Name: Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Poznaj metodę analizy funkcji białek błonowych na poziomie pojedynczych cząsteczek przy użyciu chipów nanoporowych z fluorescencyjnym odczytem. Technika umożliwia równoległe badanie dynamiki transportu błonowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Barbarze Windschiegl za pomoc w ustanowieniu SOP; Dennisowi Remme'owi za jego pracę nad oprogramowaniem NanoCalcFX oraz Alinie Kollmannsperger, Markusowi Branerowi i Milanowi Gerovacowi za pomocne sugestie dotyczące rękopisu. Niemiecko-izraelska współpraca projektowa (DIP) zapewniona przez DFG i Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych na rzecz R.T., a także przez Federalne Ministerstwo Gospodarki i Technologii (projekt badawczo-rozwojowy ZIM) na rzecz R.T. i Nanospot GmbH wspierały te prace.

<ol><li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-target+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Drug-target network.</a> Nat Biotechnol. 25, 1119(2007).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Osaki, T., Suzuki, H., Le Pioufle, B., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multichannel+simultaneous+measurements+of+single-molecule+translocation+in+%CE%B1-hemolysin+nanopore+array%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Multichannel simultaneous measurements of single-molecule translocation in α-hemolysin nanopore array.</a> Anal. Chem. 81, 9866-9870 (2009).</li>
<li>Carrillo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+membrane+capacitance+measurements+for+studying+endocytosis+and+exocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">High-resolution membrane capacitance measurements for studying endocytosis and exocytosis in yeast.</a> Traffic. , (2015).</li>
<li>Giacomini, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+transporters+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Membrane transporters in drug development.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 9, 215-236 (2010).</li>
<li>Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+membrane+protein+inhibition+by+optical+ion+flux+in+a+droplet+interface+bilayer+array%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 3134-3138 (2012).</li>
<li>Zollmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+liposome+analysis+of+peptide+translocation+by+the+ABC+transporter+TAPL%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single liposome analysis of peptide translocation by the ABC transporter TAPL.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 2046-2051 (2015).</li>
<li>Tamm, L. K., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Supported phospholipid bilayers.</a> Biophys. J. 47, 105-113 (1985).</li>
<li>Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membranes%3A+scientific+and+practical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supported membranes: scientific and practical applications.</a> Science. 271, 43-48 (1996).</li>
<li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+supported+lipid+bilayers%3A+From+biophysical+studies+to+sensor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design.</a> Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).</li>
<li>Wagner, M. L., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+polymer-supported+planar+lipid+bilayers+for+reconstitution+of+integral+membrane+proteins%3A+silane-polyethyleneglycol-lipid+as+a+cushion+and+covalent+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker.</a> Biophys. J. 79, 1400-1414 (2000).</li>
<li>Naumann, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymer-supported+phospholipid+bilayer%3A+tethering+as+a+new+approach+to+substrate-membrane+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">The polymer-supported phospholipid bilayer: tethering as a new approach to substrate-membrane stabilization.</a> Biomacromolecules. 3, 27-35 (2002).</li>
<li>Weiskopf, D., Schmitt, E. K., Klühr, M. H., Dertinger, S. K., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-BLMs+on+highly+ordered+porous+silicon+substrates%3A+Rupture+process+and+lateral+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Micro-BLMs on highly ordered porous silicon substrates: Rupture process and lateral mobility.</a> Langmuir. 23, 9134-9139 (2007).</li>
<li>Watanabe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrayed+lipid+bilayer+chambers+allow+single-molecule+analysis+of+membrane+transporter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity.</a> Nat. Commun. 5, (2014).</li>
<li>Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Microarrays+of+Attoliter+Molecular+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 115, 5738-5741 (2003).</li>
<li>Lohr, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Liposomes+Used+to+Study+the+Activity+of+Individual+Transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single Liposomes Used to Study the Activity of Individual Transporters.</a> Biophysical Journal. 106, 229a(2014).</li>
<li>Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+electrophysiology%3A+an+emerging+paradigm+for+ion-channel+screening+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and physiology.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 358-368 (2008).</li>
<li>Milligan, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robotic+multiwell+planar+patch-clamp+for+native+and+primary+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Robotic multiwell planar patch-clamp for native and primary mammalian cells.</a> Nat. Protoc. 4, 244-255 (2009).</li>
<li>Soga, N., Watanabe, R., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attolitre-sized+lipid+bilayer+chamber+array+for+rapid+detection+of+single+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Attolitre-sized lipid bilayer chamber array for rapid detection of single transporters.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li>
<li>Kleefen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+parallel+single+transport+recordings+on+nanopore+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiplexed parallel single transport recordings on nanopore arrays.</a> Nano Lett. 10, 5080-5087 (2010).</li>
<li>Wei, R., Gatterdam, V., Wieneke, R., Tampé, R., Rant, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+sensing+of+proteins+with+receptor-modified+solid-state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores.</a> Nat. Nanotechnol. 7, 257-263 (2012).</li>
<li>Urban, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+transport+recordings+on+a+membrane-on-nanopore+chip+at+single+molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Highly parallel transport recordings on a membrane-on-nanopore chip at single molecule resolution.</a> Nano Lett. 14, 1674-1680 (2014).</li>
<li>Kusters, I., Van Oijen, A. M., Driessen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-on-a-Chip%3A+Microstructured+Silicon%2FSilicon-Dioxide+Chips+for+High-Throughput+Screening+of+Membrane+Transport+and+Viral+Membrane+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Membrane-on-a-Chip: Microstructured Silicon/Silicon-Dioxide Chips for High-Throughput Screening of Membrane Transport and Viral Membrane Fusion.</a> ACS Nano. 8, 3380-3392 (2014).</li>
<li>Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+directed+intrinsic+membrane+protein+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Lipid directed intrinsic membrane protein segregation.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 17294-17297 (2013).</li>
<li>Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Micrometer-Sized+Free-Standing+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Preparation of Micrometer-Sized Free-Standing Membranes.</a> ChemPhysChem. 12, 2568-2571 (2011).</li>
<li>Lazzara, T. D., Carnarius, C., Kocun, M., Janshoff, A., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+attoliter-sized+compartments+using+fluid+pore-spanning+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Separating attoliter-sized compartments using fluid pore-spanning lipid bilayers.</a> ACS nano. 5, 6935-6944 (2011).</li>
<li>Winterhalter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Black+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Black lipid membranes.</a> Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 5, 250-255 (2000).</li>
<li>Koçer, A., Walko, M., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+utilization+of+reversible+and+irreversible+light-activated+nanovalves+derived+from+the+channel+protein+MscL%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Synthesis and utilization of reversible and irreversible light-activated nanovalves derived from the channel protein MscL.</a> Nat. Protoc. 2, 1426-1437 (2007).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Przedstawiona technika pozwala na wysoce równoległą analizę transportu białek błonowych. Zrekonstytuowane systemy białek błonowych mogą być bezpośrednio nakładane na biochip, co teoretycznie umożliwia adaptację każdego transportera błonowego lub kanału. Analiza transportu jest ograniczona jedynie przez ustanowienie systemu odczytu fluorescencyjnego, albo poprzez bezpośrednią zmianę fluorescencji (translokacja fluoroforów lub substratów znakowanych fluorescencyjnie), albo pośrednią zmianę fluorescencji (barwniki wrażliwe ...

Analiza białek błonowych stała się przedmiotem rosnącego zainteresowania w badaniach podstawowych i farmaceutycznych w ciągu ostatnich 20 lat. Opracowywanie nowych leków zależy od identyfikacji i szczegółowej charakterystyki nowych celów terapeutycznych, co obecnie stanowi jeden z czynników ograniczających. Fakt, że około 60% wszystkich celów terapeutycznych to białka błonowe1, sprawia, że opracowanie technik pozwalających wyjaśnić ich funkcję jest niezwykle istotne.
W przeszłości opracowano wiele technik badania kanałów i transporterów elektrogennych2-4. Substraty nieelektrogenne stanowią natomiast znacznie trudniejsze wyzwanie. Są one jednak szczególnie istotne jako główne cele terapeutyczne, ponieważ kontrolują przepływ substancji rozpuszczonych i składników odżywczych przez błonę komórkową oraz pełnią funkcję kluczowych receptorów w kaskadach sygnalizacyjnych5.
Znaczące wysiłki poświęcono opracowaniu technik służących do badania funkcji białek transportowych błon6,7. Systemy wykorzystujące błony wsparte na stałym podłożu okazały się najbardziej obiecującymi narzędziami w tej dziedzinie8-10, w tym m.in. wsparte na stałym podłożu dwuwarstwy lipidowe, dwuwarstwy przywiązane (tethered bilayers)11,12, mikro-czarne błony lipidowe13,14 oraz natywne macierze pęcherzykowe15,16 . Niektóre z nich są nawet dostępne jako gotowe zestawy komercyjne17,18. Opublikowano przykłady łączące możliwość badania pojedynczych białek błonowych w sposób wysoce równoległy14,19, co jest warunkiem koniecznym dla zastosowań w screeningu. Jednak metody te rzadko przenikają z badań podstawowych do środowiska przemysłowego. Trudności wynikają często z braku możliwości automatyzacji systemu, kosztownej produkcji i/lub pracochłonnego przygotowania. Celem końcowym jest opracowanie podejścia, które pokona wszystkie wyżej wymienione przeszkody.
Technika przedstawiona w niniejszym opracowaniu została opracowana w celu badania kanałów i transporterów błonowych in vitro w kontrolowanym środowisku na poziomie pojedynczego białka20-22. Rekonstytucja oczyszczonych białek błonowych w LUV jest znacznie lepiej udokumentowana niż porównywalne podejścia dla GUV23-26 lub czarnych błon lipidowych27. Mogą być one bezpośrednio naniesione na powierzchnię chipa, gdzie formowanie dwuwarstwy odbywa się poprzez proces samorzutnego składania. Konstrukcja chipa nanoporowatego z szklanym dnem (Rys. 1) umożliwia zastosowanie mikroskopii powietrznej, co pozwala na bezpośrednią automatyzację systemu. W połączeniu z zmotoryzowanym stolikiem można jednocześnie mierzyć wiele chipów, przy czym każde pole widzenia zawiera tysiące szczelnych wnęk przeznaczonych do analizy.
<img alt="Schemat mikro полости nanoporowej i mikroskopia; podłoże SiO2; mikrofabrykacja, analiza nanostruktury." src="/files/ftp_upload/53373/53373fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Projekt multipleksowych biochipów nanoporowych. A) Wafer krzemu na izolatorze (SOI) zostaje ustrukturyzowany poprzez trawienie jonami reaktywnymi. Z każdego wafera wytwarza się około 1 150 pojedynczych chipów o identycznych właściwościach i jakości. B) Każdy chip składa się z 250 000 pojedynczych mikro полости z nano-otworami. Pasek skali: 200 µm. C) Każda cavity jest adresowalna za pomocą wielospektralnego odczytu fluorescencyjnego. Nieprzezroczysta warstwa wierzchnia blokuje sygnały fluorescencyjne z rezerwuaru buforu, dzięki czemu biochip jest kompatybilny z odwróconymi mikroskopami fluorescencyjnymi. D) Obrazowanie za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) ujawnia równomiernie rozmieszczone otwory porów oraz chropowatość powierzchni warstwy dwutlenku krzemu wynoszącą 3,6 nm (n = 40), co jest optymalne dla fuzji pęcherzyków. Pasek skali: 5 µm. E) Obraz z transmisyjnego mikroskopu elektronowego (SEM) przedstawia przekrój przez nanopor, umożliwiający dostęp do femtolitrowych cavities wewnątrz krzemowego chipu. Rysunek został powtórzony za zgodą z 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53373/53373fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Wszelkie analizy danych są przeprowadzane przy użyciu darmowego oprogramowania, aby zagwarantować użytkownikom końcowym nieograniczony dostęp. Serie czasowe analizowane są za pomocą bezpłatnego oprogramowania do przetwarzania obrazów oraz autorskiego programu do analizy krzywych, który umożliwia przetwarzanie wsadowe i bezpośrednią korelację dużych zbiorów danych z wieloma kanałami fluorescencyjnymi i tysiącami krzywych.
Białkiem modelowym wykorzystanym w tym protokole jest białko kanału mechanosensorycznego o dużym przewodnictwie (MscL) pochodzące z E. coli. W naturze pełni ono funkcję zaworu uwalniającego szok osmotyczny, lecz zostało zmodyfikowane w taki sposób, aby po stronie zwężenia kanału można było kowalencyjnie przyłączyć racjonalnie zaprojektowane funkcjonalności syntetyczne. Poprzez odpychanie ładunków kowalencyjnie związanego aktywatora (MTSET) dochodzi do otwarcia kanału, tworząc nanozawór. Przez kanał mogą przenikać małe cząsteczki, takie jak jony, woda, małe białka, a także niewielkie fluorofory. W niniejszym doświadczeniu białko to służy jako model do wykazania zdolności systemu do wykrywania translokacji pośredniczonej przez białka.

<table><tbody><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td>[</tr><tr><td>2-(trimetyloamonio)etylo] metanetiosulfonian</td><td>Toronto Research Chemicals Inc.</td><td>T792900</td><td>MTSET; hydrolizowany wodą. Przechowywać w suchej objętości w temperaturze -80 °C. Zużyć natychmiast (30 minut) po rozpuszczeniu w buforze.</td></tr><tr><td>Strzykawka gazoszczelna 1 ml</td><td>Hamilton</td><td>#1001</td><td></td></tr><tr><td>Kolba okrągła 10 ml</td><td>Koraliki szklane Schott Duran</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,7 mm</td><td>Roth</td><td>N032.1</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanole</td><td>Roth</td><td>9866.5</td><td></td></tr><tr><td>30 cm Rurka przedłużająca Luer-Lock</td><td>Sarstedt</td><td>744304</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Roth</td><td>5025.5</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Koraliki SM-2 Adsorbent</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td>należy aktywować przed pierwszym użyciem</td></tr><tr><td>CaCl2 Dihydrat</td><td>Roth</td><td>HN04.3</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td>przechowywać w ciemności w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Odczynnik chloroformowy klasy</td><td>VWR Chemicals</td><td>22711324</td><td></td></tr><tr><td>DOPEATTO390</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 390-165</td><td>przechowywać w ciemności w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Absolut</td><td>etanolu Sigma-Aldrich</td><td>32205</td><td></td></tr><tr><td>Injekt Strzykawka jednorazowa</td><td>Braun</td><td>460 60 51V</td><td></td></tr><tr><td>Injekt-F Strzykawka jednorazowa</td><td>Braun</td><td>91 66 017V</td><td></td></tr><tr><td>Klipsy do kecka</td><td>Schott</td><td>KC29</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-Fosfatydylocholina, 20% (sojowa)</td> <td>Avanti Polar Lipids</td><td>5416016</td><td>przechowywać w atmosferze gazu obojętnego w temperaturze -20 &; C</td></tr><tr><td>NaCl 99,5% rocznie</td><td>Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Nanopore E100 wafel/chipy</td><td>Mikromotoryka (Moguncja/Niemcy)</td><td></td><td>dostępne na zamówienie</td></tr><tr><td>Nucleopore Track-Etch Membrane 0,4 i mikro; m</td><td>Whatman</td><td>800282</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)</td><td>life Technologies</td><td>D-7173</td><td>przechowywać w ciemności przy -20 stopniach; C</td></tr><tr><td>Oy647</td><td>Luminartis (M&uuml; nster / Niemcy)</td> <td>OY-647-T-1mg</td><td>przechowywać w ciemności w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Filtracja strzykawką Rotilabo, niesterylna, wielkość porów 0,22 i mikro; m</td><td>Roth</td><td>P 818.1</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5080</td><td>materiał kolumny do chromatografii wykluczającej rozmiar</td></tr><tr><td>Silastic MDX4-4210</td> Utwardzacz <td>Dow Corning</td><td></td><td>do mocowania wiórów na szklanym wsporniku nakrywkowym</td></tr><tr><td>lepki-Slide 8-dołkowa</td> komora wielostudzienna <td>ibidi</td><td>80828</td><td>do montażu na szkiełkach szklanych (uchwyt na wióry)</td></tr><tr><td>Zawór trójdrożny niebieski</td><td>Sarstedt</td><td>744410001</td><td></td></tr><tr><td>Tris Pufferan 99,9% Ultra Jakość</td><td>Roth</td><td>5429.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0,2 i mikro; m Filtr membranowy z azotanu celulozy</td><td>Roth</td><td>NH69.1</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; chi 461 kąpiel wodna</td><td>B&uuml; chi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; chi Rotavapor RE 111</td><td>B&uuml; </td> Spektroftometr fluorescencji chi <td></td><td></td></tr><tr><td>Cary Eclipse&nbsp;</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiposoFast Mini Extruder</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa membranowa&nbsp;</td><td>Vaccubrand</td><td>15430</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight Mikroskop śledzący nanocząstki</td><td>Malvern / Nanosight</td><td>LM 14C</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop NyONE</td><td>Synentec</td><td></td><td>dostępny na zamówienie</td></tr><tr><td>Sterowanie pompą</td><td>Vaccubrand</td><td>CVC 2II</td><td></td></tr><tr><td>Wanna Sonorex RK100H</td><td>Brandelin elektroniczna</td><td>31200001107477</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa RC5</td><td>Vaccubrand</td><td>1805400204</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna W13</td><td>Haake</td><td>002-9910</td><td></td></tr><tr><td>Myjka plazmowa PDC-37G</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-37G</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Open Source</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td> <td>naukowe oprogramowanie do przetwarzania obrazów</td></tr><tr><td>NanoCalcFX</td><td>Freeware</td><td>http://sourceforge.net/projects/nanocalc/</td> <td>oprogramowanie do analizy/oceny danych dla ogromnych zestawów danych kinetycznych transportu</td></tr><tr><td>Oprogramowanie analityczne NTA 2.3 Oprogramowanie do</td> akwizycji i analizy danych <td>Nanosight</td><td></td><td>do śledzenia nanocząstek mikroskop</td></tr><tr><td>NTA 2.3 Temperature Comms</td><td>Nanosight</td><td></td><td>oprogramowanie do kontroli temperatury do mikroskopu śledzącego nanocząstki</td></tr></tbody></table>

procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Transport białek błonowych na poziomie pojedynczego białka nadal unika szczegółowej analizy, jeśli translokowany substrat nie jest elektrogeniczny. Poczyniono znaczne wysiłki w tej dziedzinie, ale techniki umożliwiające zautomatyzowaną, wysokoprzepustową analizę transportu w połączeniu z bezrozpuszczalnikowymi technikami dwuwarstwowymi lipidów wymaganymi do analizy transporterów błonowych są rzadkie. Ta klasa transporterów ma jednak kluczowe znaczenie dla homeostazy komórek, a zatem jest kluczowym celem w opracowywaniu leków i metodologiach w celu uzyskania nowych informacji, które są rozpaczliwie potrzebne.
Prezentowany tutaj manuskrypt opisuje stworzenie i obsługę nowego biochipa do analizy procesów transportu za pośrednictwem białek błonowych w rozdzielczości pojedynczego transportera. Biochip składa się z mikrownęk otoczonych nanoporami, który jest wysoce równoległy w swojej konstrukcji i może być produkowany w klasie przemysłowej i ilości. Liposomy zawierające białka można bezpośrednio nakładać na powierzchnię chipa, tworząc samoorganizujące się dwuwarstwy lipidowe obejmujące pory przy użyciu technik SSM (stałe błony lipidowe na podłożu). Części membrany rozciągające się na porach są wolnostojące, zapewniając interfejs do translokacji substratu do lub z przestrzeni wnęki, po której można śledzić wielospektralny odczyt fluorescencyjny w czasie rzeczywistym. Ustanowienie standardowych procedur operacyjnych (SOP) pozwala na proste ustanowienie dwuwarstw lipidowych zawierających białka na powierzchni chipa praktycznie każdego białka błonowego, które można funkcjonalnie odtworzyć. Jedynym warunkiem wstępnym jest stworzenie fluorescencyjnego systemu odczytu dla nieelektrogenicznych substratów transportowych.
Aplikacje do badań przesiewowych o wysokiej zawartości są możliwe dzięki użyciu zautomatyzowanych odwróconych mikroskopów fluorescencyjnych, rejestrujących wiele chipów równolegle. Duże zbiory danych mogą być analizowane za pomocą ogólnodostępnego, specjalnie zaprojektowanego oprogramowania analitycznego. Trójkolorowy, wielospektralny odczyt fluorescencyjny pozwala ponadto na bezstronną dyskryminację danych w różnych klasach zdarzeń, eliminując wyniki fałszywie dodatnie.
Technologia chipów jest obecnie oparta na powierzchniach SiO2, ale możliwa jest również dalsza funkcjonalizacja przy użyciu powierzchni chipów pokrytych złotem.

