Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Ogólnym celem tej platformy opartej na chipach nanostrukturalnych jest analiza funkcji białek błonowych na poziomie pojedynczych cząsteczek w wysoce równoległy sposób. Dzięki jego zdolności do rozdzielania pojedynczych białek uzyskuje się nowe informacje na temat transportu błonowego i strumienia. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie białek błonowych, takie jak przewodność lub zachowanie transportowe pojedynczych kanałów lub transporterów, szczególnie takich w przypadku ładunków nieelektrogenicznych.

Główną zaletą tej techniki jest jej wysoka równoległość wynikająca z konstrukcji chipów o nanostrukturze, obejmującej setki tysięcy nanoporów i fluorescencyjny odczyt zdarzeń transportowych. Implikacje tej techniki rozciągają się na to, co tworzy najlepsze testy skutecznych bibliotek dla białek błonowych. Ponieważ platforma oparta na chipach umożliwia wysoce równoległe i automatyczne rejestrowanie transportu.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, szybko nauczą się, jak radzić sobie z prezentowaną techniką. Zawsze skupialiśmy się na stworzeniu przyjaznego dla użytkownika testu, tak aby wszyscy zainteresowani mogli go zaadoptować. Ten test transportu membranowego wykorzystuje krzem na izolowanej płytce, zaprojektowany przy użyciu reakcyjnego trawienia jonowego.

Z każdej płytki wytwarzanych jest około 1 000 chipów testowych. Każdy chip zawiera 250 000 mikrowgłębień. Wnęki te są uszczelniane przez dwuwarstwy lipidowe zawierające interesujące białka transportowe.

Membrana stanowi interfejs czujnika. Początkowo materiały fluorescencyjne znajdują się po jednej stronie dwuwarstwy lipidowej, odpowiadającej wnętrzu liposomów, z których się składają. Każda wnęka jest adresowalna za pomocą wielospektralnego odczytu fluorescencji.

Nieprzezroczysta warstwa górna blokuje sygnały fluorescencyjne ze zbiornika buforowego, dzięki czemu biochip jest kompatybilny z odwróconymi mikroskopami fluorescencyjnymi. Za pomocą mikroskopii sił atomowych zmierzono równomiernie rozmieszczone otwory porów i chropowatość powierzchni warstwy dwutlenku krzemu na poziomie 3,6 nanometra, optymalnym dla fuzji pęcherzyków. Skaningowa mikroskopia elektronowa pokazuje przekrój poprzeczny przez nanopory, które uzyskują dostęp do wnęk femtolitrowych wewnątrz chipa krzemowego.

Ten film pokazuje przygotowanie proteoliposomów, przygotowanie chipów do testu i podstawowe wykonanie testu. Podłączyć kolbę okrągłodenną przemytą etanolem do wyparki obrotowej. Suszyć film lipidowy przez 40 minut w temperaturze 300 milibarów, temperaturze łaźni wodnej 30 stopni Celsjusza i maksymalnej prędkości obrotowej, aby utworzyć jednorodny film lipidowy na szklanej ściance kolby.

Następnie, za pomocą pompy wysokopróżniowej, susz film lipidowy przez dodatkowe 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj pięć mililitrów buforu i osiem szklanych kulek przemytych etanolem do kolby, aby uzyskać pęcherzyki wielopłytkowe. Podłączyć kolbę do wyparki obrotowej i obracać bez podciśnienia w temperaturze 50 stopni Celsjusza z maksymalną prędkością.

Po 45 minutach roztwór będzie wyglądał na mleczny, bez resztkowego filmu lipidowego na ściankach. Przenieść kolbę pod gazem obojętnym do łaźni ultradźwiękowej i poddać ją sonikacji przez cztery minuty w temperaturze pokojowej. Sonikacja zaburza liposomy, czyniąc je jednopłytkowymi.

Teraz podziel roztwór LUV na jedną mililitrową porcję i wykonaj pięć cykli zamrażania i rozmrażania przy użyciu ciekłego azotu i łaźni wodnej o temperaturze 40 stopni Celsjusza. Prowadzi to do pękania, przegrupowania i wzrostu liposomów. Na ostatnim etapie zamrażania wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Przed odtworzeniem podwielokrotności LUV należy wytłaczać liposomy, przepuszczając podwielokrotność przez 400-nanometrową membranę filtracyjną z poliwęglanu 17 razy za pomocą mini-ekstrudera. Następnie zdestabilizuj LUV, dodając 4% Triton X-100 na 0,25% roztworu. Inkubować mieszaninę przez pięć minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza.

Teraz wymieszaj jedną część oczyszczonego, zmodyfikowanego MscL z 20 częściami liposomów nasyconych detergentem i kontynuuj inkubację przez 30 minut. Po inkubacji weź 100 mikrolitrów podwielokrotności i dodaj jedną objętość 30-milimolowego kalcyny. Inkubuj tę mieszaninę przez pięć minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza.

