Wytwarzanie i hodowla komórek śródbłonka przerostu krwi z ludzkiej krwi obwodowej

Ogólnym celem tego protokołu jest niezawodne generowanie komórek śródbłonka wyrastających z krwi z ludzkiej krwi obwodowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii naczyniowej, takie jak to, w jaki sposób dysfunkcja komórek śródbłonka przyczynia się do chorób sercowo-naczyniowych, w tym tętniczego nadciśnienia płucnego lub choroby von Willebranda. Główną zaletą tej techniki jest to, że konsekwentnie generuje stabilną populację komórek śródbłonka wyrostka krwi z niewielkiej objętości dorosłej krwi obwodowej. Procedurę zademonstruje Christopher Wang, doktorant z mojego laboratorium i profesor laboratoryjny Nicholas Morrell.

Aby rozpocząć tę procedurę. Dla każdego dawcy dodaj trzy mililitry cytrynianu sodu do każdej z dwóch 50-mililitrowych stożkowych probówek wirówkowych. Następnie dodaj 30 mililitrów zebranej krwi do każdej probówki.

Delikatnie odwróć probówki dwa do trzech razy w celu wymieszania. Następnie rozcieńczyć 60 mililitrów krwi za pomocą DPBS w stosunku jeden do jednego, przechylić probówkę zawierającą gradient gęstości. Odwirowywanie pożywki pod kątem 20 stopni z powierzchnią roboczą za pomocą pipety i pipety serologicznej o pojemności 25 mililitrów.

Powoli nałóż 21 mililitrów rozcieńczonej krwi na wierzch pożywki. Następnie odwirować próbki w temperaturze 400 razy G przez 35 minut w temperaturze pokojowej za pomocą akceleratora i oddzielić Podczas wirowania napraw roztwór kolagenu o stężeniu 50 mikrogramów na mililitr przez rozcieńczenie bulionu. Kolagen typu pierwszego w 10 mililitrach sterylnego kwasu octowego o grubości 0,02 mola.

Przefiltruj zawiesinę kolagenu przed użyciem. Następnie dodaj 7,5 mililitra roztworu kolagenu do kolby do hodowli komórek T 75. Pozostawić kolbę do pokrycia przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Po godzinie powlekania odessać roztwór kolagenu i odpipetować 10 mililitrów DPBS do kolby, aby zmyć resztki kwasu octowego. Odessać DPBS i powtórzyć pranie jeszcze raz. Następnie dodaj pięć mililitrów pożywki wytwarzającej BOEC do kolby, aby zapobiec wysychaniu powłoki kolagenowej do momentu, gdy zawiesina komórkowa będzie gotowa do posiewu.

Po odwirowaniu w gradimencie gęstości ostrożnie zebrać warstwę kożucha za pomocą sterylnej plastikowej pipety transferowej i unikać przenoszenia pożywki o gradiencie gęstości. Kolekcja kożucha powinna dać około 20 mililitrów zawiesiny celu i osocza z każdej probówki. Następnie rozcieńczyć zawiesinę komórek jednojądrzastych w DPBS w stosunku jeden do jednego i odwrócić w celu wymieszania, a następnie odwirować w temperaturze pokojowej przez 20 minut przy 300 razy G z hamulcem i akceleratorem ustawionymi na maksimum po odwirowaniu, zassać supernatant i ponownie zawiesić komórki, dodając jeden mililitr pożywki wytwarzającej BOEC do każdej osadki i wielokrotnie pipetując w górę iw dół, zebrać wszystkie zawiesiny komórek razem i uzupełnić całkowita objętość do 10 mililitrów z pozostałym podłożem.

Aby uzyskać oszacowanie całkowitej liczby komórek, rozcieńczyć 10 mikrolitrów zawiesiny komórek 490 mikrolitrami roztworu Turka, aby sprowadzić czerwone krwinki. Następnie policz 10 mikrolitrów próbki rozcieńczonej zawiesiny komórek za pomocą hemocytometru. Następnie umieść zawiesinę komórkową w pojedynczej kolbie T 75 pokrytej kolagenem.

Uzupełnij objętość podłoża do 15 mililitrów na kolbę i kulturę. Ogniwa w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2. Teraz zmieniaj pożywkę co dwa dni, dodając 15 mililitrów świeżej generacji BOEC, pożywkę do kultury na weekendy, zmiany pożywki można opóźnić do co trzy dni.

Monitorować kolbę hodowlaną BOEC w dniach od 7 do 14 pod kątem pojawienia się kolonii odrostowych. Zidentyfikuj kolonie jako okrągłe grupy komórek wykazujące klasyczną morfologię śródbłonka bruku. Po zidentyfikowaniu kolonii lub wielu kolonii w kolbie, kontynuuj zmiany pożywki i pozwól koloniom urosnąć do około 1000 do 2000 komórek na kolonię.

Przed zapakowaniem określ liczbę komórek w kolonii za pomocą przybliżonego oszacowania wizualnego. Następnie przepuścić komórki, przepłukując kolby dwukrotnie 10 mililitrami DPBS. Dodaj pięć mililitrów jednego x tripsin EDTA i inkubuj w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Po pięciu minutach zneutralizować trypsynę 10 mililitrami pożywki zawierającej FBS i doprowadzić komórki do zawiesiny za pomocą wielokrotnego pipetowania. Następnie odwirować zawiesinę o stężeniu 300 razy G przez pięć minut. Ponownie zawiesić komórki w 15 mililitrach świeżej pożywki BOEC i umieścić całą zawiesinę komórkową w nowej kolbie T 75 bez powłoki kolagenowej. Kontynuować.

Pożywka zmienia się, aż komórki zlewają się i pasują. Ogniwa zgodnie z wcześniejszym opisem dla kontynuowanej płyty opakowaniowej. Nie mniej niż 750 000 komórek na kolbę T 75, ponieważ niska gęstość komórek może spowodować zatrzymanie proliferacji BO eecs.

W tej procedurze trypsyna obserwuje komórki i odwirowuje je w temperaturze 300 razy G przez pięć minut. Następnie odessać snat i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach pożywki. Pobrać 10 mikrolitrów próbki zawiesiny komórek i przeprowadzić ręczne liczenie komórek.

Następnie ponownie odwiruj próbkę i ponownie zawieś ją w lodowatym podłożu do kriopkonserwacji w ilości dwa razy od 10 do sześciu komórek na mililitr. Dodać 0,5 mililitra zawiesiny komórkowej do każdej fiolki i umieścić fiolki w lodowatym naczyniu do kriokonserwacji izopropanolowej. Następnie umieść naczynie w zamrażarce o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza na co najmniej dwie godziny przed przeniesieniem do ciekłego azotu.

Aby rozmrozić komórki, dodaj 10 mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki do 15-mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej. Usuń komórki z ciekłego azotu i rozmroź w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie mieszając, aż w fiolce pozostanie tylko mały kryształek lodu. Następnie dodać zawartość fiolki kroplami do stożkowej probówki wirówkowej i wirować w dół przez pięć minut z prędkością 300 razy G.

Następnie odessać supernatant i zawiesić osad komórkowy. Dodać zawiesinę komórek do kolby T 75 i uzupełnić podłoże do 15 mililitrów. Na tym obrazie kolonie wyrostkowe, które pojawiają się jako zbiory komórek podobnych do śródbłonka, są ułożone w monowarstwę brukową i proliferują promieniście z centralnego punktu otaczającego kolonie wyrostka są przylegającymi komórkami monocytowymi, które stanowią zdecydowaną większość komórek we wczesnych kulturach Po zapakowaniu wysoce proliferacyjne bo Oecs przejmują kulturę, gdy nieproliferacyjne komórki monocytowe albo obumierają, albo nie łączą się ponownie.

Oto reprezentatywny obraz immunofluorescencyjny immunologii Bo Oecs wybarwiony przeciwciałem przeciwko markerowi powierzchni komórek śródbłonka CD 1 44. Na tym obrazie B oecs były immunologiczne wybarwienia przeciwciałem przeciwko glikoproteinie krwi von Willebranda. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż dwie godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o jak najszybszym pobraniu próbek krwi, a najlepiej w ciągu dwóch godzin od pobrania. Po tej procedurze komórki mogą być wykorzystywane do badania funkcji komórek śródbłonka w zdrowiu i chorobie lub przeprogramowane w indukowane flury silne komórki macierzyste do wykorzystania w badaniach różnicowania, modelowaniu choroby lub terapii komórkowej po jej opracowaniu. Technika ta utorowała nam drogę do zbadania wpływu mutacji w receptorze białka morfogenetycznego kości typu drugiego na patogenezę tętniczego nadciśnienia płucnego zarówno w komórkach śródbłonka wyrostu krwi pacjenta, jak i w komórkach mięśniowych nastroju pochodzących z IPSC.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować i charakteryzować stabilne komórki śródbłonka wyrastające z krwi z niewielkiej objętości krwi obwodowej. Nie zapominaj, że praca z nieprzebadaną ludzką krwią może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić środki ochrony osobistej, w tym rękawice i fartuch laboratoryjny.