Kontrola aflatoksyn w orzeszkach ziemnych za pośrednictwem RNAi: metoda analizy produkcji mikotoksyn i ekspresji transgenów w patosystemie orzeszków ziemnych/aspergillus

Ogólnym celem tej pracy jest zapewnienie niezawodnej, dokładnej, niedrogiej i szybkiej metody testowania skuteczności wyciszania genów syntezy aflatoksyny aspergillus za pośrednictwem RNAi w transgenicznych orzeszkach ziemnych przy użyciu minimalnej liczby nasion, zwykle setki gramów nasion są wymagane do skutecznego ilościowego określenia aflatoksyn w próbkach. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona mniej niż pięć nasion do przetestowania konkretnego zabiegu na 10 dni przed przygotowaniem nasion, należy założyć kulturę aflatoksyny z dodatnim wynikiem aspergillus flavus NR RL 3 3 5 7 w pożywce ślimakowej ZAP Pex. Uprawiaj tę kulturę w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Będzie używany do inokulacji nasion. Po przygotowaniu roślin transgenicznych wykazujących ekspresję RNAI, która jest szczegółowo opisana w protokole tekstowym, przystąp do zbioru ich nasion. Najpierw usuń karpia peric za pomocą ścierania z myjki ciśnieniowej ustawionej na niską wartość lub zeskrob gosia peric ręcznie.

Po usunięciu karpia peri, zidentyfikuj kolor karpia mezo, umieszczając strąki na desce dojrzałości w odpowiednich grupach. Teraz usuń otwory i przetwarzaj żółte i brązowe nasiona osobno. Oblicz liczbę nasion potrzebnych do eksperymentu, co najmniej trzy kawałki nasion, co oznacza, że na każdą linię orzeszków ziemnych, z której pobierane są próbki, potrzebne są trzy połówki koleadyny.

Przykryj dno sterylnej zlewki warstwą nasion, a następnie po prostu przykryj nasiona odmierzoną objętością 75% etanolu. Następnie podwój tę głośność. Pozwól nasionom inkubować w roztworze przez 30 sekund, a następnie spłucz je w wysterylizowanej wodzie destylowanej.

Następnie potraktuj nasiona objętością 2% podchlorynu, tak jak w przypadku etanolu F. Pozwól tej inkubacji postępować przez pięć minut. Następnie użyj trzech płukanek w pięciokrotnej objętości wysterylizowanej wody destylowanej.

Aby usunąć podchloryn, bardzo ważne jest, aby na tym etapie zmyć cały roztwór podchlorynu. Nasiona są teraz sterylizowane powierzchniowo. Następnie nawodnij nasiona, zanurzając je w wysterylizowanej wodzie destylowanej na dwie godziny, przygotowanej do umieszczenia uwodnionych nasion na sterylnej szalce Petriego.

W tym momencie wszystkie materiały należy wysterylizować. Usuń okrywy nasienne za pomocą kleszczy, a następnie oddziel kohainę. Na koniec usuń zarodki skalpelem.

Zarodki można wyrzucić lub wykorzystać do regeneracji nowych roślin. Następnie przekrój oleinę na pół skalpelem i zanurz połówki oraz wysterylizowaną wodę destylowaną, aż będą gotowe do zaszczepienia. Następnie osusz nadmiar wody z połowy ołowiu na sterylnych ręcznikach papierowych i umieść kawałki nasion w oddzielnych 1,5% talerzach ślimakowych z wgłębieniami wielkości nasion i wsuń w nie nasiona ściętymi bokami do góry, aby zaszczepić połówki koołowiu.

Dodaj dwa mikrolitry 10 000 zarodników aspergillus na mikrolitr zawiesiny do ciętych powierzchni. Nie pozwól, aby zawiesina spływała po bokach połówki nasion. Na koniec umieść naczynia w ciemnym inkubatorze w temperaturze 30 stopni Celsjusza na jeden do czterech dni, aż zostaną przetestowane.

Po jednym dniu, po dwóch dniach, a po trzech lub czterech dniach pobieraj próbki, nasiona delikatnie usuwaj losowo wybrane połówki w razie potrzeby. Za pomocą chusteczki wytrzyj nadmiar zarodników i świdra, a następnie umieść próbkę w szklanej fiolce z zakrętką. Przenieś niezaszczepione próbki do dwóch mililitrowych probówek w celu analizy R-T-P-C-R.

Pobrać próbki w ciekłym azocie i przechowywać zamrożone próbki w zamrażarce do czasu ich przetworzenia. Do analizy aflatoksyny, w razie potrzeby weź zaszczepioną ołówkę ołowiu w szklanej fiolce z czteromililitrową nakrętką. Próbka będzie stabilna przez wiele miesięcy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Gdy nasiona osiągną temperaturę pokojową, ekstrahować próbkę, dodając cztery objętości metanolu i pozostawiając probówki do inkubacji przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej bez mieszania. Następnego dnia najpierw wykonaj UPLC, przygotuj 1,5 mililitrową mini kolumnę propylenu z pasującą frytą. Następnie dodaj 200 miligramów tlenku glinu.

A następnie włóż kolejną frytę. Następna pozycja, fiolka z automatycznym próbnikiem A-U-P-L-C znajduje się pod mini kolumną i w kontakcie z nią, aby zminimalizować parowanie. Teraz dodaj 0,5 mililitra ekstraktu metanolu z próbki do jednorazowej szklanki, a nie plastikowej.

Następnie dodaj 0,5 mililitra nitrylu aceto do probówki i wymieszaj roztwory za pomocą pipety. Teraz nałóż 0,5 mililitra mieszaniny na przygotowaną mini kolumnę i zbierz EIT tylko za pomocą grawitacji. Po szybkim pobraniu EIT przymocuj nasadkę septyczną do fiolki do pobierania w celu użycia na UPLC.

Umieścić fiolki w A-U-P-L-C, już przygotowanym z ruchomą fazą próby, z metanolem wodnym i acedonitem. Następnie należy określić ilościowo zawartość aflatoksyn w EIT. Zobacz protokół tekstowy, aby uzyskać więcej informacji wraz z analizą UPLC.

Umieść kawałki nasion używane do ekstrakcji w indywidualnych szklanych fiolkach. Następnie liofilizuj fiolki przez noc i zmierz suchą masę próbki tkanki rano, tak aby stężenie aflatoksyny można było wyrazić w nanogramach na gram próbki. Następnie wyjmij próbki z zamrażarki i dodaj triol i zmiel zamrożone tkanki za pomocą homogenizatora z młynkiem perełkowym przy 3,100 obr./min przez 40 sekund i przystąp do ekstrakcji RNA, wektor RNAI przenoszący małe fragmenty pięciu genów syntezy aflatoksyny z flavis został użyty do przekształcenia roślin orzeszków ziemnych.

Numery identyfikacyjne odpowiadają numerom adnotacji genomu szerokiego instytutu z 99 zregenerowanych linii TRANSFORMANT, siedmiu dodatnich linii PCR, które zostały sklonowane i przetestowane zgodnie z opisem. Wszystkie siedem wykazało od 60 do 100% mniejszą akumulację aflatoksyny w porównaniu z liniami kontrolnymi. Przedstawiono wyniki z dwóch z siedmiu linii.

Te dwie linie RN AI wykazały obecność dwóch markerów NPT, które można wybrać. Zgodnie z wynikami S-T-N-P-C-R, zastosowana kontrola ujemna była ujemną linią PCR, która przeszła proces transformacji w celu przetestowania linii RNAi pod kątem ich odporności na aflatoksyny świeżo zebrana kedia aflatoksyny aflatoksyny. Linię flavis NRRL 3, 3, 5, 7 nałożono na pół łóżka ołowiu pozbawionego zarodka i jądra po inkubacji przez okres do 96 godzin.

Zaszczepione tkanki poddano obróbce przy użyciu UPLC w celu zmierzenia poziomu aflatoksyn zgodnie z opisem. Wyniki te zostały następnie potwierdzone za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas. Ogólnie rzecz biorąc, RNAi 2 88 72 wykazało 94 do 100% zmniejszenie aflatoksyny B 2 i 90 do 100% redukcję aflatoksyny B 1 w porównaniu z kontrolą.

Natomiast RNAi 2 88 74 wykazało 60 do 100% redukcję obu aflatoksyn. Zgodnie z tą procedurą, te same ekstrakty z nasion można wykorzystać do analizy phyto Xin w celu lepszego zrozumienia odpowiedzi nasion na inwazję grzybów. Metoda ta dostarczy również unikalnego narzędzia, które pomoże w opracowaniu technologii RNAI do kontroli mikotoksyn.