Name: Badania elektrotaktyczne komórek raka płuc przy użyciu wielokanałowego układu mikroprzepływowego o podwójnym polu elektrycznym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Poznaj metodę badania elektrotaksji komórek raka płuc przy użyciu wielokanałowego układu mikroprzepływowego z podwójnym polem elektrycznym. Technika ta pozwala ocenić wpływ inhibitorów kinaz na migrację nowotworową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana finansowo przez Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu (Kontrakt nr. MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2) oraz Program Badawczy w zakresie nanonauki i nanotechnologii, Academia Sinica, Tajwan.

1. Projekt i wykonanie chipa MDF
<ol>
	<li>Narysuj indywidualny wzór warstwy akrylowej za pomocą komercyjnego oprogramowania, takiego jak AutoCAD, i zapisz wzór.
	<ol>
		<li>Przejrzyj projekt wzoru czterowarstwowego arkusza akrylowego na rysunku 1A i potwierdź połączenia międzywarstwowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj wszystkie arkusze akrylowe i taśmę dwustronną za pomocą ablacji laserowej za pomocą rysika laserowego CO2 (rysunki 1B, 2A i 2B). 16
	<ol>
		<li>Włącz rysik laserowy i podłącz urządzenie do laptopa sterującego.</li>
		<li>Uruchom komercyjne oprogramowanie i otwórz wzór zaprojektowany w kroku 1.1, klikając "zaprojektowany plik wzorca".</li>
		<li>Umieść kawałek czystego arkusza akrylowego lub taśmy dwustronnej na stoliku X-Y-Z rysika laserowego.</li>
		<li>Ustaw skupienie wiązki laserowej na powierzchni arkusza akrylowego lub taśmy dwustronnej za pomocą patyczka do automatycznego wyrównywania dostarczonego przez producenta rysika laserowego.</li>
		<li>Wyślij zaprojektowany wzór do rysika laserowego w celu bezpośredniej obróbki arkusza akrylowego lub taśmy dwustronnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń papier ochronny z arkuszy akrylowych za pomocą kleszczy i przedmuchaj powierzchnię gazowym azotem.</li>
	<li>Ułóż arkusze akrylowe w stosy i połącz je ze sobą pod ciśnieniem 2 kg/cm2 w spoiwa termicznym przez 45 minut w temperaturze 110 °C, aby utworzyć zespół kanału przepływu/stymulacji elektrycznej.</li>
	<li>Przygotuj szkło nakrywkowe mikroskopu jako substrat do hodowli komórkowych w chipie.
	<ol>
		<li>Włóż szklankę nakrywkową do słoika do barwienia i napełnij słoik dziesięciokrotnym rozcieńczeniem detergentu wymienionego w wykazie materiałów.</li>
		<li>Umieść szkło nakrywkowe i słoik do barwienia w ultradźwiękowym myjce sterylnej i czyść szkło nakrywkowe przez 15 minut.</li>
		<li>Wylej rozcieńczony detergent ze słoika do barwienia, napełnij słoik wodą destylowaną i powtórz krok 1.5.2 3 razy.</li>
		<li>Osusz oczyszczoną szklankę nakrywkową, przedmuchując ją gazowym azotem przed przyklejeniem jej do taśmy dwustronnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przyklej oczyszczone szkło nakrywkowe do zespołu kanału przepływu/stymulacji elektrycznej za pomocą taśmy dwustronnej wykonanej w kroku 1.2.</li>
	<li>Przyklej 13 sztuk adapterów akrylowych do poszczególnych otworów w warstwie 1 zespołu wiórów MDF za pomocą super kleju. Montaż chipa MDF jest wtedy zakończony (rysunek 2D).</li>
	<li>Przed użyciem wysterylizuj cały zespół wiórów MDF za pomocą 30 minut naświetlania promieniami UV.</li>
</ol>
2. Konfiguracja sieci Salt Bridge dla chipa MDF
<ol>
	<li>Przed użyciem wysterylizuj wszystkie plastikowe probówki, nakrętki dokręcane palcami i probówki do mikrowirówek pokazane na rysunku 3B, ustawiając czas utrzymywania w autoklawie na 15 minut w temperaturze 121 °C.</li>
	<li>Podłącz rurki fluoroplastyczne (Rysunek 3B-i) do zespołu chipów MDF za pomocą adapterów wlotowych i wylotowych medium pokazanych na rysunku 1A.</li>
	<li>Podłącz stożek Luer plastikowych rurek wlotowych i wylotowych medium na rysunku 3B-i do 3-drogowych kurków odcinających.</li>
	<li>Pobrać 2,5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w równowadze CO2 za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml i podłączyć strzykawkę do 3-kierunkowego kranu plastikowej rurki wlotowej. Podłączyć pustą strzykawkę o pojemności 3 ml do 3-kierunkowego kranu plastikowej rurki wylotowej. Obie strzykawki są w ten sposób połączone ze sobą za pomocą chipa MDF. 
	UWAGA: Inkubować PBS w inkubatorze hodowli komórkowych O/N o temperaturze 37 °C 5%-CO2 w celu uzyskania PBS o równowadze CO2.</li>
	<li>Uszczelnij otwory niebieskiego i zielonego adaptera (Rysunek 1A) na arkuszu PMMA warstwy 1 za pomocą białych, solidnych nakrętek dokręcanych palcami (Rysunek 3B-iii).</li>
	<li>Napełnij kanały mostków solnych i komory hodowlane PBS o równowadze CO2 w strzykawce opisanej w kroku konfiguracji 2.4. Unikaj tworzenia się pęcherzyków.</li>
	<li>Następnie umieść chip MDF z równowagą CO2 zawierający PBS w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C 5%-CO2 w celu inkubacji O/N. Dzięki temu rozpuszczone powietrze w taśmie dwustronnej tworzy pęcherzyki w komorach.</li>
	<li>Wypłukać pęcherzyki w kanałach za pomocą szybkiego przepływu PBS w kanale za pomocą dwóch strzykawek. W razie potrzeby pompuj PBS tam iz powrotem.</li>
	<li>Opróżnić PBS w kanałach przez 3-drogowy kran podłączony do rurki wylotowej medium.</li>
	<li>Używając nowej strzykawki o pojemności 3 ml, pobrać 2,5 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco o równowadzeCO 2 (patrz krok 3.5) i wymienić strzykawkę podłączoną do wlotu na nową. Uzupełnij kanały pożywką.</li>
	<li>Przygotowanie sieci mostów solnych.
	<ol>
		<li>Tymczasowo odkręć stałe nakrętki (Rysunek 3B-iii) na zielonych adapterach (Rysunek 1A) i wstrzyknij 3% gorącej (>70 °C) agarozy do kanału mostka solnego przez otwór w zielonych adapterach (Rysunek 1A). 
		UWAGA: Przygotowanie gorącej agarozy: Rozpuść 1,5 g proszku agarozy w 50 ml PBS. Sterylizować, ustawiając czas przetrzymywania w autoklawie na 20 minut w temperaturze 121 °C.</li>
		<li>Przestań wstrzykiwać agarozę, gdy płyn wypełni trzy czwarte długości kanału mostka solnego.</li>
		<li>Uszczelnij pory na zielonych adapterach (Rysunek 1A), przykręcając solidne nakrętki (Rysunek 3B-iii) po wstrzyknięciu agarozy.</li>
		<li>Zamień solidne nakrętki na niebieskich adapterach (Rysunek 1A) na półprzezroczyste rurkowe nakrętki dokręcane palcami (Rysunek 3B).</li>
		<li>Załaduj 3% wstępnie podgrzaną agarozę do nakrętek rurkowych (rysunek 3B-iv).</li>
		<li>Osadź elektrody Ag/AgCl (rysunek 3B-v) w nakrętkach rurkowych (rysunek 3B-iv) przed zestaleniem agarozy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu konfiguracji sieci mostków solnych wstrzyknij komórki raka płuc CL1-5 do komór hodowlanych, po jednej komorze na raz.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek rakowych i przygotowanie do eksperymentu elektrotaktycznego
