Wszechstronny mysi model podkorowego udaru istoty białej do badania zwyrodnienia aksonów i neurobiologii istoty białej
March 17th, 2016
Tutaj prezentujemy metodologię wytwarzania ogniskowego udaru w mysiej istocie białej poprzez miejscowe wstrzyknięcie nieodwracalnego inhibitora śródbłonkowej syntazy tlenku azotu (eNOS) (L-Nio). Przedstawiono dwie odmiany stereotaktyczne, wsteczne śledzenie neuronów oraz znakowanie i rozwarstwianie świeżych tkanek, które rozszerzają potencjalne zastosowania tej techniki.
Ogólnym celem tej procedury jest dokładne zlokalizowanie małego udaru w mysiej istocie białej, aby modelować tę powszechną formę podkorowego udaru istoty białej. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie udaru, takie jak mechanizmy uszkodzenia aksonów, odpowiedź neuronów na udar podkorowy oraz reakcja elementów komórkowych istoty białej zarówno podczas ostrej, jak i naprawczej fazy udaru. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do precyzyjnego zlokalizowania udaru istoty białej i może być używana z szeroką gamą modeli myszy mysich.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, będą miały trudności z powodu niewielkiej ilości istoty białej prowadzącej do nieprawidłowej lokalizacji udaru. Mogą być wymagane drobne korekty kąta wtrysku lub współrzędnych stereotaktycznych dla każdego szczepu myszy lub konfiguracja stereotaktyczna. Zacznij od przymocowania wyciągniętej szklanej pipety do rurki podłączonej do przewodu próżniowego.
Włóż pociągnięty koniec do roztworu L-Nio lub znacznika fluorescencyjnego L-Nio plus. Uruchom podciśnienie i stosuj ssanie, aż co najmniej dwa milimetry części pipety o średnicy 0,5 milimetra zostaną napełnione. Odłóż napełnioną pipetę na bok.
Następnie umieść mysz w aparacie stereotaktycznym wyposażonym w mikroskop stereotaktyczny. Po znieczuleniu i przygotowaniu myszy do zabiegu zgodnie z zatwierdzonymi procedurami, sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą szczypania palca u nogi. Nie powinno być żadnej odpowiedzi.
Następnie ustaw ramię wtryskowe na 36 stopni. Przymocować wyciągnięty szklany uchwyt do pipet na dystalnym końcu systemu iniekcyjnego o niskiej objętości i przymocować go do ramienia iniekcyjnego. Po wykonaniu 1,5-centymetrowego nacięcia linii środkowej skóry głowy w celu odsłonięcia czaszki, osusz powierzchnię czaszki bawełnianym wacikiem.
Następnie, patrząc przez mikroskop stereotaktyczny, przy powiększeniu od jednego do trzech razy, użyj narzędzia mikropunktowego, aby usunąć znajdującą się nad nim tkankę okostnej. Zaznacz bregmę markerem drobnopunktowym. Następnie użyj wiertła chirurgicznego wyposażonego w wiertło chirurgiczne z cienką końcówką, aby wywiercić dwumilimetrową kraniotomię eliptyczną, zaczynając od tyłu w bregma i rozciągając się do przodu tuż po lewej stronie linii środkowej.
Usuń fragmenty kości i leżące nad nimi tkanki miękkie, aby można było uwidocznić korę mózgową. Utrzymuj wilgotną powierzchnię kory mózgowej, stosując od czasu do czasu krople sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Następnie przymocuj napełnioną pipetę do ramienia wtryskiwacza.
Wyrównaj dystalny koniec pipety z bregmą i wyzeruj współrzędne stereotaktyczne. Przesunąć pipetę do pierwszego punktu wstrzyknięcia, używając współrzędnych przednich, tylnych i przyśrodkowo-bocznych podanych w tabeli pierwszej. Następnie przesuń pipetę do powierzchni kory mózgowej i wyzeruj pomiar grzbietowo-brzuszny.
Powoli opuść pipetę do współrzędnych grzbietowo-brzusznych. Upewnij się, że powiększenie mikroskopu stereotaktycznego jest ustawione na trzy X i że skalibrowana siatka celownicza jest wyraźnie widoczna. Spójrz na pipetę pod kątem z boku, tak aby menisk płynu powietrznego miał widok strzałkowy.
Łąkotka powinna znajdować się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej zarówno wewnętrznej, jak i zewnętrznej ścianki pipety. Teraz, używając lokalnego systemu wstrzykiwania ciśnienia ustawionego na 20 PSI dla 20 milisekundowych impulsów, wstrzyknij 100 nanolitrów L-Nio do mózgu. Po wstrzyknięciu całkowitej objętości należy odczekać pięć minut, aby zapobiec cofaniu się refluksu w górę ścieżki pipety.
Następnie należy wyjąć pipetę i powtórzyć procedurę wstrzykiwania przy drugim i trzecim zestawie współrzędnych podanym w tabeli pierwszej. Po ostatnim wstrzyknięciu należy wyjąć pipetę i umieścić wystarczającą ilość wosku kostnego, aby wypełnić miejsce kraniotomii. Na koniec zbliż krawędzie rany skóry głowy i zwiąż za pomocą kleju skórnego.
Po podaniu znieczulenia pooperacyjnego umieść zwierzę w czystej klatce. Podawaj antybiotyki pooperacyjne w wodzie do picia przez pięć dni lub do uśmiercenia, jeśli jest krótsze niż pięć dni. Po złożeniu w ofierze i odcięciu głowy myszy zgodnie z zatwierdzonymi procedurami, użyj sterylnych nożyczek, aby otworzyć czaszkę z tyłu, a następnie użyj szpatułki, aby delikatnie usunąć leżącą nad nią czaszkę.
Następnie włóż sterylną czteromilimetrową szpatułkę z przodu mózgu, aby przeciąć opuszkę węchową i nerwy wzrokowe. Następnie delikatnie wyjmij mózg z kalwarii i umieść w lodowatym buforze preparacyjnym. Używając bloku mózgowego i sterylnych żyletek, pokrój od dwóch do trzech milimetrowych plasterków zawierających dotknięty obszar i umieść w zimnym buforze preparacyjnym.
Pod mikroskopem preparacyjnym zidentyfikuj istotę białą leżącą pod korą ruchową w wstrzykniętej półkuli. We wcześniejszych odstępach czasu po udarze wstrzyknięcie L-Nio zmieszanego z popularnymi barwnikami laboratoryjnymi, takimi jak fast green, może umożliwić wizualną identyfikację udaru. W dłuższych odstępach czasu po udarze region ten można wizualnie zidentyfikować na podstawie martwicy ogniskowej i bladość mieliny.
Po zidentyfikowaniu użyj skalpela, aby dokładnie wypreparować obszar istoty białej, w którym znajduje się udar. Usuń leżącą nad nią korę i leżące pod nią prążkowie, zgodnie z potrzebami. Jak pokazano tutaj, znakowanie immunofluorescencyjne włókien nerwowych, pokazane na czerwono, pokazuje stopień utraty aksonów siedem dni po udarze, przy użyciu podejścia przyśrodkowego.
Przy podejściu pod kątem tylnym, zmiana udaru istoty białej jest ukierunkowana tuż nad komorą boczną i wykazuje intensywną reaktywność mikrogleju, wykrytą przez znakowanie immunologiczne IBA-1. Dwa pośrednie markery włókien astrocytów, wimentyna, pokazana na czerwono, i kwaśne białko fibrylarne gleju, pokazane na zielono, ujawniają zmiany w morfologii astrocytów istoty białej po udarze. Jednoczesna iniekcja fluorescencyjnej aminy dekstranu w momencie indukcji udaru umożliwia identyfikację pojedynczych neuronów z aksonami uszkodzonymi w wyniku udaru.
Większość znakowania zachodzi w aksonach w warstwie piątej i szóstej neuronów w pierwotnej korze czuciowo-ruchowej pokrywającej udar. Ten obraz przedstawia siedem dni po udarze. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 45 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać ogniskowy udar istoty białej u myszy i przygotować mózg do różnych dalszych procesów, przydatnych do odpowiedzi na ważne pytania dotyczące udaru i naprawy układu nerwowego.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodologię wytwarzania ogniskowego udaru w białej substancji u myszy poprzez lokalne wstrzyknięcie nieodwracalnego inhibitora eNOS (L-Nio). Technika obejmuje wariacje stereotaktyczne i oznaczanie świeżego tkanki w celu zwiększenia jej zastosowań w badaniach nad udarem.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Badania nad udarem
- Modele mysie
Tło
- Ogniskowe udary w białej substancji są częste w modelach podkorowych udarów.
