Skuteczny protokół izolacji limfocytów B i T z ludzkich migdałków podniebiennych

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie frakcji limfocytów BNT z próbek migdałków ludzkich. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu wirusologii, np. jakie są role frakcji limfocytów BT w patogenezie chorób wirusowych w ciągu trzech godzin od ich chirurgicznego usunięcia. Przetransportuj tkankę migdałków do laboratorium w 50-mililitrowej probówce wirówkowej wypełnionej lodowatymi, sterylnymi suplementami zawierającymi HBSS.

Następnie przy użyciu odpowiednich procedur bezpieczeństwa biologicznego zalecanych do obchodzenia się z tkankami ludzkimi. Zwilż tkankę świeżym suplementem zawierającym HBSS i przenieś migdałki na 60-milimetrową plastikową płytkę do hodowli komórkowej na lodzie. Za pomocą kleszczy usuń wszelkie widoczne skrzepy krwi lub tkanki tłuszczowe i łączne, a następnie przenieś migdałki na nową 60-milimetrową płytkę zawierającą pięć mililitrów HBSS z suplementami.

Następnie wytnij. Tkanka migdałkowa zlepia się na trzy do 10 milimetrowych fragmentów, a następnie płynnie przenosi się fragmenty do plastikowego sitka do komórek o średnicy 100 mikrometrów na nowej 60-milimetrowej płytce do hodowli komórkowej zawierającej 10 mililitrów świeżego HBSS z suplementami za pomocą końcówki tłoka plastikowej strzykawki. Wyciśnij fragmenty tkanek przez sitko do komórek, upewniając się, że fragmenty migdałków pozostają całkowicie zanurzone w HBSS, gdy cała tkanka zostanie zmacerowana, wyrzuć sitko i przenieś powstałą zawiesinę komórek do 50-mililitrowej plastikowej probówki wirówkowej na lodzie.

Doprowadź roztwór komórkowy do końcowej objętości 35 mililitrów ze świeżymi suplementami zawierającymi HBSS, a następnie dodaj 10 mililitrów roztworu gradientu gęstości w temperaturze pokojowej do kilku 50-mililitrowych stożkowych probówek. Delikatnie nałożyć zawiesiny komórek na gradienty gęstości, uważając, aby nie wymieszać roztworów, a następnie oddzielić komórki przez odwirowanie. Komórki jednojądrzaste rozdzielą się w puszystą białą warstwę na granicy z czerwonymi krwinkami, fibroblastami i szczątkami komórek znajdującymi się w osadzie na dnie probówki.

Za pomocą pipety o pojemności 10 mililitrów ostrożnie zbierz warstwę komórek jednojądrzastych i wciągnij komórki jednojądrzaste do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Następnie umyj komórki trzy razy w 25 mililitrach lodowatego PBS na każde pranie i ponownie zawieś ostatnią granulkę w 15 mililitrach PBS. Po policzeniu liczby żywotnych komórek umieść komórki na lodzie, aby wyizolować limfocyty T tonsora przez separację kulek magnetycznych.

Zakręć zawiesinę komórek jednojądrzastych i ponownie zawieś osad w 80 mikrolitrach lodowatego bufora separacyjnego na jeden razy 10 do siedmiu komórek. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do sterylnej dwumililitrowej probówki i inkubuj w 20 mikrolitrach przeciwciała magnetycznego CD three przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza z ciągłym delikatnym mieszaniem, aby utrzymać komórki i zawiesinę pod koniec inkubacji, przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki zawierającej pięć mililitrów lodowatego buforu separacyjnego i umyj je podczas mycia. Przymocuj separator magnetyczny do stojaka i załaduj kolumnę na magnes.

Umyj kolumnę 500 mikrolitrami lodowatego buforu do separacji, a następnie umieść sitko o średnicy 40 mikrometrów na górze kolumny. Teraz ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 mikrolitrach świeżego bufora separacyjnego i załadować komórki przez sitko na kolumnę zbierającą komórkę B zawierającą EIT w stożkowym 15 mililitrowym zbiorniku. Dwa bon lód, gdy wszystkie komórki przeszły do probówki zbiorczej.

Przemyć kolumnę cztery razy 500 mikrolitrami buforu separacyjnego na jeden raz 10 do siedmiu komórek, czekając, aż zbiornik kolumny będzie pusty przed zastosowaniem następnego płukania. Po ostatnim praniu przenieś kolumnę do nowej 15-mililitrowej probówki zbiorczej. Następnie za pomocą tłoka kolumny wciśnij dwa mililitry buforu separacyjnego przez kolumnę do probówki, aby zebrać CD trzy dodatnie frakcje limfocytów T.

Aby przeanalizować izolowane frakcje komórek B i t tonsor, należy zagnieździć CD trzy dodatnie i CD trzy ujemne frakcje komórek i umyć oba zestawy komórek w jednym mililitrze PBS uzupełnionym 0,2% BSA lub PBSA po drugim wirowaniu. Rozprowadzić 100 mikrolitrów podwielokrotności komórek i PBSA do odpowiedniej liczby probówek do etykietowania faksem i dodać odpowiednią ilość sprzężonego z fluorem czteroma przeciwciała monoklonalnego lub kontrolnego do każdej probówki. Następnie krótko zawiruj probówki i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności pod koniec inkubacji.

Umyj probówki dwa razy świeżym PBSA, a następnie utrwal barwienie komórek 1% aldehydem paraformowym, aby wykryć obecność DNA adenowirusa w komórkach metodą PCR. Przeprowadzić amplifikację PCR w odpowiednich warunkach cyklicznych, rozdzielając powstałe produkty amplifikacji PCR na 1,5% żelu AGROS i międzystanowym buforze EDTA. Na koniec zwizualizuj powstałe prążki za pomocą odpowiedniego barwnika kwasu nukleinowego.

Zgodnie ze standardowymi protokołami, pomyślne oddzielenie komórek jednojądrzastych tonsoru skutkuje wysoce oczyszczonymi subpopulacjami limfocytów BNT, co potwierdza analiza cytometryczna przepływowa z użyciem przeciwciał anty CD 20 i anty CD two w celu wykrycia odpowiednio populacji limfocytów b i t. W przeciwieństwie do tego, nieefektywne oddzielenie komórek jednojądrzastych powoduje powstanie frakcji komórkowych, które są mieszaniną komórek zarówno z limfocytów b, jak i t. Subpopulacje, DNA i RNA można wyekstrahować z oddzielonych kulkami magnetycznymi limfocytów b i t w celu dalszej analizy, jak właśnie pokazano.

Na przykład w tym przypadku specyficzne wykrywanie DNA adenowirusa w limfocytach T TONSOR, wykryte za pomocą PCR, jest pokazane jako cytoplazmatyczne jakości. RNA można również ekstrahować z izolowanych limfocytów tonsor B NT. Raz potwór dwie próbki migdałków można przetworzyć w ciągu sześciu godzin, jeśli technika zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przetworzyć próbki migdałków tak szybko, jak to możliwe. Liczba etapów mycia i objętość bufora myjącego są również parametrami krytycznymi dla dobrego wyniku. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak QPCR i R-T-Q-P-C-R, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące ilościowej obecności wirusowego DNA i mRNA po jego opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się wirusologią do zbadania patogenezy i latencji różnych gatunków wirusów w ludzkich tkankach limfatycznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować frakcje limfocytów BT z próbek ludzkich migdałków. Nie zapominaj, że praca z niesprawdzonymi materiałami pochodzenia ludzkiego, takimi jak krew i tkanki, może być niezwykle niebezpieczna.

W związku z tym należy przestrzegać odpowiednich praktyk bezpieczeństwa.