Pomiar przyczepiania i internalizacji wirusa grypy A w komórkach A549 za pomocą cytometrii przepływowej

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar przyłączenia i internalizacji grypy. Wirus przenika do 5 49 komórek nabłonka płuc. Osiąga się to poprzez pierwsze wiązanie na zimno przez wirusa grypy z 5 49 komórkami, co umożliwia przyczepienie, ale zapobiega wchłanianiu cząstek wirusa.

Następnie wirus może się zinternalizować poprzez zmianę temperatury do 37 stopni Celsjusza. Następnie etap blokowania, w którym nieoznakowane pasmo Aden jest wiązane z powierzchnią komórki. Przyłączone wirusy są wykonywane w celu rozróżnienia między przyłączonymi i zinternalizowanymi cząsteczkami wirusa.

Na koniec biotynylowany wirus związany z komórką jest inkubowany ze streptawidyną znakowaną CY trzy, a do wykrywania barwionych wirusów stosuje się cytometrię przepływową. Ostatecznie obliczana jest względna ilość przyłączonych i zinternalizowanych wirusów. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd we względną ilość grypy, wirusa, który przyczepia się i internalizuje w komórkach 5 0 9.

Może być również stosowany w innych systemach wykorzystujących różne linie komórkowe lub inne wirusy Po wygenerowaniu biotynylowanego wirusa i określeniu wymaganych ilości znakowanego wirusa strep din i SI trzy znakowane strep din zgodnie z protokołem tekstowym, przygotuj cztery probówki głębinowe, z których każda zawiera 200 000, A 5 49 komórek oznaczonych probówkami jako minuty zero. Zero minut, plus STV, 30 minut i 30 minut plus STV. Następnie zakręć rurkami.

Usunąć supernatant i użyć 200 mikrolitrów PBS do ponownego zawieszenia granulek. Następnie, po ponownym odwirowaniu probówek, użyj 200 mikrolitrów standardowej pożywki wzrostowej 5 49 do ponownego zawieszenia komórek inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut po inkubacji, odwiruj próbki i ponownie zawieś granulki w 200 mikrolitrach PBS Po powtórzeniu prania jeszcze raz, schłodzić probówki na lodzie przez 10 minut. Gdy probówki ostygną, ponownie odwirować i użyć 100 mikrolitrów biotynylowanego wirusa rozcieńczonego w infekcji PBS do ponownego zawieszenia granulek po inkubacji na lodzie przez jedną godzinę, powtórzyć wirowanie i dwukrotnie przemyć PBS, przetwarzając następujące próbki równolegle tak bardzo, jak to możliwe, dla próbek o zerowej minucie.

Po wirowaniu użyj 100 mikrolitrów 3,7% aldehydu paraform lub PFA do ponownego zawieszenia osadu komórkowego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut przed odwirowaniem i użyciem PBS do dwukrotnego przemycia komórek po utrwaleniu. Przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż wszystkie próbki zostaną przetworzone.

Aby poddać działaniu próbek o wartości zero minute plus STV, należy obrócić probówki, usunąć supernatant i użyć 15 mikrolitrów STV 2% BSA i 0,1% sodu azi w PBS do ponownego zawieszenia osadu komórkowego inkubowanego na lodzie przez 30 minut. Następnie odwirować i użyć PBS do dwukrotnego przemycia komórek po utrwaleniu PFA, jak właśnie pokazano, przepuszczając próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Po odwirowaniu i usunięciu supernatu należy użyć PBS 2%BSA do rozpuszczenia próbek.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut przed umyciem PBS i utrwaleniem PFA. Następnie przechowuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut plus próbki STV. Po granulowaniu zawieszamy próbki w 200 mikrolitrach PBS 2%BSA, po inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Odwiruj i ponownie zawieś komórki w 50 mikrolitrach STV 2%BSA 0,1%Sodium azi w PBS inkubuj na ICE przez 30 minut przed umyciem i utrwaleniem. Następnie, po przepuszczalności i zabarwieniu wszystkich próbek STV SI trzy, postępując zgodnie ze szczegółami w protokole tekstowym, przechowywały próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Na koniec przeanalizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej.

Określić procentową zawartość CY trzech dodatnich komórek w każdej próbce. Oblicz procent dołączonego wirusa i względną ilość wirusa zinternalizowanego. Zgodnie z protokołem tekstowym, jak pokazano tutaj w próbce zero minut, wirus jest związany na zimno z komórkami docelowymi, co jest widoczne za pomocą St.V.SI trzech barwienia.

Gdy STV jest stosowany jako etap blokujący, wirus na powierzchni komórki nie może być już wykryty przez barwienie S St.V.SI trzy, co znacznie zmniejsza sygnał. Gdy temperatura zostanie podniesiona do 37 stopni Celsjusza, przyłączony wirus jest wchłaniany do komórek. Zinternalizowany wirus nie jest wrażliwy na blokowanie za pomocą nieznakowanego STV, co skutkuje mniej dramatycznym spadkiem intensywności sygnału w ciągu 30 minut plus pokazane próbki STV.

Oto procenty trzech dodatnich komórek SI dla wszystkich warunków eksperymentalnych opisanych w tym filmie. Pozorowane zainfekowane komórki dają intensywność sygnału tła dla eksperymentu i działają jako negatywna kontrola przyczepiania się wirusa. Inna neuraminidaza kontrolna silnie znosi przyłączanie się IAV o 90% w porównaniu z komórkami nieleczonymi.

Azi sodu, który zubaża TP, hamując w ten sposób endocytozę, hamował internalizację cząstek wirusa zarówno podczas, jak i po zakażeniu, jak pokazano tutaj, po leczeniu azydem sodu komórki inkubowane przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza wykazały dramatyczny spadek internalizacji w porównaniu z nieleczonymi komórkami inkubowanymi w tych samych warunkach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć przywiązanie i internalizację grypy, wirusa w komórkach 5 0 9. Protokół ten pozwala na wygodny odczyt za pomocą cytometrii przepływowej i może być łatwo dostosowany do innych warunków eksperymentalnych.