Błony rozpinające pory można łatwo tworzyć na nanostrukturalnej powierzchni chipa w sposób samoorganizujący. Jednak proces ten jest wciąż delikatny i zależy od wielu parametrów, takich jak rozmiar liposomów, monodyspersyjność populacji liposomów, lamelarność, stężenie lipidów i soli oraz chemiczne właściwości powierzchni. Większość tych parametrów została dokładnie scharakteryzowana i zestandaryzowana w powyższym protokole. Inne parametry powinny być jednak sprawdzane przy każdym nowym pr...

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Ogólnym celem tej platformy opartej na chipie z nanostrukturami jest analiza funkcji białek błonowych na poziomie pojedynczych cząsteczek w sposób wysoce równoległy. Dzięki możliwości rozdzielania pojedynczych białek uzyskano nową wiedzę na temat transportu i przepływu przez błony. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie białek błonowych, takie jak przewodność lub zachowanie transportowe pojedynczych kanałów lub transporterów, zwłaszcza tych z ładunkiem nieelektrogennym.Główną zaletą tej techniki jest wysoki stopień równoległości wynikający z konstrukcji chipa z nanostrukturami, który posiada setki tysięcy nanoporów oraz umożliwia fluorescencyjny odczyt zdarzeń transportu. Zastosowania tej techniki obejmują tworzenie optymalnych testów skutecznych bibliotek białek błonowych, ponieważ platforma oparta na chipie pozwala na wysoce równoległą i automatyczną rejestrację transportu.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą szybko opanują zaprezentowaną technikę. Głównym celem było stworzenie przyjaznego dla użytkownika testu, aby każdy zainteresowany mógł go wdrożyć. Ten test transportu przez błony wykorzystuje wafle krzemowe na izolatorze, opracowane przy użyciu reaktywnego trawienia jonowego.Z każdego wafla wytwarza się około 1 000 chipów analitycznych. Każdy chip zawiera 250 000 mikrojam. Jam te są uszczelniane przez dwuwarstwy lipidowe zawierające badane białka transportowe.Membrana stanowi interfejs czujnika. Początkowo materiały fluorescencyjne znajdują się po jednej stronie dwuwarstwy lipidowej, co odpowiada wnętrzu liposomów, z których są one zbudowane. Każda wnęka jest dostępna za pomocą multispektralnego odczytu fluorescencji.Nieprzezroczysta warstwa wierzchnia blokuje sygnały fluorescencyjne z rezerwuaru buforu, dzięki czemu biochip jest kompatybilny z odwróconymi mikroskopami fluorescencyjnymi. Przy użyciu mikroskopii sił atomowych zmierzono równomiernie rozmieszczone otwory porów oraz chropowatość powierzchni warstwy dwutlenku krzemu, która wyniosła 3,6 nanometra, co jest wartością optymalną dla fuzji pęcherzyków. Skaningowa mikroskopia elektronowa ukazuje przekrój przez nanopor, który daje dostęp do femtolitrowych wnęk wewnątrz krzemowego chipu.W tym filmie przedstawiono przygotowanie proteoliposomów, przygotowanie chipów do analizy oraz podstawowy przebieg badania. Podłączymy kolbę o okrągłym dnie, przemytą etanolem, do rotacyjnego odparowacza. Susz film lipidowy przez 40 minut przy ciśnieniu 300 millibar, temperaturze kąpieli wodnej 30 stopni Celsius i maksymalnej prędkości obrotowej, aby utworzyć jednorodny film lipidowy na szklanej ściance kolby.Następnie, używając pompy wysokopróżniowej, suszyć film lipidowy przez kolejne 30 minut w temperaturze pokojowej. Dalej, dodać pięć mililitrów buforu oraz osiem szklanych kulek przemytych etanolem do kolby, aby przygotować pęcherzyki wielowarstwowe. Podłączyć kolbę do rotavapora i rotować bez próżni w temperaturze 50 °C z maksymalną prędkością.Po 45 minutach roztwór stanie się mętny, a na ściankach nie będzie widocznej pozostałości filmu lipidowego. Przenieś kolbę w atmosferze gazu obojętnego do kąpieli ultradźwiękowej i sonikuj przez cztery minuty w temperaturze pokojowej. Sonikacja powoduje rozbicie liposomów, przekształcając je w formy jednowarstwowe.Następnie podziel roztwór LUV na aliquoty o objętości 1 ml i przeprowadź pięć cykli zamrażania i rozmrażania, wykorzystując ciekły azot oraz kąpiel wodną o temperaturze 40 °C. Prowadzi to do rozerwania, reorganizacji i wzrostu liposomów. Po ostatnim etapie zamrażania przechowuj wszystkie próbki w temperaturze -80 °C.Przed rekonstytucją alikwotu LUV należy przeprowadzić ekstruzję liposomów, przepuszczając alikwot 17 razy przez poliwęglanową membranę filtracyjną o rozmiarze 400 nm za pomocą mini-ekstrudera. Następnie należy zdestabilizować LUV, dodając Triton X-100 do stężenia 0,25% w roztworze (z roztworu 4%). Mieszaninę inkubuje się przez pięć minut w temperaturze 50 °C.Następnie zmieszaj jedną część oczyszczonego, zmodyfikowanego MscL z 20 częściami liposomów nasyconych detergentem i kontynuuj inkubację przez 30 minut. Po inkubacji pobierz alikwot o objętości 100 µL i dodaj jedną objętość 30 mM kalcyny. Inkubuj tę mieszaninę przez pięć minut w temperaturze 50 °C.Następnie usuń detergent z próbki poddanej kalcynacji oraz z próbki nietraktowanej. Do każdej z nich dodaj mokre kulek bio-beads w buforze Tris i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze. Przed rozpoczęciem eksperymentu sprawdź przygotowany materiał za pomocą testu aktywności.Aby rozpocząć, wymieszaj bazę elastomeru z utwardzaczem i całkowicie osusz mieszaninę, aż stanie się gęsta. Gotowy klej należy zużyć w ciągu 30 minut. W międzyczasie, zachowując środki ostrożności, oczyść szkiełko nakrywowe, używając pięciu mililitrów chloroformu naniesionego za pomocą szklanej strzykawki, a następnie pozostaw szkiełko do wyschnięcia.Następnie, używając pipety 10 µL, nanieś przygotowany klej na szkiełko nakrywkę. Następnie ostrożnie wyjmij chip z płytki waflowej za pomocą precyzyjnej pęsety. Umieść chip powłoką do góry na kleju i delikatnie dociśnij go do szkiełka, aby równomiernie rozprowadzić substancję klejącą.Należy dopilnować, aby pod spodem nie uwięzły pęcherzyki powietrza, a na chip nie dostał się żaden środek przylepny. Dodatkowo należy przygotować zespół tak, aby pasował do uchwytu na slajdy ośmiokomorowe. Następnie zespoły należy poddać desykacji przez dwie godziny w temperaturze 65 °C w szafce suszacej.Następnie usuń warstwę ochronną z płytek, wykonując kilka płukań rozpuszczalnikiem w temperaturze 54 °C. Najpierw umieść zamontowane płytki w uchwycie do slajdów. Następnie inkubuj je w trzech kąpielach z rozpuszczalnikiem przez 10 minut każda.Izopropanol, aceton i izopropanol. Następnie ostrożnie i dokładnie przemyj chipy wodą ultraczystą. Zakończ proces, susząc chipy pod łagodnym strumieniem gazu azotowego.Następnie należy przygotować ośmiodobowe szkiełko przylepne i położyć je odwrócone na blacie. Potem ostrożnie podnieść i docisnąć szkiełka nakrywkowe do szkiełka przylepnego, tak aby chipy były skierowane w stronę dołków. Pozostawić tak przygotowany zestaw na kilka minut przed przejściem do kolejnego kroku.Przed przystąpieniem do badania translokacji należy dokładnie wypłukać zespół chipa, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, kończąc proces kąpielą w buforze Tris. Następnie należy wymienić roztwór kąpieli na bufor Tris z dodatkiem DOPE, zawierający 5 mM chlorku wapnia oraz 1 µM barwnika Oy647. W kolejnym kroku należy dodać proteoliposomy do komory chipa, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mg/mL, i odczekać jedną godzinę.Po godzinie przepłucz płytki cztery razy 400 µL buforu Tris bez wapnia. Następnie do każdego otworu dodaj barwnik kontrolny do stężenia 5 µM i przystąp do analizy. W dalszej kolejności zamocuj uchwyt z płytką do mikroskopu epifluorescencyjnego i ustaw ostrość na krawędzi płytki z nanoporami, aby zlokalizować mikrownęki.Po ustawieniu mikrokomór w obszarze ostrości, należy przeskanować matrycę nanoporów w celu znalezienia obszaru wykazującego najwyższy stosunek sufitowy (ceiling ratio). Szczegóły znajdują się w tekście protokołu. Liposomy zostały przygotowane, a następnie sprawdzono ich rozkład wielkości oraz stopień dyspersji.Przygotowane liposomy były większe niż średnica porów w teście, co jest kluczowe. Pożądane są również liposomy monodyspersyjne. Przed eksperymentem sprawdzono obecność zmodyfikowanego białka MscL w preparacie liposomów, wykorzystując test odeksygancji fluorescencji.Stosunek liposomów zawierających aktywny zmodyfikowany kanał MscL był odpowiedni do przeprowadzenia eksperymentu z translokacją. Na biochipie zaobserwowano translokację fluorescencyjnego związku docelowego poprzez zmodyfikowany kanał MscL. W celu otwarcia zmodyfikowanych kanałów MscL poprzez odpychanie elektrostatyczne zastosowano modulator chemiczny MTSET.Następnie monitorowano spadek fluorescencji wewnątrz przestrzeni wnęki. Proces ten okazał się wysoce powtarzalny, z bardzo spójnymi zdarzeniami odpływu. Powstałe krzywe odpływu pogrupowały się w dwie wyraźne populacje, odpowiadające zdarzeniom translokacji przez pojedynczy kanał lub wiele kanałów.System ten umożliwił śledzenie do trzech unikalnie fluorescencyjnych barwników przy użyciu analizy w czasie rzeczywistym. Ułatwia to precyzyjne rozróżnienie wyników dodatnich, zdarzeń eflluksu mono-wykładniczego, złożonej kinetyki, intruzji lipidów oraz pęknięć błony. Po opanowaniu technika ta może być wykonywana w kolejnych krokach, mianowicie: przygotowaniu chipa, przygotowaniu próbki, obrazowaniu i analizie, co czyni cały protokół modułowym.

membrane-transport-processes-analyzed-highly-parallel-nanopore-chip

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Podejście oparte na mikroskopii pojedynczych cząsteczek dostarczyło nowych informacji na temat transportu jądrowego.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w transporcie jądrowym

Opisano metodę wykorzystania nanoporów w stanie stałym do monitorowania niespecyficznej adsorpcji białek na powierzchni nieorganicznej. Metoda ta opiera się na zasadzie impulsu rezystywnego, co pozwala na badanie adsorpcji w czasie rzeczywistym i na poziomie pojedynczych cząsteczek. Ponieważ proces adsorpcji pojedynczych białek zachodzi daleko od stanu równowagi, proponujemy zastosowanie równoległych macierzy syntetycznych nanoporów, co umożliwia ilościowe wyznaczenie pozornej stałej szybkości...

Monitorowanie adsorpcji białek za pomocą nanoporów w stanie stałym

Przedstawiono metodologię przygotowania nanoporów w stanie stałym w roztworze do eksperymentów z translokacją biomolekularną. Stosując krótkie impulsy o silnym polu elektrycznym, średnica nanoporów może być kontrolowana z subnanometryczną precyzją, a jej charakterystyka szumu elektrycznego znacznie się poprawia. Procedura ta jest wykonywana in situ przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego w warunkach eksperymentalnych.

Dostrajanie rozmiaru i minimalizowanie szumów nanoporów w stanie stałym

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania dyskretnych klastrów tlenu metali, polioksometalanów (POM), na granicy pojedynczej cząsteczki za pomocą biologicznej platformy elektronicznej opartej na nanoporach. Metoda ta stanowi komplementarne podejście do tradycyjnych narzędzi chemii analitycznej stosowanych w badaniu tych cząsteczek.

Charakterystyka fizyczna pojedynczych nanocząstek metalicznych w wysokiej rozdzielczości

Tutaj prezentujemy protokół do badania molekularnego mechanizmu translokacji protonów przez błony lipidowe pojedynczych liposomów, używając cytochromu bo3 jako przykładu. Łącząc elektrochemię i mikroskopię fluorescencyjną, zmiany pH w świetle pojedynczych pęcherzyków, zawierających jeden lub wiele enzymów, mogą być wykrywane i analizowane indywidualnie.

Pomiary pojedynczych liposomów do badania enzymów błonowych pompujących protony przy użyciu elektrochemii i mikroskopii fluorescencyjnej

Sekwencjonowanie nanoporowe to nowatorska technologia, która pozwala na efektywne kosztowo sekwencjonowanie w odległych lokalizacjach i miejscach o ograniczonych zasobach. W tym miejscu przedstawiamy protokół sekwencjonowania mRNA z krwi pełnej, który jest zgodny z takimi warunkami.

Sekwencjonowanie mRNA z krwi pełnej za pomocą sekwencjonowania nanoporowego

Prezentowany tutaj jest protokół do określania oligomerycznego stanu białek błonowych, który wykorzystuje natywny system nanocząstek błony komórkowej w połączeniu z mikroskopią elektronową.

System natywnych nanocząstek błony komórkowej do analizy interakcji białko-białko błonowe

Ten protokół przedstawia metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z receptorami w czasie rzeczywistym w środowisku komórkowym. Wiązanie mierzy się jako transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych a białkiem znakowanym niekanonicznym, fluorescencyjnym aminokwasem.

Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym

Ten protokół opisuje oparte na iSCAT przetwarzanie obrazów i śledzenie pojedynczych cząstek, które umożliwia jednoczesne badanie masy cząsteczkowej i dyfuzyjnego zachowania makrocząsteczek oddziałujących z błonami lipidowymi. Instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania próbki, konwersji masy na kontrast, akwizycji filmu i obróbki końcowej są dostępne wraz ze wskazówkami, aby zapobiec potencjalnym pułapkom.

Śledzenie cząstek czułych na masę w celu scharakteryzowania dynamiki makrocząsteczek związanych z błoną

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Poznaj metodę analizy funkcji białek błonowych na poziomie pojedynczych cząsteczek przy użyciu chipów nanoporowych z fluorescencyjnym odczytem. Technika umożliwia równoległe badanie dynamiki transportu błonowego.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka (Wideo) | JoVE Journal

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Przeglądaj więcej filmów