<ol>
	<li>Regularna hodowla linii komórkowej raka płuca CL1-5.
	<ol>
		<li>Hodowla komórek raka płuc CL1-5, uzyskanych od prof. Pan-Chyr Yanga,17 w kompletnym podłożu w kolbie do hodowli komórek 75T w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 . Kompletna pożywka składa się z DMEM i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Subkulturuj komórki co 3 do 4 dni. Ogniwa używane do przeprowadzania eksperymentów z elektrotaksją znajdują się w odległości mniejszej niż 25 przejść od pierwotnego źródła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 2 ml 0,25% buforu trypsyny do wykładniczo rosnących komórek CL1-5 i inkubować przez 2 minuty w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C 5%-CO2 w celu oddzielenia komórek.</li>
	<li>Zakończyć proces odrywania za pomocą 6 ml 10% FBS DMEM i odwirować komórki przy 300 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odrzucić pożywkę i zawiesić osad komórkowy w 5 ml PBS.</li>
	<li>Policz liczbę komórek w Spisie Książek Telefonicznych. Następnie weź 1 x 106 komórek i odwiruj przy 300 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyrzuć PBS. Zawiesić komórki za pomocą wstępnie ogrzanego DMEM o równowadze CO2 i dostosować gęstość komórek do 1 ×10 6 komórek/ml. 
	UWAGA: Inkubować kompletną pożywkę w inkubatorze do hodowli komórkowych O/N o temperaturze 37 °C 5%-CO 2 w celu uzyskania DMEM o równowadze CO2.</li>
</ol>
4. Przygotuj się do eksperymentu elektrotaktycznego
<ol>
	<li>Z wylotu chipa MDF wstrzyknąć 0,3 ml, 1 × 106/ml komórek do chipa.</li>
	<li>Inkubować rozdrobniony z komórek chip MDF w inkubatorze do hodowli komórkowych (w temperaturze 37 °C i 5% CO2 ) przez 2-4 godziny.</li>
	<li>Konfiguracja systemu mikroprzepływowego MDF.
	<ol>
		<li>Zainstaluj system mikroprzepływowy MDF na przezroczystym grzejniku ze szkła indowo-cynowego (ITO). Zmierz temperaturę chipa MDF za pomocą termopary typu K wciśniętej między chip MDF a szkło ITO. Sterowanie grzałką ITO za pomocą regulatora proporcjonalno-całkowo-pochodnej (PID). Ustawić temperaturę inkubacji układu mikroprzepływowego MDF na 37 °C za pomocą regulatora PID. 
		UWAGA: Produkcja grzałki ITO i konfiguracja systemu ogrzewania kultur komórkowych są opisane w poprzednich raportach. Rozdział 18,19</li>
		<li>Zamontuj zespół chipów MDF z kontrolowaną temperaturą na sterowanym komputerowo stoliku z napędem X-Y-Z na odwróconym mikroskopie. Zastosowanie stopnia z napędem silnikowym opisano w kroku 5.1. Przepompować całą pożywkę do komór hodowlanych przez wloty za pomocą czterokanałowej pompy strzykawkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wpompuj całe medium do wióra MDF z prędkością przepływu 20 μl/h. Odpady hodowlane z wylotów są zbierane w probówkach do mikrowirówek (pokazanych jako "odpady" na rysunku 3A).</li>
	<li>Inkubować komórki przez kolejne 16-18 godzin w temperaturze 37 °C w chipie MDF.</li>
	<li>Aby zastąpić pożywkę, należy pompować pożywkę zawierającą odpowiednio 50, 25, 5 i 0 μM inhibitora kinazy do każdej komory hodowlanej z natężeniem przepływu 20 μl/min przez 10 min. 
	UWAGA: Przygotować 10 mM roztwór podstawowy inhibitora kinazy białkowej Y27632 związanego z Rho, dodając 3 ml sterylnej wody do inhibitora kinazy 10,6 mg. Rozcieńczyć roztwór podstawowy 10 mM odpowiednio do 50, 25 i 5 μM, używając 10% pożywki FBS DMEM.</li>
	<li>Inkubować komórki w inhibitorze kinazy przez kolejne 60 minut w temperaturze 37 °C. Ustawić szybkość przepływu medium na 20 μl/h. W późniejszych krokach należy użyć tej samej temperatury hodowli i szybkości przepływu, które opisano powyżej.</li>
	<li>Użyj przewodów elektrycznych, aby podłączyć zasilacz prądu stałego do chipa MDF za pośrednictwem elektrod Ag/AgCl na chipie.</li>
	<li>Podłącz szeregowo amperomierz do obwodu elektrycznego. Użyj amperomierza, aby monitorować prąd elektryczny w chipie MDF.</li>
	<li>Włącz zasilanie prądem stałym i ustaw prąd amperomierza na 86,94 μA, regulując napięcie zasilania w zakresie od 15 do 19 V. 
	UWAGA: Biorąc pod uwagę prawo Ohma, E = I/(σAeff), gdzie I jest prądem elektrycznym przepływającym przez materiał sypki, tj. pożywkę hodowlaną w komorze elektrotaktycznej, σ (= 1,38 Ω−1m−1) jest przewodnością pożywki, Aeff (= 0,21 mm2 dla szerokości 3 mm × 0,07 mm wysokości) jest efektywnym polem przekroju poprzecznego komory elektrotaktycznej, a prąd elektryczny (I) wymagany do wygenerowania EF 300 mV/mm w chipie MDF wynosi 86,94 μA.</li>
</ol>
5. Akwizycja i analiza obrazów komórek
<ol>
	<li>Steruj zmotoryzowaną sceną za pomocą programu MATLAB GUI. Po zamontowaniu systemu mikroprzepływowego MDF na mikroskopie, przenieś chip do obszarów obserwacyjnych za pomocą zmotoryzowanego stolika.</li>
	<li>Rejestruj obrazy komórek za pomocą cyfrowej lustrzanki jednoobiektywowej (SLR) zamontowanej na mikroskopie.</li>
	<li>Wykonuj zdjęcia mikroskopowe za pomocą obiektywu 4X w odstępach 15 minut przez 2 godziny.</li>
	<li>Analiza migracji komórek.
	<ol>
		<li>Uruchom NIH ImageJ 1.47 V.</li>
		<li>Przeanalizuj odległość od początkowej do końcowej pozycji środka ciężkości komórki.</li>
		<li>Przejdź do "Plik"→"Importuj"→"Sekwencja obrazów" i zaimportuj dziewięć obrazów do analizy migracji komórek. Pierwszy obraz jest wynikiem czasu zerowego, a ostatni obraz jest wynikiem 120 min.</li>
		<li>Przejdź do "Analizuj"→"Ustaw pomiary" i zaznacz pole obok "Centroid"</li>
		<li>Kliknij ikonę "Wybory odręczne".</li>
		<li>Przedstaw krawędź zaznaczonych komórek na pierwszym obrazie.</li>
		<li>Przejdź do "Edytuj"→"Wybór"→"Dodaj do menedżera"</li>
		<li>Przejdź do dziewiątego obrazu i przedstaw krawędź tych samych komórek zaznaczonych na pierwszym obrazie. Pozycje komórek można śledzić za pomocą obrazów od drugiego do ósmego.</li>
		<li>Przejdź do "Edytuj"→"Wybór"→"Dodaj do menedżera"</li>
		<li>Powtórz kroki od 5.4.5 do 5.4.9, aby zebrać dane z 90 do 100 komórek.</li>
		<li>Przejdź do "Analizuj"→"Zmierz", aby uzyskać wynik początkowej i końcowej pozycji wybranych komórek. 
		UWAGA: Szybkość migracji jest definiowana jako średnia długość ruchu komórki na godzinę. Kierunkowość definiuje się jako cosinus, gdzie jest kątem między wektorem dcEF (od anody do katody) a wektorem od punktu początkowego komórki do jej końcowego położenia. Kierunkowość wynosi -1 dla komórek migrujących w kierunku anody i +1 dla komórek migrujących w kierunku katody. W przypadku grupy losowo migrujących komórek ukierunkowanie wynosi 0. cyfra arabska</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+cell+behavior+electrically%3A+current+views+and+future+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling cell behavior electrically: current views and future potential.</a> Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).</li>
