Name: Kontrola aflatoksyn w orzeszkach ziemnych za pośrednictwem RNAi: metoda analizy produkcji mikotoksyn i ekspresji transgenów w patosystemie orzeszków ziemnych/aspergillus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Poznaj metodę analizy aflatoksyn w transgenicznych orzeszkach ziemnych z wykorzystaniem RNAi przeciwko Aspergillus flavus. Technika ta umożliwia skuteczną kontrolę mikotoksyn przy użyciu minimalnej liczby nasion.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca otrzymała wsparcie finansowe od projektu USDA-ARS CRIS 6604-21000-004-00D, projektu CRIS 6604-42000-008-00D oraz umowy programu USAID Feed-the-Future numer 58-0210-3-012. Dziękujemy Valerie Orner, LaTanyi Johnson, Josephowi Powellowi i Kathy Gray za ich pomoc techniczną. Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tym artykule służy wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznacza rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa USA.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia ani nie mają żadnych konfliktów interesów.

Wykazano wyciszanie genów w patogenach grzybowych za pośrednictwem RNAi gospodarza roślinnego 27,43, jednak nie ma publikacji wskazujących na wykonalność kontroli akumulacji mikotoksyn w roślinach za pośrednictwem RNAi. Jednym z czynników ograniczających te badania na orzeszkach ziemnych był brak metody oceny fenotypu akumulacji aflatoksyn w poszczególnych roślinach, ponieważ liście nie wykazują żadnych objawów po infekcji grzybiczej podziemnych strąków. Ponadto akumulacja aflatoksyn o innym rozkładzie nienormalnie oraz potrzeba pobierania dużych próbek do analizy chemicznej 15,16 utrudniły ilościowe określenie potencjalnego wpływu RNAi na pojedynczą roślinę. Przedstawiona tutaj metoda składa się z 72-godzinnych eksperymentów z wykorzystaniem pięciu nasion w celu wykonania trzech potrójnych próbek w odstępach 24-godzinnych (Tabela 1, Rysunek 7). W porównaniu z typową analizą aflatoksyny, która wymaga nie mniej niż 100 g nasion, nasza metoda jest szczególnie odpowiednia dla indywidualnych zdarzeń transgenicznych roślin orzeszków ziemnych, które początkowo wytwarzają nie więcej niż dwa lub trzy strąki.
Wyciszanie syntezy aflatoksyn za pośrednictwem RNA wykazano poprzez genetyczną transformację Aspergillus flavus i A. parasiticus. Ponieważ aflR jest głównym regulatorem produkcji aflatoksyn u A. flavus i A. parasiticus44,45, staje się interesującym celem wyciszania za pośrednictwem RNA w roślinach. Jednak genetyczne różnice w aflR wykazano wśród gatunków Aspergillus 46, a te warianty genetyczne mogą uniknąć wyciszenia, jeśli nie ma idealnej sekwencji pasującej do sygnału RNAi wytwarzanego w gospodarzu rośliny. Tak więc aflR był jednym z celów do wyciszenia w wektorze p5XCAPD, ale nie jedynym. Odwrócone powtórzenia genu aflR wprowadzone do A. flavus i A. parasiticus w drodze transformacji skutkowały wyciszeniem i minimalną lub żadną produkcją aflatoksyn 47 (McDonald i wsp., 2005b). Ponadto wyciszenie genu aflD zapobiegło wytwarzaniu aflatoksyn nawet o 98% u A. flavus i A. parasiticus w bezpośredniej transformacji 48. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo sukcesu w naszym systemie, orzeszki ziemne zostały przekształcone z odwróconymi powtórzeniami fragmentów pięciu genów zaangażowanych w produkcję aflatoksyny u A. flavus. Tutaj pokazano, że przy użyciu p5XCAPD, który ma na celu wyciszenie kilku genów w szlaku syntezy aflatoksyny, osiągnięto o 90%-100% niższe poziomy aflatoksyny B1 i B2 w linii 288-72 i o 60-100% niższe poziomy skumulowane w linii 288-74 w porównaniu z kontrolą, gdy półliścienie zostały zaszczepione A. flavus, Ryc. 4, 7. Co najważniejsze, metoda ta wykryła statystycznie istotne różnice w akumulacji aflatoksyny według linii 288-72, 288-74 w porównaniu z kontrolą w całym eksperymencie poprzez zastosowanie statystyki parametrycznej, Rysunek 7. Biorąc pod uwagę mały rozmiar próby, ważne jest, aby podkreślić potrzebę użycia potężnej metody wykrywania aflatoksyn, eksperymenty te zostały przeanalizowane przez UPLC, który ma wysoką rozdzielczość, pięciokrotnie wyższą wydajność i trzykrotnie wyższą czułość niż HPLC 49.
Ekspresję wstawki RNAi w 288-74 wykryto tylko w niedojrzałych liścieniach (żółtych) po 24 godzinach inkubacji. Inserta RNAi nie została wykryta przez RT-PCR na dojrzałych liścieniach 288-74 po 24 godzinach, ani w żadnej grupie dojrzałości po 48 godzinach, Figura 6. To samo zjawisko zaobserwowano w innych transgenicznych liniach RNAi orzeszków ziemnych (Arias, R.S., 2015 niepublikowane), gdzie zwykle transkrypty RNAi wykrywano tylko na niedojrzałych liścieniach po 24 godzinach. Próbki RNA traktowano DNAzą przed syntezą cDNA, dane znormalizowano do poziomu ekspresji aktyny i nie zaobserwowano dowodów na zanieczyszczenie DNA. Gdyby DNA było obecne w próbkach, powinno zostać wykryte również w próbkach z 48 godzin, ale konsekwentnie tak nie było. Ekspresja pod kontrolą promotora 35S