Name: Wszechstronny mysi model podkorowego udaru istoty białej do badania zwyrodnienia aksonów i neurobiologii istoty białej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Poznaj metodę modelowania udaru podkorowego w istocie białej myszy przy użyciu stereotaksycznej iniekcji L-Nio. Technika umożliwia precyzyjną lokalizację zmian i badanie mechanizmów uszkodzenia aksonów oraz reakcji mikrogleju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SN i MDD otrzymały wsparcie od NIH K08 NS083740 i Wydziału Neurologii UCLA. AJG dziękuje za wsparcie ze strony Fundacji Badań Medycznych dr Miriam i Sheldona G. Adelsonów oraz Fundacji Larry'ego L. Hillbloma. KLN z wdzięcznością dziękuje za wsparcie ze strony American Heart Association 14BFSC17760005 ASA-Bugher Stroke Center. ILL, EGS i STC były wspierane przez NIH R01 NS071481. JDH potwierdza wsparcie ze strony NIH K08 NS083740.

Wykorzystanie zwierząt w tym protokole zostało przeprowadzone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles.
Uwaga: Zacznij od zidentyfikowania docelowej populacji myszy. We wcześniejszych badaniach wykorzystano tylko samce myszy C57 / Bl6 typu dzikiego, jednak można również użyć różnych myszy transgenicznych lub nokautowych. Należy pamiętać, że współrzędne stereotaktyczne są oparte na anatomii C57/Bl6. Zaleca się, aby każdy użytkownik wstępnie zweryfikował lokalizację udaru w istocie białej.
1. Indukcja udaru istoty białej - podejście przyśrodkowe pod kątem
<ol>
	<li>Zacznij od przygotowania wyciągniętej szklanej pipety za pomocą rurki kapilarnej 0,5 mm tak, aby średnica dystalna wynosiła 15-25 μm 11.</li>
	<li>Przygotować sterylną 10 μl podwielokrotności L-Nio (N(5)-(1)-iminoetylo-L-ornityny HCl) w stężeniu 27,4 mg/ml (130 μM) w sterylnym 0,9% roztworze soli fizjologicznej.</li>
	<li>Wstępnie napełnij pipetę z wyciągniętego szkła niewielką objętością L-Nio (2-5 μl), umieszczając szklaną pipetę na rurce podłączonej do przewodu próżniowego. Połóż pipetę płasko na blacie stołu i włóż wyciągniętą końcówkę do roztworu L-Nio.
	<ol>
		<li>Stosować próżnię, aż co najmniej 2 mm z 0,5 mm części pipety zostanie napełnione. Wyłącz próżnię i wyjmij pipetę. Odłóż go na bok do kroku 1.12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej i wywołaj znieczulenie myszy za pomocą standardowego 32% izofluranu przepływającego przez parownik (5 l/min wdychany z 5 l/min tlenu i 0,5 l/min N2) przez 1 minutę lub do głębokiego znieczulenia. Przenieś mysz do aparatu stereotaktycznego wyposażonego w mikroskop stereotaktyczny. Zapewnij znieczulenie podtrzymujące za pomocą 32% izofluranu przepływającego przez parownik (2 l/min wdychane z 5 l/min tlenu i 0,5 l/min N2) i stożek nosowy. Sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi. </li>
	<li>Ustawić ramię wtryskowe w pozycji 36°.</li>
	<li>Przymocować wyciągnięty szklany uchwyt do pipet na dystalnym końcu systemu iniekcyjnego o niskim ciśnieniu objętościowym i przymocować go do ramienia iniekcyjnego zestawu stereotaktycznego.</li>
	<li>Posmaruj wąsy znieczulonego zwierzęcia wazeliną i nałóż sztuczną maść na łzy na oba oczy. Przygotuj sterylne pole operacyjne, umieszczając sterylną serwetę na głowie zwierzęcia z otworem o długości 5-10 cm nad głową. Przygotuj aspetyczną powierzchnię chirurgiczną, goląc futro leżące nad czaszką. Oczyść skórę głowy naprzemiennie betadyną i wacikami nasączonymi 70% alkoholem.</li>
