Name: Pomiar pH fagosomu za pomocą ratiometrycznej mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Poznaj ratiometryczną mikroskopię fluorescencyjną do pomiaru pH fagosomu w żywych fagocytach. Ta technika umożliwia monitorowanie zmian pH w czasie rzeczywistym, co jest kluczowe dla zrozumienia dojrzewania fagosomów i interakcji z patogenami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wspierani finansowo przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki poprzez grant operacyjny nr 31003A-149566 (dla N.D.) oraz The Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust poprzez dotację dla młodych badaczy (dla P.N.).

Oświadczenie etyczne: Wszystkie manipulacje na zwierzętach zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z wytycznymi Komitetu Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu Genewskiego.
1. Przygotowanie celów fagocytarnych
<ol>
	<li>Dodać 20 mg suszonego zymosanu do 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wirować i podgrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut. Schłodzić i odwirować przy 2 000 x g przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant, ponownie zawiesić w 1 ml PBS i poddać sonikacji przez 10 minut w sonikatorze łaźni wodnej. Przenieś 500 μl do dwóch probówek o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 11 000 x g przez 5 min.</li>
	<li>Powtórz pranie z 500 μl PBS. Ugotowany zymozan można porcjować, zamrażać i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Umyć zymosan dwukrotnie w 500 μl świeżo przygotowanego 0,1 M Na2CO3, pH 9,3 jak wyżej (krok 1.2).</li>
	<li>Zawiesić ponownie w 490 μl po ostatnim praniu. Dodać 10 μl 10 mg/ml FITC rozpuszczonego w dimetylosulfotlenku (DMSO), zwirować, przykryć folią i inkubować z mieszaniem przez 4 godziny w temperaturze suchej masy.</li>
	<li>Aby usunąć niezwiązany barwnik, przemyj jak wyżej (krok 1.2), najpierw 0,5 ml DMSO + 150 μl PBS, następnie 0,5 ml DMSO + 300 μl PBS, następnie 0,5 ml DMSO + 450 μl PBS, a następnie sam PBS.</li>
	<li>Policz zymosan za pomocą hemocytometru. Dodać 1 μl zymosanu do 500 μl PBS, odwirować, a następnie dodać 10 μl do krawędzi komory hemocytometru, gdzie styka się ze szkiełkiem nakrywkowym umieszczonym nad siatką centralną. Zamontuj hemocytometr na mikroskopie jasnego pola wyposażonym w obiektyw 20X.</li>
	<li>Skoncentruj się na lewym górnym rogu zawierającym 16 kwadratów i policz wszystkie cząsteczki zymosanu w tym obszarze za pomocą ręcznego licznika zliczania. Powtórz tę czynność z prawym dolnym rogiem. Obliczyć stężenie zymosanu, korzystając z następującego równania: Stężenie zymosanu = Liczba/2 x 500 x 104 zymosan/ml. Znakowany zymozan może być podawany, zamrażany i przechowywany w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Opsonizować znakowany zymosan za pomocą króliczego przeciwciała anty-zymosanu w rozcieńczeniu 1:100. Wirować i inkubować przez 1 godzinę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Umyć 500 μl PBS jak wyżej (krok 1.2). 
	Uwaga: Sonikacja jest wysoce zalecana, szczególnie po opsonizacji, ponieważ zymosan ma tendencję do tworzenia grudek, które mogą utrudniać późniejszą analizę. Jako alternatywę można zastosować opsonizację 65% v/v surowicy szczurzej lub ludzkiej.</li>
	<li>Policz zymozan za pomocą hemocytometru, jak opisano w krokach 1.7-1.8, i rozcieńczyć do 100 x 106 cząstek/ml. Alternatywnie można przeprowadzić opsonizację z innymi stymulatorami fagocytarnymi, takimi jak opsonizacja dopełniacza lub brak opsonizacji.</li>
</ol>
2. Mikroskopia wideo na żywo
<ol>
	<li>Wyizoluj pierwotne neutrofile myszy, jak opisano szczegółowo w innym miejscu38.
	<ol>
		<li>Alternatywnie użyj dowolnego typu komórek fagocytarnych. Przechowywać neutrofile na lodzie w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionej 5% płodową surowicą cielęcą (v/v), 200 U penicyliny/streptomycyny, w stężeniu 10 x 106 komórek/ml, aż będzie gotowa do użycia. Inne typy komórek można wysiewać 1-4 dni wcześniej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 2 x 105 (20 μl) neutrofili do środka naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm, rozprowadzić kroplę, dodając 50 μl pożywki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut, aby umożliwić przyleganie komórek.</li>
	<li>Dodać 1 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) ogrzanego do temperatury 37 °C, zawierającego specyficzny inhibitor MPO, hydrazyd 4-aminobenzoesowy (4-ABH, 10 μM). Nieswoiste inhibitory MPO, takie jak azydek sodu (5 mM), mogą być również stosowane, ale ostatnio zasugerowano, że wywierają dodatkowe niespecyficzne skutki na pH 39.</li>
	<li>Zamontuj czaszę na szerokokątnym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w system grzewczy 37 °C i obiektyw olejowy 40X. Inkubować komórki bez obrazowania przez 10 minut, aby umożliwić komórkom i sprzętowi zrównoważenie się.</li>
	<li>Dostosuj ustawienia mikroskopu, aby uzyskać obraz transmisyjny w jasnym polu [kontrast fazowy lub różnicowy kontrast interferencyjny (DIC), jeśli jest dostępny] ze wzbudzeniem 440 nm lub 490 nm i emisją 535 nm co 30 sekund.</li>
	<li>Dostosuj czas ekspozycji i częstotliwość akwizycji zgodnie z systemem mikroskopu, aby uniknąć zbyt dużego fotowybielania i fototoksyczności oraz w zależności od zadawanych pytań eksperymentalnych. Rozpocznij akwizycję obrazu.</li>
	<li>Po 2 minutach dodaj 10 x 106 (50 μl) opsonizowanego FITC-zymosanu na środek naczynia. Dostosuj proporcje cel:komórka w zależności od rodzaju użytego fagocytu i celu.</li>
	<li>Kontynuuj obrazowanie przez 30 minut. Po 30 minutach zatrzymaj akwizycję poklatkową i uruchom stoper. Przesuń scenę i zrób 10 lub więcej migawek w różnych polach widzenia, aby zobrazować inne fagosomy, a wszystko to w ciągu 5 minut.</li>
</ol>
3. Eksperymenty kalibracyjne i kontrolne
<ol>
	<li>Przygotować roztwory wzorcowe pH (przepisy są opisane w tabeli 1) przed dniem doświadczenia i zamrozić w 10 ml podwielokrotności. Rozmrozić roztwory kalibracyjne i ogrzać je do temperatury 37 °C w łaźni wodnej. Sprawdź pH za pomocą pH-metru i zapisz rzeczywiste pH roztworów.</li>
	<li>Zamontuj pompę perystaltyczną na szklanym dnie naczynia przed akwizycją obrazu i wykonaj mikroskopię wideo na żywo, jak opisano powyżej (sekcja 2).</li>
	<li>Pod koniec 30-minutowego okresu pobierania włącz pompę, aby usunąć roztwór z naczynia, dodaj 1 ml pierwszego roztworu kalibracyjnego i zatrzymaj pompę.</li>
	<li>Poczekaj, aż sygnał się ustabilizuje, zwykle 5 minut. Powtórz z każdym roztworem kalibracyjnym.
	<ol>
		<li>Wykonaj co najmniej jedną kalibrację na dzień doświadczalny i kalibruj, zaczynając od najwyższego pH i pracując sekwencyjnie do najniższego, a także zaczynając od najniższego pH i pracując sekwencyjnie w kierunku najwyższego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jako kontrolę, dodać 100 μl 100 μM inhibitora oksydazy NADPH jodku difenylopropionium (DPI) rozcieńczonego w HBSS do komórek w 900 μl HBSS w naczyniu ze szklanym dnem i inkubować przez 10 minut.</li>
	<li>Rozpocznij akwizycję i dodaj zymosan jak powyżej (krok 2.7). Po 15 minutach fagocytozy dodać 10 μl 10 μM inhibitora V-ATPazy konkanamycyny A (ConcA) rozcieńczonej w HBSS i kontynuować obrazowanie przez dodatkowe 15 minut.</li>
</ol>
4. Analiza
<ol>
	<li>Analiza filmów poklatkowych i migawek fagosomów. 
	Uwaga: Poniższe instrukcje dotyczą ImageJ. Instrukcje krok po kroku mogą się znacznie różnić w zależności od używanego oprogramowania, ale funkcje opisane w tej sekcji są dostępne w większości profesjonalnych programów do analizy obrazu.
	<ol>
		<li>Otwórz obrazy za pomocą profesjonalnego oprogramowania do analizy obrazu. Odejmij tło w kanale 490, rysując mały kwadratowy ROI za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów kwadratowych w obszarze, w którym nie ma komórek, i klikając Wtyczki> Odejmowanie BG od ROI. Następnie prześlij ten sam zwrot z inwestycji na kanale 440, klikając Edytuj> Wybór> Przywróć zaznaczenie i powtórz.</li>
