Szczepienie kulek w rozwijających się kończynach zarodka kurczaka w celu identyfikacji szlaków transdukcji sygnału wpływających na ekspresję genów

Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, w jaki sposób można określić wpływ czynników wzrostu i inhibitorów na ekspresję genów rozwijających się kończyn zarodka kurczaka. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii rozwoju, takie jak to, w jaki sposób cząsteczki sygnałowe wpływają na wzrost i różnicowanie komórek in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona metodę badania tych czynników bezpośrednio w zarodku.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w rozwój kończyny, można ją również zastosować do innych układów, takich jak tkanka nerwowa, somity lub gastrulacja. Procedurę zademonstruje Rebeea Mohammed, doktorantka z mojego laboratorium. Na początek przenieś jeden mililitr kulek z oryginalnego roztworu podstawowego do świeżej probówki.

Pozwól, aby kulki opadły, a następnie usuń płyn i zastąp go jednym mililitrem PBS. Powtórz ten krok pięć razy i przechowuj umyte koraliki w temperaturze czterech stopni Celsjusza jako zawiesinę w PBS. Wybierz kulki do szczepienia, wyjmując je z przemytego roztworu podstawowego za pomocą pipety o pojemności 20 mikrolitrów i umieść je w jednym mililitrze PBS.

Za pomocą stereoskopu wybierz koraliki o średnicy około 100 mikronów. Przenieś wybrane kulki w dwóch mikrolitrach płynu na nową szalkę Petriego zawierającą 20 mililitrową kroplę PBS Następnie usuń PBS z kulek. Najpierw za pomocą pipety o pojemności 20 mikrolitrów, a następnie usuń pozostałą ciecz przez działanie kapilarne za pomocą cienkich kleszczyków zegarmistrzowskich.

Ważne jest, aby usunąć jak najwięcej płynu, aby czynnik wzrostu nie został rozcieńczony po dodaniu do kulek. Odpipetować czynnik wzrostu bezpośrednio na kulki. W przypadku FGF18 dodaj 0,5 mikrolitra rekombinowanego FGF18, rozpuszczonego dodaj 0,5 miligrama na mililitr w PBS z 0,1 procentem BSA.

Następnie umieść kilka kropel wody wokół krawędzi naczynia, aby zapobiec odparowaniu płynu. Gdy będą gotowe, inkubuj koraliki przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji usuń krople wody z naczynia za pomocą pipety Pasteura i umieść naczynie na lodzie.

Wyprowadź kulki, najpierw za pomocą szpatułki, aby przenieść kulki do 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Następnie dodaj jeden mililitr 0,2 normalnego kwasu mrówkowego i inkubuj kulki w kwasie na platformie do wytrząsania przez godzinę. Następnie pozwól kulkom osiąść, usuń kwas mrówkowy i zastąp go jednym mililitrem wody.

Myj koraliki przez godzinę na platformie do wytrząsania i powtórz pranie sześć razy, aby usunąć resztki kwasu mrówkowego. Po ostatnim praniu usuń pozostały płyn i przechowuj kulki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą szpatułki usuń z bulionu małą paletę koralików o objętości około pięciu do dziesięciu mikrolitrów i umieść koraliki na 30-mililitrowej szalce Petriego.

Następnie dodaj jeden mililitr DMSO. Następnie użyj pipety P2 ustawionej na dwa mikrolitry, aby przenieść kulki o średnicy około 100 mikronów do 20 mikrolitrowej kropli rozpuszczalnika na innej 30-mililitrowej szalce Petriego. Usunąć większość rozpuszczalnika za pomocą pipety o pojemności 20 mikrolitrów, a wszelkie pozostałości rozpuszczalnika za pomocą pipety o pojemności dwóch mikrolitrów.

Następnie przykryj kulki 20 mikrolitrami leku, który ma być zastosowany, rozpuszczonym w DMSO. Inkubuj kulki w roztworze leku przez godzinę. Chroń kulki przed światłem, ponieważ wiele cząsteczek leków jest wrażliwych na światło.

Aby pomóc w wizualizacji kulek, przenieś cztery do pięciu kulek w dwóch mikrolitrach płynu do 20 mikrolitrów dwuprocentowej czerwieni fenolowej rozpuszczonej w wodzie. Usuń pojedynczy koralik za pomocą cienkich kleszczyków zegarmistrzowskich i opłucz koralik w PBS. Nie pozostawiaj kulek w roztworze czerwieni fenolowej na dłużej niż 15 minut przed ich spłukaniem, ponieważ może to spowodować utratę aktywności.

Pokrój cienki drut wolframowy na długości od trzech do czterech centymetrów Następnie włóż jeden kawałek drutu do końca szklanej pipety Pasteura i rozpuść w palniku Bunsena, aby zamocować go na miejscu. Przygotuj do 10 igieł, aby upewnić się, że są części zamienne, jeśli są uszkodzone. Następnie umieść koniec drutu w płomieniu palnika i przytrzymaj go tam, aż wolfram zaświeci się na biało, a końcówka będzie ostra.

