Optogenetyczny funkcjonalny rezonans magnetyczny
19 kwietnia 2016
Ten protokół opisuje kroki i analizę danych wymaganych do pomyślnego przeprowadzenia optogenetycznego funkcjonalnego rezonansu magnetycznego (ofMRI). ofMRI to nowatorska technika, która łączy odczyt fMRI w wysokim polu ze stymulacją optogenetyczną, pozwalając na specyficzne dla typu komórki mapowanie funkcjonalnych obwodów nerwowych i ich dynamiki w całym żywym mózgu.
Ogólnym celem tej procedury obrazowania jest połączenie fMRI ze stymulacją optogenetyczną w celu specyficznego dla typu komórek mapowania funkcjonalnych obwodów neuronalnych oraz ich dynamiki w całym żywym mózgu. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki, takie jak określenie roli konkretnych elementów obwodów mózgowych w napędzaniu globalnej aktywności mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona specyficzną dla typu komórek stymulację oraz odczyt globalnej aktywności mózgu z relatywnie wysoką rozdzielczością przestrzenną.
Procedurę tę zaprezentują Jia Liu i Zhongnan Fang, doktoranci w moim laboratorium. Po znieczuleniu zwierzęcia zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy ogolić głowę maszynką elektryczną i przeprowadzić potrójne chirurgiczne oczyszczenie skóry za pomocą Betadine oraz płukania 70% etanolem. Następnie należy unieruchomić czaszkę zwierzęcia w aparacie stereotaktycznym.
Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie skóry głowy w linii środkowej o długości od 15 do 20 milimetrów. Odciągnij skórę głowy, używając chirurgicznych kleszczyków hemostatycznych przymocowanych do okostnej. Zlokalizuj punkty Lambda i Bregma na czaszce, a następnie ustaw wiertło nad obszarem zainteresowania (ROI).
Za pomocą wiertarki stomatologicznej wykonaj niewielką kraniotomię nad obszarem ROI, uważając, aby nie przebić mózgu. Powoli wprowadź igłę połączoną z strzykawką mikrolitrową przez otwór kraniotomii do obszaru ROI w mózgu. Następnie, używając kontrolera pompy do mikrostrykawek, wstrzyknij dwa mikrolitry roztworu wektora do ROI.
Po zakończeniu wstrzykiwania odczekaj 10 minut, a następnie powoli wyjmij strzykawkę z prędkością 0,5 mm/min. Po wstrzyknięciu osusz powierzchnię czaszki. Potwierdź współrzędne ROI i wprowadź implant feruli do docelowej głębokości z prędkością 0,5 mm/min.
Na koniec zamocuj implant z tuleją do czaszki za pomocą cementu stomatologicznego. Po stwardnieniu cementu stomatologicznego zamknij nacięcie szwami wokół nasadki z cementu. Rozpocznij od podłączenia światłowodowego kabla patchcord do źródła światła laserowego, a następnie zmierz moc na końcówce złącza kabla za pomocą miernika mocy.
Dostosuj odpowiedni poziom mocy, aby uzyskać pożądany sygnał wyjściowy na końcówce kabla światłowodowego zaimplantowanego w mózgu. Zapobiegaj wyciekom światła z implantu poprzez zasłonięcie oczu zwierzęcia. Następnie umieść cewkę nad głową zwierzęcia.
Użyj tulei zaciskowej, aby przymocować kabel światłowodowy do implantu ferulowego. Wsuń kolebkę z zwierzęciem do otworu skanera. Przez cały czas trwania eksperymentu monitoruj częstotliwość oddechów, tidal CO2 oraz temperaturę ciała, regulując respirator, aby utrzymać wartości fizjologiczne w odpowiednich granicach.
Podłącz kable BNC z portu wyzwalającego skanera MRI do generatora funkcji. Wybierz sekwencję pozycjonowania i kliknij „scan” w oknie operacyjnym. Kliknij „continue”, aby obrazować położenie głowy zwierzęcia.
