Optogenetyczny funkcjonalny rezonans magnetyczny
April 19th, 2016
Ten protokół opisuje kroki i analizę danych wymaganych do pomyślnego przeprowadzenia optogenetycznego funkcjonalnego rezonansu magnetycznego (ofMRI). ofMRI to nowatorska technika, która łączy odczyt fMRI w wysokim polu ze stymulacją optogenetyczną, pozwalając na specyficzne dla typu komórki mapowanie funkcjonalnych obwodów nerwowych i ich dynamiki w całym żywym mózgu.
Ogólnym celem tej procedury obrazowania jest połączenie F-MRI ze stymulacją optogenetyczną w celu specyficznego dla typu komórki mapowania funkcjonalnych obwodów neuronalnych i ich dynamiki w całym żywym mózgu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak określenie roli określonych elementów obwodów mózgowych w napędzaniu globalnej aktywności mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na stymulację specyficzną dla typu komórki i stosunkowo wysoką rozdzielczość przestrzenną odczytu globalnej aktywności mózgu.
Tę procedurę zademonstrują Jia Liu i Zhongnan Fang, doktoranci w moim laboratorium. Po znieczuleniu zwierzęcia zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy ogolić głowę elektryczną maszynką do golenia i wykonać potrójny peeling chirurgiczny na skórze przy użyciu Betadine i płukania 70% etanolem. Następnie unieruchomij czaszkę zwierzęcia w aparacie stereotaktycznym.
Użyj skalpela, aby wykonać 15 do 20 milimetrowe nacięcie w linii środkowej skóry głowy. Cofnij skórę głowy za pomocą hemostatów chirurgicznych przymocowanych do okostnej. Zidentyfikuj lokalizacje Lambda i Bregma na czaszce, a następnie umieść wiertło w obszarze zainteresowania lub ROI.
Wywierć małą kraniotomię nad ROI za pomocą wiertła dentystycznego, uważając, aby nie przebić mózgu. Powoli wprowadzić igłę przymocowaną do mikrolitrowej strzykawki przez kraniotomię do ROI w mózgu. Następnie użyj sterownika pompy mikrostrzykawkowej, aby wstrzyknąć dwa mikrolitry roztworu wektorowego do ROI.
Po zakończeniu wstrzyknięcia należy odczekać 10 minut, a następnie powoli wyjmować strzykawkę z szybkością 0,5 milimetra na minutę. Po wstrzyknięciu należy osuszyć powierzchnię czaszki. Potwierdź współrzędne zwrotu z inwestycji i włóż implant okucia na docelową głębokość z prędkością 0,5 milimetra na minutę.
Na koniec zamontuj implant okucia do czaszki za pomocą cementu dentystycznego. Po zastygnięciu cementu dentystycznego uszczelnij nacięcie szwami wokół nasadki z cementu dentystycznego. Zacznij od podłączenia światłowodowego krosowego do laserowego źródła światła i zmierz moc wyjściową na końcówce cylindra krosowego za pomocą miernika mocy.
Dostosuj odpowiedni poziom mocy, aby wytworzyć pożądaną moc wyjściową na końcówce światłowodowego, który jest wszczepiony do mózgu. Zapobiegaj wyciekowi światła z implantu, zakrywając oczy zwierzęcia. Następnie umieść cewkę nad głową zwierzęcia.
Użyj tulei tulejowej, aby przymocować światłowodowy do implantu tulejki. Włóż kołyskę ze zwierzęciem do otworu skanera. Monitoruj częstość oddechów oraz oddechowy poziom CO2 i temperaturę ciała przez cały czas trwania eksperymentu, dostosowując sztuczny respirator, aby utrzymać wartości fizjologiczne w odpowiednich granicach.
Podłącz BNC z portu wyzwalającego skanera MRI do generatora funkcyjnego. Wybierz sekwencję pozycjonowania i kliknij skanuj'w oknie operacji. Kliknij kontynuuj", aby zobrazować lokalizację głowy zwierzęcia.
Jeśli mózg nie znajduje się w izocentrum, dostosuj położenie głowy zwierzęcia i powtarzaj skanowanie pozycjonowania, aż mózg znajdzie się w izocentrum. Uzyskaj obraz anatomiczny o wysokiej rozdzielczości, aby sprawdzić ogólną integralność mózgu i potwierdzić lokalizację implantu światłowodowego. Następnie wybierz sekwencję ważoną T2.
Dostosuj liczbę plasterków, a następnie kliknij skanuj'aby uzyskać T2 ważone obrazy anatomiczne korony o wysokiej rozdzielczości. Na koniec wybierz wieloplasterkową sekwencję echa przywołanego gradientu, a następnie kliknij kontynuuj"aby uzyskać funkcjonalny obraz. Protokół ten wykorzystuje optogenetyczny F-MRI do stymulacji kory ruchowej w modelu zwierzęcym.
Ta mapa aktywacji pokazuje aktywowane woksele w korze ruchowej i wzgórzu, wskazując na połączenia synaptyczne dalekiego zasięgu między tymi regionami. Tutaj pogrubiony sygnał jest pokazany dla aktywnych wokseli w korze ruchowej i wzgórzu podczas optogenetycznej stymulacji kory ruchowej. Funkcja odpowiedzi hemodynamicznej wzgórza wykazuje opóźnioną odpowiedź w stosunku do odpowiedzi w korze ruchowej po stymulacji.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać operacje implantacji i optogenetycznego funkcjonalnego rezonansu magnetycznego. Po opanowaniu tej procedury obrazowania można ją wykonać w ciągu dwóch godzin. Podczas wykonywania tej procedury bardzo ważne jest monitorowanie zwierzęcia i utrzymywanie jego fizjologii w normalnych granicach.
Po tej procedurze można zastosować metody uzupełniające, takie jak elektrofizjologia w celu zbadania czasowej dynamiki neuroaktywności lub immunohistochemia w celu walidacji ekspresji i swoistości opsyny. Opracowanie tej techniki utorowało drogę neurobiologom do zbadania funkcjonalnej łączności w nienaruszonym, żywym mózgu. Nie zapominaj, że praca ze skanerem MRI może być bardzo niebezpieczna.
Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak trzymanie sprzętu magnetycznego w odpowiedniej odległości od skanera.
Przegląd
Ten protokół opisuje procedurę i analizę danych do przeprowadzania optogenetycznej funkcjonalnej rezonansu magnetycznego (ofMRI), techniki, która integruje wysokopolowego rezonans magnetyczny z stymulacją optogenetyczną. Ta metoda pozwala badaczom na mapowanie funkcjonalnych obwodów neuronowych i ich dynamiki w żywych mózgach z określeniem typu komórki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Techniki obrazowania
- Optogenetyka
Tło
- ofMRI łączy rezonans magnetyczny z stymulacją optogenetyczną.
- Ta technika pozwala na precyzyjne mapowanie obwodów neuronowych.
- Adresuje kluczowe pytania dotyczące funkcji obwodów mózgowych.
- Wysoka rozdzielczość przestrzenna jest istotną zaletą tej metody.
Cel badania
- Aby wykazać zastosowanie ofMRI w badaniu obwodów neuronowych.
- Aby dostarczyć szczegółowego protokołu dla badaczy.
- Aby podkreślić znaczenie monitorowania parametrów fizjologicznych podczas procedury.
Stosowane metody
- Przygotowanie zwierząt i znieczulenie.
- Kraniotomia i wstrzyknięcie roztworu wektora do mózgu.
- Implantacja kabla światłowodowego i podłączenie do źródła światła laserowego.
- Wykorzystanie skanera MRI do obrazowania i pozyskiwania danych.
Główne wyniki
- Mapy aktywacji pokazują połączenia między korą ruchową a talem.
- Wykazano opóźnioną reakcję hemodynamiczną w talemie.
- Udane wdrożenie stymulacji optogenetycznej podczas obrazowania.
- Procedura może być zakończona w około dwóch godzinach.
Wnioski
- ofMRI jest cennym narzędziem do badania funkcjonalnej łączności w mózgu.
- Utrzymanie fizjologii zwierzęcia jest kluczowe podczas procedury.
- Komplementarne metody mogą poprawić zrozumienie dynamiki neuroaktywności.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Optogenetic functional MRI (ofMRI) enables cell-type-specific interrogation of neural circuits with whole-brain spatial resolution, supporting target validation in neuropsychiatric drug discovery. By linking precise circuit manipulation to global brain activity readouts, the method enhances mechanistic de-risking and predictive confidence in early-stage target hypotheses. This capability aids portfolio triage by clarifying functional connectivity relevant to disease models and therapeutic mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of specific brain circuit elements in driving global activity, supporting therapeutic hypothesis testing.
- Operational Value: Provides cell-type-specific stimulation with high spatial resolution readout of brain dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates activation maps showing long-range synaptic connections, such as between motor cortex and thalamus, for circuit-based assay design.
- Operational Value: Delivers quantitative BOLD signal measurements enabling comparison of stimulation conditions and network responses.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by mapping functional connectivity in intact living brains across healthy and diseased states.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery through preclinical validation via non-invasive, repeatable imaging of neuronal activity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology by enabling hypothesis testing of circuit function, into screening via assay-ready quantitative outputs, and into translational research through disease-relevant connectomic mapping.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking of neural targets.
- Screening: Provides assay standardization, reproducibility, and quantitative BOLD readouts for compound evaluation.
- Analytics: Yields hemodynamic response function data and activation maps to compare circuit engagement across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via whole-brain monitoring in disease models.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform for circuit-based target validation across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in circuit-based hypotheses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of circuit-specific brain activation mapping.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in neuropsychiatric programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on circuit-level target engagement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroscience, optogenetics, and MRI physics for surgical implantation and image acquisition.
- Needs high-field MRI scanner, laser light source, fiberoptic implants, and physiological monitoring systems.
- Demands cross-team standardization for surgical protocols, light delivery parameters, and imaging sequences.
- Involves adaptation considerations across species, brain regions, and opsin expression systems.
- Includes practical limitations such as surgical invasiveness, light scattering in tissue, and hemodynamic signal interpretation complexity.
