Name: Pomiar przyczepiania i internalizacji wirusa grypy A w komórkach A549 za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Poznaj metodę pomiaru przyczepiania i internalizacji wirusa grypy A w komórkach A549 za pomocą cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia ilościowe określenie interakcji wirusa z komórkami gospodarza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem ze Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (31003A_135278) dla SSt. MOP jest beneficjentem grantu doktorskiego z Funduszu Badawczego AXA. Dziękujemy Patricii Nigg za pomoc w zaprojektowaniu rysunku 1.

Uwaga przed rozpoczęciem: Używaj kaptura z przepływem laminarnym i odpowiedniego zabezpieczenia biologicznego podczas pracy z żywym wirusem. W tym miejscu opisano warunki wzrostu odpowiednie do hodowli szczepu wirusa grypy A/WSN/33. Wielokrotność infekcji (MOI) i czas inkubacji mogą się różnić w zależności od użytego szczepu wirusa.
1. Przygotowanie biotynylowanego wirusa A/WSN/33
<ol>
	<li>Nasiona komórek Madin-Darby canine kindey (MDCK) do kolby T175 cm2 przy użyciu zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny (Pen / Strep). Hodować komórki w temperaturze 37 °C aż do osiągnięcia około 70% zbieżności.</li>
	<li>Przed zakażeniem usuń pożywkę i umyj komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, pH 7,0-7,3), dodając wystarczająco dużą objętość, aby pokryć monowarstwę komórki.</li>
	<li>Usuń PBS i zainfekuj komórki A/WSN/33 o MOI 10-4. Rozcieńczony wirus w PBS uzupełniony 0,02 mg Mg2+, 0,01 mg Ca2+, 0,3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 1% Pen/Strep (zakażenie-PBS). Użyć inokulum o pojemności 4 ml do kolby T175 cm2.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Usunąć inokulum przez aspirację i odpipetować 10 ml DMEM uzupełnionego 0,3% BSA, 20 mM HEPES i 1% Pen/Strep do kolby.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez około 3 dni, aż do uzyskania efektu cytopatycznego (CPE), a następnie pobrać supernatant. CPE można rozpoznać jako zaokrąglanie komórek, po którym następuje odwarstwienie i śmierć komórek 14.</li>
	<li>Wirować supernatant w temperaturze 450 x g przez 5 minut, aby usunąć resztki komórek. Przenieś supernatant do nowej probówki Falcon i powtórz ten krok jeszcze raz. Wyrzuć granulki.</li>
	<li>Przenieść supernatanty do probówek ultrawirówek i umieścić supernatanty pod 5 ml 30% sacharozy rozcieńczonej w buforze NTE (10 mM Tris [pH 7,4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Zrównoważyć probówki przed ultrawirowaniem i napełnić PBS, aby osiągnąć końcową objętość 30 ml. Wirować supernatanty przy 112 398 x g (co odpowiada 25 000 obr./min dla wirnika SW28) przez 90 minut w ultrawirówce.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant przez pipetowanie i namoczyć osad wirusa w temperaturze 4 °C w 250 μl PBS. Zawiesić osad, pipetując w górę iw dół. Zmierz zawartość białka w oczyszczonym wirusie za pomocą testu Bradforda 15.</li>
	<li>Użyj zestawu do biotynylacji, aby wygenerować biotynylowany A/WSN/33. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Krótko mówiąc, dodaj odpowiednią ilość biotyny do oczyszczonego wirusa i inkubuj przez 2 godziny na lodzie. Przenieść wirusa do probówki ultrawirówkowej i napełnić probówkę PBS, aż do uzyskania końcowej objętości 30 ml. Wiruj wirusa przy 112 389 xg przez 90 minut w ultrawirówce. Usunąć supernatant za pomocą pipetowania i dodać 250 μl PBS. Namoczyć osad przez noc w temperaturze 4 °C. Podwielokrotność Biotynylowanego wirusa przechowywać w temperaturze -80 °C, gdzie będzie stabilny przez co najmniej 24 miesiące. 
	UWAGA: Pomocne może być określenie miana biotynylowanego preparatu IAV za pomocą standardowego testu płytki nazębnej. Należy jednak zauważyć, że kolejny protokół będzie mierzył tylko biotynylowane cząsteczki wirusa. Pozostałe niebiotynylowane cząstki spowodowane niepełną biotynylacją przyczynią się do miana zakaźnego za pomocą testu płytki nazębnej, ale nie do sygnału mierzonego w teście przyłączania/internalizacji.</li>
</ol>
2. Określ wymaganą ilość biotynylowanego wirusa 
UWAGA: Zanim zostanie przeprowadzony test przyłączenia/internalizacji, ważne jest określenie ilości biotynylowanego wirusa potrzebnej do zainfekowania wszystkich komórek próbki.
<ol>
	<li>Hodowla i trypsyna komórek A549 zgodnie z instrukcjami producenta. Policz komórki za pomocą komory komórkowej. Odpipetuj 200 000 komórek A549 do probówek głębinowych FACS. Wirowanie 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą 200 μl PBS. Schłodzić komórki na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Przygotować 5-krotne seryjne rozcieńczenia biotynylowanego wirusa w zakażonym PBS.</li>
	<li>Probówki wirujące zawierające komórki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad ze 100 μl wirusa zawierającego wirusa-PBS. Jako pozorowaną kontrolę użyj infekcji-PBS bez biotynylowanego wirusa. Inkubuj probówki na lodzie przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl PBS. Powtórz ten krok jeszcze raz.</li>
	<li>W celu utrwalenia wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl 3,7% paraformaldehydu (PFA). Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie powtórzyć krok prania opisany w 2.4).</li>
	<li>W celu przepuszczalności wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl PBS zawierającym 0,5% Triton X-100. Inkubować przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Następnie powtórzyć krok prania opisany w 2.4).</li>
	<li>Wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i zawiesić osad w 50 μl 2% BSA rozcieńczonym w PBS zawierającym STV-Cy3. (Należy pamiętać, że odpowiednie stężenie STV-Cy3 należy określić przed rozpoczęciem eksperymentu. Zacznij od stężenia 1:200 i przetestuj 2-krotne rozcieńczenia do 1:2,400. W naszych rękach rozcieńczenie 1:1000 okazało się optymalne.)</li>
	<li>Inkubuj 1 godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej. Następnie powtórzyć etap płukania opisany w ppkt 2.4, ale ponownie zawiesić osad w 200 μl 2% BSA rozcieńczonym w PBS.</li>
	<li>Analizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej 16. Brama w populacji Cy3-dodatniej. Wybierz najniższe stężenie biotynylowanego wirusa, co daje maksymalną liczbę komórek Cy3-dodatnich w populacji A549.</li>
</ol>
3. Określ wymaganą ilość streptawidyny
 