nie zawsze jest jednolita; Wpływ na nią mogą mieć warunki środowiskowe 50, rodzaj tkanki i stadium rozwojowe 51,52. Jednocześnie, w szlaku interferencji RNA, szybkość rozpadu mRNA i szybkość rozpadu siRNA mogą się znacznie różnić 53. Możliwe, że szybka degradacja mRNA przez mechanizm interferencji RNA mogła zapobiec wykryciu mRNA po 48 godzinach inkubacji. To, czy brak ekspresji w 48 godzinach był spowodowany niską transkrypcją sterowaną promotorem 35S, czy szybką degradacją dsRNA przez Dicer, pozostaje bez odpowiedzi. W związku z tym wykrywanie małych RNA za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości dałoby lepszy wgląd w procesy zachodzące za pośrednictwem RNAi 54 w tych eksperymentach. Ponieważ jednak wyciszanie RNA rozprzestrzenia się ogólnoustrojowo, głównie przez łyko ze źródeł fotosyntezy do pochłaniaczy sacharozy (w tym przypadku nasion orzeszków ziemnych) 55, wyciszenie syntezy aflatoksyny może wystąpić w nasionach bez lokalnej ekspresji insertu RNAi. Pozostaje jeszcze wiele badań do wykonania, aby określić poziom progowy małych interferujących RNA (siRNA) niezbędnych do zapobiegania akumulacji aflatoksyn w nasionach. Ważne jest, aby podkreślić fakt, że zarówno ekspresja mRNA konstruktu RNAi (ryc. 6), jak i akumulacja aflatoksyn B1 i B2 (ryc. 7) wykazały różne wyniki dla niedojrzałych (żółtych) i innych. dojrzałe (brązowe) liścienie. Rośliny orzeszków ziemnych mają nieokreślony wzrost, to znaczy podczas zbiorów prezentują szereg strąków o dojrzałości, ryc. 2. Ponadto nasiona z różnych grup dojrzałości różnią się składem chemicznym, np. 2,4% sacharozy w nasionach niedojrzałych i 1,9% w nasionach dojrzałych w tych samych warunkach polowych 56,57. Dlatego, aby zrozumieć rzeczywistą skuteczność kontroli akumulacji aflatoksyny za pośrednictwem RNA, ważne jest, aby oddzielnie analizować grupy dojrzałości.
Naturalną obroną nasion orzeszków ziemnych jest produkcja fitoaleksyn, która różni się różnorodnością wytwarzanych związków i ich względnymi ilościami w zależności od dojrzałości nasion i warunków środowiskowych 58-61, a jest szczególnie wyższa w zarodkach w porównaniu z liścieniami 62. Zarodki mają również znacznie wyższe stężenia kwasów nukleinowych, zarówno DNA, jak i RNA, niż liścienie (Arias R.S., niepublikowane). W miarę dojrzewania nasion orzeszków ziemnych zachodzą zmiany w ich fizjologii i składzie chemicznym 63. Przeciwutleniacze fenolowe w testach orzeszków ziemnych tworzą skondensowane taniny o działaniu fungistatycznym 64; Jest to również widoczne w kolorze mezokarpu, który odzwierciedla etapy dojrzałości, od żółtego do czarnego 35, ponieważ zawartość garbników i związków fenolowych wzrasta wraz z dojrzałością 65. Tak więc obecność jąder lub zarodków w eksperymencie, biorąc pod uwagę ich właściwości przeciwdrobnoustrojowe, mogła ograniczyć wzrost grzybów, a tym samym przeszacować efekt wyciszenia RNAi, dlatego zostały one usunięte. Ponadto usunięcie jądra i zarodków pomaga ograniczyć źródła zmienności w analizie, ponieważ pół liścienia, która przenosi zarodek, będzie miała więcej fitoaleksyn i większą zawartość RNA.
Oprócz analizy według grup dojrzałości i usuwania jądra i zarodka w tych eksperymentach, ważne jest, aby zwrócić uwagę na kilka dodatkowych obserwacji: a) chociaż wyniki są wyświetlane dla inkubacji do 96 godzin, zaleca się użycie nie więcej niż 72 godzin, aby uzyskać spójne wyniki, ponieważ nasiona ulegają degradacji przez 96 godzin; oraz b) mając na uwadze, że połówki liścieni z tego samego nasiona, mimo że pobierane są losowo, nie stanowią całkowicie niezależnych próbek, akumulacja RT-PCR i aflatoksyny w obrębie zdarzeń transgenicznych wykazała minimalne różnice między nasionami. Ważne jest również, aby upewnić się, że kiełkujące zarodniki są wystawione na działanie tkanki roślinnej, objętość inokulum wynosząca 2 μl i nałożenie zarodników na powierzchnię cięcia liścieni, unikając kapania na boki. Woda/agar na płytkach powinna mieć temperaturę 1,5% (w/v), bardziej miękki agar powoduje spływ zarodników, jak pokazano na ostatniej ramce rysunku 4 (na dole). Jeśli dostępność nasion z danego zdarzenia transgenicznego jest ograniczona, pobieranie próbek można wykonać w dwóch egzemplarzach, a nie trzykrotnie, uzyskując podobne wyniki (tj. Ryc. 7); Jednak trzykrotne próbki pomogą zmniejszyć błąd standardowy. Jedynym ograniczeniem tej metody jest to, że wymaga ona wysoce czułego systemu (UPLC) do wykrywania/oznaczania ilościowego aflatoksyn, ale jednocześnie zmniejsza to prawdopodobieństwo przeszacowania wpływu RNAi, jeśli aflatoksyny nie zostaną wykryte mniej czułymi metodami.
Podsumowując, metoda ta po raz pierwszy oferuje wiarygodne podejście do badania wpływu RNAi na kontrolę aflatoksyn. Skracając czas eksperymentu z całego sezonu upraw do mniej niż jednego tygodnia, metoda ta ogromnie przyspieszy badania nad patosystemem RNAi-orzeszków ziemnych/Aspergillus w kierunku łagodzenia i/lub eliminacji aflatoksyn.

Około 4,5 miliarda ludzi jest chronicznie narażonych na aflatoksyny 1, najsilniejsze znane w naturze substancje rakotwórcze 2. Mikotoksyny te zanieczyszczają 25% upraw żywności na świecie 3, w tym kukurydzę, maniok, ryż, orzechy, zboża i przyprawy 4. Aflatoksyny powodują zahamowanie wzrostu u dzieci 5, upośledzają układ odpornościowy 6, występują w 58% przypadków raka wątroby w biopsjach ludzkich 7,8 i powodują śmierć setek osób podczas okresowych wybuchów aflatoksykozy 9,10. Aflatoksyny są pochodnymi poliketydów mikotoksynami, zwykle produkowanymi przez Aspergillus flavus i A. parasiticus; aflatoksyny B1 i B2 są produkowane przez A. flavus, natomiast A. parasiticus produkuje również G1 i G2. Struktura chemiczna tych związków oraz chromatogram przedstawiający ich rozdział metodą UPLC są ukazane na Rysunku 1.
<img alt="Rysunek 1" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig1.jpg" /> 
Rysunek 1. Aflatoksyny i wkładka RNAi. Góra: struktura chemiczna (po lewej) i przykład chromatogramu (po prawej) czterech najczęstszych pochodnych poliketydowych aflatoksyn: B1, B2, G1 i G2, produkowanych przez Aspergillus parasiticus; A. flavus produkuje B1 i B2. Dół: Schemat fragmentów genów w konstrukcie RNAi p5XCAPD wykorzystanym do transformacji arakiidowca; numery pod strzałkami to numery dostępowe fragmentów genów w genomie Aspergillus flavus; PIV2: intron ziemniaka; bp: pary zasad; RT_5X_1 i RT_5X_2: miejsca przyłączania starterów do Real-Time PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Straty ekonomiczne w eksporcie spowodowane obecnością aflatoksyn w samych orzeszkach ziemnych przekraczają 450 milionów dolarów amerykańskich, jeśli obliczyć je na podstawie limitu 4 ng.g-1 aflatoksyny dopuszczalnej do spożycia przez ludzi w Unii Europejskiej 11. Aflatoksyny są znane od 60 lat 12; jednak, mimo opracowania wielu praktyk rolniczych mających na celu łagodzenie ich wpływu, w tym stosowania innych szczepów grzybów 13,14, nie istnieje spójna metoda kontroli, a odmiany roślin odporne nie są dostępne. Badanie plazmy zarodkowej roślin pod kątem odporności na aflatoksyny jest szczególnie trudne, ponieważ nawet w warunkach sprzyjających inwazji patogenu akumulacja mikotoksyn jest nieprzewidywalna i nie wykazuje rozkładu normalnego. W związku z tym eksperymenty zazwyczaj wymagają dużych obszarów upraw, setek nasion oraz wielokrotnych próbek o masie 100-1 700 g w celu zmniejszenia zmienności danych 15,16.
Interferencja RNA została odkryta w 1998 roku 17, a korzyści z tzw. „wyciszania” są obecnie badane w wielu nowych zastosowaniach, np. w terapiach przeciwko przerzutowemu rakowi piersi 18, rakowi wątroby 19, białaczkach szpikowych 20 oraz w ochronie roślin przed owadami 21 i nicieniami 22. W roślinach sygnały interferencji RNA mogą przemieszczać się z komórki do komórki, przy czym małe interferujące RNA (siRNA) oraz RNA o wysokiej masie cząsteczkowej odpowiadają za systemowe posttranskrypcyjne wyciszanie genów 23,24, nawet wewnątrz grzybowych patogenów będących w bliskim kontakcie z rośliną żywicielem 25. Skuteczność RNAi w zapośredniczonym przez rośliny wyciszaniu genów patogenów grzybowych opisano w kilku patosystemach roślinnych, w których wizualna ocena objawów w nadziemnych częściach roślin (liściach) pozwoliła na kwantyfikację choroby, tj. w przypadku oomyceta Bremia w sałacie 26, Puccinia w pszenicy 27 i Fusarium w bananowcu 28. Znacznie trudniejsza jest ocena skuteczności RNAi w kontrolowaniu mikotoksyn w roślinach, w szczególności aflatoksyn w arachidziach, ponieważ liście nie wykazują objawów infekcji, zainfekowane organy (nasiona) znajdują się pod kilkoma centymetrami gleby, występowanie infekcji jest nieprzewidywalne, a obecność aflatoksyn można stwierdzić jedynie za pomocą analizy chemicznej. Ponadto każde zdarzenie transgeniczne u arachidzi zazwyczaj daje niewiele nasion (4-6 na roślinę); dlatego tradycyjne testowanie cechy braku akumulacji aflatoksyn na dużych poleach doświadczalnych, trwające całe sezony upraw i wymagające setek nasion, nie jest wykonalne. Opisano tutaj metodę analizy nasion arachidzi poddanych RNAi w czasie krótszym niż tydzień pod kątem obecności transgenu oraz cechy braku akumulacji aflatoksyn, przy użyciu zaledwie kilku nasion.