Teraz usuń detergent z próbki poddanej kalcynacji i niepoddanej obróbce. Do każdego z nich dodaj mokre biokulki w buforze Tris i inkubuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na obracającej się płytce. Przed eksperymentem należy przetestować preparat za pomocą testu aktywności.

Na początek wymieszaj bazę elastomerową z utwardzaczem i całkowicie wysusz mieszaninę, aby była przerażona. Klej należy zużyć w ciągu 30 minut, gdy jest gotowy. W międzyczasie, zachowując środki ostrożności, wyczyść szkiełko nakrywkowe za pomocą pięciu mililitrów chloroformu, nałożonego ze szklanej strzykawki i pozostaw szkiełko do wyschnięcia.

Teraz za pomocą pipety o pojemności 10 mikrolitrów nałóż przygotowany klej na szkło nakrywkowe. Następnie ostrożnie usuń wiór z deski waflowej za pomocą cienkiej pęsety. Powlekaną stroną wióra do góry umieść go na kleju i delikatnie wetrzyj w szkiełko, aby równomiernie rozprowadzić klej.

Nie pozwól, aby pęcherzyki powietrza zostały uwięzione poniżej lub aby klej dostał się powyżej chipa. Wykonaj również montaż tak, aby pasował do ośmiokomorowego uchwytu suwaka. Teraz osuszaj zestawy przez dwie godziny w temperaturze 65 stopni Celsjusza w suszarce szafkowej.

Później usuń warstwę ochronną z wiórów za pomocą kilku płukań rozpuszczalnikiem w temperaturze 54 stopni Celsjusza. Najpierw umieść zamontowane wióry w uchwycie na suwak. Następnie inkubuj je w trzech kąpielach rozpuszczalnikowych przez 10 minut każda.

Izopropanol, aceton i izopropanol. Następnie ostrożnie i dokładnie umyj frytki ultra czystą wodą. Zakończ proces, susząc wióry pod delikatnym strumieniem azotu.

Teraz przygotuj ośmiodołkową szkiełko samoprzylepne i połóż ją tyłem na ławce. Następnie ostrożnie podnieś i dociśnij szkiełka pokrywy do lepkiego szkiełka tak, aby wióry były skierowane w stronę studzienek. Pozwól zespołowi odpocząć przez kilka minut przed kontynuowaniem.

Przed przystąpieniem do testu translokacji należy dokładnie umyć zespół chipów, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, kończąc kąpielą buforową Tris. Następnie należy wymienić roztwór kąpieli na bufor DOPEd Tris, zawierający pięć milimolowych chlorków wapnia i jeden mikromolowy barwnik Oy647. Następnie dodaj proteoliposomy do komory chipowej, aby uzyskać końcowe stężenie jednego miligrama na mililitr i odczekaj godzinę.

Po godzinie opłucz frytki czterokrotnie 400 mikrolitrami bezwapniowego buforu Tris. Teraz dodaj kontrolowany barwnik do każdej studzienki do pięciu mikromolowców i kontynuuj test. Następnie zamontuj uchwyt chipa do mikroskopu epifluorescencyjnego i skup się na krawędzi chipa nanoporowego, aby znaleźć mikroubytki.

Gdy mikrownęki są już ostre, zeskanuj matrycę nanoporów w poszukiwaniu obszaru, który wyświetla najwyższy współczynnik sufitu. Szczegóły znajdują się w protokole tekstowym. Liposomy przygotowano i sprawdzono pod kątem ich wielkości, rozkładu i dyspersji.

Przygotowane liposomy były większe niż średnica porów do testu, co jest niezbędne. Pożądane są również liposomy monorozproszone. Przed eksperymentem zmodyfikowane białko MscL w preparacie liposomu sprawdzono za pomocą testu wygaszania fluorescencji.

Stosunek liposomów zawierających aktywny zmodyfikowany MscL był odpowiedni do przeprowadzenia eksperymentu z translokacją. Na biochipie zaobserwowano translokację substancji rozpuszczonej celu fluorescencyjnego przez zmodyfikowany kanał MscL. Modulator chemiczny, MTSET, został użyty do otwarcia zaprojektowanych kanałów MscL poprzez odpychanie elektrostatyczne.

Monitorowano późniejszy spadek fluorescencji wewnątrz przestrzeni jamowej. Proces ten okazał się wysoce powtarzalny, z bardzo spójnymi zdarzeniami wypływu. Powstałe krzywe wypływu skupiły się w dwóch odrębnych populacjach, odpowiadających jednokanałowym lub wielokanałowym zdarzeniom translokacji.

System był w stanie śledzić do trzech unikalnie fluoryzujących barwników za pomocą analizy w czasie rzeczywistym. Ułatwia to precyzyjną dyskryminację wyników dodatnich, monowykładniczych zdarzeń wypływu, złożonej kinetyki, intruzji lipidów i pęknięć błon. Po opanowaniu technika ta może być wykonywana w kolejnych krokach, a mianowicie przygotowaniu chipa, przygotowaniu próbki, obrazowaniu i analizie, dzięki czemu cały protokół jest modułowy.