UWAGA: Skuteczność blokowania sygnału pochodzącego z wirusa zewnątrzkomórkowego określa zakres wykrywania testu. Dlatego ważne jest, aby w jak największym stopniu usunąć sygnał STV-Cy3. Wymagana ilość potrzebnego STV zależy od ilości użytego biotynylowanego wirusa (określonej w sekcji 2).
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z krokami 2.1-2.4, ale użyj stężenia wirusa określonego w sekcji 2.</li>
	<li>Przygotować pięciokrotne seryjne rozcieńczenia STV rozcieńczonego w PBS zawierającym 2% BSA i 0,1% azydku sodu.</li>
	<li>Wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w rozcieńczeniu 50 μl STV. Jako próbną kontrolę należy użyć PBS zawierającego 2% BSA i 0,1% azydku sodu bez STV. Inkubuj probówki przez 30 minut na lodzie. Następnie powtórzyć etap prania opisany w ppkt 2.4.</li>
	<li>Wykonaj kroki 2.5-2.9. Do testu internalizacji wybierz najniższe stężenie STV, co daje silny blok sygnału Cy3 (w porównaniu z próbką, w której nie było STV). W tym celu można użyć procentu komórek CY3-dodatnich lub średniej intensywności fluorescencji sygnału Cy3. Idealnie byłoby, gdyby sygnał Cy3 próbek poddanych działaniu STV był jak najbardziej zbliżony do sygnału z pozorowanych zakażonych komórek.</li>
</ol>
4. Test przywiązania/internalizacji
 
