Nowe podejście, które eliminuje postępowanie w celu badania agresji i efektu "przegranego" u Drosophila melanogaster

Podczas walk muszek owocowych, obserwowane wzorce zachowań, dynamika walki oraz związane z nią uczenie się i pamięć są pod wpływem warunków eksperymentalnych. Przedstawiony tutaj protokół opisuje nowatorską procedurę, która całkowicie eliminuje obchodzenie się z muchami podczas eksperymentów. Poprawia to dynamikę walki i pozwala na tworzenie silnych efektów "przegranych".

Ogólnym celem tej metody jest wprowadzenie powstawania efektów przegranego i zwycięzcy u Drosophila, melaniny, gaster poprzez wyeliminowanie obchodzenia się z muchami z procedury behawioralnej. Większość badań behawioralnych na zwierzętach, które są przeprowadzane w warunkach laboratoryjnych, dotyczyła obchodzenia się ze zwierzętami. Z kolei obchodzenie się ze zwierzętami zwykle wywołuje u nich stres, a stres może zakłócać badania behawioralne, które próbujesz przeprowadzić, aby wyeliminować stresujące obchodzenie się ze zwierzętami.

Opracowaliśmy nową komorę do naszych badań agresji u muszek owocowych, która całkowicie eliminuje obchodzenie się ze zwierzętami przed, w trakcie lub po eksperymentach. Korzystając z tych nowych komór, wszystkie zmierzone przez nas parametry behawioralne okazały się lepsze. Stosując tę metodę, minimalizujemy żywotność behawioralną wśród jednostek.

Skróciliśmy czas potrzebny do wygenerowania wyraźnej relacji dominacji i byliśmy w stanie wywołać silną mentalność przegranego i zwycięzcy. Komory te są łatwe w użyciu i mogą być wielofunkcyjne do badania różnych zachowań muszek owocowych. Aby rozpocząć eksperyment, należy hodować i utrzymywać stada much w 12-godzinnym inkubatorze o jasnym i ciemnym cyklu, w temperaturze 25 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 50%.

Następnie przygotuj fiolki izolacyjne, podgrzewając świeży pokarm dla much, aż się rozpuści. Za pomocą pipety do pasti przenieś około 1,5 mililitra stopionego pokarmu muchowego do pojedynczych pustych szklanych probówek i pozwól żywności zestalić się drobnym pędzlem. Delikatnie wyjąć poczwarkę samca w późnym stadium rozwoju z fiolki podstawowej i umieścić ją na boku probówki zawierającej świeżo przygotowany pokarm.

Zamknąć fiolki izolacyjne bawełnianą fiolką do izolacji przechowywać w inkubatorze. Po izolacji muchy są gotowe do malowania. Znieczulij muchę dwutlenkiem węgla, a następnie drobną wykałaczką.

Umieść małą kropkę farby akrylowej na klatce piersiowej i unikaj malowania głowy, skrzydeł, brzucha lub nóg. Pozostaw farbę do wyschnięcia na około 10 sekund i delikatnie przenieś muchy z powrotem do ich oryginalnych fiolek izolacyjnych. Umieścić fiolki izolacyjne z powrotem w inkubatorze.

Kontynuuj przygotowanie aparatury, podgrzewając świeży pokarm dla much, aż się rozpuści. Za pomocą tylnej pipety przenieś 0,8 mililitra żywności do pokrywki fiolki z zakrętką i pozwól żywności ostygnąć. Gdy jedzenie ostygnie.

Nałóż niewielką kroplę świeżej pasty drożdżowej na środek powierzchni kubka z jedzeniem. Przed każdym użyciem umyj aparat i poszczególne komory bojowe wodą i osusz je ręcznikiem papierowym. Następnie nałóż kroplę szpachli na kubek z jedzeniem i umieść go na środku każdej komory bojowej.

Przykryj komory bojowe pokrywą aparatu. Umieść zakryte urządzenie pod źródłem światła i zainstaluj kamerę wideo nad konstrukcją. Rozpocznij eksperymenty behawioralne od włożenia plastikowych przegród do każdej komory bojowej.

Wyjmij bawełnianą zatyczkę z rurki izolacyjnej i umieść rurkę pod otwartym otworem z boku urządzenia. Pozwól muchy wejść do komory bojowej przez ujemną oś geograficzną. Następnie zamknij ścianę przesuwną Po wejściu muchy do komory powtórz procedurę, aby wprowadzić drugą muchę do komory bojowej po drugiej stronie aparatu.

Następnie umieść urządzenie z powrotem w oświetlonej pozycji nagrywania wideo. Rozpocznij nagrywanie wideo i usuń plastikową przegrodę, aby umożliwić muchom interakcję w eksperymentach z efektem przegranej. Nagrywaj pierwsze walki przez 20 minut, aby zapewnić tworzenie silnych relacji dominacji.

Po 20 minutach delikatnie włóż plastikową przegrodę do komór bojowych, aby oddzielić muchy i zatrzymać wideo. Tak więc, aby wywołać silną mentalność przegranego, upewnij się, że muchy nawiążą i utrzymają relację dominacji podczas pierwszej walki, a następnie zminimalizuj przeszkadzanie zwierzęcia podczas wkładania przegród w celu oddzielenia much. Po 10 minutach odpoczynku rozpocznij nagrywanie i delikatnie wyjmij plastikową przegrodę.

Pozostaw muchy do interakcji przez dodatkowe 20 minut. Zatrzymaj nagrywanie po 20 minutach, aby zakończyć eksperyment. Usuń muchy z komór behawioralnych za pomocą ujemnej osi geograficznej, odwracając procedurę opisaną przed zastosowaniem nowej metody do obserwacji pierwszych walk.

Średnio pierwsze spotkanie obserwuje się po dwóch minutach. Pierwszy wypad następuje po czterech minutach, a muchy nawiązują relację dominacji po ośmiu minutach. W ciągu pozostałych 12 minut relacja dominacji zostaje wzmocniona.

W miarę jak zwycięzcy rzucają się coraz bardziej, a przegrani coraz bardziej się wycofują. Nowe podejście wykorzystano do ilościowego określenia efektu przegranego, czyli odsetka przegranych, którzy przegrywają drugie walki podczas drugich walk. Znaczący efekt obserwuje się, gdy poprzedni przegrani zostali sparowani ze znanymi zwycięzcami lub z nieznanymi zwycięzcami w swoich drugich walkach.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wykonaniu próby agresji przy użyciu sześcio- lub siedmiodniowych samców much, które dorastały w izolacji społecznej. Tak więc, po opanowaniu, komory te pozwalają na łatwe wprowadzanie, monitorowanie, interakcje i oddzielanie much bez żadnej obsługi, a to indukuje silny efekt przegranego. Użycie separatorów do oddzielenia much po pierwszej walce pozwala na zmianę w protokole eksperymentalnym.

Możemy zatrzymać zwycięzców i sparować ich z innym przeciwnikiem w drugiej walce, aby wywołać efekt zwycięzcy Przy niewielkich korektach te same komory mogą być używane do badania zalotów, lokomocji i innych zachowań społecznych muszki owocowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać testy agresji i jak wywołać luźniejszy efekt bez manipulowania muchami przed i w trakcie eksperymentów.