elektroporacji, np. Haas i wsp.14), połączenie wstrzyknięć znacznika z elektroporacją w preparacie in vitro obejmującym bloki tkanki mózgowej jest nowszym osiągnięciem7. Jego główną zaletą w porównaniu z technikami śledzenia neuronów wykorzystującymi ten sam rodzaj barwników znacznikowych u żywych zwierząt jest zwiększona intensywność znakowania, ze względu na wyższą wydajność, z jaką elektroporowany barwnik jest pobierany przez neurony. Dodatkowym atutem jest skrócony okres inkubacji (wymagany do transportu barwnika) oraz jego zwiększona dokładność celu podczas iniekcji znacznika, ponieważ eksperymentator ma wizualną kontrolę nad obszarem docelowym iniekcji. To ostatnie oznacza również, że nie jest wymagany drogi sprzęt stereotaktyczny, aby znaleźć jądro lub obszar zainteresowania mózgu.
Aby dodatkowo zwiększyć dokładność celowania, skorzystaliśmy z transgenicznej linii myszy, która wyraża GFP w swojej glicynergicznej subpopulacji neuronów15 oraz podstawowego sprzętu optycznego składającego się z ręcznego wskaźnika laserowego o długości fali 405 nm i dopasowanych okularów filtrujących pasmowo-przepustowych (450 - 700 nm). W ten sposób osiągnęliśmy znaczny dalszy wzrost dokładności celowania, identyfikując obszar wstrzyknięcia na podstawie sygnału fluorescencyjnego i zapewniając dokładniejszy sposób kontroli rozprzestrzeniania się barwnika w obszarze iniekcji poprzez obserwację interakcji między rodzimym sygnałem GFP a fluorescencją znacznika. Nasza technika pozwala również odkryć funkcjonalność obwodu wraz z jego łącznością poprzez identyfikację neuronów hamujących GFP-dodatnich (lub pobudzających w innych liniach myszy), które zostały wypełnione znacznikiem.
Podsumowując, jeszcze bardziej udoskonaliliśmy potężne narzędzie neuronaukowe do badania konektomu mózgu kręgowców i oceny różnych cech neuroanatomicznych danego obwodu nerwowego. Używając transgenicznych myszy wraz z niedrogim i powszechnie dostępnym sprzętem optycznym, byliśmy w stanie znacznie zwiększyć dokładność celowania naszych zastrzyków. Co więcej, transgeniczne myszy pozwoliły nam zidentyfikować rodzaj śledzonych połączeń, co pomogło odkryć funkcjonalność hamującego mikroobwodu w słuchowym pniu mózgu.

<table><tbody><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Wszystkie chemikalia pochodzą z Sigma-Aldrich, chyba że zaznaczono inaczej.</td></tr><tr><td>Chlorek potasu&nbsp;</td><td></td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td></td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td></td><td>S907</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek</td><td></td> magnezu <td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek</td><td></td> wapnia <td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td></td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan</td><td></td> sodu <td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Kwas</td><td></td> askorbinowy <td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Myo-inozytol</td><td></td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian</td><td></td> sodu <td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>A2153</td><td>opcjonalnie, do dodatkowej (immuno)histochemii</td>Triton-X-100 X100 opcjonalnie, do dodatkowej (immuno)histochemii Poli(glikol etylenowy), 8000 MW <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>P2139</td><td>opcjonalnie, do oczyszczania mózgu</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Fisher Scientific</td><td>F84</td><td>opcjonalnie, do oczyszczania mózgu</td></tr><tr><td>Podjednostka choleratoksyny-b</td><td>Sondy molekularne</td><td>C-34776 (Alexa 555)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td> <td>dekstranu tetrametylo-rodaminy</td><td>D-7162 (Alexa 555)</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjne Nissl</td><td>Invitrogen</td><td>N-21479 (niebieskie)</td> <td>opcjonalnie</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF93</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbi-tal</td><td>Vortech Pharmaceuticals</td><td>Fatal-Plus&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Filamenty ze szkła borokrzemianowego</td><td>Aparat Harvarda</td><td>G150F-10</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>Zeitz Instruments, Niemcy</td><td>DMZ Uniwersalny ściągacz</td><td></td></tr><tr><td>Konfiguracja perfuzji</td><td>Wykonany</td><td></td><td></td>na zamówienie</tr><tr><td>wskaźnik laserowy&nbsp;</td><td>laserpointerpro.com, Hong Kong</td><td>HK-88007294 (405 nm)</td><td></td></tr><tr><td>Gogle filtrujące/ochronne</td><td>Dragon Lasers, Chiny</td><td>LSG09 (pasmo przepustowe 450-700 nm)</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop biookularowy&nbsp;</td><td>Wild Heerbrugg, Szwajcaria</td><td>Wild M3</td><td>Wyposażony w oświetlacz o dużej intensywności (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)&nbsp;</td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Instruments</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>PC z zainstalowanym oprogramowaniem MC Stimulus</td><td>Multi Channel Sys-tems, Niemcy (oprogramowanie)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-kanałowy stymulator</td><td>Multi Channel Sys-tems, Niemcy</td><td>STG-1002</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka izolująca stymulację</td><td>A.M.P.I., Izrael</td><td>Mikromanipulator Iso-Flex</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige, Japonia</td><td>YOU-1</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica, Niemcy</td><td>VT1000S</td><td></td></tr></tbody></table>

laserowe śledzenie neuronów w eksplantatach mózgu

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Prezentujemy technikę, która łączy protokół wstrzykiwania znacznika in vitro, który wykorzystuje serię impulsów elektrycznych i ciśnieniowych do zwiększenia absorpcji barwnika poprzez elektroporację w eksplantatach mózgu z ukierunkowanym oświetleniem laserowym i dopasowanymi goglami filtrującymi podczas zabiegu. Opisana technika elektroporacji in vitro sama w sobie daje stosunkowo dobrą kontrolę wzrokową przy celowaniu w określone obszary mózgu. Łącząc to z laserowym wzbudzaniem fluorescencyjnych markerów genetycznych i ich odczytem przez gogle filtrujące przechodzące przez pasmo, które mogą wychwytywać emisje genetycznie znakowanych komórek/jąder i fluorescencyjny barwnik śledzący, badacz może znacznie zwiększyć dokładność wstrzyknięć, znajdując obszar zainteresowania i znacznie skuteczniej kontrolując rozprzestrzenianie się / wychwyt barwnika w obszarze wstrzyknięcia. Ponadto technika oświetlenia laserowego pozwala na badanie funkcjonalności danego obwodu nerwowego poprzez dostarczanie informacji o typie neuronów rzutujących na określony obszar w przypadkach, gdy ekspresja GFP jest związana z typem przekaźnika wyrażanego przez subpopulację neuronów.

Rysunki 1 i 2 pokazują, jak wskaźnik laserowy i okulary laserowe mogą być wykorzystane do szybkiego i niedrogiego genotypowania zwierząt GFP-dodatnich z miotu. W przypadku młodych myszy technikę tę można zastosować do nieinwazyjnego wykrywania znacznika GFP w mózgach zwierząt przez czaszkę i skórę (Rysunek 1A - D). Emitowana fluorescencja jest widoczna przez skórę i czaszkę młodych myszy przynajmniej do 3. dnia po urodzeniu (Rysunek 1C). Procedura została przedstawiona n...

Opisujemy technikę oznaczania neuronów i ich procesów poprzez iniekcje śladowe do jąder mózgowych za pomocą preparatu in vitro. Zmodyfikowaliśmy istniejącą metodę elektroporacji znaczników invitro, wykorzystując znakowane fluorescencyjnie mutanty myszy i podstawowy sprzęt optyczny w celu zwiększenia dokładności znakowania.

Laserowe śledzenie neuronów w eksplantatach mózgu

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Ogólnym celem tej metody jest znakowanie neuronów i ich projekcji aksonalnych w celu prześledzenia ich połączeń z docelowymi lub źródłowymi jądrami mózgu. Metoda ta pomaga w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuronauki, takie jak wzorce łączności między różnymi obszarami lub subpopulacjami neuronów w mózgu, a także ich znaczenie funkcjonalne dla danego obwodu neuronalnego. Główną zaletą tej techniki jest zwiększona precyzja celowania podczas iniekcji tracerów.Osiąga się to poprzez wykorzystanie podstawowego sprzętu optycznego do wizualizacji jądra mózgu znakowanych fluorescencyjnie. Inną zaletą tej metody jest to, że umożliwia ona nieinwazyjne genotypowanie młodych myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych pod kontrolą promotorów neuronalnych. Podczas genotypowania młodych osobników należy sprawdzić ekspresję odpowiednich markerów fluorescencyjnych, używając wskaźnika laserowego o właściwej długości fali wzbudzenia.Jednocześnie należy założyć gogle z filtrem, które blokują długość fali wzbudzenia, ale przepuszczają długość fali emisji. Skieruj laser na tył głowy lub rdzeń kręgowy danego szczenięcia. Należy uważać, aby nie świecić laserem w oczy zwierzęcia i ograniczyć czas ekspozycji na laser do minimum.Wzbudzone markery fluorescencyjne powinny być widoczne przez skórę. U starszych myszy możliwe jest zidentyfikowanie pojedynczych neuronów w pobranych tkankach. Po znieczuleniu myszy i sprawdzeniu braku odruchów, należy usunąć skórę znad czaszki, przecinając ją wzdłuż tyłu głowy do środkowej części czaszki.U jeszcze starszych myszy, powyżej jednego miesiąca, fluorescencję można zaobserwować przez oczy zwierzęcia. Następnie, używając lodowatego PBS, przeprowadź perfuzję przezsercową zwierzęcia wykazującego obecność markera za pomocą igły o rozmiarze 30 G; po pięciu do 10 minut większość krwi zostanie usunięta. Następnie wyjmij mózg i wypreparuj obszar zainteresowania.Tutaj ciało trapezowate, stanowiące dwie wyraźne wypukłości w brzusznej części mózgu, zawiera obszar zainteresowania. Przygotowanie jąder brzusznych ciała trapezowatego (VNTB) rozpoczyna się od przeniesienia wyekstrahowanego obszaru mózgu do naczynia z natlenionym roztworem do sekcji. Następnie eksplant należy unieruchomić za pomocą igieł strzykawki o rozmiarze 30 G w taki sposób, aby obszar wstrzyknięcia był dostępny od góry.Do iniekcji należy użyć szklanych pipet iniekcyjnych z borokrzemianu, wytworzonych w trzech lub czterech cyklach wyciągania. Pipetę należy napełnić następującym roztworem: podjednostką B toksyny cholery sprzężoną z Alexa FLUORA 4 5 55, stosowaną głównie do transportu retrogradnego.Po zamontowaniu i przygotowaniu do pracy wskaźnika laserowego oraz pipet do iniekcji, należy skierować wiązkę na oznaczoną obszar mózgu lub komórki, w które ma zostać wykonana iniekcja. Obserwując pole widzenia przez gogle z filtrem pasmowym, należy zidentyfikować neurony, które będą celem iniekcji. Następnie, za pomocą mikromanipulatora, należy ustawić pipetę w obszarze zainteresowania.Następnie, używając injektora ciśnieniowego ustawionego na podawanie impulsów trwających 50 milisekund przy ciśnieniu 15 PS, wstrzykuję substancję śledzącą w dwóch do 10 impulsach. Odczekuję od 10 do 15 sekund pomiędzy impulsami, aby wstrzyknięty barwnik mógł się rozprzestrzenić. Podczas wstrzykiwania tetraetylorubydyny stymuluję elektrycznie ten obszar za pomocą elektrody stymulującej podającej impulsy TTL.Upewnij się, że elektroda jest uziemiona w roztworze kąpieli. Podaj osiem impulsów TTL o napięciu 8 V każdy, o czasie trwania 50 ms i odstępach 50 ms. Stymuluj dany obszar, powtarzając serię impulsów od 10 do 20 razy w ciągu kilku minut.Jądra mózgu różnią się wielkością, gęstością neuronalną i typami komórek. Oznacza to, że czas trwania oraz liczba impulsów ciśnieniowych i/lub elektrycznych mogą wymagać dostosowania, aby uzyskać optymalne wyniki znakowania dla danego regionu mózgu. Używając lasera i gogli, należy sprawdzić sygnał fluorescencyjnego znacznika.Barwnik powinien zostać pobrany przez komórki i rozprzestrzenić się wokół miejsca wstrzyknięcia. Po iniekcji inkubować pnie mózgu w napowietrzonym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym w temperaturze pokojowej przez jedną do czterech godzin. Podczas inkubacji należy zachować napowietrzanie, a następnie utrwalić tkankę w 4%paraform aldehyde.Po całonocnej inkubacji w PBS w temperaturze 4 °C, następnego dnia tkankę można pokroić i zamontować, wykonując zastrzyk śródstopniowy do jądra brzusznego ciała trapezowatego (VNTB). Zastosowanie dekstryny tetraetylorodynowej wykazuje, że projekcje z VNTB rozciągają się do jądra przyśrodkowego ciała trapezowatego (MNTB). Następnie do MNTB wstrzyknięto cholinę, podjednostkę B, co spowodowało silne znakowanie wsteczne VNTB.Większe szczegóły wykazały, że następnie oznakowane zostały ciała komórek glikowych VNTB w układzie jelitowym. Do MNTB wstrzyknięto znakownik retrogradny dekstryna tri. W przeciwieństwie do punktowego wzorca znakowania CTB, znakowanie dekstryną trit było gęste i przypominało GOGI.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak znakować neurony oraz ich wypustki z zwiększoną dokładnością. Przedstawiona technika pomaga w identyfikacji obszarów mózgu i subpopulacji neuronalnych uczestniczących w danym obwodzie neuronowym; po opanowaniu metody procedura wstrzykiwania może zająć około 30 minut, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Procedurę tę można łatwo połączyć z innymi metodami, takimi jak immunochemia lub utrwalanie i przezrocznienie tkanki mózgowej (brain clearing), aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące morfologii, kierunkowości lub funkcjonalności projekcji neuronalnych i innych struktur neuronalnych.

laser-guided-neuronal-tracing-in-brain-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie opisano manipulację hodowanymi neuronami z wykorzystaniem pęsety laserowej in vitro.

Wykorzystanie pęsety laserowej do manipulowania izolowanymi neuronami in vitro

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

Hodowla eksplantów neuronalnych z wypreparowanych embrionów Xenopus laevis wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek fuzyjnych umożliwia obrazowanie dynamiki cytoszkieletu stożka wzrostu.

Kultury eksplantów neuronalnych z Xenopus laevis

Źródło: Muto, A., et al. Ablacja populacji neuronów za pomocą lasera dwufotonowego i jej ocena za pomocą obrazowania wapnia i rejestracji behawioralnej larw danio pręgowanego. J. vis. exp. (2018) W tym filmie  Zademonstrowano procedurę dwufotonowej ablacji laserowej, umożliwiającą selektywne niszczenie neuronów fluorescencyjnych w unieruchomionych agarozą larwach danio pręgowanego. Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości przed i po zabiegu potwierdza skuteczne uszkodzenie neuronów, co obserwuje...

Celowana ablacja neuronów przy użyciu mikroskopii dwufotonowej u danio pręgowanego Larava

Ludzkie komórki neuroprogenitorowe (NPC) były rozwijane w warunkach proliferacji. NPC różnicowano w kultury bogate w neurony w obecności kombinacji neurotrofin. Markery neuronalne wykryto za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Aby wyizolować czystą populację neuronów, NPC różnicowano na szkiełkach membranowych PEN i przeprowadzono mikrodysekcję wychwytywania laserowego.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji neuronów ze zróżnicowanych ludzkich komórek neuroprogenitorowych w hodowli

Opisujemy metodę charakteryzowania funkcjonalnej topografii i właściwości synaptycznych obwodów przodomózgowia za pomocą podejścia optogenetycznego do fotostymulacji populacji neuronów in vitro.

Fotostymulacja optogenetycznie ukierunkowana obwodów przodomózgowia ze skaningiem laserowym

Obrazowanie dwufotonowe, sprzężone z nanodysekcją laserową, są użytecznymi narzędziami do badania procesów zwyrodnieniowych i regeneracyjnych w ośrodkowym układzie nerwowym z rozdzielczością subkomórkową. Protokół ten pokazuje, jak oznaczać, obrazować i preparować pojedyncze włókna pnące w korze móżdżku in vivo.

Laserowa nanochirurgia aksonów móżdżku in vivo

Tutaj prezentujemy protokół do ablacji genetycznie znakowanej subpopulacji neuronów za pomocą dwufotonowego lasera z larw danio pręgowanego.

Ablacja populacji neuronów za pomocą lasera dwufotonowego i jej ocena za pomocą obrazowania wapnia i rejestracji behawioralnej u larw danio pręgowanego

Ten protokół opisuje zestaw metod do identyfikacji specyficznej dla typu komórki funkcjonalnej łączności sygnałów dalekiego zasięgu z odległych obszarów mózgu za pomocą stymulacji optogenetycznej w wycinkach mózgu ex vivo.

Wewnątrzmózgowe zastrzyki stereotaktyczne in vivo do optogenetycznej stymulacji sygnałów wejściowych dalekiego zasięgu w wycinkach mózgu myszy

Ten protokół demonstruje prostą i solidną metodę badania dynamiki wzrostu aksonów in situ i stożka wzrostu. Opisano w nim, w jaki sposób przygotować ex vivo fizjologicznie istotne ostre wycinki mózgu i przedstawiono przyjazny dla użytkownika potok analizy.

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

Opisujemy intraparenchymalne przeszczepienie ludzkich nerwowych komórek progenitorowych transdukowanych podwójnym wektorem reporterowym wyrażającym lucyferazy-zielone białko fluorescencyjne (GFP) w mózgu myszy. Po przeszczepie sygnał lucyferazy jest wielokrotnie mierzony za pomocą bioluminescencji in vivo i przeszczepionych komórek wykazujących ekspresję GFP, identyfikowanych w sekcjach mózgu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Przeszczep domózgowy i śledzenie bioluminescencji in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Poznaj technikę etykietowania neuronów i ich projekcji aksonalnych w eksplantatach mózgu myszy. Ta metoda zwiększa dokładność iniekcji znaczników przy użyciu podstawowego sprzętu optycznego.

Laserowe śledzenie neuronów w eksplantatach mózgu

Przeglądaj więcej filmów