Zajmuje to około dwóch do trzech minut. Dodaj pięć do sześciu kropli atramentu artystycznego Indii do 15 mililitrów PBS zawierających 100 jednostek penicyliny i 0,1 miligrama streptomycyny na mililitr. Aby przygotować zarodki kurczaka, wysiaduj jaja końcem, aż osiągną pożądany etap dla większości manipulacji zawiązkami kończyn, który zwykle trwa od trzech do pięciu dni.

Po osiągnięciu pożądanego punktu czasu użyj kleszczy, aby postukać w koniec jajka i rozbić skorupkę. Następnie użyj kleszczy, aby usunąć skorupę i odsłonić zarodek. Upewnij się, że błona komórki jajowej również została usunięta.

Aby uwidocznić zarodek, wstrzyknij PBS uzupełniony kilkoma kroplami atramentu artist India, pod zarodek za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra i igły o rozmiarze 21. Błonę witelinową pokrywającą zarodek można następnie usunąć za pomocą cienkich kleszczy. Następnie dodaj do jaja dwa do trzech mililitrów uzupełnionego PBS z jednym procentem płodowej surowicy cielęcej, 100 jednostek na mililitr penicyliny i 0,1 miligrama na mililitr streptomycyny, aby upewnić się, że zarodek nie odwodni się.

Używając zaostrzonych kleszczy zegarmistrzowskich, otwórz owodnię nad rozwijającymi się pąkami kończyn. Na tych etapach zarodek zazwyczaj obraca się tak, że prawa strona znajduje się najwyżej. Upewnij się, że zarodek nie wysycha, dodając więcej uzupełnionego roztworu PBS, gdy jest to potrzebne.

Owodnię otaczającą zarodek można otworzyć za pomocą cienkiej igły wolframowej, aby odsłonić rozwijającą się kończynę. Następnie użyj zaostrzonego drutu wolframowego, aby wykonać nacięcie w pąku kończyny, w którym zostanie wszczepiony koralik. Jeśli to możliwe, unikaj przecinania pączka kończyny.

Chociaż na młodszych etapach jest to trudne. Podnieś koralik, pokryty czynnikiem wzrostu lub lekiem, używając bardzo cienkich kleszczy zegarmistrzowskich. Jeśli kulka została namoczona w DMSO lub czerwieni fenolowej, upewnij się, że została spłukana PBS przed nałożeniem jej na zarodek.

Przenieś koralik do zarodka za pomocą kleszczy, a następnie użyj zaostrzonego drutu wolframowego, aby wprowadzić koralik w miejsce nacięcia. Dodaj dodatkowy jeden do dwóch mililitrów uzupełnionego roztworu PBS do komórki jajowej, aby upewnić się, że zarodek jest nawodniony. Należy unikać stosowania roztworu bezpośrednio na sam zarodek, ponieważ może to spowodować uszkodzenie zarodka i usunięcie kulki.

Następnie użyj dziesięciomililitrowej strzykawki, wyposażonej w igłę o rozmiarze 19, aby usunąć tylko tyle albuminy, ile jest potrzebne, aby zarodek nie stykał się z taśmą używaną do uszczelniania komórki jajowej. Upewnij się, że igła nie uszkodziła żółtka, przesuwając je po wewnętrznej stronie skorupy. Na koniec zamknij jajo taśmą i włóż je z powrotem do inkubatora.

W celu potwierdzenia, że FGF18 jest w stanie działać poprzez MEK w celu fosforylacji ERK, zarodki zostały pobrane godzinę po przeszczepieniu koralików i wybarwione immunologicznie na obecność fosforylowanego ERK, który można zobaczyć wokół przeszczepionego koralika na zdjęciu po prawej stronie. W stadium HH 21 MyoD nie ulega ekspresji w rozwijających się mioblastach kończyn. Chociaż barwienie można zobaczyć w miotomii rozwijających się somitów.

Sześć godzin po przeszczepie kulki FGF18 można zaobserwować MyoD indukowany w mioblastach w pobliżu koralika. Podczas gdy nie ma wyrazu w przeciwległej kończynie. Ekspresja ta może być zahamowana przez współszczepienie kulki, pokrytej inhibitorem MEK, takim jak U0126.

Podobnie, przeszczepienie koralika U0126 w stadium HH 21 zmniejsza endogenną ekspresję MyoD po 24 godzinach, w porównaniu z nieleczoną kończyną przeciwległą. W zawiązkach kończyn, w stadium HH 19, FGF18 nie indukuje MyoD. Jednak współszczepienie kulek nasączonych FGF18 i antagonistą kwasu retinowego może to przezwyciężyć i wykryć ektopowy MyoD.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do czterech minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Opracowanie tej techniki umożliwiło naukowcom zajmującym się biologią rozwoju zbadanie czynników wzrostu sygnalizujących rozwój zarodka. Próbując tej techniki, należy pamiętać, aby nie dopuścić do wyschnięcia zarodka.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeszczepiać koraliki do rozwijających się zarodków, aby określić, w jaki sposób sygnalizacja czynników wzrostu wpływa na rozwój.