<li>Djamgoz, M. B. A., Mycielska, M., Madeja, Z., Fraser, S. P., Korohoda, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+movement+of+rat+prostate+cancer+cells+in+direct-current+electric+field%3A+involvement+of+voltagegated+Na%2B+channel+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Directional movement of rat prostate cancer cells in direct-current electric field: involvement of voltagegated Na+ channel activity.</a> J Cell Sci. 114, 2697-2705 (2001).</li>
<li>Pu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+receptor+signaling+is+essential+for+electric-field-directed+migration+of+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">EGF receptor signaling is essential for electric-field-directed migration of breast cancer cells.</a> J Cell Sci. 120, 3395-3403 (2007).</li>
<li>Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+lung+cancer+cells+in+a+multiple-electric-field+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip.</a> Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).</li>
<li>Huang, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+of+human+lung+cancer+cell+line+CL1-5+in+response+to+a+direct+current+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field.</a> PLoS One. 6, e25928(2011).</li>
<li>Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+lung+cancer+cells+in+ordered+three-dimensional+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds.</a> Biomicrofluidics. 6, 14102-1410214 (2012).</li>
<li>Tsai, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+EGFR+and+RTK+signaling+in+the+electrotaxis+of+lung+adenocarcinoma+cells+under+direct-current+electric+field+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of EGFR and RTK signaling in the electrotaxis of lung adenocarcinoma cells under direct-current electric field stimulation.</a> PLoS One. 8, e73418(2013).</li>
<li>Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+chemical+and+electrical+stimulation+on+lung+cancer+cells+using+a+multichannel-dual-electric-field+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip.</a> Biomicrofluidics. 8, (2014).</li>
<li>Faupel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electropotential+evaluation+as+a+new+technique+for+diagnosing+breast+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol%22%5BJournal%5D)">Electropotential evaluation as a new technique for diagnosing breast lesions.</a> Eur J Radiol. 24, 33-38 (1997).</li>
<li>Szatkowski, M., Mycielska, M., Knowles, R., Kho, A. L., Djamgoz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recordings+from+the+rat+prostate+gland+in+vitro%3A+identified+single-cell+and+transepithelial+%28lumen%29+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recordings from the rat prostate gland in vitro: identified single-cell and transepithelial (lumen) potentials.</a> BJU Int. 86, 1068-1075 (2000).</li>
<li>McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+dimensions+in+cell+science%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Electrical dimensions in cell science.</a> J Cell Sci. 122, 4267-4276 (2009).</li>
<li>Das, T., Maiti, T. K., Chakraborty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+on-chip%3A+shear+deformation+of+fibroblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy on-chip: shear deformation of fibroblast cells.</a> Lab Chip. 8, 1308-1318 (2008).</li>
<li>Lin, F., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+chemotaxis+in+a+simple+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">T cell chemotaxis in a simple microfluidic device.</a> Lab Chip. 6, 1462-1469 (2006).</li>
<li>Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+for+studying+cell+migration+in+single+or+co-existing+chemical+gradients+and+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields.</a> Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).</li>
<li>Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+oral+squamous+cell+carcinoma+cells+in+a+multiple-electric-field+chip+with+uniform+flow+field%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field.</a> Biomicrofluidics. 6, 34116(2012).</li>
<li>Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-write+laser+micromachining+and+universal+surface+modification+of+PMMA+for+device+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 99, 186-196 (2004).</li>
<li>Chu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+invasive+and+metastatic+subpopulations+from+a+human+lung+adenocarcinoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Selection of invasive and metastatic subpopulations from a human lung adenocarcinoma cell line.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 17, 353-360 (1997).</li>
<li>Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+cell-culture+microchamber+with+a+variably+controlled+concentration+gradient+generator+and+flow+field+rectifier%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier.</a> Biomicrofluidics. 2, 24105(2008).</li>
<li>Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Hsu, W. -C., Jhang, J. -H., Young, T. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITO+patterning+by+a+low+power+Q-switched+green+laser+and+its+use+in+the+fabrication+of+a+transparent+flow+meter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 17, 2316(2007).</li>
<li>Pu, J., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi+polarization+in+a+strong+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Golgi polarization in a strong electric field.</a> J Cell Sci. 118, 1117-1128 (2005).</li>
<li>Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+directly+induces+pre-angiogenic+responses+in+vascular+endothelial+cells+by+signaling+through+VEGF+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors.</a> J Cell Sci. 117, 397-405 (2004).</li>
<li>Yao, L., Shanley, L., McCaig, C., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+applied+electric+fields+guide+migration+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons.</a> J Cell Physiol. 216, 527-535 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Stwierdziliśmy, że proces przyklejania adapterów akrylowych do warstwy 1 chipa MDF jest trudny. Nałożenie zaledwie 1 do 2 μl super kleju wystarczy, aby mocno przykleić adapter do wióra MDF. Większe ilości kleju powodowały niepełną polimeryzację super kleju i brak przylegania. Gdy adaptery akrylowe zostały mocno przyklejone do chipa MDF, wyciek cieczy w układzie mikroprzepływowym rzadko występował. Ponadto inkubacja O/N wewnątrz komory próżniowej pomogła usunąć powietrze uwięzione między dwustronną taśmą / szkłem nakrywko...