<table><tbody><tr><td>Startery, oligonukleotydy</td><td>DNA Technologies, Coralville, IA, USA</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Plant Mini Kit</td><td>Qiagen, Walencja, CA</td><td>69106</td><td></td></tr><tr><td>Czapek Dox agar medium</td><td>Oxoid, firmy Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>CM0095</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>BP 1423</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka -80&nbsp; &deg; C</td><td>n/a</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek glinu, Al2O3</td><td>Fisher Scientific</td><td>A941</td><td></td></tr><tr><td>SPE Zbiorniki 1,5 ml</td><td>Grace Davison Discovery Scientific</td><td>210011</td><td></td></tr><tr><td>Fryty do 1,5 ml SPE</td><td>Grace Davison Discovery Scientific</td><td>211401</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki do automatycznego pobierania próbek</td><td>Waters Corporation, Milford, Massachusetts</td><td></td><td></td>186005221</tr><tr><td>Przyrząd do ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) firmy Waters Acquity; UPLC-Klasa H Czwartorzędowy menedżer rozpuszczalników; Menedżer próbek UPLC; UPLC Detektor fluorescencyjny (FLR); UPLC BEH C18 2.1&nbsp; mm x 50&nbsp; mm, 1,7&nbsp; kolumna mm</td><td>Waters Corporation, Milford, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy pułapki jonowej Finnigan LCQ Advantage MAX, z oprogramowaniem Xcalibur w wersji 1.4</td><td>Thermo Electron Corp., San Jose, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standardy aflatoksyny, B1, B2, G1 oraz G2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A6636; A9887; A0138; A0263</td><td></td></tr><tr><td>Systat Software 12.2</td><td>SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Trizol</td><td>Invitrogen, CA</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Synteza pierwszej nici Super Mix</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11752-050</td><td></td></tr><tr><td>ABI 7500 Real-Time PCR</td><td>Lifetechnologies, Grand Island, Nowy Jork</td><td>4406984</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth-Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>R453642</td><td></td></tr><tr><td>pENTR1A</td><td>Invitrogen, CA</td><td>A10462</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase II Mieszanka enzymów</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11791-020</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA</td><td>NEB Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Gelrite</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1919</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>Stacja robocza robota QIAcube</td><td>Qiagen, Walencja, CA</td><td>9001292</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyki: kanamycyna, cefotaksym, gentamycyna; streptomycyna</td><td>Goldbio, St. Louis, MO</td><td>cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; paciorkowce: S-150-50</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11304-029</td><td></td></tr></tbody></table>

kontrola aflatoksyn w orzeszkach ziemnych za pośrednictwem rnai: metoda analizy produkcji mikotoksyn i ekspresji transgenów w patosystemie orzeszków ziemnych/aspergillus

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

Organizacja Narodów Zjednoczonych ds. Wyżywienia i Rolnictwa szacuje, że 25% upraw żywności na świecie jest skażonych aflatoksynami. Oznacza to, że każdego roku 100 milionów ton żywności jest niszczonych lub kierowanych do spożycia przez ludzi innych niż ludzie. Aflatoksyny są silnymi czynnikami rakotwórczymi normalnie gromadzonymi przez grzyby Aspergillus flavus i A. parasiticus w zbożach, orzechach, roślinach okopowych i innych produktach rolnych. Wyciszenie pięciu genów syntezy aflatoksyny przez interferencję RNA (RNAi) w roślinach orzeszków ziemnych wykorzystano do kontrolowania akumulacji aflatoksyny po inokulacji A. flavus. Wcześniej nie istniała żadna metoda analizy skuteczności RNAi w indywidualnych zdarzeniach transgenicznych orzeszków ziemnych, ponieważ zwykle dają one niewiele nasion, a tradycyjne metody dużych eksperymentów polowych w warunkach sprzyjających aflatoksynom nie były opcją. Na polu prawdopodobieństwo znalezienia naturalnie zanieczyszczonych nasion wynosi często od 1/100 do 1/1000. Ponadto zanieczyszczenie aflatoksynami nie jest równomiernie rozłożone. Nasza metoda wykorzystuje kilka nasion na zdarzenie transgeniczne, z małymi cząstkami przetworzonymi do PCR W CZASIE RZECZYWISTYM (RT-PCR) lub sekwencjonowania małego RNA oraz do analizy akumulacji aflatoksyn za pomocą ultra-sprawnej chromatografii cieczowej (UPLC). Linie orzeszków ziemnych 288-72 i 288-74 wykazujące ekspresję RNAi wykazały do 100% redukcji (p≤0,01) aflatoksyny B1 i B2 w porównaniu z kontrolą, która zgromadziła do 14 000 ng.g-1 aflatoksynyB1 po zaszczepieniu aflatoksyną A. flavus. Dla porównania, maksymalna całkowita ilość aflatoksyn dopuszczona do spożycia przez ludzi w Stanach Zjednoczonych wynosi 20 ng.G-1. Protokół ten opisuje zastosowanie kontroli aflatoksyn za pośrednictwem RNAi w transgenicznych nasionach orzeszków ziemnych oraz metody jej oceny. Wierzymy, że jego zastosowanie w hodowli orzeszków ziemnych i innych roślin uprawnych przyniesie szybki postęp w tej ważnej dziedzinie nauki, medycyny i żywienia człowieka oraz znacząco przyczyni się do międzynarodowych wysiłków na rzecz kontroli aflatoksyn i potencjalnie innych mikotoksyn w głównych uprawach spożywczych.

Plazmid p5XCAPD został stworzony jako pochodna pCAPD 29 i wykorzystany do transformacji roślin arachidowca; wektor ten niesie odwrócone powtórzenia pięciu małych fragmentów, po 70-80 bp każdy, genów syntezy aflatoksyn A. flavus oddzielonych intronem (Rycina 1). Do konstrukcji wykorzystano fragmenty AFL2G_07224 (aflR), AFL2G_07223 (aflS lub aflJ), AFL2G_05027 (pompa odpływowa aflatoksyny, aflep), AFL2G_07228 (aflC/pksA/pksL1) oraz AFL2G_07731 (pes1); numery na Rycynie 1 odpowiadają adnotacji genomu A. flavus w BROAD Institute, Cambridge, MA, oraz literaturze 42. Po procesie transformacji zregenerowano łącznie 99 linii arachidowca, z czego 50 było PCR-dodatnich w kierunku NPTII wykrytego za pomocą STN-PCR, a 33 linie były PCR-dodatnie i wytworzyły nasiona. Tylko siedem linii PCR-dodatnich rozmnożono klonalnie i poddano badaniu akumulacji aflatoksyn metodą opisaną w niniejszej pracy; wszystkie siedem wykazało o 60% do 100% mniejszą akumulację aflatoksyn niż kontrola. Tutaj przedstawiamy wyniki dla dwóch z tych siedmiu linii. Ponieważ poszczególne zdarzenia transgeniczne zazwyczaj dają niewielką liczbę nasion, opracowano metodę pozwalającą na wykorzystanie minimalnej liczby nasion przy jednoczesnej możliwości przeprowadzenia parametrycznej analizy statystycznej. Schemat blokowy przygotowania próbek i układu eksperymentalnego przedstawiono na Rycynie 5 oraz w Tabeli 1. Choć pierwsze pokolenie nasion transgenicznych jest zazwyczaj hemizygotyczne, oczekuje się, że ruch międzykomórkowy i systemiczny małych interferujących RNA (siRNA) generowanych poprzez interferencję RNA zapewni wyciszenie syntezy aflatoksyn w całej roślinie.
<img alt="Rysunek 5" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig5.jpg" /> 
Rysunek 5. Schematyczny wykres blokowy metody analizy skuteczności RNAi w wyciszaniu genów syntezy aflatoksyn grzyba Aspergillus w nasionach arakiidowy. Graficzna reprezentacja przebiegu prac podczas przetwarzania próbek arakiidowych w celu analizy ekspresji genów lub zawartości aflatoksyn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Linie orzeszka ziemniaczanego RNAi 288-72 i 288-74 wykazały obecność markera selekcyjnego NPTII w teście STN-PCR; fragmenty żelu przedstawiono na Rysunku 6 (góra), oryginalne zdjęcia są dostępne u autorów na żądanie. Plazmid pCAPD nie został użyty jako kontrola transformacji, ponieważ koduje on odwrócone powtórzenia dwóch genów Cmr (oporność na chloramfenikol) i CcdB (toksyna) o nieznanym wpływie na rośliny. W charakterze kontroli negatywnej wykorzystano linię orzeszka ziemniaczanego 288-9, która była wynikiem negatywnym w teście PCR, oraz inne linie, które przeszły proces regeneracji i były hodowane w tych samych warunkach co linie RNAi.
<img alt="Rycina 6" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig6.jpg" /> 
Rycina 6. Wykrywanie transgenicznych linii oraz analiza ekspresji w czasie rzeczywistym wstawki RNAi. Góra: Detekcja w jednej probówce metodą Nested PCR dla transgenicznych linii arakiis RNAi-288-72 i RNAi-288-74, rośliny pozytywne. Kontrole: W (woda), PP (roślina pozytywna), MM (master mix), p (plazmid p5XCAPD); frakcje 1/2&#160; 1/4 1/8 1/16 reprezentują 2-krotne rozcieńczenia DNA. Dół: Detekcja ekspresji wstawki RNAi metodą Real-Time PCR (zestawy starterów: RT_5X_1, RT_5X_2, jak w Rycini 1, na niedojrzałych (żółtych) i dojrzałych (brązowych) kotyledonach linii transgenicznych po 24 i 48 h inkubacji; szara linia: CT = 1. Histogramy przedstawiają średnie i słupki błędu standardowego (T) z trzech próbek biologicznych z trzema powtórzeniami technicznymi. Ilościowa analiza wstawki RNAi została znormalizowana względem genu gospodarza Actin jako kontroli wewnętrznej, a porównawkowy poziom ekspresji transgenu obliczono zgodnie z opisem w punktach 5.2.2 i 5.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Aby przetestować skuteczność potencjalnej kontroli akumulacji aflatoksyn za pomocą RNAi pośredniczonej przez roślinę-gospodarza, świeżo zebrane konidia Aspergillus flavus NRRL 3357 naniesiono na powierzchnię cięcia połówek liścic lędźwiowych, z których usunięto embriony i łupiny (Ryc. 3, 4). Szczep A. flavus NRRL 3357, którego genom został zsekwencjonowany i posłużył jako podstawa do zaprojektowania p5XCAPD, został uprzejmie udostępniony przez dr. Horna z USDA-ARS-NPRL. Wynikową inwazję grzybową połówek liścic po 24, 48 i 72 h w 30 °C przedstawiono na Ryc. 4. Próbki inokulowanych połówek liścic pobierano po 24, 48, 72 i 96 h inkubacji i analizowano pod kątem czterech głównych aflatoksyn B1, B2, G1 oraz G2 przy użyciu UPLC, a następnie potwierdzono wyniki metodą LC-MS; wyniki przedstawiono na Ryc. 6. Stężenia aflatoksyn określono przy użyciu opublikowanej metody z modyfikacjami 36. Po 96 h inkubacji liścice zaczynają ulegać rozpadowi z powodu infekcji grzybiczej. Linia RNAi 288-72 wykazała znacznie niższe poziomy aflatoksyn niż kontrola we wszystkich terminach pobierania próbek w niedojrzałych liścicach oraz w większości terminów w liścicach dojrzałych. Linia RNAi 288-74 wykazała znacznie niższe poziomy aflatoksyn w większości terminów pobierania próbek. Poziomy istotności testu Tukeya zaznaczono gwiazdkami na wykresie na Ryc. 7.
<img alt="Rysunek 7" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig7.jpg" /> 
Rysunek 7. Aflatoksyny B1 i B2 w połowach kotyledonów orzeszków ziemnych po inkubacji (24, 48, 72 i 96 h) z Aspergillus flavus. Kontrola: nasiona linii nietransgenicznej 288-9; RNAi: nasiona z linii RNAi-288-72 i RNAi-288-74, transgeniczne dla RNAi p5XCAPD w celu wyciszenia pięciu genów syntezy aflatoksyn. (A) Aflatoksyna B1 w nasionach dojrzałych (brązowe); (B) aflatoksyna B2 w nasionach dojrzałych; (C) aflatoksyna B1 w nasionach niedojrzałych (żółte) i (D) aflatoksyna B2 w nasionach niedojrzałych. Przedstawiono wartości średnie wraz z odpowiednimi słupkami błędów standardowych (T) dla prób biologicznych wykonanych w dubletach. Różnice statystycznie istotne według testu Tukey'a *: p ≤ 0,05, **: p ≤ 0,01, ***: p ≤ 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Ogólnie rzecz biorąc, RNAi-288-72 wykazał w trakcie całego eksperymentu (inkubacja od 24 do 96 h) redukcję aflatoksyny B2 o 94%-100% oraz redukcję aflatoksyny B1 o 90%-100% w porównaniu z kontrolą. RNAi-288-74 wykazał redukcję aflatoksyny B2 o 63%-100% oraz redukcję aflatoksyny B1 o 60%-100%, Rycina 7.
Startery użyte do detekcji ekspresji insertu RNAi metodą Real-Time PCR przedstawiono na Rysunku 1. Analizie poddano kotyledony nasion ziemniaka bez embrionów, aby wyeliminować ich naturalne mechanizmy obronne i umożliwić wykrycie potencjalnego efektu RNAi w obszarze najbardziej narażonym na inwazję grzybów, czyli w kotyledonach. Ekspresja insertu RNAi wykryta w niedojrzałych kotyledonach (żółtych) linii 288-74 za pomocą zestawu starterów RT_5X_1 była czterokrotnie wyższa niż próg CT=1 kontroli negatywnej, a za pomocą zestawu starterów RT_5X_2 była 19-krotnie wyższa od progu, przy inkubacji przez 24 hr. Za pomocą RT-PCR wykryto co najmniej trzy z pięciu kolejnych fragmentów genów użytych w transformacji ziemniaka: 5027, 7223 i 7228 (odpowiednio aflep, aflS/aflJ oraz aflC/pksA) (Rysunek 1, 6). Ekspresji insertu RNAi nie wykryto w dojrzałych kotyledonach po 24 hr, ani w dojrzałych lub niedojrzałych kotyledonach po 48 hr inkubacji, Rysunek 6 (dół).
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody >
		<tr height="21">
			<td height="65" rowspan="3" style="height:65px;width:64px;">Linia arakidowa</td>
			<td rowspan="3" style="width:64px;">Czas pobierania próbek</td>
			<td colspan="3" style="width:192px;">Próbki do RT-PCR</td>
			<td colspan="3" rowspan="2" style="width:192px;">Próbki do analizy aflatoksyn (inokulowane)</td>
			<td rowspan="3" style="width:64px;">Liczba nasion</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:192px;">(nieinokulowane)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">Powt. 1</td>
			<td style="width:64px;">Powt. 2</td>
			<td style="width:64px;">Powt. 3</td>
			<td style="width:64px;">Powt. 1</td>
			<td style="width:64px;">Powt. 2</td>
			<td style="width:64px;">Powt. 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="66" rowspan="3" style="height:66px;width:64px;">RNAi (żółta)</td>
			<td style="width:64px;">24 hr</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td rowspan="3" style="width:64px;">4.5</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">48 hr</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">72 hr</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">Kontrola</td>
			<td style="width:64px;">24 hr</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td rowspan="3" style="width:64px;">4.5</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">(żółta)</td>
			<td style="width:64px;">48 hr</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;">72 hr</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
			<td style="width:64px;">1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Przykład układu dla małej próby do analizy ekspresji genów i akumulacji aflatoksyn w nasionach arahisowej poddanych RNAi. Pełna analiza ekspresji i aflatoksyn dla jednej grupy dojrzałości (tj. żółtej), w trzech punktach czasowych pobierania próbek (24, 48 i 72 h), w trzech powtórzeniach, wymagałaby 4,5 nasiona; każda liczba w tabeli reprezentuje półtorej kotyledonu.

Pokazujemy metodę analizy aflatoksyn i ekspresji transgenów w nasionach orzeszków ziemnych, które zawierają sygnały interferencji RNA do wyciszania genów syntezy aflatoksyn u grzyba Aspergillus flavus. Kontrola mikotoksyn w roślinach za pośrednictwem RNAi nie została wcześniej zgłoszona.

Kontrola aflatoksyn w orzeszkach ziemnych za pośrednictwem RNAi: metoda analizy produkcji mikotoksyn i ekspresji transgenów w patosystemie orzeszków ziemnych/aspergillus

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

Ogólnym celem tej pracy jest zapewnienie niezawodnej, dokładnej, niedrogiej i szybkiej metody testowania skuteczności wyciszania genów syntezy aflatoksyny aspergillus za pośrednictwem RNAi w transgenicznych orzeszkach ziemnych przy użyciu minimalnej liczby nasion, zwykle setki gramów nasion są wymagane do skutecznego ilościowego określenia aflatoksyn w próbkach. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona mniej niż pięć nasion do przetestowania konkretnego zabiegu na 10 dni przed przygotowaniem nasion, należy założyć kulturę aflatoksyny z dodatnim wynikiem aspergillus flavus NR RL 3 3 5 7 w pożywce ślimakowej ZAP Pex. Uprawiaj tę kulturę w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Będzie używany do inokulacji nasion. Po przygotowaniu roślin transgenicznych wykazujących ekspresję RNAI, która jest szczegółowo opisana w protokole tekstowym, przystąp do zbioru ich nasion. Najpierw usuń karpia peric za pomocą ścierania z myjki ciśnieniowej ustawionej na niską wartość lub zeskrob gosia peric ręcznie.Po usunięciu karpia peri, zidentyfikuj kolor karpia mezo, umieszczając strąki na desce dojrzałości w odpowiednich grupach. Teraz usuń otwory i przetwarzaj żółte i brązowe nasiona osobno. Oblicz liczbę nasion potrzebnych do eksperymentu, co najmniej trzy kawałki nasion, co oznacza, że na każdą linię orzeszków ziemnych, z której pobierane są próbki, potrzebne są trzy połówki koleadyny.Przykryj dno sterylnej zlewki warstwą nasion, a następnie po prostu przykryj nasiona odmierzoną objętością 75% etanolu. Następnie podwój tę głośność. Pozwól nasionom inkubować w roztworze przez 30 sekund, a następnie spłucz je w wysterylizowanej wodzie destylowanej.Następnie potraktuj nasiona objętością 2% podchlorynu, tak jak w przypadku etanolu F. Pozwól tej inkubacji postępować przez pięć minut. Następnie użyj trzech płukanek w pięciokrotnej objętości wysterylizowanej wody destylowanej.Aby usunąć podchloryn, bardzo ważne jest, aby na tym etapie zmyć cały roztwór podchlorynu. Nasiona są teraz sterylizowane powierzchniowo. Następnie nawodnij nasiona, zanurzając je w wysterylizowanej wodzie destylowanej na dwie godziny, przygotowanej do umieszczenia uwodnionych nasion na sterylnej szalce Petriego.W tym momencie wszystkie materiały należy wysterylizować. Usuń okrywy nasienne za pomocą kleszczy, a następnie oddziel kohainę. Na koniec usuń zarodki skalpelem.Zarodki można wyrzucić lub wykorzystać do regeneracji nowych roślin. Następnie przekrój oleinę na pół skalpelem i zanurz połówki oraz wysterylizowaną wodę destylowaną, aż będą gotowe do zaszczepienia. Następnie osusz nadmiar wody z połowy ołowiu na sterylnych ręcznikach papierowych i umieść kawałki nasion w oddzielnych 1,5% talerzach ślimakowych z wgłębieniami wielkości nasion i wsuń w nie nasiona ściętymi bokami do góry, aby zaszczepić połówki koołowiu.Dodaj dwa mikrolitry 10 000 zarodników aspergillus na mikrolitr zawiesiny do ciętych powierzchni. Nie pozwól, aby zawiesina spływała po bokach połówki nasion. Na koniec umieść naczynia w ciemnym inkubatorze w temperaturze 30 stopni Celsjusza na jeden do czterech dni, aż zostaną przetestowane.Po jednym dniu, po dwóch dniach, a po trzech lub czterech dniach pobieraj próbki, nasiona delikatnie usuwaj losowo wybrane połówki w razie potrzeby. Za pomocą chusteczki wytrzyj nadmiar zarodników i świdra, a następnie umieść próbkę w szklanej fiolce z zakrętką. Przenieś niezaszczepione próbki do dwóch mililitrowych probówek w celu analizy R-T-P-C-R.Pobrać próbki w ciekłym azocie i przechowywać zamrożone próbki w zamrażarce do czasu ich przetworzenia. Do analizy aflatoksyny, w razie potrzeby weź zaszczepioną ołówkę ołowiu w szklanej fiolce z czteromililitrową nakrętką. Próbka będzie stabilna przez wiele miesięcy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Gdy nasiona osiągną temperaturę pokojową, ekstrahować próbkę, dodając cztery objętości metanolu i pozostawiając probówki do inkubacji przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej bez mieszania. Następnego dnia najpierw wykonaj UPLC, przygotuj 1,5 mililitrową mini kolumnę propylenu z pasującą frytą. Następnie dodaj 200 miligramów tlenku glinu.A następnie włóż kolejną frytę. Następna pozycja, fiolka z automatycznym próbnikiem A-U-P-L-C znajduje się pod mini kolumną i w kontakcie z nią, aby zminimalizować parowanie. Teraz dodaj 0,5 mililitra ekstraktu metanolu z próbki do jednorazowej szklanki, a nie plastikowej.Następnie dodaj 0,5 mililitra nitrylu aceto do probówki i wymieszaj roztwory za pomocą pipety. Teraz nałóż 0,5 mililitra mieszaniny na przygotowaną mini kolumnę i zbierz EIT tylko za pomocą grawitacji. Po szybkim pobraniu EIT przymocuj nasadkę septyczną do fiolki do pobierania w celu użycia na UPLC.Umieścić fiolki w A-U-P-L-C, już przygotowanym z ruchomą fazą próby, z metanolem wodnym i acedonitem. Następnie należy określić ilościowo zawartość aflatoksyn w EIT. Zobacz protokół tekstowy, aby uzyskać więcej informacji wraz z analizą UPLC.Umieść kawałki nasion używane do ekstrakcji w indywidualnych szklanych fiolkach. Następnie liofilizuj fiolki przez noc i zmierz suchą masę próbki tkanki rano, tak aby stężenie aflatoksyny można było wyrazić w nanogramach na gram próbki. Następnie wyjmij próbki z zamrażarki i dodaj triol i zmiel zamrożone tkanki za pomocą homogenizatora z młynkiem perełkowym przy 3,100 obr./min przez 40 sekund i przystąp do ekstrakcji RNA, wektor RNAI przenoszący małe fragmenty pięciu genów syntezy aflatoksyny z flavis został użyty do przekształcenia roślin orzeszków ziemnych.Numery identyfikacyjne odpowiadają numerom adnotacji genomu szerokiego instytutu z 99 zregenerowanych linii TRANSFORMANT, siedmiu dodatnich linii PCR, które zostały sklonowane i przetestowane zgodnie z opisem. Wszystkie siedem wykazało od 60 do 100% mniejszą akumulację aflatoksyny w porównaniu z liniami kontrolnymi. Przedstawiono wyniki z dwóch z siedmiu linii.Te dwie linie RN AI wykazały obecność dwóch markerów NPT, które można wybrać. Zgodnie z wynikami S-T-N-P-C-R, zastosowana kontrola ujemna była ujemną linią PCR, która przeszła proces transformacji w celu przetestowania linii RNAi pod kątem ich odporności na aflatoksyny świeżo zebrana kedia aflatoksyny aflatoksyny. Linię flavis NRRL 3, 3, 5, 7 nałożono na pół łóżka ołowiu pozbawionego zarodka i jądra po inkubacji przez okres do 96 godzin.Zaszczepione tkanki poddano obróbce przy użyciu UPLC w celu zmierzenia poziomu aflatoksyn zgodnie z opisem. Wyniki te zostały następnie potwierdzone za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas. Ogólnie rzecz biorąc, RNAi 2 88 72 wykazało 94 do 100% zmniejszenie aflatoksyny B 2 i 90 do 100% redukcję aflatoksyny B 1 w porównaniu z kontrolą.Natomiast RNAi 2 88 74 wykazało 60 do 100% redukcję obu aflatoksyn. Zgodnie z tą procedurą, te same ekstrakty z nasion można wykorzystać do analizy phyto Xin w celu lepszego zrozumienia odpowiedzi nasion na inwazję grzybów. Metoda ta dostarczy również unikalnego narzędzia, które pomoże w opracowaniu technologii RNAI do kontroli mikotoksyn.

rnai-mediated-control-aflatoxins-peanut-method-to-analyze-mycotoxin

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Tutaj prezentujemy protokół do analizy wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w ziarnach kukurydzy wyrażających białko przeciwgrzybicze. Używając szczepu A. flavus wykazującego ekspresję GFP, monitorowaliśmy infekcję i rozprzestrzenianie się grzyba w dojrzałych ziarnikach w czasie rzeczywistym. Test jest szybki, wiarygodny i powtarzalny.

Hamowanie wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w transgenicznej kukurydzy z ekspresją inhibitora α-amylazy z Lablab purpureus L.

Demonstrujemy średnioprzepustową metodę ilościowego oznaczania aflatoksyn i fitoaleksyn stilbenoidowych w pojedynczych nasionach orzeszków ziemnych przy użyciu ultra wydajnej chromatografii cieczowej. Metoda ta została opracowana specjalnie do analiz dzikich gatunków pajęczaków zagrożonych przez aflatoksynogenne gatunki Aspergillus.

Nieniszcząca kwantyfikacja aflatoksyn i fitoaleksyn stilbenoidowych w pojedynczych orzechach ziemnych (Arachis spp.) Nasiona

Spaliny z elektrowni są tanim źródłem CO2 dla wzrostu glonów. Zbudowaliśmy prototypowe systemy "od gazów spalinowych do hodowli glonów" i opisaliśmy, jak zwiększyć skalę procesu hodowli glonów. Wykazaliśmy zastosowanie modelu bioreakcji z przeniesieniem masy do symulacji i zaprojektowania optymalnej pracy gazów spalinowych do wzrostu Chlorella sp. w fotobioreaktorach glonów.

Optymalizacja ustawień spalin w celu promowania wzrostu mikroalg w fotobioreaktorach za pomocą symulacji komputerowych

Ta praca opisuje nowatorską metodę selektywnego celowania w organelle subkomórkowe u roślin, testowaną za pomocą BioRad Gene Gun.

Przejściowa ekspresja genów w tytoniu przy użyciu zespołu Gibsona i pistoletu genowego

Fosfolipidowe kwasy tłuszczowe dostarczają informacji o strukturze zbiorowisk mikroorganizmów glebowych. Przedstawiono metody ekstrakcji z próbek glebowych za pomocą jednofazowej mieszaniny chloroformu, frakcjonowania wyekstrahowanych lipidów za pomocą kolumn ekstrakcyjnych do fazy stałej oraz metalizy do produkcji estrów metylowych kwasów tłuszczowych, które są analizowane za pomocą kapilarnej chromatografii gazowej.

Ekstrakcja i analiza mikrobiologicznych fosfolipidowych kwasów tłuszczowych w glebie

Tradycyjne tabele termogradientowe tworzą zakres temperatur na całej powierzchni. Spawanie węzłów prostopadłych do powierzchni stołu termogradientowego pozwoli na dogłębną kontrolę temperatury, zwiększając możliwe zastosowania badawcze.

Stół termogradientowy z fałdami do kontrolowania temperatury gleby w celu oceny wzrostu roślin i monitorowania procesów zachodzących w glebie

Ten artykuł opisuje procedury operacyjne dla Harvard Environmental Chamber (HEC) i powiązanych przyrządów do pomiaru gatunków gazowych i cząstek. Komora środowiskowa służy do produkcji i badania wtórnych gatunków organicznych wytwarzanych z prekursorów organicznych, zwłaszcza związanych z atmosferycznym pyłem organicznym.

Produkcja i pomiar organicznego pyłu zawieszonego w Harvard Environmental Chamber

Tutaj prezentujemy protokół do testowania zjadliwości roślin z patogenem roślinnym Magnaporthe grisea. Raport ten przyczyni się do zakrojonych na szeroką skalę badań przesiewowych patotypów izolatów grzybów i posłuży jako doskonały punkt wyjścia do zrozumienia mechanizmów oporności roślin podczas hodowli molekularnej.

Test infekcji roślin: inokulacja w sprayu i za pośrednictwem ran patogenem roślinnym Magnaporthe Grisea

Skuteczność pestycydów zdrowia publicznego przeciwko uciążliwym owadom i wektorom chorób nie jest jednakowa w różnych strefach ekologicznych. W tym miejscu przedstawiamy system technik wykorzystujących owady wektory żyjące w niewoli jako strażników skuteczności pestycydów w celu uzyskania elektronicznych map wspierających standardową ocenę pestycydów w wielu środowiskach.

Wizualizacja skuteczności pestycydów przeciwko komarom wektorom chorób w terenie

Dokładne oszacowanie wskaźnika powierzchni liści (LAI) jest kluczowe dla wielu modeli przepływów materiałów i energii w ekosystemach roślinnych oraz między ekosystemem a atmosferyczną warstwą graniczną. W związku z tym w przedstawionym protokole znalazły się trzy metody (pułapki na śmieci, technika igłowa i PCA) wykonywania precyzyjnych pomiarów LAI.

Szacowanie wskaźnika powierzchni liści przy użyciu trzech różnych metod w drzewostanach czystych liściastych

Poznaj metodę analizy aflatoksyn w transgenicznych orzeszkach ziemnych z wykorzystaniem RNAi przeciwko Aspergillus flavus. Technika ta umożliwia skuteczną kontrolę mikotoksyn przy użyciu minimalnej liczby nasion.

Kontrola aflatoksyn w orzeszkach ziemnych za pośrednictwem RNAi: metoda analizy produkcji mikotoksyn i ekspresji transgenów w patosystemie orzeszków ziemnych/aspergillus (Wideo) | JoVE Journal

Kontrola aflatoksyn w orzeszkach ziemnych za pośrednictwem RNAi: metoda analizy produkcji mikotoksyn i ekspresji transgenów w patosystemie orzeszków ziemnych/aspergillus

Przeglądaj więcej filmów