- Zrozumienie uszkodzeń aksonów i reakcji neuronów jest kluczowe w badaniach nad udarem.
- Precyzyjne zlokalizowanie udarów może poprawić wyniki eksperymentalne.
- Odmienne szczepy myszy mogą wymagać dostosowań techniki.
Cel badania
- Aby dokładnie modelować podkorowe udary w białej substancji u myszy.
- Aby zbadać mechanizmy uszkodzeń aksonów i reakcje neuronów.
- Aby zbadać odpowiedzi komórkowe w fazie ostrej i naprawy udaru.
Stosowane metody
- Wstrzyknięcie L-Nio za pomocą aparatu stereotaktycznego.
- Przygotowanie myszy i procedury chirurgiczne dla indukcji udaru.
- Rozcinanie i oznaczanie tkanki mózgowej w celu analizy.
- Oznaczanie immunofluorescencyjne do oceny utraty aksonów i reaktywności mikrogleju.
Główne wyniki
- Udane zlokalizowanie zmian po udar w białej substancji u myszy.
- Identyfikacja uszkodzeń aksonów i aktywacji mikrogleju po udar.
- Wizualizacja udaru za pomocą fluorescujących znaczników.
- Demonstracja zmian astrocytarnych w odpowiedzi na udar.
Wnioski
- Ta technika pozwala na precyzyjne modelowanie udarów białej substancji.
- Dostarcza wglądu w komórkowe mechanizmy uszkodzeń po udar.
- Przyszłe zastosowania mogą poprawić zrozumienie procesów regeneracji po udar.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Modeling focal white matter stroke in mice addresses a critical gap in preclinical stroke research, enabling mechanistic de-risking of axonal degeneration pathways. This model supports target validation by providing a disease-relevant system to study neuroinflammatory and repair responses relevant to vascular dementia and silent infarct burden. Precise lesion localization enhances predictive confidence in early discovery by reducing biological variability in downstream assay readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to axonal injury mechanisms in white matter pathology.
- Operational Value: Provides a murine-compatible platform for functional target validation using established neurobiological tools.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by modeling silent infarct contributions to vascular dementia progression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable histological endpoints such as axonal loss and microglial reactivity for assay standardization.
- Operational Value: Facilitates preparation of validated tissue sections for reproducible immunofluorescence and tracer-based analyses.
- Scientific Value: Enables screening readiness through focal lesion induction compatible with retrograde neuronal tracing and fresh tissue labeling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling subcortical white matter stroke contributing to vascular dementia.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation via standardized stereotactic delivery and tissue processing.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking lesion location to cellular response profiles in acute and repair phases.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of white matter-specific stroke mechanisms prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification through targeted lesion induction in murine white matter tracts.
- Screening: Delivers assay-ready tissue with quantifiable outputs such as IBA-1+ microglial activation and axonal filament loss.
- Analytics: Provides measurable dependent variables including fluorescence intensity of neural filament and astrocytic markers for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through modeling of stroke phases relevant to vascular cognitive impairment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable stereotactic framework adaptable across mouse strains and tracer combinations for longitudinal studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in white matter injury models.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized coordinates, injection parameters, and tissue dissection protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of target engagement in axonal degeneration pathways.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by modeling a highly prevalent yet understudied stroke subtype linked to dementia risk.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery and murine neuroanatomy for accurate white matter targeting.
- Dependent on calibrated pressure injection systems and sterile microsurgical tools for consistent lesion induction.
- Necessitates cross-team standardization of histological staining and imaging protocols for multi-site reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the model across different murine genetic backgrounds or comorbid conditions.
- Practical limitations include small target size requiring strain-specific coordinate adjustments and meticulous postoperative care to ensure survival.