Zachowanie przylegających do siebie komórek poruszających się w kierunku anody lub katody pod wpływem pola elektrycznego prądu stałego (dcEF) jest określane jako elektrotaksja. Zachowanie elektrotaktyczne komórek odgrywa znaczącą rolę w embriogenezie, regeneracji nerwów i gojeniu się ran. 1 Komórki nowotworowe, takie jak komórki raka prostaty szczura,2 komórki raka piersi,3 i komórki gruczolakoraka płuc4-8 wykazały ruch elektrotaktyczny pod zastosowanym dcEF. Fizjologiczny EF został zmierzony w tkankach gruczołu. 9,10 Elektrotaksję odnotowano również w komórkach nowotworowych związanych z gruczołami. 2,3 Podsumowując, elektrotaksja komórek nowotworowych jest uważana za czynnik przerzutów. 11 Kontrolowanie przewodnictwa elektrycznego komórek nowotworowych w ramach dcEF może być potencjalnym podejściem do przyszłego leczenia raka. Jednak dziś szczegółowy mechanizm molekularny elektrotaksji pozostaje kontrowersyjny. W związku z tym badanie wpływu stymulacji elektrycznej na migrację komórek nowotworowych może ułatwić opracowanie strategii leczenia nowotworów.
Ostatnio wyprodukowano urządzenia bio-mikroprzepływowe do badania reakcji komórek na siłę ścinającą przepływ,12 gradientów chemicznych,13 i bodźce elektryczne4 in vitro. Wytwarzanie urządzeń biomikroprzepływowych z wykorzystaniem polidimetylosiloksanu (PDMS) lub polimetakrylanu metylu (PMMA, znanego również jako akryl) skutecznie zmniejszyło wskaźnik niepowodzeń takich eksperymentów. Co więcej, użycie urządzeń mikroprzepływowych na bazie akrylu jako prototypu do badania podmiotów biologicznych jest prostsze niż użycie chipów PDMS. Do nauki elektrotaksji opracowano różne funkcje w urządzeniach na bazie akrylu. Jednak żadna z dotychczasowych konstrukcji nie jest w stanie jednocześnie testować wpływu różnych warunków chemicznych i pola elektrycznego na ogniwa do badań elektrotaksji. W związku z tym opracowaliśmy urządzenie mikroprzepływowe - wielokanałowy chip z podwójnym polem elektrycznym (MDF) - zawierający cztery niezależne kanały hodowlane i osiem różnych warunków eksperymentalnych w jednym chipie.
Chip MDF na bazie akrylu, po raz pierwszy opisany przez Hou et al.,8 integruje stymulację elektryczną i kilka chemicznie izolowanych kanałów. Te chemicznie izolowane kanały mogą być wykorzystane do hodowli różnych typów komórek w jednym eksperymencie. DcEF w kanałach jest wytwarzany przez zasilacz elektryczny. W każdym chemicznie izolowanym kanale przewodzone są dwa niezależne pola elektryczne, jedno o natężeniu zastosowanego pola elektrycznego (EFS), a drugie o 0 EFS. W ten sposób chip zapewnia lepiej kontrolowany współistniejący EF i stymulację chemiczną. Co więcej, wyniki symulacji numerycznej dyfuzji chemicznej wewnątrz chipa MDF wskazują, że po 24-godzinnym okresie eksperymentalnym nie doszło do zanieczyszczenia krzyżowego między kanałami. 8
W porównaniu do urządzenia opisanego przez Li et al.,14 chip MDF zapewnia większy obszar hodowli, co pozwala na dalszą analizę biochemiczną stymulowanych elektrycznie komórek. Dodatkowo, dzięki większemu obszarowi obserwacji chipa MDF, w teście można zaobserwować więcej komórek, dzięki czemu analiza prędkości migracji lub ukierunkowalności elektrycznie stymulowanych komórek jest dokładniejsza. Projekty jednokanałowych układów scalonych z poprzednich badań zgłoszonych przez Huang i wsp.4 oraz Tsai i wsp.15 zezwalaj na badanie tylko jednego rodzaju ogniw lub substancji chemicznych. Jednak chip MDF może być używany do badania wpływu różnych substancji chemicznych na elektrotaksję, a także wpływu stymulacji elektrycznej na różne typy komórek. Innymi słowy, chip MDF pozwala na efektywne badanie zależności dawek chemicznych.

