Name: Skuteczny protokół izolacji limfocytów B i T z ludzkich migdałków podniebiennych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Poznaj szybką metodę izolacji limfocytów B i T z ludzkich migdałków podniebiennych. Protokół umożliwia badania nad wirusowymi przyczynami zapalenia migdałków w ciągu trzech godzin od zabiegu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Szwedzkie Towarzystwo Onkologiczne (11 0253, 13 0469), Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych (K2012-99X-21959-01-3), Fundację Marcusa Borgströmsa i Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych poprzez grant dla Centrum Badań RNA w Uppsali (2006-5038-36531-16). Jesteśmy wdzięczni głównej placówce BioVis na Uniwersytecie w Uppsali za dużą pomoc w analizie FACS.

Protokół opisuje izolację komórek limfoidalnych od ludzkiego materiału pacjenta i dlatego wymaga zgody etycznej. Praca wykonana w niniejszym badaniu została przyznana przez Komisję ds. Oceny Etycznej w Uppsali (Dnr. 2013/387).
1. Izolacja komórek jednojądrzastych (MNC) z ludzkich migdałków podniebiennych
UWAGA: Wszystkie niesprawdzone materiały pochodzenia ludzkiego, takie jak krew, tkanki lub płyny ustrojowe, powinny być uważane za potencjalnie zainfekowane materiały. W związku z tym należy przestrzegać zalecanych praktyk bezpieczeństwa biologicznego w odniesieniu do tkanek ludzkich.
Uwaga: Aby uniknąć kontaminacji, wszystkie roztwory i sprzęt do hodowli komórkowych muszą być sterylne. Wszystkie i roztwory powinny być wstępnie schłodzone i przechowywane na lodzie. Tkanki migdałków i wyizolowane komórki powinny być przechowywane i poddawane obróbce na lodzie.
<ol>
	<li>Uzyskaj świeże migdałki od pacjentów poddawanych tonsillektomii lub tonsillotomii (ryc. 2). Zanurz grudki tkanek w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml wypełnionej lodowatym sterylnym zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS) uzupełnionym 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 10 mM glutaminy, 0,05 mg/ml gentamycyny i 1% mieszaniny antybiotykowo-przeciwgrzybiczej (penicylina, streptomycyna i amfoterycyna B).</li>
	<li>Probówki z zanurzonymi próbkami tkanki migdałkowej należy przechowywać przez cały czas na lodzie. Staraj się przetworzyć migdałki tak szybko, jak to możliwe i nie później niż 3 godziny po chirurgicznym usunięciu.</li>
	<li>Umieścić migdałek na plastikowej płytce do hodowli komórkowej o średnicy 60 mm na lodzie i utrzymywać tkankę zwilżoną HBSS. Usuń widoczne skrzepy krwi, tkankę tłuszczową i łączną za pomocą czystych kleszczy z powierzchni migdałków.</li>
	<li>Użyć nowej płytki o średnicy 60 mm zawierającej 5 ml HBSS. Pokrój kępkę tkanki migdałkowej na fragmenty o wielkości 3-10 mm za pomocą sterylnych nożyczek i/lub skalpela.</li>
	<li>Przygotować nową płytkę do hodowli komórkowej o średnicy 60 mm zawierającą 10 ml HBSS i umieścić sitko z tworzywa sztucznego o średnicy 100 μm w roztworze HBSS.</li>
	<li>Przenieś wypreparowane fragmenty migdałków do sitka komórkowego za pomocą sterylnych kleszczy. Za pomocą tłoka plastikowej strzykawki płynnie przecisnąć fragmenty tkanki przez sitko do komórek. Upewnij się, że fragmenty migdałków są całkowicie zanurzone w HBSS.</li>
	<li>Odrzucić sitko komórkowe wraz z resztkami tkanek i przenieść powstałą zawiesinę komórek z płytki do hodowli komórkowej o średnicy 60 mm do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Pozostaw probówkę na lodzie, wykonując kroki 1.8 i 1.9.</li>
	<li>W przypadku dużych migdałków, większych niż 2 cm (ryc. 2), należy ścisnąć fragmenty migdałków w sitkach dwukomórkowych, aby uniknąć zatkania siatki w sitku.</li>
	<li>Otrzymać końcową objętość 35 ml zawiesiny komórek. 
	Uwaga: Na tym etapie możliwe jest przygotowanie zawiesiny komórek do kriokonserwacji (patrz punkt 2).</li>
	<li>Dodać 10 ml roztworu gradientu gęstości, takiego jak Ficoll, do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Delikatnie nałożyć zawiesinę komórek (krok 1.9) na wierzch roztworu gradientu gęstości. Unikać mieszania zawiesiny komórek z roztworem gradientu gęstości. 
	Uwaga: Roztwór gradientu gęstości musi być rozgrzany do RT.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek w odchylanym rotorze o masie 700 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Nie włączaj funkcji hamowania w wirówce, ponieważ szybkie hamowanie może zakłócić nachylenie. Należy również użyć funkcji najniższego przyspieszenia dostępnej w wirówce. 
	Uwaga: Po tym etapie wirowania obserwuj MNC jako puszystą białą warstwę na granicy faz, a czerwone krwinki (RBC), fibroblasty i szczątki komórkowe jako osad na dnie probówki.</li>
	<li>Ostrożnie zebrać warstwę MNC za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Umieścić zawiesinę komórek w nowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać 25 ml lodowatego PBS do zawiesiny komórek i wirować probówkę o sile 300 x g przez 5 minut w odchylanym rotorze w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć sklarowany osad za pomocą pipety o pojemności 25 ml i powtórzyć etap przemywania osadów komórkowych jeszcze dwa razy. Na koniec ponownie zawiesić osad komórkowy w 15 ml PBS. 
	Uwaga: Po ostatnim etapie płukania możliwe jest kriokonserwowanie zawiesiny komórek (patrz punkt 2).</li>
	<li>Nałożyć 10 μl zawiesiny komórek do komory zliczania komórek hemocytometru i policzyć liczbę komórek pod mikroskopem. Dozować odpowiednią ilość komórek (np. 2-3 x 107) do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml w celu późniejszego oddzielenia kulek magnetycznych. Przechowywać tę podwielokrotność na lodzie do kroku 3.2.</li>
</ol>
2. Kriokonserwacja komórek migdałków
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę do zamrażania (90% FBS i 10% DMSO) i trzymaj ją na lodzie. W przypadku długotrwałego przechowywania należy przechowywać zamrażarki w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Określ całkowitą liczbę komórek za pomocą komory zliczania komórek hemocytometru (krok 1.15). Obliczyć wymaganą ilość pożywki zamrażającej zgodnie z pożądaną gęstością zamrożonych komórek (np. 107 komórek/ml pożywki zamrażającej).</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek o sile 300 x g przez 5 minut. Zdekantować supernatant bez naruszania osadu komórkowego i ponownie zawiesić osad komórkowy w lodowato zimnym pożywce do zamrażania (od kroku 2.1).</li>
	<li>Dozować 1 ml porcji zawiesiny komórkowej do sterylnych fiolek przeznaczonych do długotrwałego przechowywania w ciekłym azocie. Zamrozić fiolki w komorze izopropanolowej i przechowywać je w temperaturze –80 °C O/N. W celu długotrwałego przechowywania należy przenieść fiolki do zbiornika magazynowego zawierającego ciekły azot lub zamrażarki komórkowej o temperaturze –140 °C.</li>
	<li>Aby rozmrozić fiolki z zamrożonymi komórkami, należy je szybko ogrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Natychmiast po rozmrożeniu zawiesinę komórkową rozpuścić w 10 ml wstępnie podgrzanego HBSS (z dodatkami, krok 1.1) w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować probówkę o masie 300 x g przez 5 minut, usunąć HBSS i ponownie zawiesić osad komórek o żądanej gęstości komórek w HBSS (z dodatkami, krok 1.1). 
	Uwaga: Żywotność MNC po rozmrożeniu ma znaczenie, ponieważ obecność martwych komórek zmniejszy ostateczną wydajność oczyszczonych limfocytów B i T. 
	Uwaga: Zgodnie z naszym doświadczeniem żywotność ogniw mniejsza niż 80% zmniejszy skuteczność izolacji komórek.</li>
</ol>
3. Pozytywna selekcja populacji limfocytów T z migdałków wieloletnich
Uwaga 1: Ten protokół opiera się na pozytywnej selekcji ludzkich limfocytów T CD3+ z migdałków TNC za pomocą kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałem CD3. Możliwe jest rozpoczęcie tej sekcji od świeżych (sekcja 1) lub mrożonych (sekcja 2) MNC.
Uwaga 2: Zacznij od 3 x 107 MNC. Nie przekraczaj tej liczby komórek, ponieważ kolumny separacyjne mogą się zatkać, co zmniejszy skuteczność izolacji. Użyj większych kolumn, jeśli ma być obsługiwanych więcej komórek. Woluminy używane w tym protokole zostały eksperymentalnie zoptymalizowane pod kątem liczby komórek używanych w naszej konfiguracji eksperymentalnej.
<ol>
	<li>Przygotować bufor separacyjny [PBS (pH 7,2), 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM EDTA]. Przefiltrować bufor separacyjny przez filtr 0,45 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Obracać zawiesinę MNC (krok 1.14) przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić powstałe osady komórkowe w 240 μl (80 μl na 107 komórek) lodowatego buforu rozdzielającego. Przenieść zawiesinę komórkową do sterylnej probówki o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Dodać 20 μl przeciwciała magnetycznego CD3 do roztworu komórkowego. Inkubować probówki przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, ciągle delikatnie mieszając, aby utrzymać komórki w zawiesinie.</li>
	<li>Przenieść całą zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml lodowatego buforu rozdzielającego w celu przepłukania komórek.</li>
	<li>Odwirować probówkę o masie 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w odchylanym wirniku.</li>
	<li>W międzyczasie ustaw separator magnetyczny i kolumnę. Przymocuj separator magnetyczny do stojaka i umieść kolumnę w separatorze. Przemyć kolumnę, nakładając 500 μl lodowatego buforu rozdzielającego. Odrzuć przepływ.</li>
	<li>Umieść nową probówkę zbiorczą o pojemności 15 ml pod kolumną. Trzymaj probówkę zbiorczą na lodzie.</li>
	<li>Odrzucić supernatant (krok 3.5) za pomocą pipety i delikatnie zawiesić osad komórek w buforze separacyjnym o pojemności 500 μl. Nałóż zawiesinę komórkową na wstępnie umytą kolumnę i pozwól jej przepłynąć. 
	Uwaga: Grudki komórek mogą zatkać kolumnę, a tym samym zmniejszyć natężenie przepływu. Aby zapobiec temu problemowi, umieść plastikowe sitko o wielkości 40 μm na górze kolumny. Przepuszczenie komórek przez tę siatkę znacznie poprawi skuteczność tej metody.</li>
	<li>Przemyć kolumnę 4 razy 1,5 ml buforu rozdzielającego (500 μl na 107 komórek). Poczekaj, aż zbiornik kolumny będzie pusty (w kolumnie nie należy zaobserwować płynu) przed zastosowaniem następnego kroku mycia. 
	Uwaga: Uzyskać nieznakowane komórki CD3, uważane za frakcję limfocytów B, podczas ich elucji do probówki zbiorczej.</li>
	<li>Wyjąć kolumnę z separatora i umieścić w nowej probówce zbiorczej o pojemności 15 ml. Odpipetować pipetą 2 ml buforu separacyjnego na kolumnę. Za pomocą tłoka dostarczonego z kolumną eluować dodatnio wyselekcjonowane limfocyty T, które są uważane za frakcję limfocytów T.</li>
	<li>W razie potrzeby określić liczbę oczyszczonych komórek (krok 1.15). Zawiesiny komórek są teraz gotowe do dalszych eksperymentów.</li>
</ol>
4. Analiza metodą cytometrii przepływowej izolowanych limfocytów B i T migdałków
UWAGA: Roztwór paraformaldehydu jest drażniący i podejrzewa się, że jest rakotwórczy. Nosić odpowiednią odzież ochronną, rękawice i ochronę oczu/twarzy.
