Mapowanie losu

Biolodzy rozwojowi używają mapowania losu jako narzędzia do śledzenia linii komórkowych podczas dojrzewania organizmu. Odbywa się to poprzez znakowanie komórek w stadium embrionalnym, a następnie śledzenie ich i ich potomstwa przez cały okres rozwoju organizmu. Mapowanie losu jest również wykorzystywane do badania migracji i różnicowania komórek podczas rozwoju, a także regeneracji i naprawy w wieku dorosłym.

Ten film zawiera przegląd mapowania losu, wyjaśni protokół używany do generowania mapy losu u danio pręgowanego i pokaże kilka sposobów, w jakie ta technika jest obecnie stosowana w laboratoriach.

Zanim przejdziemy do szczegółów proceduralnych, omówmy, czym jest mapa losu i jak jest skonstruowana.

W klasycznych eksperymentach mapowania losu naukowcy barwili grupy komórek we wczesnym embrionie, takim jak te w stadium gastruli, barwnikiem, który byłby przekazywany wszystkim potomkom tych komórek. Po pozwoleniu zarodkowi rozwijać się przez pewien czas, oglądali wybarwione komórki w bardziej dojrzałym organizmie. Zwrócono wówczas uwagę na lokalizację wybarwionych komórek w dojrzałym organizmie. Zebrane wyniki kilku podobnych eksperymentów pozwoliły na skonstruowanie diagramu znanego jako mapa losu.

Dlatego mapa losu jest ogólnym planem, który nakreśla los każdej części wczesnego zarodka. Mapy te pomagają naukowcom określić, które komórki embrionalne różnicują się w które funkcjonalne dorosłe komórki oraz jak migrują i organizują się w dojrzałe struktury.

Naukowcy wykorzystali wiele organizmów modelowych do stworzenia map losu, w tym żaby, nicienie, ryby, pisklęta i myszy. Niektóre organizmy modelowe, takie jak danio pręgowany Danio rerio, mają dodatkową przewagę w tego typu eksperymencie. Ponieważ są one małe i pozostają przezroczyste przez większą część procesu rozwojowego, naukowcy mogą łatwo śledzić komórki, oglądając ryby pod mikroskopem świetlnym. Co ważne, postępy w technikach znakowania komórek pozwalają obecnie naukowcom na precyzyjne oznaczanie pojedynczych komórek i śledzenie ich w miarę rozwoju organizmu, co pomaga w tworzeniu niezwykle szczegółowej mapy losu.

Teraz, gdy masz już pojęcie o tym, czym są mapy losu, omówmy protokół mapowania losu u danio pręgowanego, który wykorzystuje fotoaktywację. To stosunkowo nowe podejście opiera się na białkach fotoaktywowanych. Są to specjalne białka fluorescencyjne, które są "zamknięte w klatce", co oznacza, że są utrzymywane w określonej konformacji, aby zapobiec fluorescencji. Zastosowanie kontrolowanego impulsu laserowego powoduje zmianę konformacyjną, zwaną "odklekotywaniem", która powoduje widoczną fluorescencję.

Aby przeprowadzić ten eksperyment, te wyspecjalizowane białka w klatkach są najpierw syntetyzowane, a następnie wstrzykiwane do zarodków danio pręgowanego w stadium komórkowym lub dwukomórkowych. Następnie zarodki mogą dojrzeć do pożądanego etapu rozwoju przed fotoaktywacją.

Następnie, aby przygotować ryby do fotoaktywacji, zarodki są dechorionowane, aby umożliwić dostęp do tkanki docelowej. Następnie są one montowane w optycznie przezroczystym podłożu, takim jak agaroza o niskiej temperaturze topnienia, która bezpiecznie utrzymuje je w stabilnej pozycji. Próbki są wyrównywane tak, aby naświetlić obszar zainteresowania i montowane na mikroskopie wyposażonym w laser. Impuls laserowy jest przykładany do docelowego obszaru zawierającego interesujące komórki, indukując fotoaktywację.

Po zabiegu laserowym zarodki są ostrożnie usuwane z agarozy i wracają do swojego naturalnego środowiska, aż do osiągnięcia pożądanego etapu rozwoju. Aby prześledzić komórki aktywowane fotoaktywem, zarodki są ponownie zanurzane w agarozie o niskiej temperaturze topnienia, a komórki aktywowane fotoaktywowane mogą być następnie wizualizowane i śledzone za pomocą bezpośredniej fluorescencji lub barwienia immunologicznego.

Teraz, gdy masz już ogólne zrozumienie protokołu mapowania losu, przyjrzyjmy się kilku eksperymentom laboratoryjnym, które wykorzystują tę procedurę.

Oprócz badania rozwoju embrionalnego, mapowanie losu może być wykorzystywane do badania naprawy w dojrzałych systemach. W tym eksperymencie określony podtyp komórki został usunięty z transgenicznej siatkówki danio pręgowanego. Następnie naukowcy prześledzili genetycznie znakowane dorosłe komórki macierzyste, aby określić ich los po urazie. Na koniec przeprowadzono analizę obrazu, która wykazała aktywację dorosłych komórek macierzystych i późniejszą naprawę tkanek.

Naukowcy stosują również podobne protokoły, aby zrozumieć los przeszczepionych komórek macierzystych. W tym przypadku genetycznie znakowane ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) zostały przeszczepione do mysiego modelu z obniżoną odpornością. Wszczepionym komórkom pozwalano różnicować się przez 8-12 tygodni, po czym powstały potworniak, który jest guzem zawierającym tkankę z wielu listków zarodkowych, został pobrany, utrwalony i wybarwiony immunologicznie w celu określenia losu wszczepionych komórek macierzystych. Tego typu eksperyment pomaga naukowcom potwierdzić potencjał różnicowania in vivo hodowanych komórek macierzystych.

Jak wspomniano wcześniej, naukowcy przeprowadzają procedury mapowania losu w różnych organizmach modelowych, w tym u ssaków. W tym konkretnym badaniu naukowcy oznaczyli komórki w określonym regionie wczesnego zarodka myszy za pomocą indukowalnych metod genetycznych. Odbywa się to poprzez podanie środka indukującego ciężarnej myszy noszącej genetycznie zmodyfikowane potomstwo. Znakowane komórki były śledzone w późniejszych stadiach rozwoju, co pomogło naukowcom określić ich ostateczny los.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat mapowania losu. Ten film dostarczył pewnych informacji na temat tworzenia map losu, dokonał przeglądu konkretnego protokołu mapowania losu oraz omówił niektóre modyfikacje i zastosowania tej niezwykle przydatnej techniki. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!