Name: Wykorzystanie pojedynczego zapisu sensillum do wykrywania reakcji neuronów węchowych pluskiew na substancje semiochemiczne (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Poznaj technikę pojedynczego zapisu sensillum do badania reakcji neuronów węchowych pluskiew na substancje semiochemiczne. Metoda ta umożliwia precyzyjne pomiary aktywności neuronów i ma zastosowanie w ekologii chemicznej oraz strategiach zwalczania szkodników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt był wspierany przez Award AAES 461Hatch/Multistate Grants ALA08-045 i ALA015-1-10026 dla N.L.

1. Przygotowanie instrumentów, roztworów bodźców i pluskiew
<ol>
	<li>Przygotuj 50% roztwór KNO2 (w/v) w butelce o pojemności 20 ml.</li>
	<li>Naostrzyć dwie mikroelektrody wolframowe w roztworze KNO2 pod napięciem 5 V, wielokrotnie zanurzając elektrody wolframowe w roztworze i wyjmując je z niego.
	<ol>
		<li>Z grubsza naostrz drut wolframowy, zanurzając około 10 mm drutu wolframowego w roztworze KNO2 z prędkością 2 zanurzeń/s przez około 5 minut, co może znacznie pochłonąć przedni koniec drutu wolframowego.</li>
		<li>Delikatnie naostrz elektrodę, zanurzając około 1 mm końcówki drutu w roztworze i wyjmując go z prędkością 2 zanurzeń/s przez co najmniej 1 minutę, tak aby elektroda była cienka i ostra. Często sprawdzaj średnicę końcówki elektrody pod mikroskopem, aż osiągnie 0,2-0,5 μm, co powinno wystarczyć do przebicia naskórka czucia węchowego pluskwy. 
		Uwaga: Podczas ręcznego ostrzenia elektrody prędkość zanurzania drutu wolframowego w roztworze KNO2 nie jest cały czas stała. Przy większej wprawie znacznie łatwiej jest utrzymać w miarę stałą prędkość ostrzenia elektrody. Czas ostrzenia jest również niepewny w zależności od tego, jak drobna powinna być elektroda. W tym przypadku końcówka elektrody o średnicy ~0,2 μm jest wystarczająca, aby przebić się przez zmysł węchowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć każdy z bodźców chemicznych w dimetylosulfotlenku (DMSO) z czystego związku do początkowego stężenia 1:10 v/v jako roztwór podstawowy. Stwórz serię dziesięcioletnich rozcieńczeń w zależności od tego, ile dawek jest wymaganych w eksperymencie, ponownie za pomocą DMSO, z każdego z roztworów podstawowych dla każdej substancji chemicznej. Tutaj użyj 10% (+)-β-pinenu i eukaliptolu.</li>
	<li>Umieść niekarmione lub siedem dni po karmieniu dorosłe pluskwy (samce lub samice) z kolonii Ft. Dix (prezent od dr Haynesa z University of Kentucky) do wykorzystania w eksperymencie na szalce Petriego. 
	Uwaga: Nie ma dokładnej liczby pluskiew umieszczonych na szalce Petriego. Może to być kilka lub dużo.</li>
</ol>
2. Przygotowanie anten pluskiew
<ol>
	<li>Znieczulenie pluskiew na lodzie (2-3 min).</li>
	<li>Przymocuj zarówno czułki, jak i ciało owada do szkiełka nakrywkowego mikroskopu za pomocą taśmy dwustronnej i usuń nogi cienkimi nożyczkami.</li>
	<li>Użyj małej szpilki, aby delikatnie dotknąć anten, aby równomiernie przykleić je do taśmy.</li>
	<li>Oprzyj szkiełko nakrywkowe o małą kulkę (~1 cm średnicy) wosku dentystycznego, aby ułatwić manipulację, i ustaw ją pod odpowiednim kątem (~ 90°) dla elektrody rejestrującej (Rysunek 1).</li>
	<li>Po zabezpieczeniu umieść pluskwę pod mikroskopem stereoskopowym, włącz zimne źródło światła i dostosuj intensywność oświetlenia, aż antena będzie wyraźnie widoczna, a następnie skoncentruj mikroskop na drugiej wici anteny pluskwy przy dużym powiększeniu (720X). 
	Uwaga: Intensywność oświetlenia użytego w eksperymencie nie jest mierzona, co tak naprawdę zależy od tego, jak oczy eksperymentatora odczuwają intensywność oświetlenia.</li>
</ol>
3. Pojedynczy zapis Sensillum
<ol>
	<li>Podłącz przedwzmacniacz (10X) do sterownika akwizycji sygnału, który jest połączony z komputerem w celu rejestracji i wizualizacji sygnału. Włącz komputer i uruchom oprogramowanie, np. AutoSpike32 i kliknij tryb "Nagraj" na pasku menu. Następnie wybierz "falę", aby rozpocząć nagrywanie sygnałów fali. 
	Uwaga: Płaska linia biegnąca wielokrotnie od lewej do prawej krawędzi monitora powinna być teraz widoczna. W tym przypadku okno nagrywania trwa 40 sekund. Maksymalny zapis fali to 10 sekund. Wybrana częstotliwość próbkowania to 96000, a częstotliwość próbkowania cyfrowego to 240. Jest przesunięcie 0% i brak filtrowania, brak rektyfikacji dla sygnałów nagrywania. Wszystkie te ustawienia parametrów w oprogramowaniu można modyfikować w zależności od potrzeb.</li>
	<li>Włącz głośnik podłączony do przedwzmacniacza, który służy do prezentacji trybu tonowania dla odpowiedzi neuronalnych z czułka antenowego.</li>
	<li>Włóż elektrodę referencyjną do brzucha ustabilizowanej pluskwy. 
	Uwaga: Elektroda referencyjna była przytrzymywana przez metalowy stojak magnetycznie przymocowany do stołu powietrznego.</li>
	<li>Po podłączeniu elektrody referencyjnej do brzucha pluskwy, przesuń elektrodę nagrywającą, która jest podłączona do przedwzmacniacza i manipulowana przez mikromanipulator, w kierunku tylnego końca anteny pluskwy.</li>
	<li>Gdy elektroda rejestrująca styka się z prawą końcówką anteny, włącz mikroskop i zlokalizuj elektrodę w małym powiększeniu.</li>
	<li>Wyreguluj elektrodę rejestrującą, stopniowo zwiększając powiększenie, aż zarówno elektroda, jak i czułek anteny znajdą się w tej samej płaszczyźnie i będą wyraźnie widoczne pod mikroskopem. 
	Uwaga: W tym czasie mikroskop ma zwykle największe powiększenie.</li>
	<li>Włóż elektrodę rejestrującą do trzonu czujnika za pomocą mikromanipulatora i wejdź nieco głębiej, jeśli szum tła jest wysoki w porównaniu z potencjałem czynnościowym.</li>
	<li>Po zaobserwowaniu czystych potencjałów czynnościowych z zarejestrowanego sensillum, napełnij mikropipetę 10% (+)-β-pinenem. Za pomocą mikropipety nanieść 10 μl podwielokrotności 10% (+)-β-pinenu na pasek bibuły filtracyjnej (~3 x 15 mm) umieszczony w szklanej pipecie Pasteura.
	<ol>
		<li>Podłącz załadowaną pipetę do wylotu rurki przepływu impulsowego kontrolera bodźca i umieść końcówkę pipety w małym otworze w rurce skierowanej w stronę anteny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy wszystkie te połączenia się ustabilizują, naciśnij przełącznik nożny sterownika bodźców, aby dostarczyć 0.5 sekundy bodźca (0.5 l/min) do ciągłego strumienia nawilżonego powietrza. Rejestracja potencjałów czynnościowych zostanie zainicjowana jednocześnie, gdy przełącznik nożny zostanie wciśnięty. Proces nagrywania będzie trwał 10 sekund, zaczynając 1 sekundę przed stymulacją.</li>
	<li>Policz potencjały czynnościowe w trybie off-line przez dwa okresy 500 ms, jeden przed i jeden po stymulacji. Odejmij wszelkie zmiany w szybkości skoków w ciągu 500 ms po stymulacji od spontanicznej aktywności zarejestrowanej w ciągu poprzednich 500 ms i przelicz zliczenia na konwencjonalną skalę skoków/s, mnożąc je przez 2.</li>
</ol>
4. Wymiana bodźca w SSR
<ol>
	<li>Po uruchomieniu przełącznika nożnego należy dostarczyć 10% (+)-β-pinenu z pipety na czułki pluskiew i rejestrować reakcję na ten konkretny środek zapachowy przez 10 sekund, po czym pipeta zostanie usunięta.</li>
	<li>Oznacz kolejną nową pipetę 0,001% eukaliptolem, który ma być przetestowany. Umieść mały kawałek bibuły filtracyjnej, na który nałożono 10 μl bodźca, do nowej pipety.</li>
	<li>Odczekaj 2-5 minut, aż bodziec całkowicie odparuje w szklanej pipecie. Przymocuj pipetę do wylotu rurki przepływu impulsowego.</li>
	<li>Włóż końcówkę pipety do małego otworu w rurce skierowanej w stronę anteny. Naciśnij przełącznik nożny i rozpocznij 10-sekundowe nagrywanie.</li>
	<li>Odłącz pipetę i przygotuj kolejną pipetę z 0,01% eukaliptolu.</li>
	<li>Przetestuj wszystkie pozostałe dawki eukaliptolu (od 0,001% do 10%) na czułce czułki, aby zaobserwować reakcje zależne od dawki. Przeprowadzić test od najbardziej rozcieńczonych do najmniej rozcieńczonych dawek.</li>
</ol>

<ol><li>Bartonicka, T., Gaisler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonal+dynamics+in+the+numbers+of+parasitic+bugs+%28Heteroptera%2C+Cimicidae%29%3A+a+possible+cause+of+roost+switching+in+bats+%28Chiroptera%2C+Vespertilionidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Seasonal dynamics in the numbers of parasitic bugs (Heteroptera, Cimicidae): a possible cause of roost switching in bats (Chiroptera, Vespertilionidae).</a> Parasitol Res. 100 (6), 1323-1330 (2007).</li>
<li>Thomas, I., Kihiczak, G. G., Schwartz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bed+bug+bites%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Bed bug bites: a review.</a> Int J Dermatol. 43 (6), 430-433 (2004).</li>
<li>Anderson, A. L., Leffler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bed+bug+infestations+in+the+news%3A+a+picture+of+an+emerging+public+health+problem+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22J+Environ+Health%22%5BJournal%5D)">Bed bug infestations in the news: a picture of an emerging public health problem in the United States.</a> J Environ Health. 70 (9), 24-27 (2008).</li>
<li>Boase, C. Bed bugs (Hemiptera: Cimicidae): an evidence-based analysis of the current situation. Sixth international conference on urban pests. OOK-Press Kft. Robinnson, W., Bajomi, D. Budapest, Hungary, , (2008).</li>
<li>Doggett, S. L., Geary, M. J., Russell, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Resurgence+of+bed+bugs+in+Australia%3A+with+notes+on+their+ecology+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health%22%5BJournal%5D)">The Resurgence of bed bugs in Australia: with notes on their ecology and control.</a> Environ Health. 4 (2), 30-38 (2004).</li>
<li>Ter Poorten, M. C., Prose, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+return+of+the+common+bedbug%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The return of the common bedbug.</a> Pediatr Dermatol. 22 (3), 183-187 (2005).</li>
<li>Yoon, K. S., Kwon, D. H., Strycharz, J. P., Craig, S., Lee, S. H., Clark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+molecular+analysis+of+deltamethrin+resistance+in+the+common+bed+bug+%28Hemiptera%3A+Cimicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and molecular analysis of deltamethrin resistance in the common bed bug (Hemiptera: Cimicidae).</a> J Med Entomol. 45 (6), 1092-1101 (2008).</li>
<li>Wang, L., Xu, Y., Zeng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resurgence+of+bed+bugs+%28Hemiptera%3A+Cimicidae%29+in+mainland+China%5BTitle%5D)+AND+%22Fla+Entomol%22%5BJournal%5D)">Resurgence of bed bugs (Hemiptera: Cimicidae) in mainland China.</a> Fla Entomol. 96 (1), 131-136 (2013).</li>
<li>Haynes, K. F., Potter, M. F. Recent progress in bed bug management. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaynes%2C+KF+%22Advanced+technologies+for+managing+insect+pests%22">Advanced technologies for managing insect pests</a>. Ishaaya, I., Palli, S. R., Horowitz, A. R. , Springer. New York. 269-278 (2013).</li>
<li>Carey, A. F., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+olfaction+from+model+systems+to+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Insect olfaction from model systems to disease control.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (32), 12987-12995 (2011).</li>
<li>Leal, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+reception+in+insects%3A+roles+of+receptors%2C+binding+proteins%2C+and+degrading+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Odorant reception in insects: roles of receptors, binding proteins, and degrading enzymes.</a> Annu Rev Entomol. 58, 373-391 (2013).</li>
<li>Den Otter, C. J., Behan, M., Maes, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+response+in+female+Pieris+brassicae.+%28Lepidoptera%3A+Pieridae%29+to+plant+volatiles+and+conspecific+egg+odours%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Single cell response in female Pieris brassicae. (Lepidoptera: Pieridae) to plant volatiles and conspecific egg odours.</a> J Insect Physiol. 26 (7), 465-472 (1980).</li>
<li>Levinson, H. Z., Levinson, A. R., Muller, B., Steinbrecht, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+of+sensilla%2C+olfactory+perception%2C+and+behavior+of+the+bed+bug%2C+Cimex+lectularius.%2C+in+response+to+its+alarm+pheromone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Structural of sensilla, olfactory perception, and behavior of the bed bug, Cimex lectularius., in response to its alarm pheromone.</a> J Insect Physiol. 20 (7), 1231-1248 (1974).</li>
<li>Harraca, V., Ignell, R., Löfstedt, C., Ryne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+antennal+olfactory+system+of+the+bed+bug+%28Cimex+lectularius%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Characterization of the antennal olfactory system of the bed bug (Cimex lectularius).</a> Chem Senses. 35 (3), 195-204 (2010).</li>
<li>Liu, F., Haynes, K. F., Appel, A. G., Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antennal+olfactory+sensilla+responses+to+insect+chemical+repellents+in+the+common+bed+bug%2C+Cimex+lectularius%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Ecol%22%5BJournal%5D)">Antennal olfactory sensilla responses to insect chemical repellents in the common bed bug, Cimex lectularius.</a> J Chem Ecol. 40 (6), 522-533 (2014).</li>
<li>Olson, J. F., Moon, R. D., Kells, S. A., Mesce, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology%2C+ultrastructure+and+functional+role+of+antennal+sensilla+in+off-host+aggregation+by+the+bed+bug%2C+Cimex+lectularius%5BTitle%5D)+AND+%22Arthropod+Struct+Dev%22%5BJournal%5D)">Morphology, ultrastructure and functional role of antennal sensilla in off-host aggregation by the bed bug, Cimex lectularius.</a> Arthropod Struct Dev. 43 (2), 117-122 (2014).</li>
<li>Bruyne, M., Foster, K., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+coding+in+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odor coding in the Drosophila antenna.</a> Neuron. 30 (2), 537-552 (2001).</li>
<li>Qiu, Y. T., Loon, J. J. A., Takken, W., Meijerink, J., Smid, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+coding+in+antennal+neurons+of+the+malaria+mosquito%2C+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Olfactory coding in antennal neurons of the malaria mosquito, Anopheles gambiae.</a> Chem Senses. 31 (9), 845-863 (2006).</li>
<li>Ghaninia, M., Ignell, R., Hansson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+classification+and+central+nervous+projections+of+olfactory+receptor+neurons+housed+in+antennal+trichoid+sensilla+of+female+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional classification and central nervous projections of olfactory receptor neurons housed in antennal trichoid sensilla of female yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Eur J Neurosci. 26 (6), 1611-1623 (2007).</li>
<li>Hill, S. R., Hanson, B. S., Ignell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+antennal+trichoid+sensilla+from+female+southern+house+mosquito%2C+Culex+quinquefasciatus+Say%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Characterization of antennal trichoid sensilla from female southern house mosquito, Culex quinquefasciatus Say.</a> Chem Senses. 34 (3), 231-252 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Technika Single Sensillum Recording jest szeroko stosowana w testowaniu reakcji neuronalnych owadów, takich jak muszki owocowe, komary i pluskwy, na różne bodźce chemiczne w środowisku. Te bodźce chemiczne są często rozpuszczane i rozcieńczane w zwykłym rozpuszczalniku w celu przygotowania różnych dawek zabiegów. Jednak różne rozpuszczalniki mogą wytwarzać dość różne szybkości uwalniania bodźców. Wcześniejsze badania nad niektórymi szeroko przebadanymi owadami, takimi jak Drosophila melanogaster, Anopheles g...

Pospolity pluskwa Cimex lectularius L (Hemiptera: Cimicidae), jako tymczasowy ektopasożyt, jest obowiązkowym owadem wysysającym krew, co oznacza, że ich przetrwanie, rozwój i rozmnażanie wymagają źródeł krwi od gospodarzy, w tym zarówno ludzi, jak i zwierząt1,2. Chociaż rzadko zgłaszano przenoszenie wirusa z powodu C. lectularius, uciążliwość gryzienia spowodowana inwazją poważnie wpływa na gospodarzy zarówno fizycznie, jak i psychicznie3. Wprowadzenie i powszechne stosowanie chemicznych środków owadobójczych, zwłaszcza DDT, obniżyło ryzyko inwazji i pod koniec lat pięćdziesiątych inwazje osiągnęły tak niski poziom, że nie stanowiły już poważnego problemu publicznego. Jednak wiele możliwych czynników doprowadziło do odrodzenia się populacji pluskiew na całym świecie, takich jak zmniejszone stosowanie środków owadobójczych, spadek świadomości społecznej, zwiększona aktywność podróżnicza i rozwój odporności na insektycydy4-9.
Sygnały chemiczne w środowisku są wykrywane i rozpoznawane przez owady za pomocą narządów węchowych, takich jak czułki i szczęki. Zmysł węchowy na czułkach owadów odgrywa kluczową rolę w wykrywaniu tych sygnałów chemicznych. Cząsteczki chemiczne dostają się do naskórka czułka przez pory na powierzchni naskórka. Białka wiążące substancje zapachowe w limfie czułkowej wiążą się z tymi cząsteczkami chemicznymi i transportują je do receptorów zapachowych10. Receptory zapachowe i ich koreceptor z nieselektywnego kanału jonów kationowych na błonie nerwowej, który zostanie zdepolaryzowany, gdy te cząsteczki chemiczne zostaną rozpoznane przez receptory zapachowe11.
Single sensillum recording (SSR) został opracowany w celu wykrywania zewnątrzkomórkowych zmian w potencjale czynnościowym spowodowanych zastosowaniem bodźców chemicznych lub niechemicznych. Poprzez wprowadzenie elektrody rejestrującej do limfy sensillum i elektrody referencyjnej do innej części ciała owada (zwykle oczu złożonych lub brzucha), można zarejestrować szybkość wypalania neuronów w odpowiedzi na bodźce12. Zmiany w liczbie kolców reprezentują wrażliwość owada na określone bodźce. Bodźce chemiczne o różnej tożsamości i stężeniu będą wywoływać różne reakcje neuronalne, z różnymi szybkościami wyzwalania i strukturami czasowymi, a zatem mogą być wykorzystane do zbadania procesu kodowania owada na określone substancje chemiczne.
Dla pospolitego pluskwy, obie formy płciowe mają ten sam wzór węchowej sensilli na czułkach: dziewięć rowkowanych kołków C sensilla, 29 włoskowatych sensilli E (E1 i E2) i po jednej parze Dα, Dβ, Dγ smooth peg sensilla 13,14. Ponieważ w każdym typie sensillum zidentyfikowano wiele neuronów, nie jest łatwo odróżnić potencjały czynnościowe od różnych neuronów znajdujących się w tym samym sensillum, więc w tym eksperymencie całkowita liczba potencjałów czynnościowych została policzona poza linią przez okres 500 ms przed i po stymulacji. Liczba potencjałów czynnościowych po stymulacji została następnie odjęta od liczby potencjałów czynnościowych przed stymulacją i pomnożona przez dwa w celu ilościowego określenia zmian szybkości wypalania w każdym indywidualnym sensylum w skokach na sekundę15.

<table><tbody><tr><td>Drut wolframowy</td><td>A-M SYSTEMS</td><td>#716500</td><td>Służy do przygotowania elektrody</td></tr><tr><td>KNO2</td><td>Sigma</td><td>#310484</td><td>Służy do ostrzenia drutu wolframowego</td></tr><tr><td>Zasilacz prądu przemiennego</td><td>BK Precision</td><td>1653A</td><td>Zapewnienie napięcia podczas ostrzenia drutu wolframowego</td></tr><tr><td>Mikroskop Leica Z6 APO</td><td>Leica</td><td>10447424</td><td>Służy do obserwacji sensyli na antenach</td></tr><tr><td>Kontroler Simulus</td><td>Syntech</td><td>CS-55</td><td>Służy do sterowania aplikacją bodźca</td></tr><tr><td>4-kanałowy kontroler akwizycji USB</td><td>Syntech</td><td>IDAC-4</td><td>Wyświetlanie w czasie rzeczywistym na ekranie wszystkich sygnałów przed i podczas nagrywania</td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>SCHOTT</td><td>A20500</td><td>Zapewnienie źródeł światła do obserwacji</td></tr><tr><td>Mikromanupulator</td><td>Leica</td><td>115378</td><td>Służy do niewielkiego ruchu elektroda</td></tr><tr><td>Głośnik</td><td>Juster</td><td>95a</td><td>Połączony z kontrolerem akwizycji IDAC-4 i dostarczający dźwięk do sygnału</td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td>Służy do trzymania elektrody referencyjnej, stabilizowanej rurki dostarczającej pluskwy i bodźce</td></tr><tr><td>Stół do izolacji drgań TMC</td><td>TMC</td><td>63-500</td><td>Służy do izolowania wibracji od urządzeń</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Tedpella</td><td>2225-1</td><td>Służy do przytrzymywania pluskwy</td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>3M</td><td>XT6110</td><td>Służy do stabilizacji pluskwy na klipsie</td></tr><tr><td>Wosk dentystyczny</td><td>Dentakit</td><td>DK-R012</td><td>Służy do podtrzymywania klipsa w miejscu, w którym stabilizowana jest pluskwa&nbsp;</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie pojedynczego zapisu sensillum do wykrywania reakcji neuronów węchowych pluskiew na substancje semiochemiczne

Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals

System węchowy owadów odgrywa ważną rolę w wykrywaniu substancji semiochemicznych w środowisku. W szczególności uważa się, że czułki czułkowe, w których znajduje się jeden lub wiele neuronów, mają główny wkład w reagowanie na bodźce chemiczne. Poprzez bezpośrednie rejestrowanie potencjału czynnościowego w czubku węchowym po ekspozycji na bodźce, technika rejestracji pojedynczej czułości (SSR) zapewnia potężne podejście do badania reakcji neuronalnych owadów na bodźce chemiczne. W przypadku pluskwy, która jest znanym ludzkim pasożytem, scharakteryzowano wiele rodzajów zmysłu węchowego. W tym badaniu wykazaliśmy reakcje neuronalne czucia węchowego pluskiew na dwa bodźce chemiczne oraz zależne od dawki odpowiedzi na jeden z nich za pomocą metody SSR. Takie podejście umożliwia naukowcom przeprowadzanie wczesnych badań przesiewowych pod kątem indywidualnych bodźców chemicznych na czulach węchowych pluskiew, co dostarczyłoby cennych informacji do opracowania nowych atraktantów lub repelentów pluskiew i przyniosłoby korzyści wysiłkom na rzecz zwalczania pluskiew.

Rejestracja z pojedynczego sensillum jest potężną techniką badawczą wykorzystywaną w studiach nad ekologią chemiczną i fizjologią neuronową owadów. Badanie odpowiedzi neuronalnych owadów na różne związki lotne, zwłaszcza te, które uważa się za ekologicznie powiązane z przetrwaniem i rozwojem owadów, nie tylko dostarcza bezcennych informacji na temat procesu olfaktornego u owadów, ale także otwiera obiecujące nowe możliwości, które potencjalnie mogą prowadzić do opracowania użytecznych now...

Pluskwy polegają na neuronach receptorów węchowych umieszczonych w ich czułkach węchowych do wykrywania substancji semiochemicznych w środowisku. Wykorzystując rejestrację pojedynczego czujnika, demonstrujemy metodę oceny reakcji pluskiew na substancje semiochemiczne i badamy związany z tym proces kodowania.

Wykorzystanie pojedynczego zapisu sensillum do wykrywania reakcji neuronów węchowych pluskiew na substancje semiochemiczne

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house ...

Ogólnym celem rejestracji z pojedynczego sensylium jest zbadanie odpowiedzi neuronalnych czułków węchowych anteny na różne substancje zapachowe. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie ekologii chemicznej, takie jak to, czy owad jest w stanie wykryć substancje zapachowe w swoim środowisku oraz w jaki sposób je przetwarza. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na odzwierciedlenie aktywności pojedynczego neuronu w ramach danej funkcji.Umożliwia ona dokładniejszy pomiar wrażliwości neuronów na chemiczne substancje zapachowe. Zastosowanie tej techniki rozciąga się na opracowywanie atraktantów lub repelentów wykorzystywanych w zwalczaniu owadów. Metoda ta pozwala na analizę dużej liczby substancji chemicznych, które są biologicznie istotne dla owadów.Zacznij tę procedurę od znieczulenia pluskwiarszy domowych na lodzie przez dwie do trzech minut. Następnie przymocuj czułki i ciało owadów do szkiełka nakrywkowego mikroskopu za pomocą dwustronnej taśmy i usuń odnóża za pomocą precyzyjnych nożyczek. Użyj małej szpilki, aby delikatnie ustawić czułki na taśmie.Następnie oprzyj szkiełko nakrywkę o małą kulkę wosku dentystycznego, aby ułatwić manipulację, i ustaw ją pod kątem 90 stopni w celu umieszczenia elektrody rejestrującej. Po zabezpieczeniu umieść pluskwę w lusterku pod stereomikroskopem. Włącz źródło światła i dostosuj intensywność oświetlenia, aż antena będzie wyraźnie widoczna.Następnie ustaw ostrość mikroskopu na drugim biczowatego członie czułka pluskwi wynaczyniowej przy dużym powiększeniu. Na tym etapie podłącz przedwzmacniacz do kontrolera akwizycji sygnałów, który jest połączony z komputerem w celu rejestracji i wizualizacji sygnału. Następnie uruchom oprogramowanie i kliknij „record” (nagraj) na pasku menu.Następnie wybierz opcję wave, aby rozpocząć rejestrację sygnałów falowych. Włącz głośnik podłączony do przedwzmacniacza, aby odtworzyć ton odpowiedzi neuronalnych z sensillum antenalnego. Teraz wprowadź elektrodę referencyjną do odwłoka ustabilizowanej pluskwiery.Po podłączeniu elektrody odniesienia do odwłoka pluskwi z pościeli, przesuń elektrodę rejestrującą w kierunku końcowego odcinka czułków owada. Gdy elektroda rejestrująca zetknie się z końcem prawego czułka, zlokalizuj elektrodę przy niskim powiększeniu. Następnie koryguj położenie elektrody rejestrującej, stopniowo zwiększając powiększenie, aż zarówno elektroda, jak i sensillum czułka znajdą się w tej samej płaszczyźnie i będą wyraźnie widoczne pod mikroskopem.Następnie, przy użyciu mikromanipulatora, wprowadź elektrodę rejestrującą do trzonu sensilla. Obniż ją głębiej, jeśli szum tła jest zbyt wysoki. Po zaobserwowaniu wyraźnych potencjałów czynnościowych z rejestrowanego sensilla, napełnij mikropipetę bodźcem botanicznym.Użyj mikropipety, aby nanieść 10 µL alikwoty bodźca na pasek papieru filtracyjnego umieszczony w szklanej pipecie Pasteura. Kluczem do sukcesu eksperymentu jest precyzyjne i bezpośrednie wprowadzenie elektrod do sensilla. Szum tła można częściowo zredukować, wprowadzając elektrody nieco głębiej.Następnie podłącz napełnioną pipetę do wylotu rurki doprowadzającej bodziec i umieść końcówkę pipety w małym otworze w rurce zorientowanym w stronę czułków. Po ustabilizowaniu wszystkich połączeń naciśnij przełącznik nożny sterownika bodźców, aby podać bodziec do ciągłego strumienia nawilżonego powietrza i rozpocznij rejestrację. Proces rejestracji będzie trwał 10 sekund, rozpoczynając się na jedną sekundę przed stymulacją.Policz potencjały czynnościowe w trybie offline dla dwóch okresów trwających 500 milisekund: jednego przed i jednego po stymulacji. Aby podać kolejny bodziec, oznakuj nową pipetę z 001% eukaliptolem do przetestowania. Nanieś 10 µL bodźca, a następnie połóż na nim mały kawałek papieru filtrującego.Następnie odczekać od dwóch do pięciu minut, aż bodziec całkowicie odparuje w szklanej pipecie. Przymocować pipetę do wylotu rurki doprowadzającej przepływ bodźca. Następnie wprowadzić końcówkę pipety do małego otworu w rurce skierowanego w stronę anten.Naciśnij przełącznik nożny i rozpocznij 10-sekundowy zapis. Następnie odłącz pipetę i przygotuj kolejną pipetę z 01% eukaliptolem. Przetestuj wszystkie pozostałe dawki eukaliptolu na sensillach czuciowych czułków, aby zaobserwować odpowiedzi najbardziej zależne.Na tym rysunku ślad sygnału przedstawia typową odpowiedź neuronalną sensillum węchowego na rozpuszczalnik, który służy jako kontrola podczas rejestracji z pojedynczego sensillum. Rejestracja sygnału rozpoczęła się na jedną sekundę przed rozpoczęciem 0,5-sekundowego podmuchu bodźca. Sygnał był rejestrowany w sposób ciągły przez 10 sekund po zainicjowaniu podmuchu bodźca.Ten zapis sygnału przedstawia niezwykle silną odpowiedź neuronalną sensillum węchowego na botaniczny bodziec 10% pozytywnego beta-pinenu. Po podaniu podmuchu bodźca do sensillum węchowego, neurony sensoryczne węchowe wewnątrz tego sensillum wykazują wysoką częstotliwość wyładowań w ramach długotrwałej dynamiki czasowej. Procedura ta dostarcza informacji, które mogą zostać wykorzystane w badaniach nad zachowaniem owadów w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak reakcje behawioralne owadów na określone substancje chemiczne wywołujące silne odpowiedzi neuronalne.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś lepiej rozumieć, w jaki sposób rejestrować odpowiedzi neuronów węchowych owadów na bodziec chemiczny.

using-single-sensillum-recording-to-detect-olfactory-neuron-responses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Reakcje elektrofizjologiczne neuronów sensorycznych węchu na odoranty u owadów można mierzyć za pomocą rejestracji z pojedynczych sensyli. W tym artykule wideo zademonstrujemy, jak przeprowadzić rejestrację z pojedynczych sensyli w czułkach muszki owocowej (Drosophila melanogaster) oraz w palpach szczękowych komara malarycznego (Anopheles gambiae).

Rejestracja z pojedynczych sensyli u owadów Drosophila melanogaster oraz Anopheles gambiae

Układy węchowe owadów zapewniają wyjątkowe możliwości rejestrowania odpowiedzi indukowanych substancjami zapachowymi w formie elektroantenogramów (EAG) oraz rejestracji z pojedynczych sensyli (SSR), które stanowią odpowiednio sumaryczne odpowiedzi wszystkich neuronów receptorowych zapachowych (ORNs) zlokalizowanych na antenie oraz tych znajdujących się w poszczególnych sensylach.

Pomiary elektrofizjologiczne z systemu węchowego ćmy

Neurony receptorowe węchu (ORNs) przekształcają sygnały zapachowe najpierw w prąd receptorowy, który z kolei wywołuje potencjały czynnościowe przekazywane do neuronów drugiego rzędu w opłatce węchowej. W niniejszej pracy opisujemy technikę pipety ssącej służącą do jednoczesnego rejestrowania indukowanego substancją zapachową prądu receptorowego oraz potencjałów czynnościowych z ORNs myszy.

Rejestracja odpowiedzi indukowanych substancjami zapachowymi w neuronach receptorowych węchowych z wykorzystaniem techniki pipety ssącej

W tym filmie żywa mucha Drosophila jest zamontowana w tubie do badań elektrofizjologicznych. Elektrody są umieszczone u podstawy czułki, aby rejestrować specyficzne odpowiedzi neuronalne na feromony za pomocą neuronów receptorów węchowych muchy.

Zapisy elektrofizjologiczne z Drosophila sensilla w odpowiedzi na lotne substancje zapachowe

Pokazujemy różne warianty techniki wewnątrzkomórkowego zapisu wielojednostkowego, aby scharakteryzować reakcje wywołane zapachem w pierwszych trzech etapach szlaku węchowego bezkręgowców. Techniki te można łatwo zaadaptować do badania aktywności zespołu również w innych systemach neuronowych.

Wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca americana)

Opisujemy protokół używania anten owadów w postaci elektroantennogramów (EAG) na autonomicznych robotach. Nasza eksperymentalna konstrukcja pozwala na stabilne nagrania w ciągu jednego dnia i rozwiązuje indywidualne plamy zapachowe do 10 Hz. Skuteczność czujników EAG w poszukiwaniu węchu jest wykazywana poprzez kierowanie robota w kierunku źródła zapachu.

Wykorzystanie czujników elektroantennogramu owadów w autonomicznych robotach do wyszukiwania węchowego

Analiza fizjologicznych właściwości węchowych neuronów czuciowych nadal napotyka na techniczne ograniczenia. Tutaj rejestrujemy je przez perforowany patch-clamp w nienaruszonym preparowaniu nabłonka węchowego u myszy ukierunkowanych na geny. Technika ta pozwala na scharakteryzowanie właściwości błony i odpowiedzi na określone ligandy neuronów wyrażających określone receptory węchowe.

Perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy

Użycie dostosowanego "chipa węchowego" do efektywnego obrazowania wapnia u samców C. elegans jest opisane tutaj. Pokazano również badania dotyczące narażenia mężczyzn na glicerol i feromon.

Wykorzystanie dostosowanego mikroprzepływowego chipa węchowego do obrazowania aktywności neuronalnej w odpowiedzi na feromony w męskich neuronach głowy C. elegans

Ogólnym celem tego protokołu jest pokazanie, jak prezentować substancje zapachowe o niskiej lotności do rejestracji pojedynczej sensyllum z neuronów receptora węchowego Drosophila, które reagują na długołańcuchowe feromony kutykularne.

Zapis elektrofizjologiczny z Drosophila trichoid Sensilla w odpowiedzi na substancje zapachowe o niskiej lotności

Ten artykuł opisuje szczegółowy i wysoce skuteczny protokół dla pojedynczych nagrań sensillum z sensilla basiconica na palpach aparatów gębowych owadów.

Single Sensillum Recordings dla Locust Palp Sensilla Basiconica

Rzadko stosowana metoda zapisu elektrofizjologicznego, zapis podstawowy, pozwala na analizę cech kodowania smaku, które nie mogą być zbadane konwencjonalnymi metodami zapisu. Zapis bazowy pozwala również na analizę reakcji smakowych na bodźce hydrofobowe, których nie można zbadać tradycyjnymi metodami elektrofizjologicznymi.

Zapis podstawowy: technika analizy reakcji neuronów smaku u Drosophila

Poznaj technikę pojedynczego zapisu sensillum do badania reakcji neuronów węchowych pluskiew na substancje semiochemiczne. Metoda ta umożliwia precyzyjne pomiary aktywności neuronów i ma zastosowanie w ekologii chemicznej oraz strategiach zwalczania szkodników.

Wykorzystanie pojedynczego zapisu sensillum do wykrywania reakcji neuronów węchowych pluskiew na substancje semiochemiczne

Przeglądaj więcej filmów