	<li>Wykonaj 1,5 cm nacięcie skóry głowy w linii środkowej sterylnymi cienkimi nożyczkami, aby odsłonić powierzchnię czaszki. Osusz czaszkę sterylnym wacikiem i za pomocą mikroskopu stereotaktycznego w powiększeniu 1-3X usuń całą leżącą nad nią tkankę okostną za pomocą sterylnego narzędzia do mikro punktu.</li>
	<li>Oznacz Bregmę jako punkt odniesienia za pomocą cienkiego markera.</li>
	<li>Wywierć elipityczną kraniotomię o średnicy 2 mm za pomocą sterylnego wiertła chirurgicznego z cienką końcówką, zaczynając od tyłu w Bregma i rozciągając się do przodu tuż po lewej stronie linii środkowej. Usuń fragmenty kości i leżące nad nimi tkanki miękkie, aby można było uwidocznić korę mózgową.</li>
	<li>Utrzymuj wilgotne pole operacyjne i powierzchnię kory mózgowej, sporadycznie aplikując krople sterylnego roztworu soli fizjologicznej.</li>
	<li>Przymocować wyciągniętą szklaną pipetę do ramienia wtryskiwacza aparatu stereotaktycznego. Wyrównaj dystalny koniec pipety z Bregma i wyzeruj współrzędne stereotaktyczne.</li>
	<li>Przesunąć pipetę do pierwszej współrzędnej przedniej/tylnej (A/P) i przyśrodkowej/bocznej (M/L) podanych w Tabeli 1.</li>
	<li>Przyłożyć pipetę do powierzchni kory mózgowej i wyzerować pomiar grzbietowy/brzuszny (D/V).</li>
	<li>Powoli wprowadzać pipetę do mózgu, aż do osiągnięcia pierwszej współrzędnej D/V w Tabeli 1.</li>
	<li>Używając systemu iniekcyjnego o niskim ciśnieniu objętości ustawionym na 20 psi dla impulsów 20 ms, wstrzyknij 100 nl L-Nio do mózgu i odczekaj 5 minut, aby zapobiec refluksowi w górę ścieżki pipety.
	<ol>
		<li>Użyj skalibrowanej siatki celowniczej w okularze mikroskopu stereotaktycznego i powiększenia 3X.</li>
		<li>W związku z tym należy przesunąć łącznie 0,100 mm3 (0,5 mm długości w pipecie o średnicy 0,5 mm, co odpowiada 100 nl) od wyciągniętej szklanej pipety dla każdego zestawu współrzędnych. Używając siatki, mierz i standaryzuj, ponieważ każda konfiguracja różni się w zależności od użytego powiększenia i skali.</li>
		<li>W celu dokładnego pomiaru objętości podczas każdego wstrzyknięcia, należy zbliżyć się do ustawionej pod kątem pipety z mikroskopem z boku, tak aby menisk powietrzno-płynny miał widok strzałkowy. Łąkotka powinna znajdować się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej zarówno wewnętrznej, jak i zewnętrznej ścianki pipety.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powoli wyjąć pipetę i powtórzyć kroki 1.13-1.16.3 dla drugiego i trzeciego zestawu współrzędnych podanych w Tabeli 1.</li>
	<li>Po ostatnim wstrzyknięciu należy wyjąć pipetę i umieścić wystarczającą ilość wosku kostnego, aby wypełnić miejsce kraniotomii. Przybliż krawędzie rany skóry głowy i zwiąż za pomocą kleju skórnego.</li>
	<li>Wstrzyknąć 0,1 ml 0,5% Marcaine w brzegi rany za pomocą sterylnej igły 30 G, aby zapobiec miejscowemu bólowi związanemu z nacięciem skóry głowy.</li>
	<li>Zwierzę należy umieścić w pomieszczeniu i podawać antybiotyki pooperacyjne (0,48 mg/ml trimetoprimu-sulfametoksazolu lub 0,5 mg/ml lewofloksacyny) w wodzie do picia przez 5 dni.</li>
</ol>
2. Indukcja udaru istoty białej - podejście pod kątem tylnym
<ol>
	<li>Wykonaj kroki 1.1-1.12, jak w protokole podejścia pod kątem przyśrodkowym, z wyjątkiem wyregulowania ramienia iniekcyjnego zestawu stereotaktycznego do 45 stopni zorientowanego od przodu do tyłu.</li>
	<li>Przesunąć pipetę do pierwszych współrzędnych A/P i M/L podanych w Tabeli 2.</li>
	<li>Wykonaj pozostałe kroki 1.14-1.20, jak w protokole podejścia pod kątem bocznym</li>.
</ol>
3. Wsteczne etykietowanie neuronów
<ol>
	<li>Przygotować sterylną 10 μl porcji L-Nio w stężeniu 54,8 mg/ml w 0,9% roztworze soli fizjologicznej.</li>
	<li>Przygotować sterylną porcję 20% Fluororuby (lub 20% biotynylowanej aminy dekstranu lub 2% Fluorogold) w 0,9% roztworze soli fizjologicznej.</li>
	<li>Rozcieńczyć razem w stosunku 1:1 do uzyskania końcowych stężeń 27,4 mg/ml L-Nio i 10% fluororubu.</li>
	<li>Wykonaj protokół udaru jak powyżej w krokach 1.3-1.23.</li>
	<li>Wizualizacja natywnie fluorescencyjnego znacznika w przekroju tkanki za pomocą utrwalenia perfuzyjnego, kriosekcji i mikroskopii, jak opisano wcześniej8.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie tkanek pod kątem immunofluorescencji
<ol>
	<li>W odpowiednim odstępie czasu po udarze, wynoszącym od 3 godzin do 14 dni po udarze, należy poddać myszy eutanazji poprzez przedawkowanie izofluranu lub lokalną procedurę zatwierdzoną przez IACUC.</li>
	<li>Otwórz klatkę piersiową za pomocą skośnych nożyczek i włóż igłę motylkową 23 G do lewej komory.</li>
	<li>Umieść małe nacięcie w prawym przedsionku za pomocą cienkich nożyczek, aby umożliwić ścieżkę odpływu płynu perfuzyjnego.</li>
	<li>Perfuzję przezskórną z 30-40 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, a następnie 30-40 ml zimnego 4% paraformaldehydu z szybkością 10 ml/min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odetnij głowę myszy i usuń mózg za pomocą sterylnych nożyczek, aby otworzyć czaszkę z tyłu, a następnie delikatnie usuń leżącą nad nią czaszkę szpatułką, umieść mózg w zimnym 4% PFA na 24 godziny, a następnie przenieś do 30% sacharozy w PBS na 48 godzin.</li>
	<li>Przygotować pływające skrawki o grubości czterdziestu mikronów za pomocą kriostatu i przeprowadzić przetwarzanie przeciwciał zgodnie z wcześniejszym opisem 6-8. W tym badaniu należy zastosować następujące przeciwciała: króliczy anty-neurofilament 200 (rozcieńczenie 1:500); królicza anty-wimentyna (1:500); anty-GFAP kóz (1:500); królik anty-Iba-1 (1:1,000).</li>
</ol>
5. Przetwarzanie tkanek do analizy białek lub RNA
<ol>
	<li>W odpowiednim odstępie czasu po udarze, wynoszącym od 3 godzin do 14 dni po udarze, należy poddać się eutanazji poprzez przedawkowanie izofluranu lub lokalną procedurę zatwierdzoną przez IACUC.</li>
	<li>Odetnij głowę myszy i usuń mózg za pomocą sterylnych nożyczek, aby otworzyć czaszkę z tyłu, a następnie delikatnie usuń leżącą nad nią czaszkę szpatułką.</li>
	<li>Włóż sterylną szpatułkę 4 mm z przodu mózgu, aby przeciąć opuszkę węchową i nerwy wzrokowe. Delikatnie wyjmij mózg z kalwarii i umieść w lodowatym buforze do rozwarstwiania (1x zbilansowany roztwór soli Hanka, 25 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 35 mM glukozy, 4 mM wodorowęglan sodu i 0,01 mg / ml cykloheksamidu).</li>
	<li>Używając bloku mózgowego i sterylnych nowych żyletek, przygotuj 2-3 mm płyty zawierające udar i umieść w zimnym buforze preparacyjnym</li>.
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym zidentyfikuj istotę białą leżącą pod korą ruchową w wstrzykniętej półkuli. W dłuższych odstępach czasu po udarze obszar ten można wizualnie zidentyfikować za pomocą martwicy ogniskowej i bladość mieliny. 
	Uwaga: We wcześniejszych odstępach czasu po udarze wstrzyknięcie L-Nio zmieszanego z 1 μl 10% Fast Green może umożliwić wizualną identyfikację udaru (ryc. 4A).</li>
	<li>Pod kierunkiem mikroskopu preparacyjnego i przy użyciu świeżego skalpela dokładnie wypreparuj obszar istoty białej, w którym znajduje się udar, zidentyfikowany przez znakowanie Fast Green lub utratę tkanki. W razie potrzeby usuń leżącą nad nią korę i leżące pod nią prążkowie.</li>
</ol>

<ol><li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2014+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 129, 28-292 (2014).</li>
<li>Saini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+stroke%3A+not+listened+to+rather+than+silent%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Silent stroke: not listened to rather than silent.</a> Stroke. 43, 3102-3104 (2012).</li>
<li>Koton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+and+outcome+of+prevalent+ischemic+brain+disease+in+a+national+acute+stroke+registry%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Burden and outcome of prevalent ischemic brain disease in a national acute stroke registry.</a> Stroke. 44, 3293-3297 (2013).</li>
<li>Jiwa, N. S., Garrard, P., Hainsworth, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+vascular+dementia+and+vascular+cognitive+impairment%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Experimental models of vascular dementia and vascular cognitive impairment: a systematic review.</a> J Neurochem. 115, 814-828 (2010).</li>
<li>Sozmen, E. G., Hinman, J. D., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+that+matter%3A+white+matter+stroke+models%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Models that matter: white matter stroke models.</a> Neurotherapeutics. 9, 349-358 (2012).</li>
<li>Sozmen, E. G., Kolekar, A., Havton, L. A., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+white+matter+stroke+model+in+the+mouse%3A+axonal+damage%2C+progenitor+responses+and+MRI+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A white matter stroke model in the mouse: axonal damage, progenitor responses and MRI correlates.</a> J Neurosci Methods. 180, 261-272 (2009).</li>
<li>Rosenzweig, S., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+exacerbation+of+white+matter+stroke+outcomes%3A+a+role+for+oxidative+damage+and+inflammatory+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Age-dependent exacerbation of white matter stroke outcomes: a role for oxidative damage and inflammatory mediators.</a> Stroke. 44, 2579-2586 (2013).</li>
<li>Hinman, J. D., Rasband, M. N., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+the+axon+initial+segment+after+focal+cortical+and+white+matter+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Remodeling of the axon initial segment after focal cortical and white matter stroke.</a> Stroke. 44, 182-189 (2013).</li>
<li>McCall, T. B., Feelisch, M., Palmer, R. M., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+N-iminoethyl-L-ornithine+as+an+irreversible+inhibitor+of+nitric+oxide+synthase+in+phagocytic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+j+pharmacol%22%5BJournal%5D)">Identification of N-iminoethyl-L-ornithine as an irreversible inhibitor of nitric oxide synthase in phagocytic cells.</a> Brit j pharmacol. 102, 234-238 (1991).</li>
<li>Gadea, A., Aguirre, A., Haydar, T. F., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1+regulates+oligodendrocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1 regulates oligodendrocyte development.</a> J Neurosci. 29, 10047-10062 (2009).</li>
<li>Dean, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+%28pulling%29+of+needles+for+gene+delivery+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+prot%22%5BJournal%5D)">Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection.</a> CSH prot. , (2006).</li>
<li>Hughes, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+lesions+in+the+rat+central+nervous+system+induced+by+endothelin-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Focal lesions in the rat central nervous system induced by endothelin-1.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 62, 1276-1286 (2003).</li>
<li>Whitehead, S. N., Hachinski, V. C., Cechetto, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+a+rat+model+of+cerebral+ischemia+and+beta-amyloid+toxicity%3A+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Interaction between a rat model of cerebral ischemia and beta-amyloid toxicity: inflammatory responses.</a> Stroke. 36, 107-112 (2005).</li>
<li>Frost, S. B., Barbay, S., Mumert, M. L., Stowe, A. M., Nudo, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+animal+model+of+capsular+infarct%3A+endothelin-1+injections+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">An animal model of capsular infarct: endothelin-1 injections in the rat.</a> Behav Brain Res. 169, 206-211 (2006).</li>
<li>Horie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+focal+cerebral+ischemia+using+endothelin-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Mouse model of focal cerebral ischemia using endothelin-1.</a> J Neurosci Methods. 173, 286-290 (2008).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+deficits+and+delayed+neuronal+loss+in+a+mouse+model+of+multiple+microinfarcts%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cognitive deficits and delayed neuronal loss in a mouse model of multiple microinfarcts.</a> Neuroscience. 32, 17948-17960 (2012).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+smallest+stroke%3A+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nat Neurosci. 16, 55-63 (2013).</li>
<li>Jung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelin+receptor+A+during+myelination+of+developing+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Korean+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of endothelin receptor A during myelination of developing oligodendrocytes.</a> J Korean Med Sci. 26, 92-99 (2011).</li>
</ol>

Opisano szereg wcześniejszych modeli udaru podkorowego, w tym ogniskowe wstrzyknięcia endoteliny-1 do torebki wewnętrznej, podkorowej istoty białej i prążkowia u szczurów 12-14 i myszy 6,15. Nowsze modele małych udarów ogniskowych wykorzystywały wstrzyknięcie cholesterolu mikrozatorowości do tętnicy szyjnej 16 i niedrożność fotozakrzepową pojedynczej tętniczki penetrującej 17. Każdy z tych modeli ma zarówno zalety, jak i wady 5. Obecnie opisany model wytwarza zmianę,...

Udar dotykający podkorową istotę białą jest powszechną jednostką kliniczną, odpowiadającą za do 25% udarów klinicznych rocznie w USA 1. Niedokrwienne uszkodzenie istoty białej również występuje po cichu ze znacznie większą szybkością i przyczynia się do rozwoju otępienia naczyniowego 2,3. Obecnie pacjenci z tą postacią niedokrwienia mózgu mają niewiele, jeśli w ogóle, możliwości leczenia. Pomimo klinicznego znaczenia tej choroby, istnieje niewiele klinicznie istotnych modeli zwierzęcych 4,5. 
Celem tego protokołu jest wytworzenie ogniskowej zmiany niedokrwiennej w obrębie mysiej istoty białej. Ten mysi model choroby człowieka pozwala na specyficzne badanie reakcji uszkodzenia aksonów na udar oraz tego, jak elementy komórkowe istoty białej, a mianowicie oligodendrocyty i astrocyty wraz z aksonami, reagują i naprawiają się po udarze.
Poprzednie raporty opisywały model podkorowego udaru istoty białej za pomocą endoteliny-1 (ET-1) 6, który jest podobny do opisanego tutaj. Wprowadzono kilka kluczowych zmian w protokole eksperymentalnym, dzięki czemu potencjalne zastosowania tego modelu rozszerzyły się 7,8. Protokół ten zapewnia niezawodną i modyfikowalną strategię wywoływania ogniskowego udaru w istocie białej mózgu myszy. 
Główne zalety tego modelu to użycie chemicznego inhibitora śródbłonkowej syntazy tlenku azotu (eNOS) N(5)-(1)-iminoetylo-L-ornityny HCl (L-Nio) 9 bez znanych efektów parakrynnych na elementy komórkowe istoty białej, co było powikłaniem modeli wykorzystujących endotelinę-1 10. Ponadto stereotaktyczne celowanie w istotę białą u myszy pozwala na użycie dowolnej odmiany szczepów transgenicznych lub nokautujących, co znacznie rozszerza dostępne narzędzia do określania wpływu udaru na istotę białą mózgu. W tym miejscu opisano dwie odmiany tej techniki i przedstawiono niektóre z dodatkowych wariantów, które można wykorzystać do lepszego zrozumienia uszkodzeń aksonów i istoty białej oraz naprawy po udarze.

<table><tbody><tr><td>L-N5-(1-Iminoetylo)ornityna, Dichlorowodorek</td><td>Calbiochem</td><td>400600-20MG</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc.</td><td>NDC 57319-559-06</td><td></td></tr><tr><td>Rurki kapilarne</td><td>World Precision Instruments</td><td>50-821-807</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Instrumentation</td><td>Picospritzer II</td><td></td></tr><tr><td>Konfiguracja stereotaktyczna</td><td>Kent Scientific</td><td>KSC51725</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>KOPF</td><td>Model 720</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy SZ51</td><td>Olympus</td><td>88-124</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Aparat Harvard</td><td>PY2 72-8547</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze zakrzywione</td><td>Aparat Harvard</td><td>PY2 72-8598</td><td></td></tr><tr><td>narzędzie do preparowania</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>10066-15</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło</td><td>Dremel</td><td>8220-1/28</td><td></td></tr><tr><td>Wiertła</td><td>Fine Narzędzia naukowe</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marcaine</td><td>HOSPIRA</td><td>NDC 0409-1610-50</td><td></td></tr><tr><td>Trimethoprim-Sulfamethaxole</td><td>STI Pharmacy</td><td>NDC 54879-007-16</td><td></td></tr><tr><td>Fluororuby</td><td>Fluorochrome Inc</td><td>30 mg</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehydu</td><td>Fisher</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher</td><td>BP220-10</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica CM3050 S</td><td></td><td></td>14047033518</tr><tr><td>Szkiełka</td><td>szklane Fisher</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>23 G igła motylkowa</td><td>Fisher</td><td>14-840-35</td><td></td></tr><tr><td>10x Hank's Balanced Salt</td><td>Solution Life Technologies</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES-KOH, pH 7,4</td><td>Affymetrix</td><td>16924</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Cykloheksamid</td><td>Sigma</td><td>01810</td><td></td></tr></tbody></table>

wszechstronny mysi model podkorowego udaru istoty białej do badania zwyrodnienia aksonów i neurobiologii istoty białej

A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology

Udar dotykający istotę białą stanowi do 25% klinicznych objawów udaru, występuje po cichu z częstością, która może być 5-10 razy większa, i znacząco przyczynia się do rozwoju demencji naczyniowej. Istnieje niewiele modeli ogniskowego udaru istoty białej, a brak odpowiednich modeli utrudnia zrozumienie mechanizmów neurobiologicznych zaangażowanych w reakcję na uraz i naprawę po tego typu udarze. Głównym ograniczeniem innych podkorowych modeli udaru jest to, że nie ograniczają one ogniskowo zawału do istoty białej lub zostały przede wszystkim zwalidowane u gatunków innych niż mysie. Ogranicza to możliwość zastosowania szerokiej gamy narzędzi badawczych na myszach do badania neurobiologii udaru istoty białej. W tym miejscu przedstawiamy metodologię niezawodnego wytwarzania ogniskowego udaru w mysiej istocie białej za pomocą miejscowego wstrzyknięcia nieodwracalnego inhibitora eNOS. Przedstawiamy również kilka wariantów ogólnego protokołu, w tym dwie unikalne warianty stereotaktyczne, wsteczne śledzenie neuronów, a także znakowanie świeżych tkanek i preparację, które znacznie rozszerzają potencjalne zastosowania tej techniki. Różnice te pozwalają na wiele podejść do analizy neurobiologicznych skutków tej powszechnej i niedostatecznie zbadanej formy udaru.

Wykorzystując przedstawiony model, można wiarygodnie celować w istotę białą leżącą pod korą sensoryczno-motoryczną przedniej kończyny. Ten chemicznie indukowany model udaru powoduje ogniskową utratę aksonów i mieliny, astrocytozę oraz mikrogliozę (Rycina 1), co jest typowe dla ludzkich zawałów lakunarnych. Dzięki zastosowaniu trzech iniekcji ustanawiany jest klinicznie użyteczny model z wczesnym upośledzeniem funkcji motorycznych przedniej kończyny 7, w którym ...

Tutaj prezentujemy metodologię wytwarzania ogniskowego udaru w mysiej istocie białej poprzez miejscowe wstrzyknięcie nieodwracalnego inhibitora śródbłonkowej syntazy tlenku azotu (eNOS) (L-Nio). Przedstawiono dwie odmiany stereotaktyczne, wsteczne śledzenie neuronów oraz znakowanie i rozwarstwianie świeżych tkanek, które rozszerzają potencjalne zastosowania tej techniki.

Wszechstronny mysi model podkorowego udaru istoty białej do badania zwyrodnienia aksonów i neurobiologii istoty białej

Stroke affecting white matter accounts for up to 25% of clinical stroke presentations, occurs silently at rates that may be 5-10 fold greater, and ...

Ogólnym celem tej procedury jest dokładne zlokalizowanie niewielkiego udaru w obrębie białej istoty u myszy, aby stworzyć model tej powszechnej postaci podkorowego udaru białej istoty. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad udarem, takie jak mechanizmy uszkodzeń aksonalnych, odpowiedź neuronalna na udar podkorowy oraz sposób, w jaki elementy komórkowe białej istoty reagują zarówno w fazie ostrej, jak i w fazie naprawczej udaru. Główną zaletą tej techniki jest możliwość precyzyjnej lokalizacji udaru w białej istocie oraz możliwość zastosowania jej w szerokim spektrum modeli mysich.Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności ze względu na niewielką ilość istoty białej, co prowadzi do błędnej lokalizacji udaru. Może być konieczne wprowadzenie niewielkich korekt w kącie wstrzyknięcia, współrzędnych stereotaktycznych dla poszczególnych szczepów myszy lub w samej konfiguracji stereotaktycznej. W pierwszej kolejności należy przymocować wypaloną pipetę szklaną do przewodu podłączonego do linii próżniowej.Wprowadź wyciągnięty koniec do roztworu L-Nio lub L-Nio z dodatkiem znacznika fluorescencyjnego. Włącz próżnię i zasysaj roztwór, aż wypełni się co najmniej dwa milimetry fragmentu pipety o średnicy 0,5 milimetra. Odstaw wypełnioną pipetę na bok.Następnie umieść mysz w aparacie stereotaktycznym wyposażonym w mikroskop stereotaktyczny. Po znieczuleniu i przygotowaniu myszy do operacji zgodnie z zatwierdzonymi procedurami, sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą ucisku palca u nogi. Nie powinna wystąpić żadna reakcja.Następnie ustaw ramię do iniekcji pod kątem 36 stopni. Przymocuj uchwyt do dociągniętej szklanej pipety do dystalnego końca niskobioobjętościowego systemu wtrysku ciśnieniowego, a następnie zamocuj go do ramienia do iniekcji. Po wykonaniu 1,5 centymetrowego nacięcia skóry głowy w linii środkowej w celu odsłonięcia czaszki, osusz powierzchnię czaszki za pomocą patyczka higienicznego.Następnie, obserwując pole pod mikroskopem stereotaktycznym przy powiększeniu od 1 do 3x, należy za pomocą narzędzia z mikropunktowym końcem usunąć wszelką nadleżącą tkankę okostnową. Punkt bregma należy zaznaczyć cienkim markerem. Następnie, używając wiertarki chirurgicznej wyposażonej w cienki wiertło chirurgiczne, należy wykonać eliptyczną kraniotomię o rozmiarze 2 mm, rozpoczynając tylnie od punktu bregma i rozszerzając ją przednio, tuż na lewo od linii środkowej.Usunąć fragmenty kości i nadkładające je tkanki miękkie, aby kora mózgowa była widoczna. Powierzchnię kory należy utrzymywać w stanie wilgotnym, okresowo aplikując krople sterylnej soli fizjologicznej. Następnie przymocować wypełnioną pipetę do ramienia injektora.Ustaw dystalny koniec pipety w linii z bregma i wyzeruj współrzędne stereotaktyczne. Przesuń pipetę do pierwszego punktu wstrzyknięcia, korzystając z przednio-tylnych i przyśrodkowo-bocznych współrzędnych wymienionych w tabeli 1. Następnie przesuń pipetę do powierzchni kory i wyzeruj pomiar grzbietowo-brzuszny.Powoli opuść pipetę do współrzędnych grzbietowo-brzusznych. Upewnij się, że powiększenie mikroskopu stereoskopowego jest ustawione na 3X i że skalibrowany siatkowy celownik jest wyraźnie widoczny. Spójrz na ustawioną pod kątem pipetę z boku, tak aby menisk cieczy był widoczny w rzucie strzałkowym.Menisk powinien znajdować się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej, co wewnętrzna i zewnętrzna ścianka pipety. Następnie, używając systemu lokalnego wtrysku ciśnieniowego ustawionego na 20 PSI przy impulsach trwających 20 milisekund, wstrzyknij 100 nanolitrów L-Nio do mózgu. Po wstrzyknięciu całej objętości odczekaj pięć minut, aby zapobiec cofaniu się cieczy w kanale pipety.Następnie wycofaj pipetę i powtórz procedurę iniekcji w drugim i trzecim zestawie współrzędnych podanych w tabeli 1. Po ostatniej iniekcji wyjmij pipetę i nałóż odpowiednią ilość wosku kostnego, aby wypełnić miejsce kraniotomii. Na koniec zbliż brzegi rany na skórze głowy i zwiąż je klejem tkankowym.Po podaniu leków przeciwbólowych pooperacyjnie, umieść zwierzę w czystej klatce. Podawaj antybiotyki pooperacyjne w wodzie pitnej przez pięć dni lub do momentu uśmiercenia, jeśli okres ten jest krótszy niż pięć dni. Po uśmierceniu i dekapitacji myszy zgodnie z zatwierdzonymi procedurami, za pomocą sterylnych nożyczek otwórz czaszkę od strony tylnej, a następnie użyj szpatułki, aby delikatnie usunąć nadległą część czaszki.Następnie wprowadź sterylną szpatułkę o szerokości 4 mm w przednią część mózgu, aby odciąć opuszki węchowe i nerwy wzrokowe. Następnie ostrożnie wyjmij mózg z czaszki i umieść go w lodowatym buforze do sekcji. Używając bloku do mózgu i sterylnych żyletek, wykonaj przekroje o grubości od 2 do 3 mm zawierające obszar dotknięty zmianami, a następnie umieść je w zimnym buforze do sekcji.Pod mikroskopem stereoskopowym zidentyfikuj istotę białą znajdującą się pod korą ruchową w wstrzykniętej półkuli. W przypadku wcześniejszych odstępów czasu po udarze, wstrzyknięcie L-Nio zmieszanego z powszechnymi barwnikami laboratoryjnymi, takimi jak fast green, może umożliwić wizualną identyfikację miejsca udaru. W przypadku dłuższych odstępów czasu po udarze, obszar ten można zidentyfikować wizualnie na podstawie ogniskowej martwicy i bladości mieliny.Po zlokalizowaniu, należy użyć skalpela, aby ostrożnie wypreparować obszar istoty białej obejmujący miejsce udaru. W zależności od potrzeb należy usunąć nadległą korę oraz podległe prążkowie. Jak pokazano tutaj, znakowanie immunofluorescencyjne filamentów neuronalnych, widoczne na czerwono, obrazuje stopień utraty aksonów siedem dni po udarze, przy zastosowaniu podejścia przyśrodkowego.Stosując tylne podejście pod kątem, obszar uszkodzenia niedokrwiennego istoty białej jest celowany tuż powyżej komory bocznej i wykazuje intensywną reaktywność mikrogleju, wykrytą za pomocą immunoznakowania IBA-1. Dwa markery włókien pośrednich astrocytów, wimentyna (kolor czerwony) oraz kwaśne białko włókienkowe gleju (kolor zielony), ujawniają zmiany w morfologii astrocytów istoty białej po udarze. Współwstrzyknięcie fluorescencyjnej dekstranaminy w momencie indukcji udaru umożliwia identyfikację pojedynczych neuronów z aksonami uszkodzonymi w wyniku udaru.Większość znakowania występuje w aksonach neuronów warstwy piątej i szóstej w pierwotnych korach czuciowo-ruchowych nad obszarem udaru. Obraz ten przedstawia stan siedem dni po udarze. Po opanowaniu techniki, jej wykonanie zajmuje 45 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać ogniskowy udar w istocie białej u myszy oraz jak przygotować mózg do różnorodnych dalszych analiz, które są przydatne do udzielenia odpowiedzi na istotne pytania dotyczące udarów i regeneracji neurologicznej.

a-versatile-murine-model-subcortical-white-matter-stroke-for-study

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film demonstruje precyzyjną technikę wywoływania udaru istoty białej u znieczulonej myszy poprzez wstrzyknięcie inhibitora tlenku azotu do docelowych współrzędnych mózgu w istocie białej. Prowadzi to do zwężenia naczyń krwionośnych i zahamowania dopływu krwi, co prowadzi do uszkodzenia neuronów i udaru mózgu.

Wywoływanie udaru istoty białej w modelu mysim przy użyciu inhibitora tlenku azotu

Różne mysie modele zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) są szeroko stosowane w eksperymentalnych badaniach mózgu. W tym miejscu demonstrujemy model przezczaszkowego stałego dystalnego MCAO, który powoduje konsekwentny zawał kory mózgowej o wielkości odpowiadającej uszkodzeniom spowodowanym przez większość udarów niedokrwiennych u ludzi.

Modelowanie udaru u myszy: trwała koagulacja dalszej tętnicy środkowej mózgu

Ten manuskrypt opisuje technikę modelowania zawału torebkowego. W tym przypadku zastosowaliśmy zmodyfikowaną technikę fotozakrzepową o niskim natężeniu światła po przedoperacyjnym mapowaniu celu. Za pomocą tej techniki stworzyliśmy opisany model zawału torebki z trwałym upośledzeniem ruchowym.

Modelowanie zawału torebki opisanej techniką fotozakrzepową

Ten artykuł opisuje metodę generowania powtarzalnego uszkodzenia kompresyjnego rdzenia kręgowego (SCI) u noworodka myszy. Model ten stanowi korzystną platformę do badania mechanizmów plastyczności adaptacyjnej, które leżą u podstaw spontanicznej odbudowy funkcjonalnej.

Model urazu kompresyjnego rdzenia kręgowego u noworodków myszy

Chirurgiczne zamknięcie dystalnej gałęzi środkowej tętnicy mózgowej (MCAo) jest często używanym modelem w eksperymentalnych badaniach nad udarem. Manuskrypt ten opisuje podstawową technikę stałego MCAo, połączoną z wstawieniem bocznego okna czaszki, które daje możliwość podłużnej mikroskopii przyżyciowej u myszy.

Przygotowanie bocznego przewlekłego okna czaszki umożliwia obserwację in vivo po niedrożności dystalnej tętnicy środkowej mózgu u myszy

Tutaj opisany jest model udaru fotozakrzepowego, w którym udar jest wytwarzany przez nienaruszoną czaszkę poprzez wywołanie trwałej okluzji mikronaczyniowej za pomocą oświetlenia laserowego po podaniu barwnika światłoczułego.

Modelowanie udaru u myszy: ogniskowe zmiany korowe spowodowane fotozakrzepicą

Ten protokół demonstruje unikalny model udaru myszy ze średniej wielkości zawałem i doskonałym wskaźnikiem przeżycia. Model ten pozwala przedklinicznym badaczom zajmującym się udarem mózgu wydłużyć czas trwania niedokrwienia, wykorzystać starzejące się myszy i ocenić długoterminowe wyniki funkcjonalne.

Zmodyfikowany przezczaszkowy model niedrożności tętnicy środkowej mózgu do badania wyników udaru u starszych myszy

Ten protokół opisuje ektopową ekspresję Neurod1 za pośrednictwem wirusa po korowym udarze niedokrwiennym. Neurod1 jest dostarczany (1) za pomocą systemu Cre-Flex AAV u myszy typu dzikiego w fazie podostrej po udarze (7 dni) oraz (2) przy użyciu pojedynczego wektora AAV u myszy z warunkowym reporterem w fazie przewlekłej po udarze (21 dni).

Systemy AAV i modele mysie do badania ektopowej ekspresji Neurod1 w transdukowanych komórkach w czasie podostrym i przewlekłym po udarze niedokrwiennym

Metoda igłowa asymetrycznego obustronnego zwężenia tętnicy szyjnej wspólnej jest proponowana do stworzenia mysiego modelu dla naczyniowego zaburzenia poznawczego i demencji. Skutkuje długoterminowymi wynikami w porównaniu z wcześniej ustalonymi modelami i jest kompatybilny z MRI na żywo. Wizualna reprezentacja przedstawiająca procedurę stanowi wskazówkę do opanowania operacji.

Mysi model naczyniowych zaburzeń poznawczych i otępienia oparty na asymetrycznym obustronnym zwężeniu tętnicy szyjnej wspólnej prowadzonym igłą

Przeszczepianie wyizolowanych wysepek zostało zaproponowane jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu 1. W niniejszym materiale opisujemy metodę izolacji wysepek z trzustek myszy oraz ich transplantacji do przestrzeni podtorebkowej nerki.

Metoda izolacji wysepek mysich i przeszczepiania podtorebkowego do nerki

Poznaj metodę modelowania udaru podkorowego w istocie białej myszy przy użyciu stereotaksycznej iniekcji L-Nio. Technika umożliwia precyzyjną lokalizację zmian i badanie mechanizmów uszkodzenia aksonów oraz reakcji mikrogleju.

Wszechstronny mysi model podkorowego udaru istoty białej do badania zwyrodnienia aksonów i neurobiologii istoty białej

Przeglądaj więcej filmów