Uwaga 1: Ten protokół opisuje metodę bezpośredniego barwienia izolowanych komórek B i T za pomocą analizy sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Głównym celem tego etapu jest ocena czystości izolowanych populacji komórek po oddzieleniu przeciwciał magnetycznych CD3. W tym celu stosuje się ustalone markery limfocytów B i T, przeciwciała monoklonalne sprzężone z fluoroforem CD20-FITC i CD2-APC. Zdecydowanie zaleca się również włączenie przeciwciał kontrolnych izotypu w celu rozróżnienia niespecyficznego wiązania "tła" przeciwciał CD2 i CD20 (patrz krok 4.8).
Uwaga 2: Możliwe jest przechowywanie oczyszczonych frakcji komórkowych w 1% roztworze paraformaldehydu (PFA) w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu barwienia (np. następnego dnia). Ta sama procedura ma również zastosowanie, jeśli istnieje przerwa czasowa między barwieniem a analizą FACS. Należy pamiętać, że w obu przypadkach komórki należy odpowiednio umyć buforem PBSA (PBS zawierającym 0,2% BSA), przed barwieniem lub analizą FACS.
<ol>
	<li>Pobrać 6 x 106 komórek MNC z kroku 1.15 (przed nałożeniem na kolumnę), frakcję limfocytów B z kroku 3.9 i frakcję limfocytów T z kroku 3.10.</li>
	<li>Wirować zawiesiny komórek w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C za pomocą odchylanego rotora. </li>
	<li>Usunąć sklarowany osad za pomocą pipety i przemyć osad komórkowy raz 1 ml lodowatego PBSA. Wirować zawiesiny komórek w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić komórki w 600 μl lodowatego buforu PBSA.</li>
	<li>Dodać 100 μl zawiesiny komórek na dno probówki FACS.</li>
	<li>Do każdej probówki dodać 100 μl PBS zawierającego 10% inaktywowanej termicznie surowicy ludzkiej, dobrze wymieszać i inkubować przez ~1 min w temperaturze pokojowej lub 20 min na lodzie. 
	Uwaga: Limfocyty B przenoszą receptory Fc. W celu zablokowania receptorów Fc, oczyszczone frakcje komórkowe inkubuje się z 10% inaktywowaną termicznie surowicą ludzką. Surowicę ludzką inaktywuje się termicznie przez inkubację w temperaturze 56 °C przez 1 godzinę. Podziel inaktywowaną termicznie surowicę na małe porcje i przechowuj zamrożone w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w odchylanym wirniku.</li>
	<li>Usunąć sklarowany osad za pomocą pipety i przemyć osad komórkowy 1 ml PBSA. Powtórzyć wirowanie (300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C).</li>
	<li>Dodaj 100 μl PBSA do każdej probówki z lodem. Dodać odpowiednią ilość przeciwciała monoklonalnego sprzężonego z fluoroforem, zgodnie z zaleceniem producenta (np. 20 μl przeciwciał anty-CD20 i/lub 5 μl przeciwciał anty-CD2 w 100 μl PBSA). Uwaga: Nie zapomnij przypisać wystarczającej liczby rurek kontrolnych do analizy FACS. W protokole tym należy uwzględnić następujące kontrole: 1) komórki barwione indywidualnie przeciwciałami anty-CD2 i anty-CD20, 2) komórki barwione indywidualnie przeciwciałami kontrolnymi izotypu anty-CD2 i anty-CD20 oraz 3) komórki bez dodatku przeciwciał.</li>
	<li>Krótko zawirować probówkę i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Umyj 2 razy za pomocą PBSA. Dodać 2 ml 1% roztworu PFA do próbek. Pozostawić komórki w roztworze PFA w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu analizy FACS.</li>
	<li>Bezpośrednio przed umieszczeniem próbek w maszynie FACS należy przemyć komórki 2 razy za pomocą PBSA (300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C). Zawiesić próbki w 1 ml PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C (lub na lodzie), chronić przed światłem, przed rozdzieleniem na cytometrze przepływowym.</li>
	<li>Sortowanie FACS należy przeprowadzić zgodnie z protokołem producenta cytometru przepływowego.</li>
</ol>
5. Wykrywanie metodą PCR DNA adenowirusa w izolowanych limfocytach B i T migdałków
Uwaga 1: Starterami genu heksonu adenowirusa są AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3') i AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3')11. Te startery generują amplikon 139 pz. Gen 18S rRNA gospodarza można wykryć za pomocą starterów tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3') i tp207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3'). Przewidywana wielkość amplikonu to 300 pz.
Uwaga 2: Każda próba PCR obejmuje kontrolę negatywną (destylowany H2O) i pozytywną kontrolę DNA uzyskaną z ludzkiej linii komórek B (BJAB) zakażonej ludzkim adenowirusem typu 512.
<ol>
	<li>Ekstrahować DNA (z co najmniej 1 x 106 komórek, krok 3.11) przy użyciu metody oczyszczania kolumny opartej na membranie krzemionkowej. Ekstrahuj RNA za pomocą roztworu fenolu i izotiocyjanianu guanidyny13.</li>
	<li>Dodać 100 ng DNA z limfocytów B i T do mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1x bufor HF, 0,2 mM mieszaniny trifosforanu deoksynukleotydu (dNTP), 0,25 μM każdego startera i 1 U polimerazy DNA High-Fidelity w całkowitej objętości 20 μl.</li>
	<li>Przeprowadzić amplifikację PCR w następujących warunkach cyklicznych: 30-sekundowa denaturacja w temperaturze 98 °C, a następnie 30 cykli w temperaturze 98 °C przez 10 sekund, 67 °C (sześciokąt) lub 58 °C (18S rRNA) przez 30 sekund i 72 °C przez 30 sekund. Reakcję PCR zakończono końcowym etapem wydłużania trwającym 7 minut w temperaturze 72 °C.</li>
	<li>Oddziel powstałe produkty amplifikacji PCR na 1,5% żelu agarozowym w buforze 1x TBE i zwizualizuj oczekiwane prążki poprzez barwienie kwasem nukleinowym.</li>
</ol>

<ol><li>Nave, H., Gebert, A., Pabst, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+immunology+of+the+human+palatine+tonsil%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Morphology and immunology of the human palatine tonsil.</a> Anat Embryol (Berl). 204, 367-373 (2001).</li>
<li>Perry, M., Whyte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+the+tonsils%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+today%22%5BJournal%5D)">Immunology of the tonsils.</a> Immunology today. 19, 414-421 (1998).</li>
<li>Alkhalaf, M. A., Guiver, M., Cooper, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+quantitation+of+adenovirus+DNA+from+human+tonsil+and+adenoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Prevalence and quantitation of adenovirus DNA from human tonsil and adenoid tissues.</a> J Med Virol. 85, 1947-1954 (2013).</li>
<li>Brandtzaeg, P., Halstensen, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+and+immunopathology+of+tonsils%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Immunology and immunopathology of tonsils.</a> Adv Otorhinolaryngol. 47, 64-75 (1992).</li>
<li>Imai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-carrying+and+-expressing+T-cell+lines+established+from+severe+chronic+active+EBV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus (EBV)-carrying and -expressing T-cell lines established from severe chronic active EBV infection.</a> Blood. 87, 1446-1457 (1996).</li>
<li>Veen, J., Lambriex, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+adenovirus+to+lymphocytes+in+naturally+infected+human+tonsils+and+adenoids%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Relationship of adenovirus to lymphocytes in naturally infected human tonsils and adenoids.</a> Infect Immun. 7, 604-609 (1973).</li>
<li>Friedman, M., Wilson, M., Lin, H. C., Chang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+systematic+review+of+tonsillectomy+and+adenoidectomy+for+treatment+of+pediatric+obstructive+sleep+apnea%2Fhypopnea+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Updated systematic review of tonsillectomy and adenoidectomy for treatment of pediatric obstructive sleep apnea/hypopnea syndrome.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 140, 800-808 (2009).</li>
<li>Garnett, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+species+C+adenoviruses+in+human+tonsil+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Latent species C adenoviruses in human tonsil tissues.</a> J Virol. 83, 2417-2428 (2009).</li>
<li>Garnett, C. T., Erdman, D., Xu, W., Gooding, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+quantitation+of+species+C+adenovirus+DNA+in+human+mucosal+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Prevalence and quantitation of species C adenovirus DNA in human mucosal lymphocytes.</a> J Virol. 76, 10608-10616 (2002).</li>
<li>Perez, M. E., Billordo, L. A., Baz, P., Fainboim, L., Arana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+memory+B+cells+isolated+from+blood+and+tonsils+are+functionally+distinctive%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human memory B cells isolated from blood and tonsils are functionally distinctive.</a> Immunol Cell Biol. 92, 882-887 (2014).</li>
<li>Cooper, R. J., Yeo, A. C., Bailey, A. S., Tullo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+polymerase+chain+reaction+assay+for+rapid+diagnosis+of+conjunctivitis%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Adenovirus polymerase chain reaction assay for rapid diagnosis of conjunctivitis.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 90-95 (1999).</li>
<li>Zhang, Y., Huang, W., Ornelles, D. A., Gooding, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+adenovirus+latency+in+human+lymphocyte+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Modeling adenovirus latency in human lymphocyte cell lines.</a> J Virol. 84, 8799-8810 (2010).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+biochem%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal. biochem. 162, 156-159 (1987).</li>
<li>Watanabe, T., Yoshizaki, K., Yagura, T., Yamamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antibody+formation+by+human+tonsil+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vitro antibody formation by human tonsil lymphocytes.</a> J Immunol. 113, 608-616 (1974).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jednym z najważniejszych czynników wpływających na wynik tego protokołu jest wykorzystanie świeżego materiału migdałkowego jako materiału wyjściowego. Dlatego próbki migdałków należy przetworzyć w ciągu 3 godzin po zabiegu. Migdałki można było uzyskać zarówno od dorosłych, jak i od dzieci. Materiał migdałków u dzieci jest zwykle mniejszy ze względu na częściowe chirurgiczne usunięcie migdałków (tonsiltomia). Dlatego liczba MNC uzyskanych z próbek tonsillotomii (1 x 107-1 x 108) jest mniejsza w porów...

Migdałki to zbiory niekompletnie zamkniętych tkanek limfatycznych, które leżą pod nabłonkiem w górnym przewodzie pokarmowym i stykają się z nim. Zwykle termin "migdałki" odnosi się do migdałków podniebiennych znajdujących się przy bocznych ścianach części ustnej gardła. Sparowane migdałki podniebienne wraz z migdałkiem nosowo-gardłowym (migdałkiem gardłowym), parzystymi migdałkami jajowodowymi i migdałkami językowymi tworzą tzw. "pierścień Waldeyera". Ten ostatni jest odpowiedzialny za początkowy kontakt między wdychanymi lub spożytymi patogenami a tkankami limfatycznymi przewodu pokarmowego1,2. Rzeczywiście, liczne doniesienia wykazały, że zarówno antygeny bakteryjne, jak i wirusowe można wykryć w próbkach tkanki migdałków podniebiennych2-6.
Migdałki podniebienne składają się z gęstej tkanki limfatycznej pokrytej warstwowym, płaskonabłonkowym, nierogowacącym nabłonkiem. Migdałki mają liczne krypty, wgłębienia nabłonkowe, które wnikają w miąższ, zwiększając powierzchnię. Histologicznie migdałki podniebienne zawierają liczne pęcherzyki limfoidalne z centrami rozrodczymi, które są miejscami dojrzewania i różnicowania komórek B (obszary komórek B). Podobnie migdałki podniebienne obejmują limfocyty T, które znajdują się głównie w obszarach pozapęcherzykowych (obszary komórek T). Oprócz limfocytów B i T w migdałkach podniebiennych można wykryć również różne pęcherzykowe komórki dendrytyczne1,2. 
Ze względu na ich anatomiczne położenie, migdałki podniebienne są łatwo dostępne za pomocą zabiegów chirurgicznych. Na przykład chirurgiczne usunięcie migdałków, znane jako wycięcie migdałków, jest rutynowo przeprowadzane na całym świecie7. U dzieci z przerostem migdałków czasami stosuje się częściowe chirurgiczne usunięcie migdałków (tonsillotomia), co powoduje mniejszy ból pooperacyjny u pacjentów. Biorąc pod uwagę nagromadzenie różnych patogenów w migdałkach, migdałki usunięte chirurgicznie dają wyjątkową okazję do zbadania wpływu czynników wirusowych i bakteryjnych na funkcje limfocytów migdałków2,8. Ponadto możliwe jest zbadanie, czy niektóre patogeny wolą przebywać w określonych subpopulacjach komórkowych9. Ponadto, ponieważ migdałki są bogatym źródłem limfocytów B, izolowane limfocyty B migdałków mogą być skutecznie wykorzystywane do badania aktywności różnych subpopulacji komórek B10. Ponieważ jednak migdałki podniebienne zawierają mieszaninę typów komórek, potrzebna jest skuteczna metoda oddzielania różnych subpopulacji komórek. 
Tutaj opisujemy prostą metodę efektywnej i szybkiej izolacji populacji komórek B i T migdałków migdałkowych od ludzkich migdałków podniebiennych za pomocą techniki separacji komórek aktywowanej magnetycznie (Rysunek 1). Opisana tutaj metoda jest przydatna dla naukowców, którzy chcą ocenić rolę różnych czynników zakaźnych w ludzkich narządach limfatycznych, takich jak migdałki podniebienne.

<table><tbody><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175-053</td><td>Zawiera 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 10 mM glutaminy,&nbsp; &nbsp; 0,05 mg/ml gentamycyna i 1% mieszanka antybiotykowo-przeciwgrzybicza</td></tr><tr><td>Pożywka</td><td></td><td></td> zamrażająca <td>90% bufor</td></tr><tr><td></td><td></td> FBS i 10% DMSO<td>MACS</td><td>PBS (pH 7,2), 0,5% BSA i 2mM EDTA</td></tr><tr><td>PBSA&nbsp;</td><td></td><td></td><td>PBS zawierający 0,2% BSA,</td></tr><tr><td>PFA</td><td></td><td></td><td>PBS zawierający 1% paraformaldehydu (PFA). Zrób świeże. PFA jest podejrzewany jako rakotwórczy. Nosić rękawice i okulary.</td></tr><tr><td>Mieszanka antybiotykowo-przeciwgrzybicza</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petridish</td><td>Nunc</td><td>150326</td><td></td></tr><tr><td>Preparowanie</td><td>przednie Fisher Scientific</td><td>1381241</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do prostych tęczówek&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12912055</td><td></td></tr><tr><td>jednorazowe skalpele</td><td>Swann-Morton</td><td>REF 0501</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m plastikowy sitko komórkowe</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Sitka do komórek z tworzywa sztucznego&nbsp;</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa strzykawka 2 ml</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>300185</tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe 15 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>62554502</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe 50 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>62547254</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka wolnoobrotowa z wirnikiem o stałym kącie nachylenia lub wahliwym</td><td>Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll&ndash; Hypaque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5415-50ML</td><td>Roztwór Ficollu</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Branże biologiczne</td><td>040071A Kolumny</td><td></td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenku (DMSO)</td><td>SIGMA</td><td>D2650-5X5ML MACS</td><td></td></tr><tr><td>MS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MACS ludzkie mikrogranulki CD3</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-881</td><td></td></tr><tr><td>Separator MACS (Octo MACS)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Merck Millipore</td><td>1120180100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>AnalaR NORMAPUR</td><td>20302.293</td><td></td></tr><tr><td>CD2 sprzężony z allofikocyjaniną ( CD2-APC)&nbsp;</td><td>BD Nauki Biologiczne&nbsp;</td><td></td><td></td>560642</tr><tr><td>CD20 sprzężony z izotiocyjanianem fluoresceiny (CD20-FITC)&nbsp;</td><td>BD Nauki Biologiczne&nbsp;</td><td></td><td></td>556632</tr><tr><td>Surowica ludzka&nbsp;</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>D119-0100</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>Probówki FACS</td><td>BD Falcon</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>Cryotube</td><td>SARSTEDT</td><td>72379</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRII flowcytometer</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie BD FACSDiva 4.1</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krew nukleospinowa&nbsp;</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740951.50</td><td>Zestaw do izolacji DNA</td></tr><tr><td>TRIzol&nbsp; odczynnik</td><td>Technologie życiowe</td><td>15596</td><td>Odczynnik do izolacji RNA</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>0610030</td><td>licznik komórek</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Barwnik w żelu z kwasem nukleinowym&nbsp;</td></tr></tbody></table>

skuteczny protokół izolacji limfocytów b i t z ludzkich migdałków podniebiennych

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Migdałki stanowią część układu odpornościowego, stanowiąc pierwszą linię obrony przed wziewnymi patogenami. Zwykle termin "migdałki" odnosi się do migdałków podniebiennych znajdujących się przy bocznych ścianach części ustnej gardła. Chirurgicznie usunięte migdałki podniebienne stanowią wygodne, dostępne źródło limfocytów B i T do badania wzajemnych oddziaływań między obcymi patogenami a układem odpornościowym gospodarza. Ten protokół wideo opisuje sekcję i przetwarzanie chirurgicznie usuniętych migdałków podniebiennych człowieka, a następnie izolację poszczególnych populacji komórek B i T z tej samej próbki tkanki. Przedstawiamy metodę, która skutecznie rozdziela limfocyty B i T migdałków za pomocą protokołu powinowactwa zależnego od przeciwciał. Ponadto używamy tej metody, aby wykazać, że ludzki adenowirus infekuje specyficznie frakcję limfocytów T migdałków. Ustalony protokół ma ogólne zastosowanie do skutecznego i szybkiego izolowania populacji komórek B i T migdałków w celu zbadania roli różnych typów patogenów w odpowiedziach immunologicznych migdałków.

Efektywna separacja mononuklearnych komórek z krwi (MNC) z migdałków pozwala na uzyskanie wysoko oczyszczonych subpopulacji limfocytów B i T. Potwierdzono to za pomocą analizy FACS, stosując przeciwciała anty-CD20 oraz anty-CD2 w celu wykrycia odpowiednio populacji limfocytów B i T (Rysunek 3A). Z kolei nieefektywna separacja MNC prowadzi do uzyskania frakcji komórkowych będących mieszaniną komórek z obu subpopulacji limfocytów B i T (Rysunek 3B).
Wyizolowane ...

Migdałki podniebienne są bogatym źródłem limfocytów B i T. Tutaj zapewniamy łatwy, skuteczny i szybki protokół izolacji limfocytów B i T z ludzkich migdałków podniebiennych. Opisana metoda została specjalnie dostosowana do badań nad wirusową etiologią zapalenia migdałków znanego jako zapalenie migdałków.

Skuteczny protokół izolacji limfocytów B i T z ludzkich migdałków podniebiennych

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest otrzymanie frakcji limfocytów B z próbek ludzkich migdałków. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu wirusologii, takie jak rola frakcji limfocytów B w patogenezie chorób wirusowych. W ciągu trzech godzin od chirurgicznego usunięcia należy przetransportować tkankę migdałka do laboratorium w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml wypełnionej lodowatym, sterylnym HBSS z dodatkami.Następnie, stosując odpowiednie procedury bezpieczeństwa biologicznego zalecane przy pracy z tkanką ludzką, należy zwilżyć tkankę świeżym suplementem zawierającym HBSS i przenieść migdałki do 60 mm plastikowej płytki do hodowli komórek umieszczonej na lodzie. Za pomocą pęsety należy usunąć wszelkie widoczne skrzepy krwi oraz tkankę tłuszczową i łączną, a następnie przenieść migdałki do nowej płytki 60 mm zawierającej 5 mL HBSS z suplementami.Następnie pokrój skupisko tkanki migdałka na fragmenty o wielkości od 3 do 10 mm, a następnie za pomocą tłoka plastikowej strzykawki gładkimi ruchami przenieś fragmenty przez plastikowe sito komórkowe o rozmiarze 100 µm, umieszczone w nowej płytce hodowlanej o średnicy 60 mm zawierającej 10 mL świ

efficient-isolation-protocol-for-b-t-lymphocytes-from-human-palatine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja limfocytów przy użyciu zestawu Miltenyi MACs jest niezawodną metodą oczyszczania komórek z homogenatów całych tkanek limfatycznych. Komórki oczyszczone za pomocą systemu Miltenyi charakteryzują się zazwyczaj czystością ≥ 96%. W niniejszym materiale przedstawiamy kroki niezbędne do izolacji komórek T CD4+, wykorzystując jeden z wielu zestawów oferowanych przez firmę Miltenyi.

Izolacja limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem oczyszczania metodą Miltenyi MACS

W niniejszym raporcie opisujemy protokół izolacji wysoko oczyszczonych populacji leukocytów infiltrujących guzy. Protokół ten został opracowany na podstawie metody firmy Miltenyi Biotech w celu zwiększenia wydajności i czystości izolacji komórek z złożonej tkanki nowotworowej.

Izolacja komórek odpornościowych z guzów pierwotnych

W tym filmie pokazujemy izolację limfocytów B z ludzkiej krwi obwodowej za pomocą biotynylowanych przeciwciał specyficznych dla komórek innych niż B oraz mikrokulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną.

Izolacja i oczyszczanie limfocytów B z ludzkiej krwi obwodowej

Z funkcjami efektorowymi odmiennymi od innych podzbiorów limfocytów T, komórki Th17 są centralnie zaangażowane w autoimmunizację zapalną. Ten protokół różnicowania Th17 in vitro zapewnia środki do określenia, czy naiwne limfocyty T CD4 + mogą różnicować się w komórki Th17 i dalszego badania ich roli w autoimmunizacji i odpowiedzi gospodarza.

Izolacja i różnicowanie Th17 naiwnych limfocytów T CD4

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania komórek prezentujących antygen z ludzkiej grasicy poprzez różne etapy enzymatycznego trawienia tkanki, następnie gęstości odwirowania zawiesiny pojedynczej komórki i na końcu magnetycznego i/lub FACS sortowania interesujących populacji komórek.

Izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy

Tutaj zapewniamy zoptymalizowany protokół izolacji i klonowania rzadkiej jednostki limfocytów T obwodowych komórek T Vδ1+CD4+, która jest, jak wykazaliśmy ostatnio, pozatymicznym progenitorem limfocytów T αβ. Technika ta pozwala na ilościowe wyizolowanie, sklonowanie i efektywną ekspansję tych komórek w hodowli ex vivo.

Izolacja i hodowla ex vivo limfocytów T Vδ1+CD4+γδ, pozatymicznego progenitora komórek αβT

Ludzka krew obwodowa jest powszechnie używana do oceny humoralnej odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisano metody izolowania ludzkich limfocytów B z krwi obwodowej, różnicowania ludzkich komórek B w limfocyty B wydzielające przeciwciała (Ab) (ASC) w hodowli oraz liczenia całkowitych IgM- i IgG-ASC za pomocą testu ELISpot.

Izolacja, różnicowanie i kwantyfikacja ludzkich limfocytów B wydzielających przeciwciała z krwi: ELISpot jako funkcjonalny odczyt odporności humoralnej

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji limfocytów z miejsc indukcyjnych, w tym tkanki limfatycznej związanej z jelitami, plam Peyera i drenujących węzłów chłonnych krezkowych, oraz miejsc efektorowych, w tym blaszki właściwej i nabłonka jelitowego układu odpornościowego jelita cienkiego.

Izolowanie limfocytów od układu odpornościowego myszy w jelicie cienkim

W tym badaniu prezentujemy nowatorski i skuteczny protokół izolacji limfocytów z plastrów Peyera (PPs), który może być następnie wykorzystany do testów funkcjonalnych in vivo i in vitro, a także do badań cytometrycznych komórek T pomocniczych pęcherzyków i komórek B centrum rozrodczego.

Odkrywanie kluczowych graczy odporności humoralnej: zaawansowany i zoptymalizowany protokół izolacji limfocytów z plastrów mysich Peyera

W obecnym protokole wyjaśniamy, jak łatwo przetwarzać i hodować jednojądrzaste komórki migdałków od zdrowych ludzi poddawanych częściowej chirurgicznej operacji wycięcia migdałków, aby badać wrodzone reakcje immunologiczne po aktywacji, naśladując infekcję wirusową w tkankach błony śluzowej.

Izolacja jednojądrzastych komórek migdałków w celu zbadania ex vivo wrodzonych odpowiedzi immunologicznych w tkance limfatycznej błony śluzowej człowieka

Poznaj szybką metodę izolacji limfocytów B i T z ludzkich migdałków podniebiennych. Protokół umożliwia badania nad wirusowymi przyczynami zapalenia migdałków w ciągu trzech godzin od zabiegu.

Skuteczny protokół izolacji limfocytów B i T z ludzkich migdałków podniebiennych

Przeglądaj więcej filmów