		<li>Utwórz obraz o proporcjach 32-bitowych kanału 490 podzielony przez kanał 440, klikając Process>Image Calculator... , wybierając odpowiednie obrazy z menu rozwijanych Image1 i Image2, a następnie wybierając opcję "Divide" w menu rozwijanym Operation (Operacja) i zaznaczając pole wyboru 32-bit (float) result.</li>
		<li>Zmień tabelę odnośników kodowania kolorami na tabelę kolorów zgodną ze stosunkiem, klikając pozycję Obraz> Tabele przeglądowe> Tęcza RGB. Określ próg proporcji obrazu, aby wyeliminować piksele 0 i nieskończoności, klikając Obraz> Dostosuj> Próg.... Dostosuj paski przewijania tak, aby zymosan był wyświetlany na czerwono i kliknij przycisk Zastosuj, upewniając się, że pole wyboru Ustaw piksele tła na NaN jest zaznaczone.</li>
		<li>Połącz ten stos proporcji z kanałem jasnego pola w kompozyt wielokanałowy, klikając opcję Obraz> Kolor> Scal kanały i wybierając obraz w jasnym polu z menu rozwijanego kanału szarego oraz obraz proporcji w menu rozwijanym kanału zielonego, a następnie zaznaczając pole wyboru Zachowaj obrazy źródłowe. Zeskanuj filmy poklatkowe lub migawki, aby określić, które fagosomy mają być analizowane. Kanał jasnego pola jest do tego przydatny.</li>
		<li>Narysuj obszary zainteresowania (ROI) za pomocą narzędzia do zaznaczania owalnych wielokątów wokół fagosomów i dodaj je do menedżera ROI, klikając Analizuj> Narzędzia > Menedżer ROI> Dodaj. Zmierz ich współczynnik intensywności zymozanu, klikając Więcej> Multi-Measure i usuwając zaznaczenie pola wyboru Jeden wiersz na plasterek.</li>
		<li>W przypadku filmów poklatkowych śledź fagosomy pojedynczo, rysując ROI, wpisując Ctrl + M, aby zmierzyć każdy punkt czasowy i przesuwając ROI, gdy to konieczne, aby śledzić wartości intensywności w czasie. Skopiuj pomiary z okna Wyniki do arkusza kalkulacyjnego. 
		Uwaga: Analiza 15 (5 kursów czasowych na eksperyment x 3) niezależnych eksperymentów jest idealna, ale może być wymagana mniej więcej w zależności od zaobserwowanej zmienności. Zapisywanie zwrotów z inwestycji jest zawsze zalecane. Niektóre pakiety oprogramowania umożliwiają rejestrację obrazu i dynamiczną aktualizację ROI, ułatwiając tę część analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konwersja z wartości fluorescencji na wartości pH
	<ol>
		<li>Zmierzyć stosunek 490/440 dla fagosomów w filmach poklatkowych z kalibracji, jak opisano w sekcji 4.1.</li>
		<li>W arkuszu kalkulacyjnym wykreśl wartości proporcji w czasie i oblicz średnie wartości proporcji ze wszystkich fagosomów w polu widzenia (zwykle od 5 do 20) z 5 punktów czasowych w środku okresu odpowiadającego każdemu roztworowi kalibracyjnemu pH. (Patrz również czerwone pola na rysunku 5A.)</li>
		<li>Wykreśl te średnie wartości proporcji 490/440 w stosunku do rzeczywistego zmierzonego pH. Połącz co najmniej 3 niezależne kalibracje w jeden wykres. Użyj pakietu oprogramowania statystycznego lub numerycznego, aby wykonać regresję nieliniową (krzywą najlepszego dopasowania), zwykle do równania sigmoidalnego. 
		Uwaga: Na przykład na rysunku 5B użyte równanie było sigmoidalnym Boltzmannem [Y = Dół + ((Góra-Dół)/(1+EXP((V50-X)/Nachylenie))], gdzie wartości Y to proporcje 490/440, X to wartości pH, a parametry górne, dolne, V50 i nachylenie są obliczane przez oprogramowanie.</li>
		<li>Użyj uzyskanego równania, aby przekształcić wartości proporcji na pH, 
		Uwaga: Na przykład na rysunku 5B równanie otrzymane dla krzywej kalibracyjnej w obecności azydku sodu to stosunek 490/440 = 1,103 + [(2,89-1,103)/(1+EXP((6,993-pH)/0,9291)]. Rozwiązanie dla pH daje następujące równanie: pH = 6,993 - 0,9291*[LN((1,178/(Stosunek-1,103))-1))].</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Yeung, T., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+signaling+and+the+modulation+of+surface+charge+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis.</a> Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Fairn, G. D., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+nascent+phagosomes+mature+to+become+phagolysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes.</a> Trends Immunol. 33 (8), 397-405 (2012).</li>
<li>Nunes, P., Demaurex, N., Dinauer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+NADPH+oxidase+and+associated+ion+fluxes+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Regulation of the NADPH oxidase and associated ion fluxes during phagocytosis.</a> Traffic. 14 (11), 1118-1131 (2013).</li>
<li>Binder, B., Holzhutter, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hypothetical+model+of+cargo-selective+rab+recruitment+during+organelle+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation.</a> Cell Biochem Biophys. 63 (1), 59-71 (2012).</li>
<li>Hurtado-Lorenzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V-ATPase+interacts+with+ARNO+and+Arf6+in+early+endosomes+and+regulates+the+protein+degradative+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">V-ATPase interacts with ARNO and Arf6 in early endosomes and regulates the protein degradative pathway.</a> Nat Cell Biol. 8 (2), 124-136 (2006).</li>
<li>Weisz, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidification+and+protein+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Acidification and protein traffic.</a> Int Rev Cytol. 226, 259-319 (2003).</li>
<li>Huynh, K. K., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+vacuolar+pH+and+its+modulation+by+some+microbial+species%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).</li>
<li>De Vito, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sodium%2Fhydrogen+exchanger%3A+a+possible+mediator+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity.</a> Cell Immunol. 240 (2), 69-85 (2006).</li>
<li>Moreland, J. G., Davis, A. P., Bailey, G., Nauseef, W. M., Lamb, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anion+channels%2C+including+ClC-3%2C+are+required+for+normal+neutrophil+oxidative+function%2C+phagocytosis%2C+and+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Anion channels, including ClC-3, are required for normal neutrophil oxidative function, phagocytosis, and transendothelial migration.</a> J Biol Chem. 281 (18), 12277-12288 (2006).</li>
<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+reactions+and+microbial+killing+in+the+neutrophil+phagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome.</a> Antioxid Redox Signal. 18 (6), 642-660 (2013).</li>
<li>Seredenina, T., Demaurex, N., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-Gated+Proton+Channels+as+Novel+Drug+Targets%3A+From+NADPH+Oxidase+Regulation+to+Sperm+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Voltage-Gated Proton Channels as Novel Drug Targets: From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology.</a> Antioxid Redox Signal. , (2014).</li>
<li>Kotsias, F., Hoffmann, E., Amigorena, S., Savina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+production+in+the+phagosome%3A+impact+on+antigen+presentation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species production in the phagosome: impact on antigen presentation in dendritic cells.</a> Antioxid Redox Signal. 18 (6), 714-729 (2013).</li>
<li>Grimm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-+and+macrophage-targeted+NADPH+oxidase+mediates+antifungal+host+defense+and+regulation+of+acute+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte- and macrophage-targeted NADPH oxidase mediates antifungal host defense and regulation of acute inflammation in mice.</a> J Immunol. 190 (8), 4175-4184 (2013).</li>
<li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).</li>
<li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.%22%5BJournal%5D)">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J Cell Sci.. 116 (Pt 16), 3387-3397 (2003).</li>
<li>Ramsey, I. S., Moran, M. M., Chong, J. A., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+voltage-gated+proton-selective+channel+lacking+the+pore+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain.</a> Nature. 440 (7088), 1213-1216 (2006).</li>
<li>El Chemaly, A., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+Hv1+proton+channels+regulate+the+ionic+and+redox+homeostasis+of+phagosomes%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Do Hv1 proton channels regulate the ionic and redox homeostasis of phagosomes?</a> Mol Cell Endocrinol. 353 (1-2), 82-87 (2012).</li>
<li>El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hv1+proton+channels+differentially+regulate+the+pH+of+neutrophil+and+macrophage+phagosomes+by+sustaining+the+production+of+phagosomal+ROS+that+inhibit+the+delivery+of+vacuolar+ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases.</a> J Leukoc Biol. , (2014).</li>
<li>Decoursey, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+proton+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated proton channels.</a> Compr Physiol. 2 (2), 1355-1385 (2012).</li>
<li>Ramsey, I. S., Ruchti, E., Kaczmarek, J. S., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hv1+proton+channels+are+required+for+high-level+NADPH+oxidase-dependent+superoxide+production+during+the+phagocyte+respiratory+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hv1 proton channels are required for high-level NADPH oxidase-dependent superoxide production during the phagocyte respiratory burst.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7642-7647 (2009).</li>
<li>Sturgill-Koszycki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+acidification+in+Mycobacterium+phagosomes+produced+by+exclusion+of+the+vesicular+proton-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase.</a> Science. 263 (5147), 678-681 (1994).</li>
<li>Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulent+and+avirulent+strains+of+Francisella+tularensis+prevent+acidification+and+maturation+of+their+phagosomes+and+escape+into+the+cytoplasm+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages.</a> Infect Immun. 72 (6), 3204-3217 (2004).</li>
<li>Alpuche-Aranda, C. M., Swanson, J. A., Loomis, W. P., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+activates+virulence+gene+transcription+within+acidified+macrophage+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (21), 10079-10083 (1992).</li>
<li>Lukacs, G. L., Rotstein, O. D., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+the+phagosomal+pH+in+macrophages.+In+situ+assessment+of+vacuolar+H%28%2B%29-ATPase+activity%2C+counterion+conductance%2C+and+H%2B+%27leak%27%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Determinants of the phagosomal pH in macrophages. In situ assessment of vacuolar H(+)-ATPase activity, counterion conductance, and H+ 'leak'.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24540-24548 (1991).</li>
<li>Watanabe, K., Kagaya, K., Yamada, T., Fukazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+candidacidal+activity+in+macrophages+activated+by+recombinant+gamma+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Mechanism for candidacidal activity in macrophages activated by recombinant gamma interferon.</a> Infect Immun. 59 (2), 521-528 (1991).</li>
<li>Ip, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+phagosome+acidification+are+required+for+pathogen+processing+and+MyD88-dependent+responses+to+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and phagosome acidification are required for pathogen processing and MyD88-dependent responses to Staphylococcus aureus.</a> J Immunol. 184 (12), 7071-7081 (2010).</li>
<li>Clarke, M., Maddera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocyte+meets+prey%3A+uptake%2C+internalization%2C+and+killing+of+bacteria+by+Dictyostelium+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocyte meets prey: uptake, internalization, and killing of bacteria by Dictyostelium amoebae.</a> Eur J Cell Biol. 85 (9-10), 1001-1010 (2006).</li>
<li>Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+the+phagosomal+pH+in+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Determinants of the phagosomal pH in neutrophils.</a> J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).</li>
<li>Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+burst+of+phagocytic+cells+is+associated+with+a+rise+in+vacuolar+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH.</a> Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).</li>
<li>Savina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX2+controls+phagosomal+pH+to+regulate+antigen+processing+during+crosspresentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells.</a> Cell. 126 (1), 205-218 (2006).</li>
<li>Rybicka, J. M., Balce, D. R., Chaudhuri, S., Allan, E. R., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomal+proteolysis+in+dendritic+cells+is+modulated+by+NADPH+oxidase+in+a+pH-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner.</a> EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).</li>
<li>Mantegazza, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+controls+phagosomal+pH+and+antigen+cross-presentation+in+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells.</a> Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).</li>
<li>Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-Interferon-inducible+lysosomal+thiol+reductase+%28GILT%29+maintains+phagosomal+proteolysis+in+alternatively+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages.</a> J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).</li>
<li>Sanjurjo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scavenger+protein+apoptosis+inhibitor+of+macrophages+%28AIM%29+potentiates+the+antimicrobial+response+against+Mycobacterium+tuberculosis+by+enhancing+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy.</a> PLoS One. 8 (11), e79670(2013).</li>
<li>Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Utility+of+Chloroquine+in+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Res+Opin%22%5BJournal%5D)">The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy.</a> Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).</li>
<li>Ohkuma, S., Poole, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probe+measurement+of+the+intralysosomal+pH+in+living+cells+and+the+perturbation+of+pH+by+various+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).</li>
<li>El Chemaly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSOP%2FHv1+proton+channels+sustain+calcium+entry%2C+neutrophil+migration%2C+and+superoxide+production+by+limiting+cell+depolarization+and+acidification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification.</a> J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).</li>
<li>Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HVCN1+channel+conducts+protons+into+the+phagocytic+vacuole+of+neutrophils+to+produce+a+physiologically+alkaline+pH%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH.</a> bioRxiv. , (2014).</li>
<li>Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+and+regulation+of+the+cellular+responses+to+cold+shock%3A+the+responses+in+yeast+and+mammalian+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems.</a> Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).</li>
<li>Yui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basolateral+targeting+and+microtubule-dependent+transcytosis+of+the+aquaporin-2+water+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).</li>
<li>Griffiths, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+phagosome+individuality+and+membrane+signalling+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">On phagosome individuality and membrane signalling networks.</a> Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).</li>
<li>Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+the+mitochondrial+proton+gradient+during+cytosolic+calcium+elevations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations.</a> J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż mikroskopia jest bardziej czasochłonna niż metody alternatywne, takie jak spektroskopia i FACS, które wykorzystują podobną strategię stosowania barwnika wrażliwego na pH w połączeniu z celami, ale mierzą średnie pH populacji fagosomów, ma kilka zalet. Po pierwsze, cząstki związane wewnętrznie i zewnętrznie, ale nie zinternalizowane, można łatwo odróżnić bez konieczności dodawania innych substancji chemicznych, takich jak błękit trypanowy lub przeciwciała, w celu odpowiednio wygaszenia lub oznakowania cząstek zewn...