<table><tbody><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Gibco, Invitrogen, USA</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco, Invitrogen, USA</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Gibco, Invitrogen, USA</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Basic Life</td><td>BL2651</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (chlorowodorek)</td><td>Cayman Chemical Co</td><td>10005583</td><td></td></tr><tr><td>agaroza</td><td>LONZO, Stany Zjednoczone</td> Strzykawka <td>SeaKem LE AGAROSE</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Terumo</td><td>3 ml ze stożkiem</td><td></td>Luer</tr><tr><td>3-drożny kran</td><td>Nipro</td><td>ze stożkiem</td><td></td>Luer</tr><tr><td>PMMA (akryl)</td><td>HiShiRon Industries CO., Ltd, Tajwan</td><td></td><td>grubość 1mm, adapter</td></tr><tr><td>akrylowy</td><td>2mm KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Tajwan</td><td>1/4-28 port, 10x10x6 mm</td><td>dostosowana</td></tr><tr><td>nakrętka</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>UPCHURCH: P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x</td><td></td></tr><tr><td>Szklana osłona mikroskopu</td><td>Deckgl&auml; ser, Niemcy</td><td>Taśma dwustronna 24x60 mm</td><td></td></tr><tr><td></td><td>3M</td><td>PET 8018</td><td></td></tr><tr><td>super klej</td><td>3M</td><td>Scotch Liquid Plus Super Glue</td><td></td></tr><tr><td>TFD4 detergent</td><td>Franklab, Francja</td><td>TFD4</td><td></td></tr><tr><td>ultradźwiękowa myjka steri</td><td>LEO ULTRASONIC CO., LTD., Tajwan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo bonder</td><td>KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Tajwan</td><td>dostosowany</td><td></td></tr><tr><td>rysik laserowy CO2</td><td>Grupa LTT, Tajwan</td><td>Regulator ISL-II</td><td></td></tr><tr><td>proporcjonalno-całkowo-pochodnej (PID)</td><td>JETEC Electronics Co., Japen</td><td>TTM-J40-R-AB,</td><td></td></tr> <tr><td>termopara typu K</td><td>TECPEL</td><td>TPK-02A 4-kanałowa</td><td></td></tr><tr><td>pompa strzykawkowa</td><td>KdScientific, USA</td> Zasilacz prądu stałego <td>250P</td><td></td></tr><tr><td></td><td>GWInstek, Tajwan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stopień motorowy X-Y-Z</td><td>TanLian, E-O Co. Ltd., Tajwan</td><td>dostosowany</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop odwrócony</td><td>Olympus, Japonia</td><td>Lustrzanka cyfrowa CKX41</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Canon, Japonia</td><td>60D</td><td></td></tr></tbody></table>

badania elektrotaktyczne komórek raka płuc przy użyciu wielokanałowego układu mikroprzepływowego o podwójnym polu elektrycznym

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Zachowanie kierunkowej migracji komórek pod wpływem pola elektrycznego prądu stałego (dcEF) jest określane jako elektrotaksja. W wielu badaniach wykazano istotną rolę fizjologicznego dcEF w kierowaniu ruchem komórek podczas rozwoju zarodka, różnicowaniu komórek i gojeniu się ran. Dzięki zastosowaniu chipów mikroprzepływowych do testu elektrotaksji, proces badania zostaje skrócony, a błędy eksperymentalne zminimalizowane. W ostatnich latach urządzenia mikroprzepływowe wykonane z substancji polimerowych (np. polimetakrylanu metylu, PMMA lub akrylu) lub polidimetylosiloksanu (PDMS) są szeroko stosowane w badaniu reakcji komórek na stymulację elektryczną. Jednak w przeciwieństwie do wielu etapów wymaganych do wytworzenia urządzenia PDMS, prosta i szybka konstrukcja akrylowego chipa mikroprzepływowego sprawia, że nadaje się on zarówno do prototypowania urządzeń, jak i do produkcji. Jednak żadne z opisanych urządzeń nie ułatwia skutecznego badania jednoczesnego wpływu substancji chemicznych i dcEF na komórki. W tym raporcie opisujemy nasz projekt i produkcję wielokanałowego chipa MDF na bazie akrylu w celu zbadania jednoczesnego wpływu stymulacji chemicznej i elektrycznej na komórki raka płuc. Chip MDF zapewnia osiem kombinacji stymulacji elektrycznej/chemicznej w jednym teście. Chip nie tylko znacznie skraca wymagany czas eksperymentu, ale także zwiększa dokładność w badaniach elektrotaksji.

Wytwarzanie i montaż urządzenia MDF
Schematyczny rysunek chipa MDF opartego na akrylu przedstawiono na Rysunku 1A. Do montażu gotowego chipa MDF (Rysunek 2D) wykorzystano cztery arkusze akrylowe, jedno szkiełko podstawowe, 13 adapterów akrylowych oraz kawałek taśmy dwustronnej. W urządzeniu MDF znajdują się tylko cztery niezależne kanały hodowlane. Jednak sieć mostków solnych na...

Wiele urządzeń mikroprzepływowych zostało opracowanych do użytku w badaniach nad elektrotaksją. Jednak żaden z tych chipów nie pozwala na efektywne badanie jednoczesnego wpływu substancji chemicznych i pola elektrycznego (EF) na komórki. Opracowaliśmy urządzenie na bazie polimetakrylanu metylu, które zapewnia lepiej kontrolowany współistniejący ślad węglowy i stymulację chemiczną do wykorzystania w badaniach nad elektrotaksją.

Badania elektrotaktyczne komórek raka płuc przy użyciu wielokanałowego układu mikroprzepływowego o podwójnym polu elektrycznym

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Ogólnym celem tego eksperymentu mikroprzepływowego jest ocena wpływu inhibitorów kinazy na migrację komórek nowotworowych pod wpływem bezpośredniego pola elektrycznego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad elektrotaksją komórkową, takie jak określenie szlaków determinujących migrację komórek rakowych sterowaną polem elektrycznym. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona wysoce powtarzalnym i oszczędzającym czas badaniem elektrotaksji, które można łatwo wdrożyć.Zastosowanie tej techniki rozciąga się na diagnostykę potencjału przerzutowego nowotworów. Ponieważ mobilność magnetycznych komórek rakowych może być zwiększana przez pole elektryczne, metoda ta może dostarczyć wglądu w wewnątrzkomórkowe właściwości elektrokinetyczne komórek nowotworowych.Można je również zastosować w procesach regeneracji skóry, takich jak gojenie ran. Rozpocznij od użycia programu do projektowania i kreślenia, aby narysować wzór pojedynczej warstwy akrylu. Zapisz wzór, a następnie włącz grawer laserowy.Podłącz skryber do laptopa sterującego i kliknij plik z zaprojektowanym wzorem, aby otworzyć wzór warstwy akrylowej. Następnie umieść arkusz czystego akrylu na stole x,

electrotaxis-studies-lung-cancer-cells-using-multichannel-dual

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy protokół demonstruje metody wykorzystywane do tworzenia środowisk 2D i 3D w specjalnie zaprojektowanych komorach elektrotaktycznych, które umożliwiają śledzenie komórek in vivo/ex vivo przy użyciu rejestracji time-lapse na poziomie pojedynczych komórek, w celu zbadania galwanotaksji/elektrotaksji oraz innych odpowiedzi komórkowych na elektryczne pola (EFs) prądu stałego (DC).

Sterowana polem elektrycznym migracja kierunkowa komórek progenitorowych neuronów w środowiskach 2D i 3D

W tym protokole pokazujemy, jak konstruować niestandardowe komory, które pozwalają na zastosowanie pola elektrycznego prądu stałego, aby umożliwić obrazowanie poklatkowe translokacji komórek prekursorowych pochodzenia nerwowego w dorosłym mózgu podczas galwanotaksji.

Test galwanotaksji do analizy kinetyki migracji neuronalnych komórek prekursorowych w zewnętrznie przyłożonym polu elektrycznym prądu stałego

Platforma elektroporacji wspomagana wirami mikroprzepływowymi została opracowana do sekwencyjnego dostarczania wielu cząsteczek do identycznych populacji komórek z precyzyjną i niezależną kontrolą dawkowania. Etap oczyszczania komórek docelowych w oparciu o rozmiar, poprzedzający elektroporację, przyczynił się do zwiększenia wydajności dostarczania molekularnego i żywotności komórek przetworzonych.

Mikroskalowy elektroporator wspomagany wirami do sekwencyjnego dostarczania molekularnego

Prezentujemy metodę zastosowania fizjologicznego pola elektrycznego do migrujących, unieśmiertelnionych komórek prostaty w specjalnie wykonanej komorze galwanotaksji. Za pomocą tej metody wykazujemy, że 2 linie nienowotworowych komórek prostaty wykazują różne stopnie kierunkowości migracji w terenie.

Wykorzystanie specjalnie zaprojektowanych komór galwanotaksji do badania kierunkowej migracji komórek prostaty

Mikro-prefabrykowane urządzenia zintegrowane z komponentami fluidycznymi stanowią platformę in vitro do badań komórkowych naśladujących mikrośrodowisko in vivo. Opracowaliśmy mikroprzepływowe chipy na bazie polimetakrylanu metylu do badania reakcji komórkowych pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających.

Projektowanie urządzeń mikroprzepływowych do badania odpowiedzi komórkowych pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających

Prezentujemy mikroprzepływowy model raka na chipie, technologię "Akcelerator Ewolucji", która zapewnia kontrolowaną platformę do długoterminowych badań ilościowych dynamiki raka w czasie rzeczywistym w dobrze zdefiniowanych warunkach środowiskowych na poziomie pojedynczej komórki. Oczekuje się, że technologia ta sprawdzi się jako model in vitro do badań podstawowych lub przedklinicznego opracowywania leków.

Generowanie heterogenicznych gradientów leków w różnych populacjach nowotworów w akceleratorze ewolucji mikroprzepływowej do obserwacji w czasie rzeczywistym

W tym badaniu prezentujemy protokół różnicowania nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych (NPC) indukowanych wyłącznie przez stymulację impulsami prądu stałego (DC) w systemie mikroprzepływowym.

Różnicowanie neuronalnych komórek prekursorowych pod wpływem pola elektrycznego w urządzeniach mikroprzepływowych

Ten protokół opisuje techniki mikrofabrykacji wymagane do zbudowania urządzenia do elektroporacji mikroprzepływowej typu lab-on-a-chip. Konfiguracja eksperymentalna wykonuje kontrolowane transfekcje na poziomie pojedynczej komórki w ciągłym przepływie i może być rozszerzona do wyższych przepustowości dzięki kontroli populacyjnej. Przedstawiono analizę pokazującą możliwość elektrycznego monitorowania stopnia przepuszczalności błony komórkowej w czasie rzeczywistym.

Wytwarzanie i działanie systemu mikroelektroporacji o ciągłym przepływie z detekcją przepuszczalności

Komórki raka piersi wykazują inne właściwości dielektryczne w porównaniu do komórek nabłonka piersi niebędących nowotworami. Postawiono hipotezę, że w oparciu o tę różnicę we właściwościach dielektrycznych, obie populacje można rozdzielić do celów immunoterapii. Aby to wesprzeć, modelujemy urządzenie mikroprzepływowe do sortowania komórek MCF-7 i MCF-10A.

Urządzenie mikroprzepływowe do separacji komórek raka piersi bez przerzutów (MCF-7) i nienowotworowych (MCF-10A) za pomocą dielektroforezy prądu przemiennego

Kliniczny chip mikroprzepływowy jest ważną techniką analizy biomedycznej, która upraszcza wstępne przetwarzanie próbek krwi pacjenta klinicznego i immunofluorescencyjnie barwi krążące komórki nowotworowe (CTC) in situ na chipie, umożliwiając szybkie wykrycie i identyfikację pojedynczego CTC.

Kliniczna mikroprzepływowa platforma chipowa do izolacji wszechstronnych krążących komórek nowotworowych

W tym miejscu przedstawiamy protokół wytwarzania unikalnego dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego do badania elektromechanicznej regulacji homeostazy tkanek nabłonkowych. Urządzenie aplikuje statyczne fizjologiczne prądy elektryczne prostopadłe do płaszczyzny tkanki, wpływając na adhezję, proliferację i wytłaczanie komórki. Obrazowanie żywych komórek i pomiary naprężeń mechanicznych ujawniają mechanizmy tych procesów.

Ujawnienie elektromechanicznej kontroli homeostazy tkanek za pomocą dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego

Poznaj metodę badania elektrotaksji komórek raka płuc przy użyciu wielokanałowego układu mikroprzepływowego z podwójnym polem elektrycznym. Technika ta pozwala ocenić wpływ inhibitorów kinaz na migrację nowotworową.

Badania elektrotaktyczne komórek raka płuc przy użyciu wielokanałowego układu mikroprzepływowego o podwójnym polu elektrycznym

Przeglądaj więcej filmów