Jeśli mózg nie znajduje się w izocentrum, należy skorygować położenie głowy zwierzęcia i powtarzać skanowanie pozycjonujące do momentu, aż mózg znajdzie się w izocentrum. Należy pozyskać obraz anatomiczny o wysokiej rozdzielczości, aby sprawdzić ogólną integralność mózgu oraz potwierdzić lokalizację implantu włókna optycznego. Następnie należy wybrać sekwencję ważoną T2.
Dostosuj liczbę warstw, a następnie kliknij „scan”, aby pozyskać anatomiczne obrazy w płaszczyźnie czołowej o wysokiej rozdzielczości, ważone T2. Na koniec wybierz sekwencję gradientowego echa z odzyskiwaniem sygnału (gradient recalled echo) w trybie wielowarstwowym, a następnie kliknij „continue”, aby pozyskać obraz funkcjonalny. Niniejszy protokół wykorzystuje optogenetyczny f-MRI do stymulacji kory ruchowej w modelu zwierzęcym.
Niniejsza mapa aktywacji przedstawia aktywne woksele w korze ruchowej i wzgórzu, co wskazuje na dalekosiężne połączenia synaptyczne między tymi obszarami. Tutaj silny sygnał został wyświetlony dla aktywnych wokseli w korze ruchowej i wzgórzu podczas stymulacji optogenetycznej kory ruchowej. Hemodynamiczna funkcja odpowiedzi wzgórza wykazuje opóźnioną odpowiedź w stosunku do odpowiedzi w korze ruchowej po stymulacji.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania operacji implantacji oraz optogenetycznego funkcjonalnego obrazowania rezonansem magnetycznym. Po opanowaniu tej techniki procedura obrazowania może zostać zrealizowana w ciągu dwóch godzin. Podczas wykonywania tej procedury bardzo ważne jest monitorowanie zwierzęcia i utrzymywanie jego parametrów fizjologicznych w granicach normy.
Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować metody komplementarne, takie jak elektrofizjologia w celu zbadania dynamiki czasowej aktywności neuronalnej lub immunohistochemia w celu walidacji ekspresji i specyficzności opsyny. Opracowanie tej techniki utorowało neurobiologom drogę do badania łączności funkcjonalnej w nienaruszonym, żywym mózgu. Należy pamiętać, że praca ze skanerem MRI może być niezwykle niebezpieczna.
Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak utrzymywanie urządzeń magnetycznych w odpowiedniej odległości od skanera.
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia procedurę i analizę danych w optogenetycznym funkcjonalnym obrazowaniu rezonansem magnetycznym (ofMRI), technice łączącej fMRI wysokopolowe ze stymulacją optogenetyczną. Metoda ta umożliwia badaczom mapowanie funkcjonalnych obwodów neuronalnych oraz ich dynamiki w żywych mózgach z rozdzielczością specyficzną dla typu komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Techniki obrazowania
- Optogenetyka
Wstęp
- ofMRI łączy fMRI ze stymulacją optogenetyczną.
- Technika ta umożliwia precyzyjne mapowanie obwodów neuronalnych.
- Pozwala ona na udzielenie odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące funkcji obwodów mózgowych.
- Wysoka rozdzielczość przestrzenna stanowi istotną zaletę tej metody.
Cel badania
- Wykazanie zastosowania ofMRI w badaniu obwodów neuronalnych.
- Przedstawienie szczegółowego protokołu dla badaczy.
- Podkreślenie znaczenia monitorowania parametrów fizjologicznych podczas procedury.
Zastosowane metody
- Przygotowanie zwierząt i znieczulenie.
- Kraniotomia i wstrzyknięcie roztworu wektora do mózgu.
- Implantacja światłowodu i podłączenie do laserowego źródła światła.
- Wykorzystanie skanera MRI do obrazowania i akwizycji danych.
Główne wyniki
- Mapy aktywacji wykazują połączenia między korą ruchową a wzgórzem.
- Wykazano opóźnioną odpowiedź hemodynamiczną we wzgórzu.
- Pomyślna implementacja stymulacji optogenetycznej podczas obrazowania.
- Procedurę można ukończyć w ciągu około dwóch godzin.
Wnioski
- ofMRI jest cennym narzędziem do badania konektywności funkcjonalnej mózgu.
- Podtrzymanie fizjologii zwierzęcia jest kluczowe podczas procedury.
- Metody komplementarne mogą pogłębić zrozumienie dynamiki neuroaktywności.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Optogenetyczny funkcjonalny rezonans magnetyczny (ofMRI) umożliwia badanie obwodów neuronalnych specyficznych dla danego typu komórek z rozdzielczością przestrzenną obejmującą cały mózg, co wspiera walidację celów w procesie odkrywania leków neuropsychiatrycznych. Poprzez powiązanie precyzyjnej manipulacji obwodami z odczytami globalnej aktywności mózgu, metoda ta zwiększa redukcję ryzyka mechanistycznego oraz pewność predykcyjną wczesnych hipotez dotyczących celów terapeutycznych. Zdolność ta wspomaga selekcję projektów w portfolio poprzez wyjaśnienie łączności funkcjonalnej istotnej dla modeli chorób i mechanizmów terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie wpływu konkretnych elementów obwodów mózgowych na aktywność globalną, co wspiera testowanie hipotez terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia specyficzną dla typu komórek stymulację z odczytem dynamiki mózgu o wysokiej rozdzielczości przestrzennej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje mapy aktywacji ukazujące długodystansowe połączenia synaptyczne, np. między korą ruchową a wzgórzem, co służy do projektowania testów opartych na obwodach neuronalnych.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ilościowych pomiarów sygnału BOLD, umożliwiając porównanie warunków stymulacji i odpowiedzi sieciowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie systemów istotnych dla przebiegu chorób poprzez mapowanie łączności funkcjonalnej w nienaruszonych żywych mózgach w stanach zdrowych i chorobowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia zapewnienie ciągłości od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej dzięki nieinwazyjnemu i powtarzalnemu obrazowaniu aktywności neuronalnej.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta znajduje zastosowanie w biologii odkrywczej, umożliwiając testowanie hipotez dotyczących funkcji obwodów, w badaniach przesiewowych dzięki gotowym do analizy wynikom ilościowym, a także w badaniach translacyjnych poprzez mapowanie konektomiczne istotne dla przebiegu chorób.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez, wyjaśnianie szlaków sygnałowych oraz ograniczanie ryzyka biologicznego w przypadku celów neuronalnych.
- Przesiewanie: Zapewnia standaryzację testów, powtarzalność oraz ilościowe odczyty BOLD do oceny związków.
- Analityka: Dostarcza danych dotyczących funkcji odpowiedzi hemodynamicznej oraz map aktywacji w celu porównania zaangażowania obwodów w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną dzięki monitorowaniu całego mózgu w modelach chorób.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi platformę wielokrotnego użytku do walidacji celów opartych na obwodach w ramach programów odkryć w dziedzinie neuronauk.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w hipotezach opartych na obwodach.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność mapowania aktywacji mózgu specyficznej dla danego obwodu.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje dotyczące kontynuacji lub przerwania badań (go/no-go), efektywność kapitałowa oraz zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach w programach neuropsychiatrycznych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja i decyzje o rozwoju skorygowane o ryzyko, oparte na zaangażowaniu celu na poziomie obwodów.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu neuronauki, optogenetyki i fizyki MRI w celu przeprowadzenia implantacji chirurgicznej i akwizycji obrazów.
- Wymaga skanera MRI wysokopolowego, źródła światła laserowego, implantów światłowodowych oraz systemów monitorowania fizjologicznego.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w odniesieniu do protokołów chirurgicznych, parametrów dostarczania światła oraz sekwencji obrazowania.
- Obejmuje kwestie adaptacyjne w zależności od gatunku, obszarów mózgu oraz systemów ekspresji opsyn.
- Uwzględnia ograniczenia praktyczne, takie jak inwazyjność chirurgiczna, rozpraszanie światła w tkankach oraz złożoność interpretacji sygnału hemodynamicznego.
