Pomiar pH fagosomu za pomocą ratiometrycznej mikroskopii fluorescencyjnej

Ogólnym celem tego zestawu eksperymentów jest pomiar pH fakosomalnego w żywych komórkach za pomocą metrycznej mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii fagocytów, takie jak identyfikacja kluczowych cząsteczek w interakcjach patogenów lub wpływ zaburzeń genetycznych lub leków na fagocytozę. Główną zaletą tej techniki jest to, że w przeciwieństwie do metod opartych na populacji, takich jak fakty lub efekty spektroskopii, można wykryć zmiany w migracji wiązania cząstek lub w niejednorodności poszczególnych fagosomów.

Implikacje tej techniki rozciągają się na nasze terapie przeciwko chorobotwórczym organizmom chemicznym, ponieważ wiele z tych mikroorganizmów może zmieniać pH fragoso, aby uniknąć rozproszenia w fagosomach. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj 20 miligramów suszonego Xanu do 10 mililitrów sterylnego wiru PBS i podgrzewaj we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut. Następnie schłodzić i odwirować w temperaturze 2000 G przez pięć minut.

Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić Xan w jednym mililitrze PBS. Sonikuj go przez 10 minut w łaźni wodnej. Sonicate następnie przenieś 500 mikrolitrów zawieszonego Xanu do dwóch 1,5 mililitrowych probówek i odwiruj je przy 11 000 G przez pięć minut.

Powtórz pranie z 500 mikrolitrami PBS. Następnie przemyć Xan dwukrotnie w 500 mikrolitrach świeżo przygotowanego 0,1-molowego roztworu węglanu sodu o pH 9,3 i ZAWIESIĆ w 490 mikrolitrach roztworu węglanu sodu po ostatnim płukaniu. Następnie dodaj 10 mikrolitrów FZ rozpuszczonych w DMSO w ilości 10 miligramów na mililitr do wiru Xan.

Przykryj folią i inkubuj z mieszaniem przez cztery godziny w temperaturze pokojowej Aby usunąć niezwiązane oko, najpierw przemyj 0,5 mililitra DMSO plus 150 mikrolitrów PBS, włączając sonikację między etapami mycia. Następnie umyj 0,5 mililitra DMSO plus 300 mikrolitrów PBS, a następnie umyj 0,5 mililitra DMSO plus 450 mikrolitrów PBS, a następnie samym PBS. Następnie dodaj jeden mikrolitr Xan do 500 mikrolitrów PBS i wiruj.

Następnie dodaj 10 mikrolitrów rozcieńczonego piasku xma do krawędzi komory hemocytometru, gdzie styka się z szkiełkiem nakrywkowym, zamontuj hemocytometr na mikroskopie jasnego pola wyposażonym w obiektyw 20x. Skoncentruj się na lewym górnym rogu zawierającym 16 kwadratów i policz wszystkie cząsteczki piasku świątecznego w tym obszarze. Korzystając z ręcznego licznika zliczeń, powtórz procedurę w prawym dolnym rogu.

Następnie oblicz stężenie Xan, korzystając z tego równania. Następnie opsonizuj znakowany Xan wściekłym przeciwciałem anty Xan w wirze rozcieńczenia od jednego do 100 i inkubuj próbkę przez godzinę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie policz świąteczny piasek za pomocą cytometru hemologicznego, a następnie rozcieńcz do 100 razy od 10 do szóstych cząstek na mililitr.

Po wyizolowaniu pierwotnych neutrofili myszy, dodaj dwa razy 10 do piątej części neutrofili do środka naczynia o szklanym dnie o grubości 35 milimetrów. Następnie rozprowadź kroplę, dodając 50 mikrolitrów pożywki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby komórki mogły przylegać. Następnie dodaj jeden mililitr HBSS ogrzanego do 37 stopni Celsjusza zawierającego inhibitor peroksydazy mielo.

Zamontuj czaszę na mikroskopie fluorescencyjnym o szerokim polu widzenia, wyposażonym w system grzewczy 37 stopni Celsjusza i obiektyw olejowy 40x. Inkubować komórki bez obrazowania przez 10 minut, aby umożliwić zrównoważenie komórek i sprzętu. Następnie dostosuj ustawienia mikroskopu, aby uzyskać obraz transmisyjny w jasnym polu z wzbudzeniem 440 nanometrów lub 490 nanometrów i emisją 535 nanometrów co 30 sekund.

Po dwóch minutach dodaj 10 razy 10 do sześcioma izowanymi fitzy zy piaskiem na środku naczynia i kontynuuj obrazowanie przez 30 minut. Po 30 minutach zatrzymaj akwizycję poklatkową i uruchom stoper. Przesuń scenę i zrób 10 lub więcej zdjęć w różnych polach widzenia, aby w ciągu pięciu minut zobrazować inne strefy vaga.

W tej procedurze rozmrozić roztwory kalibracyjne i ogrzać je do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Sprawdź pH za pomocą pH-metru i zapisz je. Następnie zamontuj pompę perystaltyczną na szklanym dnie naczynia przed akwizycją obrazu.

Następnie wykonaj mikroskopię wideo na żywo pod koniec 30-minutowego okresu akwizycji. Włącz pompę, aby usunąć roztwór z naczynia. Następnie dodaj jeden mililitr pierwszego roztworu kalibracyjnego i zatrzymaj pompę.

Poczekaj pięć minut, aż sygnał się ustabilizuje. Powtórz procedurę z każdym roztworem kalibracyjnym. Aby przeanalizować filmy poklatkowe i migawki fagosomów, otwórz obrazy z obrazem J.Odejmij tło w kanale 490, rysując mały kwadratowy ROI w obszarze bez komórek.

Korzystanie z narzędzia do zaznaczania wielokątów kwadratowych i klikanie wtyczek. Następnie odejmowanie BG. Prześlij ten sam zwrot z inwestycji w kanale 440, klikając edytuj.

Następnie wybór, a następnie przywróć wybór i powtórz procedurę odejmowania tła. Utwórz 32-bitowy obraz kanału 490 podzielony przez kanał 440, klikając proces pierwszego kliknięcia. Następnie kalkulator obrazu.

Następnie wybierz odpowiednie obrazy w menu rozwijanym obrazu pierwszego i obrazu drugiego. Wybierz opcję podziel w menu rozwijanym operacji i zaznacz pole wyboru 32-bitowego wyniku. Następnie zmień tabelę wyszukiwania kodowania kolorami na kodowanie kolorami zgodne ze stosunkiem, klikając obraz, a następnie tabele w górę.

Następnie tęczowe RGB. Ustaw próg dla obrazu o proporcjach, aby wyeliminować piksele zera i nieskończoności, klikając obraz. Następnie dostosuj, a następnie próg.

Dostosuj paski przewijania tak, aby Xan był wyświetlany na czerwono, a następnie kliknij przycisk Zastosuj, a następnie upewnij się, że pole wyboru ustaw piksele tła na nan jest zaznaczone. Jeśli wartości sygnału tła i Xan dają bardzo podobne wartości proporcji, co skutkuje obrazem o zaszumionym współczynniku, dodaj z powrotem niewielką ilość tła do kanału 440, klikając przycisk proces. Potem matematyka.

Następnie dodaj, a następnie przerób obraz proporcji, aby uzyskać czystszy efekt. Alternatywnie pomiń 440-kanałowe odejmowanie tła. Następnie połącz ten stos proporcji z kanałem jasnego pola w kompozyt wielokanałowy, klikając kolor obrazu.

Następnie scal kanały. Wybierz obraz w jasnym polu z menu rozwijanego kanału szarego i obraz proporcji z menu rozwijanego kanału zielonego. Następnie zaznacz pole wyboru Zachowaj obrazy źródłowe.

Następnie zeskanuj filmy poklatkowe lub migawki porównujące kanały jasnego pola i proporcji, aby określić, które fagosomy mają być analizowane, narysuj ROI wokół fagosomów za pomocą narzędzia do zaznaczania owalnych wielokątów i dodaj je do menedżera ROI, klikając narzędzia analizy. Następnie menedżer ROI, a następnie dodaj, zmierz ich współczynnik intensywności Xan, klikając więcej wielu miar i odznacz pole wyboru jeden wiersz na plasterek. Do filmów poklatkowych.

Śledź strefy FGA pojedynczo, rysując kontrolkę typu ROI M, aby zmierzyć każdy punkt czasowy i przesunąć ROI w razie potrzeby, aby śledzić wartości intensywności w czasie. Następnie skopiuj pomiary z okna wyników do arkusza kalkulacyjnego, aby przeliczyć wartości fluorescencji na pH. Po zmierzeniu stosunku 490 do 440 dla fagosomów w filmach poklatkowych z kalibracją w arkuszu kalkulacyjnym, wykreśl wartości proporcji w czasie.

Następnie oblicz średnie wartości proporcji dla wszystkich fagosomów w polu widzenia w pięciu punktach czasowych w środku okresu odpowiadającego każdemu roztworowi kalibracyjnemu pH. Wykreśl te średnie wartości proporcji od 490 do 440 w stosunku do rzeczywistego zmierzonego pH, łącząc co najmniej trzy niezależne kalibracje na jednym wykresie. Następnie wykonaj analizę regresji nieliniowej w celu uzyskania równania do przekształcenia wartości stosunku do pH.

Ten rysunek pokazuje, jak rozróżnia się fagosomy i spożyty Xan. Lewy panel pokazuje scalony obraz w jasnym polu i proporcje 490 do 440 Fitz zy. Natomiast prawy panel pokazuje sam obraz w jasnym polu.

Fagosomy można odróżnić od cząstek zewnętrznych, które albo nie lokalizują się razem z komórkami, albo których fluorescencja nie pasuje do ciemnego środka otoczonego jaśniejszym pierścieniem charakterystycznym dla fagosomów na pokazanym obrazie jasnego pola. Oto typowe przebiegi czasowe neutrofili typu dzikiego i HV CN jeden nokaut FGA omal pH w neutrofilach typu dzikiego, pH neu obojętne lub lekko zasadowe we wczesnych punktach czasowych Po spożyciu fagosomy neutrofili HV CN z nokautem jeden mogą być alkaliczne lub kwaśne. Migawki wykonane od 30 do 35 minut po dodaniu celów pozwalają na obliczenie średniego małego pH populacji na podstawie dużej liczby fagosomów na histogramach wskaźników Fitz Xan pokazanych tutaj.

Mogliśmy zobaczyć różnice w małym pH między neutrofilami typu dzikiego a HVCN z nokautem Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu sześciu godzin. Zaczynając od etapu optymalizacji podczas wykonywania tej procedury, należy pamiętać o optymalizacji warunków obrazowania. Po pierwsze, optymalizacja stężenia przeciwciał na etapie optymalizacji może być również pomocna w zapewnieniu silnej fagocytozy Po tej procedurze.

Inne metody, takie jak pomiar produkcji Rossa lub pomiar zabijania bakterii, można wykonać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy mały Ross lub zdolność fagosomu do zabijania bakterii zmienia się wraz z pH po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią fagocytów do zbadania, jakie czynniki wpływają na zdolność komórek fagocytarnych do zabijania lub przetwarzania spożytych materiałów w celu wywołania dalszych odpowiedzi immunologicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać geometryczną mikroskopię fluorescencyjną w celu pomiaru parametrów fizjologicznych fagosomów w czasie rzeczywistym w żywych komórkach.

Nie zapominaj, że praca z inhibitorami UNIFOR i żywymi komórkami może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek.