Wszechstronny mysi model podkorowego udaru istoty białej do badania zwyrodnienia aksonów i neurobiologii istoty białej
17 marca 2016
Tutaj prezentujemy metodologię wytwarzania ogniskowego udaru w mysiej istocie białej poprzez miejscowe wstrzyknięcie nieodwracalnego inhibitora śródbłonkowej syntazy tlenku azotu (eNOS) (L-Nio). Przedstawiono dwie odmiany stereotaktyczne, wsteczne śledzenie neuronów oraz znakowanie i rozwarstwianie świeżych tkanek, które rozszerzają potencjalne zastosowania tej techniki.
Ogólnym celem tej procedury jest dokładne zlokalizowanie niewielkiego udaru w obrębie białej istoty u myszy, aby stworzyć model tej powszechnej postaci podkorowego udaru białej istoty. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad udarem, takie jak mechanizmy uszkodzeń aksonalnych, odpowiedź neuronalna na udar podkorowy oraz sposób, w jaki elementy komórkowe białej istoty reagują zarówno w fazie ostrej, jak i w fazie naprawczej udaru. Główną zaletą tej techniki jest możliwość precyzyjnej lokalizacji udaru w białej istocie oraz możliwość zastosowania jej w szerokim spektrum modeli mysich.
Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności ze względu na niewielką ilość istoty białej, co prowadzi do błędnej lokalizacji udaru. Może być konieczne wprowadzenie niewielkich korekt w kącie wstrzyknięcia, współrzędnych stereotaktycznych dla poszczególnych szczepów myszy lub w samej konfiguracji stereotaktycznej. W pierwszej kolejności należy przymocować wypaloną pipetę szklaną do przewodu podłączonego do linii próżniowej.
Wprowadź wyciągnięty koniec do roztworu L-Nio lub L-Nio z dodatkiem znacznika fluorescencyjnego. Włącz próżnię i zasysaj roztwór, aż wypełni się co najmniej dwa milimetry fragmentu pipety o średnicy 0,5 milimetra. Odstaw wypełnioną pipetę na bok.
Następnie umieść mysz w aparacie stereotaktycznym wyposażonym w mikroskop stereotaktyczny. Po znieczuleniu i przygotowaniu myszy do operacji zgodnie z zatwierdzonymi procedurami, sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą ucisku palca u nogi. Nie powinna wystąpić żadna reakcja.
Następnie ustaw ramię do iniekcji pod kątem 36 stopni. Przymocuj uchwyt do dociągniętej szklanej pipety do dystalnego końca niskobioobjętościowego systemu wtrysku ciśnieniowego, a następnie zamocuj go do ramienia do iniekcji. Po wykonaniu 1,5 centymetrowego nacięcia skóry głowy w linii środkowej w celu odsłonięcia czaszki, osusz powierzchnię czaszki za pomocą patyczka higienicznego.
Następnie, obserwując pole pod mikroskopem stereotaktycznym przy powiększeniu od 1 do 3x, należy za pomocą narzędzia z mikropunktowym końcem usunąć wszelką nadleżącą tkankę okostnową. Punkt bregma należy zaznaczyć cienkim markerem. Następnie, używając wiertarki chirurgicznej wyposażonej w cienki wiertło chirurgiczne, należy wykonać eliptyczną kraniotomię o rozmiarze 2 mm, rozpoczynając tylnie od punktu bregma i rozszerzając ją przednio, tuż na lewo od linii środkowej.
Usunąć fragmenty kości i nadkładające je tkanki miękkie, aby kora mózgowa była widoczna. Powierzchnię kory należy utrzymywać w stanie wilgotnym, okresowo aplikując krople sterylnej soli fizjologicznej. Następnie przymocować wypełnioną pipetę do ramienia injektora.
Ustaw dystalny koniec pipety w linii z bregma i wyzeruj współrzędne stereotaktyczne. Przesuń pipetę do pierwszego punktu wstrzyknięcia, korzystając z przednio-tylnych i przyśrodkowo-bocznych współrzędnych wymienionych w tabeli 1. Następnie przesuń pipetę do powierzchni kory i wyzeruj pomiar grzbietowo-brzuszny.
Powoli opuść pipetę do współrzędnych grzbietowo-brzusznych. Upewnij się, że powiększenie mikroskopu stereoskopowego jest ustawione na 3X i że skalibrowany siatkowy celownik jest wyraźnie widoczny. Spójrz na ustawioną pod kątem pipetę z boku, tak aby menisk cieczy był widoczny w rzucie strzałkowym.
Menisk powinien znajdować się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej, co wewnętrzna i zewnętrzna ścianka pipety. Następnie, używając systemu lokalnego wtrysku ciśnieniowego ustawionego na 20 PSI przy impulsach trwających 20 milisekund, wstrzyknij 100 nanolitrów L-Nio do mózgu. Po wstrzyknięciu całej objętości odczekaj pięć minut, aby zapobiec cofaniu się cieczy w kanale pipety.
Następnie wycofaj pipetę i powtórz procedurę iniekcji w drugim i trzecim zestawie współrzędnych podanych w tabeli 1. Po ostatniej iniekcji wyjmij pipetę i nałóż odpowiednią ilość wosku kostnego, aby wypełnić miejsce kraniotomii. Na koniec zbliż brzegi rany na skórze głowy i zwiąż je klejem tkankowym.
Po podaniu leków przeciwbólowych pooperacyjnie, umieść zwierzę w czystej klatce. Podawaj antybiotyki pooperacyjne w wodzie pitnej przez pięć dni lub do momentu uśmiercenia, jeśli okres ten jest krótszy niż pięć dni. Po uśmierceniu i dekapitacji myszy zgodnie z zatwierdzonymi procedurami, za pomocą sterylnych nożyczek otwórz czaszkę od strony tylnej, a następnie użyj szpatułki, aby delikatnie usunąć nadległą część czaszki.
Następnie wprowadź sterylną szpatułkę o szerokości 4 mm w przednią część mózgu, aby odciąć opuszki węchowe i nerwy wzrokowe. Następnie ostrożnie wyjmij mózg z czaszki i umieść go w lodowatym buforze do sekcji. Używając bloku do mózgu i sterylnych żyletek, wykonaj przekroje o grubości od 2 do 3 mm zawierające obszar dotknięty zmianami, a następnie umieść je w zimnym buforze do sekcji.
Pod mikroskopem stereoskopowym zidentyfikuj istotę białą znajdującą się pod korą ruchową w wstrzykniętej półkuli. W przypadku wcześniejszych odstępów czasu po udarze, wstrzyknięcie L-Nio zmieszanego z powszechnymi barwnikami laboratoryjnymi, takimi jak fast green, może umożliwić wizualną identyfikację miejsca udaru. W przypadku dłuższych odstępów czasu po udarze, obszar ten można zidentyfikować wizualnie na podstawie ogniskowej martwicy i bladości mieliny.
Po zlokalizowaniu, należy użyć skalpela, aby ostrożnie wypreparować obszar istoty białej obejmujący miejsce udaru. W zależności od potrzeb należy usunąć nadległą korę oraz podległe prążkowie. Jak pokazano tutaj, znakowanie immunofluorescencyjne filamentów neuronalnych, widoczne na czerwono, obrazuje stopień utraty aksonów siedem dni po udarze, przy zastosowaniu podejścia przyśrodkowego.
Stosując tylne podejście pod kątem, obszar uszkodzenia niedokrwiennego istoty białej jest celowany tuż powyżej komory bocznej i wykazuje intensywną reaktywność mikrogleju, wykrytą za pomocą immunoznakowania IBA-1. Dwa markery włókien pośrednich astrocytów, wimentyna (kolor czerwony) oraz kwaśne białko włókienkowe gleju (kolor zielony), ujawniają zmiany w morfologii astrocytów istoty białej po udarze. Współwstrzyknięcie fluorescencyjnej dekstranaminy w momencie indukcji udaru umożliwia identyfikację pojedynczych neuronów z aksonami uszkodzonymi w wyniku udaru.
Większość znakowania występuje w aksonach neuronów warstwy piątej i szóstej w pierwotnych korach czuciowo-ruchowych nad obszarem udaru. Obraz ten przedstawia stan siedem dni po udarze. Po opanowaniu techniki, jej wykonanie zajmuje 45 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać ogniskowy udar w istocie białej u myszy oraz jak przygotować mózg do różnorodnych dalszych analiz, które są przydatne do udzielenia odpowiedzi na istotne pytania dotyczące udarów i regeneracji neurologicznej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodologię wywoływania ogniskowego udaru w białej substancji mózgu myszy poprzez miejscowe wstrzyknięcie nieodwracalnego inhibitora eNOS (L-Nio). Technika ta obejmuje warianty stereotaktyczne oraz znakowanie świeżej tkanki w celu rozszerzenia jej zastosowań w badaniach nad udarem.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Badania nad udarem
- Modele mysie
Wprowadzenie
- Ogniskowe udary w istocie białej są częstym zjawiskiem w modelach udarów podkorowych.
- Zrozumienie uszkodzeń aksonalnych oraz odpowiedzi neuronalnych ma krytyczne znaczenie w badaniach nad udarem.
- Precyzyjna lokalizacja udarów może poprawić wyniki eksperymentalne.
- Różnice między szczepami myszy mogą wymagać dostosowania techniki.
Cel badania
- Dokładne modelowanie udaru w obrębie podkorowej białej istoty u myszy.
- Badanie mechanizmów uszkodzenia aksonów oraz odpowiedzi neuronalnych.
- Analiza odpowiedzi komórkowych podczas ostrej fazy udaru oraz fazy naprawczej.
Zastosowane metody
- Wstrzyknięcie L-Nio za pomocą aparatu stereotaktycznego.
- Przygotowanie myszy i procedury chirurgiczne w celu wywołania udaru.
- Disekcja i znakowanie tkanki mózgowej do analizy.
- Znakowanie immunofluorescencyjne w celu oceny utraty aksonów i reaktywności mikrogleju.
Główne wyniki
- Pomyślna lokalizacja ognisk udaru w białej substancji mózgu myszy.
- Identyfikacja uszkodzeń aksonalnych i aktywacji mikrogleju po udarze.
- Wizualna identyfikacja udaru przy użyciu znaczników fluorescencyjnych.
- Wykazanie zmian astrocytarnych w odpowiedzi na udar.
Wnioski
- Technika ta umożliwia precyzyjne modelowanie udarów w obrębie istnej białej.
- Pozwala ona na uzyskanie wglądu w mechanizmy komórkowe uszkodzeń spowodowanych udarem.
- Przyszłe zastosowania mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia procesów regeneracji po udarze.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Modelowanie ogniskowego udaru białej materii u myszy pozwala na wypełnienie krytycznej luki w przedklinicznych badaniach nad udarem, umożliwiając mechanistyczną ocenę ryzyka w obrębie szlaków degeneracji aksonów. Model ten wspiera walidację celów terapeutycznych, zapewniając system istotny z punktu widzenia choroby do badania odpowiedzi neurozapalnych i naprawczych, które mają znaczenie w przypadku otępienia naczyniowego oraz obciążenia zakamuflowanymi ogniskami niedokrwienia. Precyzyjna lokalizacja zmiany zwiększa wiarygodność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania leków poprzez redukcję zmienności biologicznej w odczytach analizy końcowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących mechanizmów uszkodzeń aksonalnych w patologii istoty białej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia kompatybilną z myszami platformę do funkcjonalnej walidacji celów z wykorzystaniem uznanych narzędzi neurobiologicznych.
- Wartość naukowa: Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez modelowanie wpływu niemych udarów na progresję otępienia naczyniowego.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje mierzalne punkty końcowe histologiczne, takie jak utrata aksonów i reaktywność mikrogleju, w celu standaryzacji analizy.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przygotowanie zwalidowanych przekrojów tkankowych do powtarzalnych analiz immunofluorescencyjnych oraz analiz z użyciem tracerów.
- Wartość naukowa: Umożliwia przygotowanie do screeningu poprzez indukcję ogniskowej zmiany kompatybilnej z retrogradnym śledzeniem neuronów oraz znakowaniem świeżej tkanki.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zgodność z systemami istotnymi dla przebiegu choroby poprzez modelowanie udaru podkorowej istoty białej przyczyniającego się do demencji naczyniowej.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie ciągłości od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki standaryzowanemu podawaniu stereotaktycznemu i procesowaniu tkanek.
- Wartość naukowa: Wsparcie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez powiązanie lokalizacji zmiany z profilami odpowiedzi komórkowej w fazach ostrej i naprawczej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, umożliwiając testowanie hipotez dotyczących mechanizmów udaru specyficznych dla białej substancji przed podjęciem wysiłków w celu identyfikacji związków wiodących.
- Biologia odkryć: Wspomaga wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez ukierunkowaną indukcję uszkodzeń w istocie białej u myszy.
- Przesiewanie: Dostarcza gotową do analizy tkankę z mierzalnymi parametrami, takimi jak aktywacja mikrogleju IBA-1+ oraz utrata filamentów aksonalnych.
- Analityka: Zapewnia mierzalne zmienne zależne, w tym intensywność fluorescencji filamentów neuronalnych i markerów astrocytarnych do analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez modelowanie faz udaru istotnych dla naczyniowego upośledzenia poznawczego.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Oferuje reużywalny system stereotaktyczny, który można dostosować do różnych szczepów myszy i kombinacji znaczników w badaniach podłużnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w modelach uszkodzenia białej istoty.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji współrzędnych, parametrów wstrzykiwania oraz protokołów sekcji tkanek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, umożliwiając wczesną ocenę zaangażowania celu w szlakach degeneracji aksonalnej.
- Wpływ na portfolio: Dostarcza informacji do priorytetyzacji z uwzględnieniem ryzyka poprzez modelowanie wysoce rozpowszechnionego, a słabo zbadanego podtypu udaru powiązanego z ryzykiem otępienia.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w chirurgii stereotaktycznej i neuroanatomii myszy w celu dokładnego celowania w istotę białą.
- Zależy od skalibrowanych systemów wtrysku ciśnieniowego oraz sterylnych narzędzi mikrochirurgicznych w celu spójnego indukowania uszkodzeń.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów barwienia histologicznego i obrazowania pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności w wielu ośrodkach.
- Wymaga rozważenia adaptacji przy stosowaniu modelu u myszy o różnych podłożach genetycznych lub w stanach współistniejących.
- Ograniczenia praktyczne obejmują niewielki rozmiar celu, co wymaga dostosowania współrzędnych do konkretnej linii myszy, oraz skrupulatnej opieki pooperacyjnej w celu zapewnienia przeżywalności.
