Laserowe śledzenie neuronów w eksplantatach mózgu

Ogólnym celem tej metody jest oznaczanie neuronów i ich projekcji aksonalnych w celu prześledzenia ich połączeń z docelowymi lub źródłowymi jądrami mózgu. Metoda ta pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania w neurobiologii, takie jak wzorce połączeń między różnymi obszarami lub subpopulacjami neuronalnymi mózgu, a także ich funkcjonalne znaczenie dla danego obwodu nerwowego. Główną zaletą tej techniki jest zwiększona dokładność celu podczas wstrzykiwania znacznika.

Osiąga się to dzięki użyciu podstawowego sprzętu optycznego do wizualizacji fluorescencyjnie znakowanych jąder mózgu. Kolejną zaletą tej metody jest to, że pozwala ona na nieinwazyjne genotypowanie mysich popów, które wykazują ekspresję białek fluorescencyjnych pod kontrolą promotorów neuronalnych. Podczas genotypowania szczeniąt należy sprawdzić ekspresję odpowiednich markerów fluorescencyjnych za pomocą wskaźnika laserowego o odpowiedniej długości fali wzbudzenia.

W tym samym czasie noś gogle filtrujące, które blokują długość fali wzbudzenia, ale przepuszczają długość fali emisji. Skieruj laser na tył głowy lub rdzeń kręgowy danego szczeniaka. Uważaj, aby nie świecić laserem w oczy P'S i nie utrzymuj krótkiej ekspozycji lasera.

Wzbudzone markery fluorescencyjne powinny być widoczne przez skórę. Kiedy mysz jest starsza, można zidentyfikować pojedyncze neurony pobranych tkanek. Po znieczuleniu myszy i sprawdzeniu, czy nie ma odruchu, usuń skórę z czaszki, przetnij skórę wzdłuż tyłu głowy do środkowej części czaszki.

U nawet starszych myszy, powyżej jednego miesiąca, fluorescencję można zaobserwować oczami zwierzęcia. Następnie, używając lodowatego PBS trans Cardi, przeprowadź perfuzję zwierzęcia z dodatnim markerem za pomocą igły o rozmiarze 30, po pięciu do 10 minutach większość krwi zostanie usunięta. Następnie usuń mózg i wypreparuj obszar zainteresowania.

W tym przypadku ciało trapezowe, które jest dwiema wydatnymi opuszkami w brzusznym obszarze mózgu, zawiera obszar zainteresowania. Jądra brzuszne ciał trapezoidalnych lub VNTB rozpoczynają się od przeniesienia eksplantowanego obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania do naczynia z natlenionym roztworem preparacyjnym. Tam. Zabezpieczyć explan za pomocą igieł strzykawkowych o rozmiarze 30 w taki sposób, aby obszar do wstrzykiwania był dostępny na górze.

Do wstrzykiwań należy używać pipet iniekcyjnych ze szkła krzemianowego Bo, które są produkowane w trzech lub czterech cyklach ciągnięcia. Załaduj do pipety następujący roztwór. Podjednostka B toksyny sprzężona z Alexa FLUORA 4 5 55, która służy głównie do transportu wstecznego.

Za pomocą wskaźnika laserowego i pipet iniekcyjnych, wszystkie zamontowane i gotowe do użycia, przystępuj do kierowania wiązki na oznaczony obszar mózgu lub komórki, które mają zostać wstrzyknięte. Obserwuj pole przez gogle filtrujące przez pasmo, aby zobaczyć, które neurony należy nacelować za pomocą pipety iniekcyjnej. Użyj mikromanipulatora, aby ustawić pipetę w obszarze zainteresowania.

Następnie, używając wtryskiwacza ciśnieniowego ustawionego na dostarczanie impulsów 50 milisekund przy 15 PS, wstrzykuję substancję znacznikową w ciągu dwóch do 10 impulsów. Odczekaj od 10 do 15 sekund między impulsami, aby wstrzyknięty barwnik mógł się rozprzestrzenić. Podczas wstrzykiwania żruty tetraetylowej należy elektrycznie stymulować obszar za pomocą elektrody stymulującej, dostarczającej impulsy TTL.

Upewnij się, że elektroda jest uziemiona w roztworze kąpieli. Dostarcz osiem impulsów TTL o napięciu ośmiu woltów każdy, o długości 50 milisekund, w odstępach 50 milisekund. Stymuluj obszar za pomocą 10 do 20 powtórzeń impulsów w ciągu kilku minut.

Jądra mózgu różnią się wielkością, gęstością neuronów i typami komórek. Oznacza to, że czas trwania i liczba impulsów elektrycznych może wymagać dostosowania w celu uzyskania optymalnych wyników znakowania dla danego obszaru mózgu. Za pomocą lasera i gogli sprawdź fluorescencyjny sygnał smugowy.

Barwnik powinien zostać wchłonięty przez komórki i rozprowadzony po wstrzykniętym obszarze. Po wstrzyknięciu inkubować pnie mózgu w natlenionym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym w temperaturze pokojowej przez jedną do czterech godzin. Utrzymuj natlenienie podczas inkubacji, a następnie utrwal tkankę w 4% aldehydzie paraformowym.

W PBS przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnego dnia tkankę można pokroić i zamontować w zastrzyku międzystopniowym w jądrze brzusznym ciała trapezoidalnego lub VNTB. Użycie tetraetylowej dekstryny Rodine pokazuje, że wypustki z VNTB rozciągają się na jądro przyśrodkowe ciała trapezowego lub MNTB. Następnie MNTB został wstrzyknięty w chole toinę, podjednostkę B, którą retro znacznie oznaczono jako VNTB.

Bardziej szczegółowo, somaty glikowych jelitowych komórek VNTB wydawały się być oznaczone jako następne. MNTB wstrzyknięto z wsteczną etykietą dekstryny tri. W przeciwieństwie do punktowego wzorca znakowania CTB, znakowanie dekstryny trytem było gęste i podobne do GOGI.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oznaczać neurony i ich procesy ze zwiększoną dokładnością. Zademonstrowana technika pomaga zidentyfikować obszary mózgu i subpopulacje neuronów uczestniczące w danym obwodzie nerwowym Po opanowaniu, procedura iniekcji może być wykonana w około 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Procedurę tę można łatwo połączyć z innymi metodami, takimi jak immunochemia lub oczyszczanie mózgu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące morfologii, kierunkowości lub funkcjonalności projekcji neuronalnych i innych struktur neuronalnych.