UWAGA: Upewnij się, że przygotowałeś wszystkie odczynniki przed rozpoczęciem testu. W przypadku trzech grup kontrolnych przedstawionych w sekcji wyników (pozorowane zakażone komórki, komórki poddane wstępnej działaniu neuraminidazy i komórki poddane działaniu azydku sodu) wymagane są niewielkie zmiany w protokole.
<ol>
	<li>Przygotuj 16 probówek głębinowych, z których każda zawiera 200 000 komórek A549. Obok zestawu doświadczalnego składającego się z 4 probówek znajdują się 3 warunki kontrolne, z których każdy wymaga 4 probówek: komórki zakażone pozorem, komórki poddane działaniu neuraminidazy (NA) i komórki poddane działaniu azydku sodu. Każda grupa składa się z 4 probówek oznaczonych jako "0 min", "0 min + STV", "30 min", "30 min + STV".</li>
	<li>Wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl PBS.</li>
	<li>Probówki wirować w temperaturze 4 °C przy 450 x g. Usunąć supernatant i zawiesić osad w 200 μl DMEM zawierającym 0,3% BSA, 20 mM HEPES i 1% penicyliny-streptomycyny (pożywka inkubacyjna). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Do kontroli neuraminidazy: W celu ponownego zawieszenia komórek należy użyć neuraminidazy bakteryjnej (np. sialidazy z Vibrio) o stężeniu 200 mU/ml rozcieńczonej w pożywce inkubacyjnej.</li>
	<li>Wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl PBS. Powtórz ten krok jeszcze raz, a następnie schłodzić rurki na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl biotynylowanego wirusa (użyć stężenia wirusa oznaczonego w sekcji 2 rozcieńczonego w zakażeniu-PBS). Inkubować 1 godzinę na lodzie. Następnie powtórzyć etap prania opisany w 2.4. 
	UWAGA: W przypadku fałszywej kontroli zainfekowanej: Użyj infection-PBS bez wirusa. Do kontroli azydku sodu: Stosować wirusa rozcieńczonego w zakażeniu-PBS uzupełnionego 0,1% azydkiem sodu.</li>
	<li>Przetwarzanie próbek po zakażeniu na lodzie:
	<ol>
		<li>W przypadku próbek "0 min" należy postępować zgodnie z krokiem 2.5 i przechowywać próbki w temperaturze 4 °C do czasu utrwalenia pozostałych próbek.</li>
		<li>W przypadku próbek "0 min + STV" probówki wirować w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 50 μl STV (użyć stężenia określonego w sekcji 3) rozcieńczonym w PBS zawierającym 2% BSA i 0,1% azydku sodu (w celu zapobieżenia internalizacji podczas obchodzenia się z próbką). Inkubować 30 minut na lodzie. Postępuj zgodnie z krokami 2.4-2.5 i przechowuj próbki w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>W przypadku próbek "30 min" należy wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl PBS zawierającym 2% BSA. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Postępować zgodnie z krokiem 2.4-2.5 i przechowywać próbki w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Do kontroli azydku sodu: Stosować PBS uzupełniony 2 % BSA i 0,1 % azydkiem sodu przez 30 minut inkubacji w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>W przypadku próbek "30 min + STV" wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl PBS zawierającym 2% BSA. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Następnie wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i zawiesić osad w 50 μl STV (użyć stężenia określonego w sekcji 3) rozcieńczonym w PBS zawierającym 2% BSA i 0,1% azydku sodu (w celu zapobieżenia internalizacji podczas obchodzenia się z próbką). Inkubować 30 minut na lodzie. Postępuj zgodnie z krokami 2.4-2.5 i przechowuj próbki w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Do kontroli azydku sodu: Stosować PBS uzupełniony 2 % BSA i 0,1 % azydkiem sodu przez 30 minut inkubacji w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj kroki 2.6-2.8 i przeanalizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej. Określ procent komórek Cy3-dodatnich w każdej próbce.</li>
	<li>Oblicz procent dołączonego wirusa i względną ilość wirusa zinternalizowanego.
	<ol>
		<li>Aby obliczyć ilość przyłączonego wirusa, użyj procentu komórek bramkowanych Cy3-dodatnich lub średniej intensywności fluorescencji sygnału Cy3. Dla porównania, ustaw nieleczone komórki na 100% (Rysunek 4B). 
		UWAGA: Procent dołączonego wirusa jest opisany przez próbkę "0 min".</li>
		<li>Aby obliczyć ilość zinternalizowanego wirusa, należy wziąć stosunek próbki "30 min + STV" do próbki "30 min" (rysunek 5B). 
		UWAGA: Jak wspomniano powyżej, można użyć procentu dodatnich komórek bramkowanych Cy3 lub średniej intensywności fluorescencji sygnału Cy3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+influenza+A+virus%3A+host+factors+and+antiviral+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets.</a> J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).</li>
<li>Palese, P., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalese%2C+P+%22Fields+Virolog%22">Fields Virolog</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).</li>
<li>Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+entry+pathway+of+influenza+virus+in+a+canine+kidney+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line.</a> J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).</li>
<li>Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+can+enter+and+infect+cells+in+the+absence+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis.</a> J Virol. 76, 10455-10464 (2002).</li>
<li>Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).</li>
<li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+influenza+A+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS Pathog. 7, e1001329(2011).</li>
<li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus+entry+into+cells+lacking+sialylated+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).</li>
<li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycosylation+facilitates+sialic+acid-independent+attachment+and+entry+of+influenza+A+viruses+into+cells+expressing+DC-SIGN+or+L-SIGN%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN.</a> J Virol. 85, 2990-3000 (2011).</li>
<li>Wang, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-SIGN+mediates+avian+H5N1+influenza+virus+infection+in+cis+and+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans.</a> Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).</li>
<li>Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolidase+is+required+for+early+trafficking+events+during+influenza+A+virus+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry.</a> J Virol. 88, 11271-11283 (2014).</li>
<li>Konig, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+host+factors+required+for+influenza+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human host factors required for influenza virus replication.</a> Nature. 463, 813-817 (2010).</li>
<li>Ludwig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cell+signalling+pathways+to+fight+the+flu%3A+towards+a+paradigm+change+in+anti-influenza+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemothe%22%5BJournal%5D)">Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy.</a> J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).</li>
<li>Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanisms+of+internalization+and+intracellular+delivery+mediated+by+pH-sensitive+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes.</a> Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).</li>
<li>Tran, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+specific+host+factors+protects+against+influenza+virus-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death%2C+and+disease%22%5BJournal%5D)">Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death.</a> Cell death, and disease. 4, e769(2013).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgramm+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Macey, M. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMacey%2C+MG+%22Flow+Cytometry+Principles+and+Applications%22">Flow Cytometry Principles and Applications</a>. Macey, M. G. , Humana Press. (2007).</li>
<li>Burness, A. T., Pardoe, I. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+enzymes+on+the+attachment+of+influenza+and+encephalomyocarditis+viruses+to+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Viro%22%5BJournal%5D)">Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes.</a> J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nasz protokół opisuje prosty sposób pomiaru przyczepiania się i internalizacji wirusa za pomocą cytometrii przepływowej. Pozwala na użycie znakowanego wirusa typu dzikiego, który bardziej naśladuje infekcje wirusowe w porównaniu z użyciem cząstek wirusopodobnych (VLP). Chociaż nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem pomiaru przyczepiania i internalizacji IAV, można go łatwo dostosować do innych wirusów. Ponadto, ponieważ do odczytu stosuje się cytometrię przepływową, barwienie współaktywne można łatwo dodać do pro...

Pojawienie się wirusa grypy A (IAV) to wieloetapowy proces, który rozpoczyna się od wiązania wirusa z receptorami na błonie komórkowej komórek docelowych 1. Receptorem dla IAV jest kwas sjalowy, który jest obecny w wielu różnych glikoproteinach i glikolipidach. Białko hemaglutyniny (HA) IAV, które jest obecne w otoczce wirusa, wiąże się z kwasem sjalowym i w ten sposób pośredniczy w przyłączaniu cząstek wirusa do błony komórkowej komórek docelowych 2. Wirus wnika do komórek poprzez endocytozę za pośrednictwem klatryny, ale opisano również alternatywne drogi wnikania, takie jak makropinocytoza, 3-6. Interakcja między kwasem hialowym a kwasem sjalowym wydaje się być wystarczająca do pośredniczenia zarówno w przyłączaniu, jak i wyzwalaniu internalizacji cząstek wirusa 7. Niemniej jednak zaproponowano alternatywne receptory wejścia, a ich rola w wnikaniu do IAV jest obecnie badana 1,8,9.
Obecnie podejmowane są wysiłki mające na celu zidentyfikowanie czynników gospodarza, które są zaangażowane w cykl życia wirusa, w celu opracowania pilnie potrzebnych nowych terapii przeciwwirusowych 10-12. Wniknięcie wirusa byłoby korzystnym krokiem w kierunku ukierunkowania wzrostu IAV w celu zablokowania infekcji wirusowej w jej najwcześniejszym punkcie. Eksperymentalne zmierzenie różnych etapów wnikania wirusa IAV jest trudne, ponieważ zwykle do wykrycia przychodzącego wirusa potrzebne są duże ilości wirusa. Ponadto zakres wykrywania zmian w wnikaniu wirusa jest tylko liniowy ze względu na brak replikacji wirusa. Podkreśla to potrzebę stosowania testów o wysokiej czułości.
Test, który tutaj prezentujemy, pozwala na wykrycie wirusa przyczepionego na powierzchni komórki, jak również na wykrycie wirusa zinternalizowanego w stosunku do całkowitej ilości wirusa związanego z komórką. Zastosowanie biotynylowanego wirusa typu dzikiego umożliwia wygodny pomiar poprzez barwienie STV-Cy3 i odczyt za pomocą cytometrii przepływowej. Biotynylowany wirus jest związany na zimno z komórkami, aby umożliwić przyłączenie, ale zapobiec internalizacji cząstek wirusa. Komórki mogą być utrwalane, przepuszczalne i barwione za pomocą STV-Cy3 w celu zmierzenia przyłączonego wirusa. Sygnał z zewnątrzkomórkowych, przyłączonych wirionów może zostać zniesiony, jeśli przed utrwaleniem zostanie zastosowany etap blokowania, w którym komórki są inkubowane z nieznakowaną streptawidyną (STV). W kolejnym etapie, po przyłączeniu biotynylowanego IAV, temperatura jest zmieniana na 37 °C i pozwala na internalizację cząstek wirusa. Zinternalizowane cząstki są chronione przed wiązaniem STV, co pozwala na rozróżnienie wirusów zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych.
Na warunki eksperymentalne wymagane są cztery próbki: '0 min': Pierwsza próbka, oznaczona jako '0 min', ma na celu zmierzenie zimnego wirusa na powierzchni komórki. '0 min + STV': Druga próbka, oznaczona jako '0 min + STV', podaje podstawową intensywność sygnału eksperymentu. Przyłączony wirus jest blokowany za pomocą STV, a sygnał po barwieniu STV-Cy3 powinien być znacznie niższy w porównaniu z próbką "0 min". "30 min": Trzecia próbka, "30 min" zawiera wirusa przyłączonego i zinternalizowanego w wyniku zmiany temperatury do 37 °C przez 30 minut. "30 min + STV": Czwarta próbka, "30 min + STV", mierzy wewnątrzkomórkową frakcję wirusów. Etap blokowania STV stosuje się po 30-minutowym okresie inkubacji. W rezultacie, cząsteczki wirusa na powierzchni komórki są wiązane przez STV, pozostawiając tylko zinternalizowane wirusy dostępne do barwienia STV-Cy3. Względną ilość wirusa zinternalizowanego można obliczyć jako stosunek wirusa zinternalizowanego (mierzony w próbce "30 min + STV") podzielony przez całkowitą ilość wirusa (opisaną przez próbkę "30 min").
Jako kontrolę sugerujemy dołączenie komórek zainfekowanych metodą mock. Sygnał następujący po barwieniu STV-Cy3 pozorowanych zainfekowanych komórek daje tło wynikające z protokołu barwienia. Kontrola przyłączenia do IAV polega na wstępnym traktowaniu komórek neuraminidazą bakteryjną (NA). NA oddziela kwas sjalowy od glikoprotein komórkowych, usuwając w ten sposób receptory przyłączeniowe z powierzchni komórki. Azydek sodu (SA) jest silnym inhibitorem metabolizmu, a tym samym blokuje endocytozę 13. Komórki traktowane azydkiem sodu powinny być dodatnie pod względem wiązania wirusa, ale ujemne pod względem internalizacji.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>VWR Calbiochem</td><td>126579</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-100</td><td></td></tr><tr><td>D-sacharoza</td><td>Fluka</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Biosolve BV</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td>Zestaw EZ-LINK</td><td></td></tr><tr><td>NHS-SS-BIOTIN firmy</td><td>Fisher Scientific</td><td><a href="https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E">W9971E&nbsp; </a></td><td></td></tr><tr><td>Bio Rad Protein Bio Assay</td><td>Probówki głębinowe Bio Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>(mikroprobówki 1,2 ml)</td><td>Milian</td><td>82 00 001</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>&nbsp; Lucerna chem&nbsp; Mikroskopia elektronowa nauki</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>probówki ultrawirówkowe</td><td>Hemotec HmbH</td><td>253070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>STV-Cy3</td><td>Life Technologies</td><td>43-4315</td><td></td></tr><tr><td>STV</td><td>Life Technologies</td><td>43-4302</td><td></td></tr><tr><td>azydek sodu</td><td>Fluka</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>neuraminidaza bakteryjna/ sialidaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6514-1UN</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar przyczepiania i internalizacji wirusa grypy a w komórkach a549 za pomocą cytometrii przepływowej

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Przywiązanie do komórek docelowych, a następnie internalizacja to pierwsze kroki w cyklu życia wirusa grypy A (IAV). Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół pomiaru względnych zmian w ilości cząstek wirusa, które przyczepiają się do komórek A549, ludzkiej linii komórek nabłonka płuc, a także w ilości cząstek, które są internalizowane do komórki. Używamy biotynylowanego wirusa, który można łatwo wykryć po barwieniu streptawidyną znakowaną Cy3 (STV-Cy3). Opisujemy wzrost, oczyszczanie i biotynylację A/WSN/33, szeroko stosowanego szczepu laboratoryjnego IAV. Związane na zimno biotynylowane cząstki IAV na komórkach A549 są barwione STV-Cy3 i mierzone za pomocą cytometrii przepływowej. Aby zbadać wychwyt cząstek wirusa, wirus związany z zimnem może zostać zinternalizowany w temperaturze 37 °C. W celu rozróżnienia między zewnętrznymi i zinternalizowanymi cząstkami wirusa stosuje się etap blokowania: Wolne miejsca wiązania na biotynie przyłączonego wirusa na powierzchni komórki są wiązane przez nieznakowaną streptawidynę (STV). Późniejsza przenikanie komórek i barwienie za pomocą STV-Cy3 umożliwia następnie wykrycie zinternalizowanych cząstek wirusa. Przedstawiamy obliczenia mające na celu określenie względnej ilości wirusa zinternalizowanego. Ten test jest odpowiedni do pomiaru wpływu leczenia farmakologicznego lub innych manipulacji na przywiązanie lub internalizację IAV.

Schematyczny rysunek przedstawiający cztery różne warunki eksperymentalne znajduje się na Rysunku 1. Wyniki reprezentatywnego eksperymentu przedstawiono na Rysunkach 2–5. W próbce „0 min” biotynilowany wirus wiąże się na zimno z komórkami docelowymi, co można zwizualizować za pomocą barwienia STV-Cy3 (Rysunki 1 oraz 2). Po zastosowaniu etapu blokowania (w próbce „0 min + STV”) wirusa na powierzchni komórki nie można już wykryć za pomocą ...

Prezentujemy protokół opisujący półilościową metodę pomiaru zarówno przyczepiania wirusa grypy A do komórek A549, jak i internalizacji cząsteczek wirusa do komórek docelowych za pomocą cytometrii przepływowej.

Pomiar przyczepiania i internalizacji wirusa grypy A w komórkach A549 za pomocą cytometrii przepływowej

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar przyłączania i internalizacji cząsteczek wirusa grypy A do komórek nabłonka płuc A549. Osiąga się to poprzez wstępne wiązanie w niskiej temperaturze wirusa grypy A do komórek A549, co umożliwia przyłączenie, ale zapobiega wchłanianiu cząsteczek wirusa.Następnie, poprzez zmianę temperatury na 37 °C, umożliwia się internalizację wirusa. Następnie przeprowadza się etap blokowania, w którym do powierzchni komórki wiąże się nieoznakowany strp Aden, aby odróżnić przyłączone od zinternalizowanych cząsteczek wirusa.Na koniec biotynilowany wirus związany z komórkami jest inkubowany ze streptawidyną znakowaną CY3, a do wykrycia barwionych wirusów wykorzystuje się cytometrię przepływową. Ostatecznie obliczana jest względna ilość wirusów przyłączonych i zinternalizowanych. Metoda ta pozwala uzyskać informacje na temat względnej ilości wirusa grypy, który przyłącza się i wnika do komórek 5 0 9.Metodę tę można zastosować również do innych systemów, wykorzystując inne linie komórkowe lub inne wirusy. Po wytworzeniu biotynilowanego wirusa i oznaczeniu wymaganych ilości znakowanego wirusa, streptawidyny oraz znakowanej SI3 streptawidyny zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować cztery probówki do głębokich studzienek, z których każda zawiera 200 000 komórek A 549. Probówki należy oznaczyć jako: 0 minut, 0 minut plus STV, 30 minut oraz 30 minut plus STV. Następnie należy odwirować probówki.Usunąć supernatant i użyć 200 µL PBS do resuspensji osadów. Następnie, po ponownym odwirowaniu probówek, użyć 200 µL standardowej pożywki wzrostowej 5 49 do resuspensji komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po inkubacji odwirować próbki i resuspender osady w 200 µL PBS. Po powtórzeniu etapu płukania jeszcze raz, schłodzić probówki na lodzie przez 10 minut. Po schłodzeniu probówek ponownie odwirować i użyć 100 µL biotynilowanego wirusa rozcieńczonego w PBS do infekcji, aby resuspender osady. Po inkubacji na lodzie przez jedną godzinę powtórzyć wirowanie i dwukrotnie wypłukać PBS, przetwarzając kolejne próbki dla punktu czasowego 0 min w możliwie największym stopniu równolegle.Po wirowaniu należy użyć 100 µL 3,7% paraformaldehydu lub PFA w celu resuspensji osadu komórkowego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie wirować i dwukrotnie przemyć komórki buforem PBS po fiksacji. Przechowywać w temperaturze 4 °C aż do czasu przetworzenia wszystkich próbek.Aby przetworzyć próbki z minuty zero z dodatkiem STV, odwiruj probówki, usuń nadsącz i użyj 15 µL STV w 2% BSA i 0,1% azotku sodu w PBS, aby resuspendować pellet komórkowy; inkubuj na lodzie przez 30 minut. Następnie odwiruj i użyj PBS do dwukrotnego przemycia komórek po utrwaleniu w PFA, zgodnie z wcześniejszą demonstracją; dla próbek z 30 minuty proces przeprowadź w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu i usunięciu nadsączu użyj PBS z 2% BSA, aby rozpuścić próbki.Inkubować w temperaturze 37°C przez 30 minut, a następnie przemyć PBS i utrwalić PFA. Następnie przechowywać próbki w temperaturze 4°C przez 30 minut wraz z próbkami STV. Po wirowaniu i osadzeniu komórek, próbki zawiesić w 200 µL PBS z 2% BSA, po inkubacji w temperaturze 37°C przez 30 minut.Odwiruj i resuspenduj komórki w 50 µL STV 2%BSA 0,1%Sodium azi w PBS; inkubuj w temperaturze 0°C przez 30 minut przed przemyciem i utrwaleniem. Następnie, po przepuszczalności i barwieniu wszystkich próbek za pomocą STV SI three, zgodnie ze szczegółami zawartymi w protokole tekstowym, przechowuj próbki w temperaturze 4°C. Na koniec przeanalizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej.Wyznaczyć procent komórek pozytywnych pod kątem CY three w każdej próbce. Obliczyć procent przyczepionego wirusa oraz względną ilość wirusa zinternalizowanego. Zgodnie z protokołem tekstowym przedstawionym tutaj, w próbce z godziny zero, wirus przyczepiony jest na zimno do komórek docelowych, co uwidoczniono za pomocą barwienia St.V.SI three.Gdy STV jest stosowany jako etap blokowania, wirusy na powierzchni komórek nie są już wykrywane przez S St.V.SI trzy, co silnie redukuje sygnał. Po podniesieniu temperatury do 37°C przytwierdzone wirusy są wchłaniane do wnętrza komórek. Wirusy zinternalizowane nie są wrażliwe na blokowanie nieznakowanym STV, co skutkuje mniej gwałtownym spadkiem intensywności sygnału w pokazanych próbkach inkubowanych z STV przez 30 minut.Poniżej przedstawiono procenty komórek wykazujących pozytywny sygnał SI trzech dla wszystkich warunków eksperymentalnych opisanych w tym filmie. Komórki z infekcją pozorowaną (mock) wyznaczają tło natężenia sygnału w eksperymencie i stanowią kontrolę negatywną dla przylegania wirusa. Kolejna kontrola, neuraminidaza, silnie znosi przyleganie IAV o 90% w porównaniu do komórek nieleczonych.Azydek sodu, który wyczerpuje ATP, hamując tym samym endocytozę, zapobiegał internalizacji cząsteczek wirusa zarówno w trakcie, jak i po infekcji; jak pokazano tutaj, komórki inkubowane przez 30 minut w temperaturze 37 °C po zastosowaniu azydku sodu wykazały gwałtowny spadek internalizacji w porównaniu z komórkami nieleczonymi inkubowanymi w tych samych warunkach. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak mierzyć przyłączanie i internalizację wirusa grypy w komórkach 509. Protokół ten umożliwia wygodny odczyt za pomocą cytometrii przepływowej i może zostać łatwo dostosowany do innych warunków eksperymentalnych.

measuring-attachment-internalization-influenza-virus-a549-cells-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiamy dwukolorowy test fluorescencyjny in vitro, służący do wizualizacji fuzji pojedynczych cząsteczek wirusa z płynną dwuwarstwą docelową. Poprzez znakowanie cząsteczek wirusowych fluoroforami, które różnicowo barwią błonę wirusa oraz jego wnętrze, jesteśmy w stanie monitorować kinetykę hemifuzji i tworzenia się porów.

Metoda pomiaru kinetyki fuzji wirusowej na poziomie pojedynczych cząsteczek

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego &lt;10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

Opisujemy metodę szybkiej izolacji pierwotnych pęcherzykowych komórek nabłonkowych typu II (AECII) myszy za pomocą negatywnej selekcji cytometrycznej. Uzyskane komórki AECII wykazują wysoką żywotność oraz czystość i nadają się do szerokiego zakresu badań funkcjonalnych i molekularnych dotyczących ich roli w schorzeniach układu oddechowego, takich jak choroby autoimmunologiczne lub zakaźne.

Izolacja pierwotnych komórek nabłonkowych pęcherzyków płucnych typu II myszy metodą cytometrii przepływowej do badań funkcjonalnych i molekularnych

Source: Klaus, J. P., et al Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates how to measure arenavirus attachment to monkey kidney cells. The assay uses low temperatures to block endocytosis and isolate the virus binding step. The approach enables precise quantification of surface-bound virus particles under conditions that restrict internalization.

An In Vitro Assay to Study Arenavirus Attachment to the Host Cell

W tym filmie omawiamy korelację między CIT50 a mnogością infekcji wirusowych. Komórki zakażone wirusem wykazują działanie cytopatyczne, powodując ich śmierć i oderwanie od złotej mikroelektrody, co z kolei zmniejsza impedancję.

Test komórkowy oparty na impedancji do pomiaru wielości infekcji wirusem grypy

Ten film demonstruje test przylegania bakterii do hodowli komórek nabłonkowych oznaczony GFP w celu zbadania dynamiki interakcji gospodarz-patogen za pomocą obrazowania opartego na mikroskopii fluorescencyjnej.

Wykrywanie przylegania bakterii do komórek gospodarza za pomocą obrazowania fluorescencyjnego

Ten film demonstruje test mierzący aktywację funkcji efektorowych limfocytów T za pośrednictwem przeciwciał. Dodanie przeciwciała monoklonalnego swoistego dla hemaglutyniny (HA) wirusa grypy do transfekowanych komórek ssaków wykazujących ekspresję HA powoduje powstanie kompleksów immunologicznych z HA. Po wprowadzeniu zmodyfikowanych limfocytów T eksprymujących receptory Fc i reportera lucyferazy, limfocyty T są aktywowane przez kompleksy przeciwciało-HA, a aktywacja ta jest wykrywana przez...

Pomiar aktywacji funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc przez przeciwciała HA

Pierwszym krokiem w cyklu życia arenawirusa jest dołączenie cząsteczek wirusa do komórek gospodarza. Przedstawiamy ilościowy test oparty na (q)RT-PCR do ultraczułego wykrywania i ilościowego oznaczania zdarzeń związanych z przyłączeniem arenawirusa.

Bardzo czuły test do pomiaru przyłączenia komórki arenawirusa

Opisujemy test lektyny sprzężony z enzymem (ELLA) do pomiaru miana przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy (NA) w surowicach. Test wykorzystuje aglutyninę z orzeszków ziemnych do ilościowego określenia reszt galaktozy, które stają się dostępne, gdy NA usuwa kwas sjalowy z 96-dołkowych płytek pokrytych fetuiną.

Pomiar mian przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy za pomocą testu lektyny sprzężonej z enzymem

Opisujemy metodę pomiaru aktywacji funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc przez przeciwciała skierowane przeciwko hemaglutyniny wirusa grypy. Test ten można również dostosować do oceny zdolności przeciwciał monoklonalnych lub surowic poliklonalnych ukierunkowanych na inne glikoproteiny powierzchniowe wirusa do indukowania odporności zależnej od Fc.

Metoda oceny funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc indukowanych przez przeciwciała specyficzne dla hemaglutyniny grypy

Zgłoszono tutaj protokół do ilościowego oznaczania zakaźnych cząsteczek wirusa za pomocą monitorowania w czasie rzeczywistym impedancji elektrycznej zainfekowanych komórek. Praktyczne zastosowanie tej metody przedstawiono poprzez ilościowe określenie rozpadu wirusa grypy A przy różnych parametrach fizykochemicznych naśladujących warunki środowiskowe.

Monitorowanie przeżywalności wirusa grypy poza gospodarzem za pomocą analizy komórek w czasie rzeczywistym

Poznaj metodę pomiaru przyczepiania i internalizacji wirusa grypy A w komórkach A549 za pomocą cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia ilościowe określenie interakcji wirusa z komórkami gospodarza.

Pomiar przyczepiania i internalizacji wirusa grypy A w komórkach A549 za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów