Nowe podejście, które eliminuje postępowanie w celu badania agresji i efektu "przegranego" u Drosophila melanogaster
30 grudnia 2015
Podczas walk muszek owocowych, obserwowane wzorce zachowań, dynamika walki oraz związane z nią uczenie się i pamięć są pod wpływem warunków eksperymentalnych. Przedstawiony tutaj protokół opisuje nowatorską procedurę, która całkowicie eliminuje obchodzenie się z muchami podczas eksperymentów. Poprawia to dynamikę walki i pozwala na tworzenie silnych efektów "przegranych".
Ogólnym celem tej metody jest wprowadzenie mechanizmu powstawania efektów przegranego i zwycięzcy u Drosophila melanogaster poprzez wyeliminowanie manipulacji muchami z procedury behawioralnej. Większość badań nad zachowaniem zwierząt prowadzonych w warunkach laboratoryjnych wiąże się z bezpośrednim manipulowaniem osobnikami. Z kolei manipulowanie zwierzętami zazwyczaj wywołuje u nich stres, który może zakłócać prowadzone badania behawioralne, dlatego dąży się do wyeliminowania tego stresogennego elementu.
Opracowaliśmy nową komorę do badań nad agresją u muszek owocówek, która całkowicie eliminuje konieczność manipulowania zwierzętami przed, w trakcie lub po eksperymentach. Dzięki zastosowaniu tych nowych komór wszystkie mierzone przez nas parametry behawioralne uległy poprawie. Stosując tę metodę, minimalizujemy zmienność behawioralną między osobnikami.
Skracamy czas niezbędny do wygenerowania wyraźnych relacji dominacji, co pozwoliło nam wywołać silne postawy przegranego i zwycięzcy. Komory te są łatwe w użyciu i mogą służyć do wielu celów w badaniu różnych zachowań muszek owocówek. Aby rozpocząć eksperyment, należy hodować i utrzymywać populacje muszek w inkubatorze z 12-godzinnym cyklem światła i ciemności, w temperaturze 25 °C i wilgotności względnej 50%.
Następnie przygotuj fiolki do izolacji, podgrzewając świeżą pożywkę dla muszek do momentu jej stopienia. Za pomocą pipety Pasteura przenieś około 1,5 milliliters roztopionej pożywki do pojedynczych, pustych szklanych probówek i pozwól pożywce zastygnąć, wyrównując ją cienkim pędzlem. Delikatnie usuń samca w późnym stadium poczwarki z fiolki zapasowej i umieść go na ściance probówki zawierającej świeżo przygotowaną pożywkę.
Zamknij fiolki do izolacji watą i umieść je w inkubatorze. Po izolacji muchy są gotowe do znakowania. Znieczul muchę dwutlenkiem węgla, a następnie użyj cienkiego wykałaczki.
Nanieś niewielką kropkę farby akrylowej na tułów, unikając malowania głowy, skrzydeł, odwłoka lub odnóży. Pozostaw farbę do wyschnięcia na około 10 s, a następnie delikatnie przenieś muchy z powrotem do oryginalnych probówek izolacyjnych. Umieść probówki izolacyjne z powrotem w inkubatorze.
Kontynuuj przygotowanie aparatury, podgrzewając świeżą pożywkę dla muszek, aż do jej roztopienia. Użyj pipety Pasteura, aby przenieść 0,8 milliliters pożywki do zakrętki fiolki z gwintem i poczekaj, aż pożywka ostygnie. Po ostygnięciu pożywki.
Nanieś małą kroplę świeżej pasty drożdżowej na środek powierzchni naczynia z pożywką. Przed każdym użyciem umyj aparat oraz poszczególne komory walki wodą, a następnie osusz je ręcznikiem papierowym. Następnie nanieś kroplę masy mocującej na naczynie z pożywką i umieść je w centrum każdej komory walki.
Przykryj komory walki pokrywą aparatu. Umieść przykryty aparat pod źródłem światła i zainstaluj kamerę wideo nad konstrukcją. Rozpocznij eksperymenty behawioralne, wkładając plastikowe przegrody do każdej komory walki.
Wyjmij bawełniany korek z probówki izolacyjnej i umieść probówkę pod otworami znajdującymi się po bokach aparatury. Pozwól musze przedostać się do komory walki za pomocą ujemnego gradientu osiowego. Następnie zamknij przesuwną ściankę. Po wprowadzeniu pierwszej muchy do komory, powtórz tę procedurę, aby wprowadzić drugą muchę do komory walki z drugiej strony aparatury.
Następnie umieść aparat z powrotem w oświetlonej pozycji do nagrywania wideo. Rozpocznij nagrywanie i usuń plastikową przegrodę, aby umożliwić muchom interakcję na potrzeby eksperymentów nad efektem przegranego. Nagrywaj pierwsze walki przez 20 minut, aby zapewnić uformowanie się silnych relacji dominacji.
Po 20 minutach ostrożnie włóż plastikową przegrodę z powrotem do komór walki, aby rozdzielić muchy, a następnie zatrzymaj nagrywanie wideo. Aby wywołać silne poczucie przegranej, należy upewnić się, że muchy ustanowią i utrzymają relację dominacji podczas pierwszej walki, a następnie zminimalizować stres zwierząt podczas wkładania przegród w celu ich rozdzielenia. Po 10-minutowym okresie odpoczynku rozpocznij nagrywanie i ostrożnie usuń plastikową przegrodę.
Pozostaw muchy do interakcji na kolejne 20 minut. Po 20 minutach zatrzymaj nagrywanie, aby zakończyć eksperyment. Usuń muchy z komór behawioralnych wzdłuż ujemnej osi geo, odwracając procedurę opisaną przed zastosowaniem nowej metody obserwacji pierwszych walk.
Średnio pierwsze spotkanie obserwuje się po dwóch minutach. Pierwszy wypad następuje po czterech minutach, a muchy ustanawiają relację dominacji po ośmiu minutach. Przez pozostałe 12 minut relacja dominacji jest utrwalana.
W miarę jak zwycięzcy coraz częściej wykonują wypad w stronę przeciwnika, a przegrani coraz bardziej się cofają. Nowe podejście zostało wykorzystane do ilościowego określenia efektu przegranego, czyli procentu osobników, które przegrywają drugą walkę podczas starć w drugiej rundzie. Istotny efekt zaobserwowano w sytuacjach, gdy poprzedni przegrani zostali sparowani w drugiej walce ze znanymi zwycięzcami lub ze zwycięzcami, których wcześniej nie znali.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby test agresji przeprowadzać na samcach much w wieku od sześciu do siedmiu dni, które były hodowane w izolacji społecznej. Po opanowaniu techniki komory te umożliwiają łatwe wprowadzanie, monitorowanie, interakcje i separację much bez konieczności ich bezpośredniego dotykania, co wywołuje silny efekt przegranego. Zastosowanie przegród do oddzielenia much po pierwszej walce pozwala na wprowadzenie modyfikacji w protokole eksperymentalnym.
Możemy zachować zwycięzców i sparować ich z innymi przeciwnikami w drugiej walce, aby wywołać efekt zwycięzcy. Po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji te same komory mogą zostać wykorzystane do badania zalotów, lokomocji i innych zachowań społecznych muszki owocówki. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat przeprowadzania testów agresji oraz sposobu wywoływania efektu przegranego bez manipulacji muchami przed i w trakcie eksperymentów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie wprowadza nowatorską metodę badania agresji u muszek owocowych poprzez wyeliminowanie konieczności manipulowania osobnikami, co redukuje stres i poprawia wyniki behawioralne. Nowa konstrukcja komory zwiększa niezawodność pomiaru efektów zwycięzcy i przegranego u Drosophila melanogaster.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia behawioralna
- Zachowanie zwierząt
Wstęp
- Manipulacja zwierzętami może wywoływać stres, co wpływa na badania behawioralne.
- Tradycyjne metody często wiążą się z manipulacją, co prowadzi do zmienności wyników.
- Zrozumienie agresji u Drosophila może dostarczyć wglądu w dynamikę behawioralną.
- Wyeliminowanie manipulacji może prowadzić do dokładniejszych ocen behawioralnych.
Cel badania
- Opracowanie metody minimalizującej stres u muszek owocowych podczas badań nad agresją.
- Zbadanie wpływu manipulacji zwierzętami na wyniki behawioralne.
- Zwiększenie wiarygodności pomiarów zachowań związanych z agresją.
Zastosowane metody
- Opracowanie nowej komory do badań nad agresją.
- Eliminacja manipulacji przed, w trakcie i po przeprowadzeniu eksperymentów.
- Pomiar różnych parametrów behawioralnych u Drosophila.
- Porównanie wyników z tradycyjnymi metodami manipulacji.
Główne wyniki
- Parametry behawioralne uległy poprawie przy zastosowaniu nowej metody.
- Zaobserwowano zmniejszoną zmienność osobniczą.
- W przypadku braku manipulacji odnotowano silniejsze efekty przegranej.
- Ogólna dynamika walk została usprawniona.
Wnioski
- Nowa konstrukcja komory skutecznie redukuje stres u muszek owocówek.
- Wyeliminowanie manipulacji prowadzi do uzyskania bardziej wiarygodnych danych behawioralnych.
- Metodę tę można zastosować w dalszych badaniach nad zachowaniem zwierząt.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta rozwiązuje kluczowy problem w neuronauce behawioralnej: minimalizację błędów eksperymentalnych wprowadzanych przez manipulacje z udziałem zwierząt. Poprzez wyeliminowanie ręcznej interwencji, podejście to zwiększa wiarygodność danych w badaniach nad zależnymi od doświadczenia zmianami behawioralnymi, takimi jak efekt przegranego i zwycięzcy. Wspiera to dokładniejszą walidację celów w procesach odkrywania neurobehawioralnego, w których odczyty behawioralne stanowią podstawę do stawiania hipotez mechanistycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie wpływów genetycznych i środowiskowych na szlaki związane z agresją bez zakłóceń wynikających ze stresu wywołanego manipulacjami.
- Wartość operacyjna: Redukuje zmienność behawioralną między osobnikami, zwiększając czułość testu w wykrywaniu subtelnych zmian fenotypowych.
- Wartość prognostyczna: Wspomaga ograniczanie ryzyka w badaniach nad celami terapeutycznymi zaangażowanymi w uczenie się, pamięć i zachowania społeczne poprzez zapewnienie bardziej precyzyjnych odczytów behawioralnych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia zstandaryzowaną, powtarzalną platformę do ilościowego określania dynamiki agresji i tworzenia się hierarchii społecznej.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przepływy pracy kompatybilne z wysoką przepustowością dzięki zautomatyzowanemu wprowadzaniu much poprzez geotaksję oraz separacji komór za pomocą suwaków.
- Gotowość do analizy: Generuje dane ilościowe, takie jak czas utajenia walki, częstotliwość wypadów i czas trwania relacji dominacji, do zastosowań w badaniach przesiewowych związków chemicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie translacyjne: Umożliwia badanie związanych z doświadczeniem zmian behawioralnych, które modelują aspekty zaburzeń psychiatrycznych powiązanych z przegraną społeczną i reaktywnością na stres.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Pozwala na wyizolowanie specyficznych obwodów neuronalnych lub szlaków molekularnych przyczyniających się do powstania efektu przegranego bez zakłóceń wywołanych manipulacją zwierzętami.
- Ciągłość przedkliniczna: Wspiera podłużne śledzenie behawioralne w wielu rundach walki w celu oceny adaptacyjnej lub maladaptacyjnej plastyczności behawioralnej.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy procesów odkrywczych, w których fenotypy behawioralne służą do walidacji celów wpływających na funkcjonowanie obwodów neuronalnych i regulację behawioralną. Umożliwia ona spójne fenotypowanie przed przejściem do badań nad mechanizmami lub interwencjami terapeutycznymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących genów lub leków wpływających na agresję, pamięć społeczną i szlaki odpowiedzi stresowej.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wskaźników behawioralnych, niezbędnych do porównywania warunków genetycznych lub farmakologicznych.
- Analityka: Umożliwia pomiar czasowych parametrów behawioralnych (np. momentu rozpoczęcia walki, częstotliwości wypadów, ustalenia dominacji) w celu określenia korelacji dawka-odpowiedź lub genotyp-fenotyp.
- Badania translacyjne: Łączy z modelami przedklinicznymi poprzez rejestrację etologicznie istotnych zachowań społecznych, które odzwierciedlają zachowane mechanizmy stresu i uczenia się.
- Zastosowania rozszerzone: Konstrukcja komory jest dostosowywalna do innych zachowań społecznych Drosophila, co zwiększa jej użyteczność w wielu programach badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w testach behawioralnych poprzez wyeliminowanie manipulacji zwierzętami jako zmiennej zakłócającej.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność dzięki standaryzowanym przepływom pracy bez konieczności bezpośredniego kontaktu z obiektami.
- Wartość strategiczna: Wspomaga podejmowanie decyzji go/no-go w walidacji celów terapeutycznych poprzez redukcję wyników fałszywie dodatnich wynikających z szumu behawioralnego indukowanego stresem.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia dokładniejszą priorytetyzację celów w oparciu o wiarygodne fenotypy behawioralne w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w hodowli Drosophila, obserwacjach behawioralnych oraz fenotypowaniu opartym na analizie wideo.
- Zależne od dostępu do systemów śledzenia behawioralnego oraz kontroli parametrów środowiskowych (cykle światło/ciemność, temperatura, wilgotność).
- Wymaga standaryzacji między laboratoriami w zakresie konfiguracji komory, izolacji much oraz czasu trwania epok behawioralnych.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać modyfikacji mechanizmów wejścia opartych na geotaksji.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wymiary komory oraz zależność od ruchliwości much w kontekście samodzielnego wchodzenia do aren.