Fagocytoza, proces, w którym wrodzone komórki odpornościowe pochłaniają duże cząsteczki, wyewoluował z mechanizmu jedzenia organizmów jednokomórkowych i polega na związaniu się z celem, owinięciu go błoną i ściśnięciu błony, tworząc wakuolę w cytozolu zwaną fagosomem. Podczas gdy błona fagosomalna wywodzi się z błony plazmatycznej, aktywne sortowanie białek i lipidów, a także fuzja z endomembranami podczas tworzenia fagosomu, przekształcają fagosom w odrębne organelle w komórce o właściwościach degradacyjnych, które umożliwiają zabijanie, neutralizację i rozkład spożytego materiału1-3. Proces ten, zwany dojrzewaniem fagosomalnym, opiera się na dostarczaniu wielu enzymów proteolitycznych i bakteriobójczych, w tym oksydazy fosforanu dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADPH), która przenosi elektrony do fagosomów, wytwarzając silny utleniaczO2- i jego pochodną reaktywne formy tlenu (ROS) 2,4. 
Luminalne pH fagosomów ma głęboki wpływ na kilka zdarzeń wymaganych do funkcjonowania fagosomu. Po pierwsze, pH wpływa ogólnie na transport endobłon, ponieważ zależne od pH zmiany konformacyjne transbłonowych regulatorów transportu zmieniają rekrutację determinantów transportu, takich jak Arfs, Rabs i pęcherzykowe białka płaszcza, które z kolei określają, które pęcherzyki mogą łączyć się z fagosomami 5-8. Po drugie, skład jonowy światła fagosomalnego jest również przekształcany w miarę dojrzewania fagosomów, a niektóre transportery jonów, takie jak wymiennik Na + / H+ lub antyportery Cl- / H+ z rodziny ClC, które promują funkcję fagocytarną, opierają się na translokacji H+ 9,10. Podobnie, produkcja ROS jest ściśle związana z fagosomalnym pH. ROS i jego toksyczne produkty uboczne utleniania od dawna są uznawane za kluczowe dla zabijania fagosomalów w neutrofilach 4,11,12 i wykazano, że odgrywają kluczową rolę w innych fagocytach, w tym makrofagach, komórkach dendrytycznych (DC) i amebach 13-16. Oksydaza NADPH jest enzymem elektrogenicznym, który uwalnia H+ w cytozolu podczas zużywania NADPH, a to wymaga jednoczesnego przenoszenia H+ przez towarzyszące kanały HVCN1 wraz z transportowanymi elektronami do światła fagosomalnego, w celu złagodzenia masywnej depolaryzacji, która w przeciwnym razie doprowadziłaby do samohamowania enzymu 17-21. Wreszcie, kilka enzymów proteolitycznych ma optymalną aktywność przy różnym pH, więc zależne od czasu zmiany pH fagosomalnego mogą wpływać na to, które enzymy są aktywne i kiedy. Znaczenie phagosomalnego pH podkreślają organizmy takie jak Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis i Salmonella typherium, które przynajmniej częściowo obalają zabijanie fagocytarów poprzez zmianę pH fagosomalnego 22-24.
U ssaków głównymi fagocytami są neutrofile, makrofagi i komórki dendrytyczne, a w zależności od typu komórki, zależne od czasu zmiany pH fagosomalnego mogą się znacznie różnić i wydają się odgrywać różne role. W makrofagach silne i szybkie zakwaszenie, w którym pośredniczy zależna od ATP wakuolarna ATPaza pompy protonowej (V-ATPaza) jest jednym z kluczowych czynników pośredniczących w zabijaniu 25-27, przypominając mechanizmy obecne w amebach, które wykorzystują fagocytozę jako mechanizm jedzenia 28. Uważa się, że w tych komórkach kluczową rolę odgrywa aktywacja kwaśnych proteaz. W przeciwieństwie do tego, zabijanie neutrofili opiera się bardziej na ROS, a także na HOCl wytwarzanym przez mieloperoksydazę (MPO)11, a pH pozostaje obojętne lub zasadowe przez pierwsze 30 minut, zakwaszając dopiero później 29,30. Sugeruje się, że neutralne pH sprzyja aktywności proteaz oksydacyjnych, takich jak niektóre katepsyny. W DC pH fagosomalne jest kontrowersyjne, przy czym niektóre zgłaszają zakwaszenie, a inne obojętne lub zasadowe pH 31,32, ale ROS i pH mogą głęboko wpływać na zdolność tych komórek do prezentowania antygenów limfocytom T, co jest jedną z ich głównych funkcji 33. 
Co ważne, hormony, chemokiny i cytokiny mogą wytwarzać zdarzenia sygnalizacyjne, które indukują dojrzewanie i zmiany w zachowaniu fagocytów, a to z kolei wpływa na pH fagosomalne 34,35. Podobnie leki, na przykład chlorochina przeciwmalaryczna, która jest również brana pod uwagę w terapiach przeciwnowotworowych 36, mogą wpływać na pH fagosomalne, a tym samym na wyniki immunologiczne. W związku z tym wielu biologów komórkowych, immunologów, mikrobiologów i twórców leków może być zainteresowanych pomiarem pH fagosomalnego, starając się zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw wpływu określonego zaburzenia genetycznego, związku bioaktywnego lub mikroorganizmu na wrodzoną i nabytą odpowiedź immunologiczną. 
Tutaj opisujemy metodę pomiaru pH fagosomalnego u neutrofili, która pozwoliła nam pokazać znaczenie kanału HVCN1 w regulacji pH fagosomalnego neutrofili 19. Metoda opiera się na właściwościach ratiometrycznych izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), którego emisja fluorescencji przy długości fali 535 nm jest wrażliwa na pH przy wzbudzeniu przy długości fali 490 nm, ale nie przy długości fali 440 nm 37. Kiedy ten barwnik jest chemicznie sprzężony z celem, w tym przypadku zymozanem, można go śledzić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o szerokim polu, w której komórki są obrazowane w miarę fagocytozy, a zmiany pH fagosomalnego są mierzone w czasie rzeczywistym w miarę dojrzewania fagosomu. Rzeczywiste pH jest następnie zbierane przez przeprowadzenie eksperymentu kalibracyjnego, w którym komórki, które uległy fagocytozowaniu, są wystawiane na działanie roztworów o różnym pH, które zawierają jonofory nigerycynę i monenzynę, które umożliwiają szybkie zrównoważenie pH w fagosomach z roztworem zewnętrznym. Wartości proporcji są następnie porównywane ze znanym pH roztworów, krzywa kalibracyjna jest konstruowana za pomocą regresji nieliniowej, a wynikowe równanie służy do obliczenia pH na podstawie wartości stosunku.

<table><tbody><tr><td>Zymosan A w proszku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4250</td><td>Istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>Istnieją różni dostawcy Przeciwciało</td></tr><tr><td>anty-zymozanowe (odczynnik opsonizujący Zymosan A Bioarticles)</td><td>Life Technologies</td><td>Z2850</td><td>Sigma-Aldrich O6637 jest równoważnym produktem. Alternatywnie 25% surowicy może być użyta jako odczynnik opsonizujący.</td></tr><tr><td>Hydrazyd 4-aminobenzoesowy (4-ABH)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-204107</td><td>Toksyczny, używaj rękawiczek, istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Chlorek difenyleniodonium (DPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2926</td><td>Toksyczny, używaj rękawiczek, istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Konkanamycyna A (ConcA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27689</td><td>Toksyczny, używaj rękawiczek, istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>Toksyczne, używaj rękawiczek, istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Monensin</td><td>Enzo</td><td>ALX-380-026-G001</td><td>Toksyczne, używaj rękawiczek, istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14200-075</td><td>Toksyczne, używaj rękawiczek, istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Roztwór soli równowagi Hanka</td> Life <td>Technologies</td><td>14025092</td><td>Zbilansowany roztwór soli Ringera lub inne przezroczyste fizjologiczne mogą zostać zastąpione.</td></tr><tr><td>Węglan sodu (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795</td><td>Istnieją różni dostawcy Kwas</td></tr><tr><td>2-(N-Morfolino)etanosulfonowy (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671&nbsp;</td><td>Istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>N-metylo-D-glukamina (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004&nbsp;</td><td>Istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Kwas glikolu etylenowego-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraoctowy (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3777</td><td>Istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503&nbsp;</td><td>Istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Etanol absolutny (EtOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td>Istnieją</td></tr> <tr><td>różni dostawcyPłytki Petriego ze szklanym dnem 35 mm (fluorodish)</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>Ibidi &mikro-przezroczyste szalki lub szkiełka nakrywkowe z odpowiednimi komorami obrazowania mogą być zastąpione</td></tr><tr><td>Sonikująca łaźnia wodna</td><td>O. Kleiner AG</td><td></td><td>Zamiast tego można użyć sonikatora, istnieją różni dostawcy instrumentów</td></tr><tr><td>Heamocytometr</td><td>Marienfeld GmbH</td><td></td><td>Istnieją</td></tr> <tr><td>różni dostawcy instrumentówMikroskop do obrazowania na żywo o szerokim polu</td><td>widzenia Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Istnieje wielu dostawców instrumentów, ale mikroskop musi być w stanie obrazować odpowiednio wzbudzenie/emisję 440/535 i 490/535. Konfokalne konfokalne z wirującym dyskiem z możliwością jasnego pola mogą zostać zastąpione, ale zymosan ma tendencję do częstszego wychodzenia z ostrości. &nbsp;</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna (Dynamax RP-1)</td><td>Rainin</td><td></td><td>Istnieją różni dostawcy przyrządów</td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Schott Gerate GmbH</td><td></td><td>Istnieją różni dostawcy przyrządów</td></tr><tr><td>Licznik ręczny</td><td>Milian SA</td><td></td><td>Istnieją różni dostawcy przyrządów</td></tr></tbody></table>

pomiar ph fagosomu za pomocą ratiometrycznej mikroskopii fluorescencyjnej

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Fagocytoza to podstawowy proces, w którym wrodzone komórki odpornościowe pochłaniają bakterie, komórki apoptotyczne lub inne obce cząstki w celu zabicia lub zneutralizowania spożytego materiału, lub przedstawienia go jako antygenów i zainicjowania adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych. pH fagosomów jest krytycznym parametrem regulującym rozszczepienie lub fuzję z endobłonami i aktywację enzymów proteolitycznych, zdarzeń, które umożliwiają wakuoli fagocytarnej dojrzewanie do organelli degradacyjnej. Ponadto translokacja H+ jest wymagana do produkcji wysokich poziomów reaktywnych form tlenu (ROS), które są niezbędne do skutecznego zabijania i sygnalizacji do innych tkanek gospodarza. Wiele patogenów wewnątrzkomórkowych obala zabijanie fagocytarne poprzez ograniczanie zakwaszenia fagosomalnego, co podkreśla znaczenie pH w biologii fagosomów. Tutaj opisujemy ratiometryczną metodę pomiaru pH fagosomalnego w neutrofilach przy użyciu zymosanu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) jako celów fagocytarnych oraz obrazowania żywych komórek. Test opiera się na właściwościach fluorescencyjnych FITC, który jest wygaszany przez kwaśne pH przy wzbudzeniu przy 490 nm, ale nie przy wzbudzeniu przy 440 nm, co pozwala na ilościowe określenie stosunku zależnego od pH, a nie bezwzględnej fluorescencji pojedynczego barwnika. Dostępny jest również szczegółowy protokół przeprowadzania kalibracji barwnika in situ i konwersji stosunku do rzeczywistych wartości pH. Metody ratiometryczne z pojedynczym barwnikiem są ogólnie uważane za lepsze od protokołów pseudoratiometrycznych z pojedynczą długością fali lub podwójnym barwnikiem, ponieważ są mniej wrażliwe na zakłócenia, takie jak wybielanie, zmiany ostrości, zmiany lasera i nierównomierne etykietowanie, które zniekształcają mierzony sygnał. Metodę tę można łatwo zmodyfikować w celu pomiaru pH w innych typach komórek fagocytarnych, a zymosan można zastąpić dowolną inną cząstką zawierającą aminy, od obojętnych kulek po żywe mikroorganizmy. Wreszcie, metoda ta może być dostosowana do wykorzystania innych sond fluorescencyjnych wrażliwych na różne zakresy pH lub inne aktywności fagosomalne, co czyni ją uogólnionym protokołem funkcjonalnego obrazowania fagosomów.

Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki eksperymentu, w którym porównano pH fagosomów w pierwotnych neutrofilach mysich izolowanych z szpiku kostnego myszy typu dzikiego oraz myszy Hvcn1-/- . Dla powodzenia eksperymentu ważne jest uzyskanie odpowiedniej liczby fagosomów w polu widzenia przez cały czas trwania filmu poklatkowego, przy jednoczesnym unikaniu zbyt dużej liczby fagosomów, co utrudniłoby późniejszą segmentację podczas analizy obrazu. Rysunek 1 przedst...

pH fagosomalne wpływa na dojrzewanie fagosomów, produkcję utleniaczy, zabijanie fagosomalów, a także na prezentację antygenu. W tym miejscu opisujemy ratiometryczną metodę pomiaru zmian pH w czasie i punkcie końcowym w poszczególnych fagosomach w żywych fagocytach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Pomiar pH fagosomu za pomocą ratiometrycznej mikroskopii fluorescencyjnej

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Ogólnym celem tego zestawu doświadczeń jest pomiar pH fagosomów w żywych komórkach przy użyciu ratiometrycznej mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii fagocytów, takie jak identyfikacja kluczowych cząsteczek w interakcjach z patogenami lub wpływ zaburzeń genetycznych bądź leków na fagocytozę. Główną zaletą tej techniki jest to, że w przeciwieństwie do metod opartych na populacjach, takich jak FACS czy spektroskopia, możliwe jest wykrycie efektów takich jak zmiany w wiązaniu cząsteczek, migracja lub heterogeniczność poszczególnych fagosomów.Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapie przeciwko patogennym organizmom chemicznym, ponieważ wiele z tych mikroorganizmów potrafi zmieniać pH fagosomów, aby uniknąć degradacji w ich wnętrzu. Aby rozpocząć tę procedurę, należy dodać 20 mg wysuszonego Xan do 10 mL sterylnego PBS, wymieszać w wortexie i podgrzewać w łaźni wodnej w temperaturze wrzenia przez 10 minut. Następnie schłodzić i odwirować przy 2000 ×g przez pięć minut.Następnie usuń nadsącz i resuspenduj Xan w 1 ml PBS. Poddaj próbkę sonikacji przez 10 minut w łaźni wodnej. Po sonikacji przenieś 500 µl resuspendowanego Xan do dwóch probówek o pojemności 1,5 ml i wiruj je przy 11 000 G przez pięć minut.Powtórzyć przemywanie 500 µL PBS. Następnie przemyć Xan dwukrotnie w 500 µL świeżo przygotowanego 0,1 M roztworu węglanu sodu o pH 9,3 i RESUSPENDOWAĆ w 490 µL roztworu węglanu sodu po końcowym przemywaniu. Następnie dodać 10 µL FZ rozpuszczonego w DMSO w stężeniu 10 mg/mL do Xan i wymieszać w wortexie.Przykryć folią i inkubować z wytrząsaniem przez cztery godziny w temperaturze pokojowej. Aby usunąć niezwiązany barwnik, najpierw przemyć 0,5 ml DMSO oraz 150 µl PBS, stosując sonikację pomiędzy etapami płukania. Następnie przemyć 0,5 ml DMSO oraz 300 µl PBS, a potem 0,5 ml DMSO oraz 450 µl PBS, a na koniec samym PBS. Po tym czasie dodać 1 µl Xan do 500 µl PBS i wymieszać w wortexie.Następnie nanieś 10 µL rozcieńczonego piasku xma na krawędź komory hemocytometru w miejscu styku z szkiełkiem nakrywkowym. Umieść hemocytometr na mikroskopie w świetle przechodzącym wyposażonym w obiektyw 20 x. Ustaw ostrość na górny lewy róg zawierający 16 pól i policz wszystkie cząsteczki piasku xma w tym obszarze. Korzystając z ręcznego licznika, powtórz procedurę w dolnym prawym rogu.Następnie oblicz stężenie Xan, korzystając z tego równania. W kolejnym kroku opsonizuj znakowane Xan przeciwciałem anty-Xan przeciwko wściekliznie w rozcieńczeniu 1:100, wymieszaj w wirówce i inkubuj próbkę przez jedną godzinę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Następnie policz cząstki Xan za pomocą hemocytometru, a następnie rozcieńcz je do stężenia 100 × 10⁶ cząsteczek na ml.Po wyizolowaniu pierwotnych neutrofili mysich, nanieś 2 × 10⁵ neutrofili na środek szalki z przeszklonym dnem o średnicy 35 mm. Następnie rozprowadź kroplę, dodając 50 µL pożywki, i inkubuj w temperaturze 37 °C przez pięć minut, aby umożliwić adhezję komórek. Po tym czasie dodaj 1 mL roztworu HBSS ogrzanego do 37 °C, zawierającego inhibitor mieloperoksydazy.Umieść szalkę na szerokopolowym mikroskopie fluorescencyjnym, wyposażonym w system grzewczy utrzymujący 37 °C oraz obiektyw immersyjny 40 x. Inkubuj komórki bez obrazowania przez 10 minut, aby umożliwić wyrównanie temperatury komórek i urządzenia. Następnie dostosuj ustawienia mikroskopu, aby co 30 sekund pozyskiwać obraz transmisyjny w świetle widzialnym z wzbudzeniem 440 nm lub 490 nm i emisją 535 nm.Po dwóch minutach dodaj 10 razy 10 do sześciu izowanych fitzy zy piasku do środka szalki i kontynuuj obrazowanie przez 30 minut. Po 30 minutach zatrzymaj akwizycję time-lapse i uruchom stoper. Przesuń stolik i wykonaj 10 lub więcej zdjęć w różnych polach widzenia, aby zobrazować inne strefy vaga w ciągu pięciu minut.W tej procedurze należy rozmrozić roztwory kalibracyjne i ogrzać je do 37 °C w kąpieli wodnej. Sprawdzić pH za pomocą pH-metru i zapisać wynik. Następnie, przed akwizycją obrazów, zamontować pompę perystaltyczną na szkiełku przedmiotowym z dna szklanego.Następnie przeprowadź mikroskopię wideo na żywo po zakończeniu 30-minutowego okresu akwizycji. Włącz pompę, aby usunąć roztwór z naczynia. Następnie dodaj jeden mililitr pierwszego roztworu kalibracyjnego i wyłącz pompę.Odczekać pięć minut do momentu ustabilizowania się sygnału. Powtórzyć procedurę dla każdego roztworu kalibracyjnego. W celu analizy filmów time-lapse oraz migawek fagosomów należy otworzyć obrazy w programie ImageJ. Odjąć tło w kanale 490, rysując mały kwadratowy ROI w obszarze pozbawionym komórek.Użyj narzędzia do zaznaczania kwadratowego wielokąta i kliknij wtyczki. Następnie wykonaj odejmowanie tła (BG subtraction). Prześlij ten sam obszar zainteresowania (ROI) na kanał 440, klikając edytuj.Następnie wykonaj zaznaczenie, po czym przywróć zaznaczenie i powtórz procedurę odejmowania tła. Utwórz 32-bitowy obraz stosunku kanału 490 do kanału 440, klikając najpierw proces, a następnie kalkulator obrazu.Następnie w menu rozwijanych „image one” i „image two” wybierz odpowiednie obrazy. W menu rozwijanym „operation” wybierz opcję „divide” i zaznacz pole wyboru „32 bit result”. Po tym zmień tabelę wyszukiwania kodowania kolorów na kodowanie kolorów zgodne z proporcjami, klikając „image”, a następnie „up tables”.Następnie wybierz skalę tęczową RGB. Ustaw próg dla obrazu stosunku, aby wyeliminować piksele o wartości zero i nieskończoność, klikając w obraz. Następnie dostosuj parametry, a następnie ustaw próg.Dostosuj suwaki tak, aby Xan pojawił się na czerwono, a następnie kliknij apply, upewniając się, że zaznaczono pole wyboru set background pixels to nan. Jeśli wartości sygnału tła i Xan dają bardzo podobne wyniki stosunku, co skutkuje zaszumionym obrazem stosunku, dodaj niewielką ilość tła do kanału 440, klikając process. Następnie wybierz math.Następnie dodaj i ponownie utwórz obraz stosunku, aby uzyskać czystszy wynik. Alternatywnie można pominąć odejmowanie tła z kanału 440. Następnie połącz ten stos stosunków z kanałem jasnego pola w kompozyt wielokanałowy, klikając kolor obrazu.Następnie dokonaj scalenia kanałów. W rozwijanym menu kanału szarego wybierz obraz w świetle przechodzącym, a w rozwijanym menu kanału zielonego wybierz obraz stosunku. Następnie zaznacz pole wyboru zachowaj obrazy źródłowe.Następnie przeskanuj filmy time-lapse lub klatki, porównując kanały w jasnym polu i kanały stosunku (ratio), aby określić, które fagosomy należy przeanalizować, obrysuj fagosomy obszarem zainteresowania (ROI) za pomocą narzędzia do zaznaczania owalnego wielokąta i dodaj je do menedżera ROI, klikając analyze tools, następnie ROI manager, a potem add. Następnie zmierz stosunek intensywności Xan, klikając more multi measure i odznaczając pole wyboru one row per slice. W przypadku filmów time-lapse.Śledź strefy FGA jedna po drugiej, rysując obszar zainteresowania (ROI) typu kontrola M, aby zmierzyć każdy punkt czasowy, i przesuwaj ROI w razie potrzeby, aby śledzić wartości intensywności w czasie. Następnie skopiuj pomiary z okna wyników do arkusza kalkulacyjnego, aby przeliczyć fluorescencję na wartości pH. Po zmierzeniu stosunku 490 do 440 dla fagosomów w filmach kalibracyjnych time-lapse w arkuszu kalkulacyjnym, przedstaw wartości tego stosunku na wykresie w funkcji czasu.Następnie oblicz średnie wartości stosunku dla wszystkich fagosomów w polu widzenia w pięciu punktach czasowych w środku okresu odpowiadającego każdemu roztworowi kalibracyjnemu pH. Przedstaw te średnie wartości stosunku 490 do 440 w funkcji rzeczywistego zmierzonego pH, łącząc co najmniej trzy niezależne kalibracje na jednym wykresie. Następnie przeprowadź nieliniową analizę regresji, aby uzyskać równanie pozwalające na przekształcenie wartości stosunku na pH.Rysunek ten przedstawia sposób rozróżniania fagosomów i wchłoniętego Xan. Lewy panel prezentuje nałożony obraz w świetle przechodzącym oraz obraz z filtrem 490 do 440 Fitz zy i stosunek. Natomiast prawy panel przedstawia sam obraz w świetle przechodzącym.Fagosomy można odróżnić od cząstek zewnętrznych, które albo nie współlokalizują z komórkami, albo których fluorescencja nie wykazuje ciemnego centrum otoczonego jaśniejszym pierścieniem, co jest charakterystyczne dla fagosomów na przedstawionym obrazie w polu jasnym. Przedstawiono typowe przebiegi czasowe dla neutrofili typu dzikiego oraz z nokautem HV CN one. pH w neutrofiliach typu dzikiego jest obojętne lub lekko zasadowe w wczesnych punktach czasowych. Po pochłonięciu fagosomy neutrofili z nokautem HV CN one mogą być albo zasadowe, albo kwasowe. Migawki wykonane od 30 do 35 minut po dodaniu celów pozwalają na obliczenie średniego pH populacji na podstawie licznej grupy fagosomów w przedstawionych tutaj histogramach stosunków Fitz Xan.Można było zaobserwować różnice w pH wewnątrzkomórkowym między neutrofilami typu dzikiego a neutrofilami z nokautem genu HVCN1. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać wykonana w ciągu sześciu godzin. Rozpoczynając od etapu optymalizacji podczas próby wykonania tej procedury, należy pamiętać o zoptymalizowaniu warunków obrazowania. Po pierwsze, pomocne może być zoptymalizowanie stężenia przeciwciał na etapie optymalizacji, aby zapewnić prawidłową fagocytozę po przeprowadzeniu tej procedury.W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, czy ilość ROS lub zdolność fagosomu do zabijania bakterii ulega zmianie wraz z pH po jego utworzeniu, można zastosować inne metody, np. pomiar produkcji ROS lub pomiar zabijania bakterii. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii fagocytów do zgłębiania czynników wpływających na zdolność komórek fagocytujących do zabijania lub przetwarzania pochłoniętych materiałów w celu wywołania dalszych odpowiedzi immunologicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat przeprowadzania geometrycznej mikroskopii fluorescencyjnej w celu pomiaru parametrów fizjologicznych fagosomów w czasie rzeczywistym w żywych komórkach.Należy pamiętać, że praca z inhibitorami UNIFOR i żywymi komórkami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek.

measuring-phagosome-ph-by-ratiometric-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje technikę mikroskopii TIRF (total internal reflection fluorescence) o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji w czasie rzeczywistym powstawania i zamykania fagosomów podczas fagocytozy za pośrednictwem makrofagów opsonizowanych IgG-opsonizowanych czerwonych krwinek (RBC) przyczepionych do powierzchni naczynia o szklanym dnie. Makrofagi rozciągają pseudopodia wokół erytrocytów i pochłaniają je wewnątrz fagosomów, odrywając je od powierzchni szkła.

Wizualizacja powstawania i zamykania fagosomów oparta na mikroskopii TIRF

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Badanie biogenezy fagolizosomów w żywych makrofagach

Dostępnych jest kilka metod pomiaru pH wewnątrzkomórkowego, ale bardzo niewiele z nich pozwala na jednoczesny pomiar pH cytoplazmatycznego i organellarnego. W tym miejscu szczegółowo opisujemy szybką i dokładną metodologię jednoczesnego pomiaru pH cytoplazmatycznego i pęcherzykowego za pomocą obrazowania ratiometrycznego żywych komórek.

Jednoczesny pomiar pH w przedziałach endocytarnych i cytozolowych w żywych komórkach przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Tutaj prezentujemy protokół ilościowego oznaczania fagocytozy cząstek fluorescencyjnych za pomocą przylegającej linii komórkowej makrofagów przy użyciu metody fluorometrycznej. Metoda ta ułatwia wysokoprzepustową kwantyfikację internalizacji cząstek, a także wynikającą z niej polimeryzację aktyny.

Wysokoprzepustowa technika fluorometryczna do oceny fagocytozy makrofagów i polimeryzacji aktyny

Opisujemy eksperymentalny układ do wizualizacji z bezprecedensową wysoką rozdzielczością tworzenia i zamykania fagosomów w trzech wymiarach u żywych makrofagów, przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Umożliwia monitorowanie podstawy miseczki fagocytarnej, rozciągających się pseudopodów, a także dokładnego miejsca rozszczepienia fagosomu.

"Test zamykania fagosomu" do wizualizacji powstawania fagosomów w trzech wymiarach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM)

Ten manuskrypt opisuje prostą metodę pomiaru pH i powierzchni fagosomalnej oraz cytoplazmatycznego pH neutrofili ludzkich i mysich za pomocą wskaźnika ratiometrycznego seminaphthorhodafluor (SNARF)-1 lub S-1. Osiąga się to za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek i analizy obrazu.

Obrazowanie fagosomu neutrofili i cytoplazmy za pomocą ratiometrycznego wskaźnika pH

Znakowanie domeny zewnątrzkomórkowej białka błonowego za pomocą wrażliwego na pH fluoroforu, superekliptycznej pHluoryny (SEP), pozwala na określenie subkomórkowej lokalizacji, ekspresji i transportu. Obrazowanie białek znakowanych SEP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) umożliwia ilościowe określenie poziomów białek w obwodowej ER i błonie plazmatycznej.

Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Efferocytoza, fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych, jest niezbędna do utrzymania homeostazy i jest ułatwiana przez receptory i szlaki sygnałowe, które pozwalają na rozpoznawanie, wchłanianie i internalizację komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania efferocytozy i aktywności efferocytarnych szlaków sygnałowych.

Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

Choroby neurodegeneracyjne są związane z rozregulowanymi funkcjami mikrogleju. W artykule przedstawiono test in vitro fagocytozy komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC. Odczyty z mikroskopii ilościowej opisano zarówno dla obrazowania poklatkowego żywych komórek, jak i obrazowania o wysokiej zawartości komórek stałych.

Test obrazowania ilościowego in vitro na fagocytozę martwych komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC

Prezentowany tutaj jest protokół do ilościowego określania i tworzenia dynamicznych obrazów regulacji makrofagów (MΦ) za pośrednictwem mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) fagocytozy nieopsonizowanych cząsteczek drożdży (zymosan), które są sprzężone z cząsteczką fluorescencyjną wrażliwą na pH.

Mezenchymalne komórki macierzyste regulują fagocytozę makrofagów; Kwantyfikacja i obrazowanie

Opisujemy protokoły pomiaru pH, zdarzeń oksydacyjnych i trawienia białek w poszczególnych makropinosomach w żywych komórkach. Nacisk kładziony jest na mikroskopię ratiometryczną z podwójnym fluoroforem i zalety, jakie oferuje w porównaniu z technikami populacyjnymi.

Pomiar pH, chemii redoks i zdolności degradacyjnej makropinosomów za pomocą mikroskopii ratiometrycznej z podwójnym fluoroforem

Poznaj ratiometryczną mikroskopię fluorescencyjną do pomiaru pH fagosomu w żywych fagocytach. Ta technika umożliwia monitorowanie zmian pH w czasie rzeczywistym, co jest kluczowe dla zrozumienia dojrzewania fagosomów i interakcji z patogenami.

Pomiar pH fagosomu za pomocą ratiometrycznej mikroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów