Name: Laserowa mikrodysekcja ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego do analizy RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Poznaj mikrodysekcję laserową do izolacji RNA z nabłonka gruczołu krokowego. Ta metoda umożliwia analizę ekspresji genów w badaniach nad rakiem prostaty z czystych populacji komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy dr Vicky Macias, Angeline Giangreco i Avani Vaishnav za pomoc w optymalizacji tej metodologii na przestrzeni lat oraz Yang Zhang i dr Jian Ma z University of Illinois w Urbana-Champaign za analizę sekwencyjną RNA. Praca ta była wspierana przez NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) oraz grant Fundacji Prevent Cancer (Zhou).

Wszystkie ludzkie tkanki użyte do tych eksperymentów zostały pozyskane za pomocą zatwierdzonego przez Institutional Review Board protokołu i/lub zwolnienia na Uniwersytecie Illinois w Chicago.
1. Sekcja Świeżo Zamrożonej Prostaty na Szkiełku Mechanicznym i na Szkiełku Z Naładowanym Szkiełkiem
<ol>
	<li>Dzień przed lub kilka godzin przed sekcją próbki wyczyść narzędzia (tj. szczotkę, kleszcze, kopliny, ostrza, szkiełka z PEN-em (jeśli nie są jeszcze wolne od RNazy), bezpieczny marker ETOH i ołówek) oraz wnętrze kriostatu RT z roztworem odkażającym RNazy za pomocą butelki z rozpylaczem i chusteczek laboratoryjnych.
	<ol>
		<li>Pozostawić roztwór odkażający RNazy na 5 minut przed wytarciem, spłukać depcH20, aby usunąć resztki roztworu odkażającego RNazy i spłukać na koniec 70% EtOH (przygotowanym z depcH20). 
		Uwaga: Niezbędne jest utrzymanie przestrzeni roboczej wolnej od RNaz. Wszystkie używane kopliny, narzędzia, zamrożone medium montażowe, ostrza i prowadnice powinny być używane wyłącznie do pracy bez RNazy i nigdy nie powinny być używane w standardowym środowisku bez RNazy. Wszystkie instrumenty muszą być poddane działaniu roztworu do odkażania RNazy przed każdym eksperymentem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Schłodzić kriostat do temperatury -24 °C.</li>
	<li>Umieść następujące oczyszczone narzędzia wolne od RNaz w kriostacie do ostygnięcia co najmniej 30 minut przed cięciem: szkiełko wypełnione kopinem 100% etanolem, narzędzia, małe kasety z zamrożonymi tkankami i uchwyt montażowy.</li>
	<li>Pobrać zamrożoną tkankę prostaty z kriomagazynu i umieścić w wiadrze z pianką wypełnioną suchym lodem na czas transportu. Umieść tkankę w kriostatu, aby zrównoważyć temperaturę kriostatu przez co najmniej 30 minut. 
	Uwaga: Ludzkie tkanki prostaty do mikropreparacji laserowej mogą być świeżo mrożone lub zatopione w parafinie (FFPE) utrwalone w formalinie. Ograniczenia czasowe i przygotowanie preparatu różnią się nieco w zależności od źródła tkankowego. Tutaj opisujemy kroki dla zamrożonych sekcji.</li>
	<li>Pracuj z jedną chusteczką na raz i wstrzyknij zamrożone podłoże montażowe na dno kasety i szybko zamontuj zamrożoną tkankę prostaty w zamrożonym podłożu montażowym za pomocą schłodzonych kleszczy.</li>
	<li>Umieść kasetę z chusteczką na chłodziarce w kriostacie na 5 minut, aby ustawić zamrożone podłoże montażowe.</li>
	<li>Wlej niewielką ilość zamrożonego medium montażowego na uchwyt i ostrożnie dociśnij zamontowaną dolną stroną chusteczki do góry na zamrożone podłoże montażowe. Pozostaw w kriostacie na 5 minut, aby zamrożone podłoże montażowe całkowicie zastygło.</li>
	<li>Umieść uchwyt w uchwycie i dokręć.</li>
	<li>Zablokuj uchwyt w pozycji zablokowanej i umieść nowe ostrze na kriostacie. W przypadku dalszych molekularnych punktów końcowych, które obejmują etap amplifikacji (tj. qPCR), zaleca się użycie nowej łopatki dla każdego pacjenta, aby zapobiec zakażeniu (lub przesunięcie ostrza, aby wykorzystać obszar ostrza dla następnej próbki).</li>
	<li>Odblokuj uchwyt i ostrożnie przesuń chusteczkę ręcznie lub za pomocą pedału nożnego, aby wyrównać i odsłonić tkankę za pomocą odcinków 50 μm, aż do osiągnięcia pożądanej ekspozycji tkanki.</li>
	<li>Ustawić kriostat do 5 μm, odciąć jedną lub dwie sekcje i umieścić je na naładowanym szkiełku w celu barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) (patrz krok 2).</li>
	<li>Natychmiast umieść szkiełko w zimnym 100% etanolu na 2 minuty.</li>
	<li>Wyjmij naładowane szkiełko z etanolu i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przed przystąpieniem do barwienia H&E (krok 2).</li>
	<li>Umieść prowadnicę RT PEN-frame na wsporniku ramy.</li>
	<li>Ustaw kriostat na 10 μm i umieść sekcje na szkiełkach ramowych RT PEN. Na każdym szkiełku można umieścić od jednej do czterech sekcji w zależności od rozmiaru tkanki.</li>
	<li>Natychmiast zanurz zjeżdżalnię w zimnym 100% etanolu na 2 minuty.</li>
	<li>Wyjmij szkiełka z ramką PEN z etanolu i przechowuj szkiełko w pudełku na szkiełka w pojemniku na eksykatory w zamrażarce o temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do LCM. Trzy dni to maksymalny czas przechowywania dla optymalnego odzyskiwania RNA.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z krokiem 2 TYLKO dla naładowanego szkiełka podstawowego. Przejdź do kroku 3 dla slajdu z ramką PEN.</li>
</ol>
2. Barwienie hematoksyliną i eozyną-y (H&E) do znaczników histologicznych
Uwaga: Dotyczy to chusteczki na naładowanym szkiełku szkiełkowym, a NIE szkiełka z ramką PEN dla LCM.
<ol>
	<li>Uwodnić sekcje na naładowanym szkiełku podstawowym, zanurzając szkiełko w sortowanym etanolu w następujący sposób: zanurzyć szkiełko dwa razy w 100% etanolu na 3 minuty, dwa razy w 95% etanolu na 3 minuty, raz w 70% etanolu na 3 minuty i dwa razy w destylowanymH2Ona 3 minuty.
	<ol>
		<li>Przygotować kwaśny roztwór alkoholu: 99 ml 70% etanolu + 1 ml 1% HCl i 0,1% roztwór wodorowęglanu sodu: 0,1 g wodorowęglanu sodu w 100 ml destylowanegoH2O</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zanurz szkiełko w Hematoxylin Gill II (0,4%) na 5 minut.</li>
	<li>Nadmiar plamy zmyć w stale płynącym kranie H2O przez 3 min.</li>
	<li>Zanurz szkiełko 10 razy w kwaśnym alkoholu</li>
	<li>Myć szkiełko w bieżącym kranie H2O przez 3 minuty.</li>
	<li>Zanurz szkiełko w 0,1% roztworze wodorowęglanu sodu na 30-60 sekund, aby zmienić kolor na fioletowy na niebieski.</li>
	<li>Myć szkiełko w bieżącym kranie H2O przez 3 minuty.</li>
	<li>Opłucz szkiełko w 95% etanolu i zanurz je w 10 zanurzeniach.</li>
	<li>Zanurz szkiełko w Eosin-Y 2-3 razy na łącznie 15 sekund.</li>
	<li>Odwodnić szkiełko przez sortowany etanol w następujący sposób: zanurz szkiełko dwa razy w 95% etanolu, dwa razy w 100% etanolu i dwa razy w ksylenie (upewnij się, że tkanka jest czysta, co wskazuje na dokładne odwodnienie).</li>
	<li>Zamontuj szkiełko za pomocą niewodnego, trwałego, twardego podłoża montażowego i szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na 30 minut.</li>
	<li>Zeskanuj slajd za pomocą dowolnego skanera do slajdów i wydrukuj duży obraz w wysokiej rozdzielczości na papierze o wymiarach 8 x 11 cali.</li>
	<li>Obrysuj obszary zainteresowania (zwykle wykonywane przez certyfikowanego patologa) za pomocą markera. Ten znacznik jest przewodnikiem dla procedury LCM.</li>
</ol>
3. Niebieskie zabarwienie toluidyny na slajdach z ramką PEN
Uwaga: Odbywa się to TEGO SAMEGO DNIA co LCM. Do wszystkich roztworów należy stosować depcH2O wody. Wykonaj wszystkie kroki w obszarze wolnym od RNaz. Wszystkie kopliny muszą być oczyszczone roztworem odkażającym RNazy.
<ol>
	<li>W dniu LCM wyjmij szkiełka z ramką PEN z zamrażarki -80 °C i nawodnij, delikatnie zanurzając szkiełka w 90% EtOH na 2 minuty, a następnie 75% EtOH na 2 minuty.
	<ol>
		<li>Przygotuj 0,5% błękitu toluidynowego, rozpuszczając się w wodzie klasy biologii molekularnej, a następnie przefiltruj, wysterylizuj przez filtr 0,2 μm i przechowuj w temperaturze pokojowej. Roztwór ten może być ponownie używany przez okres do 6 miesięcy. Uwaga: Zdecydowanie zaleca się wcześniejsze przygotowanie roztworu, ponieważ filtracja może potrwać kilka godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zabarwić tkankę prostaty, delikatnie zanurzając szkiełka w 0,5% błękitu toluidynowego na 5-30 sekund. Odbarwić tkankę, myjąc szkiełka 2 razy w depcH2O przez 15 sekund, a następnie 75% EtOH przez 30 sekund do 3 minut. Uwaga: czas barwienia i odbarwiania można dostosować, aby zapewnić dobre barwienie. Prostata ma tendencję do nadmiernego przebarwień.</li>
	<li>Przenieś szkiełka z ramką PEN do suchego pojemnika na lodzie bez RNAaz.</li>
</ol>
4. Mikro-dyssekcja wychwytu laserowego (LCM) 
<ol>
	<li>Bezpośrednio przed LCM suszyć szkiełko na szkiełku podstawowym w temperaturze 42 °C przez 15 minut. Wysuszyć tylko szkiełko, które zostanie poddane obróbce, a resztę przechowywać na lodzie, aż będzie gotowe.</li>
	<li>Włącz LCM i komputer w tej kolejności, zasilanie mikroskopu, lasera, przełącznik lasera, a następnie komputer. Uruchom oprogramowanie Laser Microdissection.</li>
	<li>Użyj oprogramowania do sterowania mikroskopem, aby załadować szkiełka i probówki zbiorcze. Kliknij "rozładuj uchwyt na próbkę", załaduj szkiełko z sekcjami na uchwyt szkiełka mikroskopu chusteczką skierowaną w dół i włóż uchwyt szkiełka w odpowiednie miejsce w mikroskopie, a następnie kliknij "kontynuuj".
	<ol>
		<li>Kliknij "rozładuj probówki zbiorcze", oznacz etykietę i załaduj probówki o pojemności 0,5 ml na uchwyt probówki i włóż je w odpowiednie miejsce w urządzeniu. Po zabezpieczeniu nakrętek dodaj 35 μl buforu do lizy do nakrętek zbiorczych i staraj się unikać pęcherzyków. Następnie kliknij "OK". 
		Uwaga: Jeśli problemem jest parowanie, rozcieńczyć bufor w następujący sposób: 25 μl buforu do lizy z 10 μl depcH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W oprogramowaniu wybierz pozycję, w której slajd został umieszczony w uchwycie szkiełka. Wybierz nasadkę zbierającą, aby pobrać próbkę LCM.</li>
	<li>Wizualizuj i ustaw ostrość slajdu przez komputer z 10-krotnym natężeniem. Użyj oprogramowania, aby skalibrować laser, wybierając "Laser", a następnie "kalibruj". Dostosuj moc, aperturę i prędkość lasera, wybierając "laser", a następnie "kontrola", aby wiązka laserowa mogła całkowicie i skutecznie przeciąć wybrany obszar. Powtarzaj regulacje, aż laser całkowicie przetnie tkankę.</li>
	<li>Korzystając ze znacznika patologa 8" x 11" jako przewodnika, użyj narzędzia "narysuj kształt", aby opisać żądane obszary nabłonka w widoku i unikaj zbierania zrębów. 
	Uwaga: W jednym widoku można zaznaczyć wiele obszarów, ale nie należy przechodzić do innego widoku bez uprzedniego wycięcia, klikając narzędzie "wytnij kształt".
	<ol>
		<li>Jeśli obszar nie zostanie całkowicie przecięty przez laser, użyj narzędzia "przesuń i wytnij", aby przejść nad nim ręcznie. Kontynuuj przesuwanie obiektywu do nowych widoków i powtarzaj cięcie laserowe, aż do całkowitego wypreparowania szkiełka lub pobrania żądanej ilości tkanki (zwykle 100 łagodnych gruczołów daje 150-500 ng RNA). (patrz przykład na rysunku 1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij probówki z uchwytu zbiorczego i zamknij nakrętki, zwracając uwagę na bufor do lizy i tkankę w nakrętkach. Krótko wirować przez 30 sekund, aby zebrać płyn i tkankę na dnie probówki. Próbki inkubować w temperaturze 42 °C przez 30 minut i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będą gotowe do izolacji RNA.</li>
</ol>
5. Całkowita izolacja RNA za pomocą zestawu opartego na filtrze i analizy jakości
<ol>
	<li>Rozmrozić probówki na lodzie i doprowadzić objętość roztworu do 100 μl.</li>
	<li>Wstępnie zwilż mikrofiltr zestawu do izolacji RNA, nakładając 30 μl roztworu do lizy na środek filtra i pozwól mu nasiąknąć podczas wykonywania kolejnych dwóch kroków (co najmniej 5 minut).</li>
	<li>Dodać 3 μl roztworu dodatku LCM (dostarczonego w zestawie) do lizatu i mieszać przez wirowanie przez 5 sekund. Wirować przez 30 sekund, aby zebrać płyn na dnie probówki.</li>
	<li>Odwiruj wstępnie zwilżony filtr przez ~30 sekund z maksymalną prędkością, aby usunąć płyn.</li>
	<li>Dodać 1,25 objętości (w tym przypadku 129 μl) 100% etanolu do mieszaniny lizatów, delikatnie wirować lub pipetować w górę iw dół. **Ta metoda pozwoli odzyskać zarówno duże, jak i małe gatunki RNA.</li>
	<li>Załaduj próbkę do wstępnie zwilżonego mikrofiltra i odwiruj przy 10 000 x g przez 1 minutę, aby związać RNA z filtrem. Następnie przemyć mikrofiltr 180 μl "roztworu płuczącego 1", odwirować przy 10 000 x g przez 1 min. 
	Uwaga: Od tego momentu wszystkie wirowania powinny być wykonywane z prędkością 13 000 x g lub maksymalną prędkością.</li>
	<li>Przemyć filtr dwukrotnie odpowiednio 180 μl "roztworów myjących 2 i 3", zgodnie z zaleceniami w protokole zestawu. Wirować przez 30 sekund, następnie odrzucić przepływ i obracać filtr przez 1 minutę, aby usunąć resztki płynu i wysuszyć filtr.</li>
	<li>Przenieś filtr do nowej probówki zbiorczej.</li>
	<li>Ciepły roztwór elucyjny do temperatury -95 °C (dostarczany z zestawem).</li>
	<li>Nanieść 10 μl podgrzanego roztworu elucyjnego na środek filtra, zamknąć nakrętkę i przechowywać przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odwiruj przez 1 minutę w celu elucji RNA i powtórz ten krok jeden raz, aby uzyskać ~ 20 μl RNA.</li>
	<li>Zabieg DNazy I należy wykonywać przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Określić ilościowo RNA za pomocą spektrofotometru o absorbancji przy 260 nm. Stosunek gęstości optycznej przy długościach fal 260 nm i 280 nm służy do oceny czystości RNA (zob. tabela 1)15.</li>
</ol>
6. Analiza ekspresji genów
Uwaga: Ekspresja genów długich gatunków RNA (takich jak mRNA i lncRNA) jest pokazana w kroku 6.1, a krótkich gatunków RNA (takich jak mikroRNA) jest pokazana w kroku 6.2. Dostępne są różne zestawy do RT-qPCR, a wymagana ilość RNA różni się w zależności od zestawu (zaledwie 10 ng). Analiza sekwencjonowania RNA jest opisana w ppkt 6.3.
<ol>
	<li>Odwrotna transkrypcja (RT) RNA do cDNA miesza 5 μl próbki RNA o stężeniu 20 ng/μl z 5 μl głównej mieszanki RT (bufor RT, dNTP, startery losowe, enzym RT, inhibitor RNazy). Inkubować reakcję przez 25 minut w temperaturze 25 °C, następnie 120 minut w temperaturze 37 °C i 5 minut w temperaturze 85 °C.</li>
	<li>Rozcieńczyć reakcję RT w stosunku 1:10 wodą wolną od RNaz i użyć 2,5 μl na 10 μl reakcji qPCR ze starterami lub zestawami starter/sonda dla interesujących genów. 
	Uwaga: Aby ułatwić analizę częściowo zdegradowanego RNA, zaleca się stosowanie starterów dla krótszych amplikonów (poniżej 100 pz)16. (Tabela 2B)
	<ol>
		<li>W celu analizy ekspresji mikroRNA przeprowadzić reakcję RT, mieszając 5 μl próbki RNA o stężeniu 2-10 ng/μl z 5 μl głównej mieszanki RT. 
		Uwaga: każda dostępna na rynku technologia wykrywania mikroRNA oparta na PCR wymaga użycia zastrzeżonych i specyficznych starterów RT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywnie lub oprócz RT-PCR należy zastosować sekwencjonowanie nowej generacji (sekwencjonowanie RNA lub sekwencjonowanie małych RNA) w celu ilościowego określenia różnych gatunków RNA. Zazwyczaj do tej procedury używa się 500 ng RNA (Tabela 3) i należy postępować zgodnie z zaleceniami producenta i przyrządu do wykrywania.</li>
</ol>

<ol><li>Schauer, I. G., Rowley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+role+of+reactive+stroma+in+benign+prostatic+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia.</a> Differentiation. 82, 200-210 (2011).</li>
<li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+as+models+of+prostate+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-related+cancer%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures as models of prostate cancer development.</a> Endocrine-related cancer. 12, 19-47 (2005).</li>
<li>McNeal, J. E., Haillot, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+spread+of+adenocarcinoma+in+the+prostate+as+related+to+cancer+volume%5BTitle%5D)+AND+%22The+Prostate%22%5BJournal%5D)">Patterns of spread of adenocarcinoma in the prostate as related to cancer volume.</a> The Prostate. 49, 48-57 (2001).</li>
<li>Nonn, L., Vaishnav, A., Gallagher, L., Gann, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+and+micro-RNA+expression+analysis+in+laser-capture+microdissected+prostate+biopsies%3A+valuable+tool+for+risk+assessment+and+prevention+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+molecular+pathology%22%5BJournal%5D)">mRNA and micro-RNA expression analysis in laser-capture microdissected prostate biopsies: valuable tool for risk assessment and prevention trials.</a> Experimental and molecular pathology. 88, 45-51 (2010).</li>
<li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+transcriptome+analysis+of+formalin-fixed+prostate+cancer+specimens+identifies+biomarkers+of+disease+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Global transcriptome analysis of formalin-fixed prostate cancer specimens identifies biomarkers of disease recurrence.</a> Cancer research. 74, 3228-3237 (2014).</li>
<li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-coding+and+microRNA+biomarkers+of+recurrence+of+prostate+cancer+following+radical+prostatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Protein-coding and microRNA biomarkers of recurrence of prostate cancer following radical prostatectomy.</a> The American journal of pathology. 179, 46-54 (2011).</li>
<li>Giangreco, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+and+regulation+of+vitamin+D+hydroxylases+and+inflammatory+genes+in+prostate+stroma+and+epithelium+by+1%2C25-dihydroxyvitamin+D+in+men+with+prostate+cancer+and+an+in+vitro.+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+steroid+biochemistry+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Differential expression and regulation of vitamin D hydroxylases and inflammatory genes in prostate stroma and epithelium by 1,25-dihydroxyvitamin D in men with prostate cancer and an in vitro. model.</a> The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. , (2014).</li>
<li>Giangreco, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+microRNAs%2C+miR-100+and+-125b%2C+are+regulated+by+1%2C25-dihydroxyvitamin+D+in+primary+prostate+cells+and+in+patient+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+prevention+research%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor microRNAs, miR-100 and -125b, are regulated by 1,25-dihydroxyvitamin D in primary prostate cells and in patient tissue.</a> Cancer prevention research. 6, 483-494 (2013).</li>
<li>Mihelich, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-183-96-182+cluster+is+overexpressed+in+prostate+tissue+and+regulates+zinc+homeostasis+in+prostate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells.</a> The Journal of biological chemistry. 286, 44503-44511 (2011).</li>
<li>Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+RNA+integrity+in+a+homogeneous+population+of+mammary+epithelial+cells+isolated+by+Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection.</a> BMC cell biology. 11, 95(2010).</li>
<li>Gregg, J. L., Brown, K. E., Mintz, E. M., Piontkivska, H., Fraizer, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+in+prostate+cancer+epithelial+and+interstitial+stromal+cells+using+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression in prostate cancer epithelial and interstitial stromal cells using laser capture microdissection.</a> BMC cancer. 10, 165(2010).</li>
<li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+microRNA+profiling+of+prostate+carcinomas+with+increasing+tumor+stage+by+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer+research+%3A+MCR%22%5BJournal%5D)">Comparative microRNA profiling of prostate carcinomas with increasing tumor stage by deep sequencing.</a> Molecular cancer research : MCR. 12, 250-263 (2014).</li>
<li>Smalheiser, N. R., Lugli, G., Thimmapuram, J., Cook, E. H., Larson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+siRNAs+and+noncoding+RNA-derived+small+RNAs+are+expressed+in+adult+mouse+hippocampus+and+are+up-regulated+in+olfactory+discrimination+training%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Endogenous siRNAs and noncoding RNA-derived small RNAs are expressed in adult mouse hippocampus and are up-regulated in olfactory discrimination training.</a> Rna. 17, 166-181 (2011).</li>
<li>Song, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profile+analysis+of+microRNAs+in+prostate+cancer+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Prostate%22%5BJournal%5D)">Expression profile analysis of microRNAs in prostate cancer by next-generation sequencing.</a> The Prostate. 75, 500-516 (2015).</li>
<li>Deng, M. Y., Wang, H., Ward, G. B., Beckham, T. R., McKenna, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+six+RNA+extraction+methods+for+the+detection+of+classical+swine+fever+virus+by+real-time+and+conventional+reverse+transcription-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+veterinary+diagnostic+investigation+%3A+official+publication+of+the+American+Association+of+Veterinary+Laboratory+Diagnosticians%2C+Inc%22%5BJournal%5D)">Comparison of six RNA extraction methods for the detection of classical swine fever virus by real-time and conventional reverse transcription-PCR.</a> Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17, 574-578 (2005).</li>
<li>Kong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+short+amplicons+in+FFPE-derived+long-chain+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of short amplicons in FFPE-derived long-chain RNA.</a> Scientific reports. 4, 7246(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Profilowanie ekspresji genów na próbkach ludzkich może być wyzwaniem, nie tylko ze względu na jakość lub ilość dostępnej tkanki, ale także ze względu na różne jednostki histologiczne obecne w danej próbce tkanki. Jest to szczególnie trudne w prostacie, w której tkanki łagodne są w dużej mierze tkankami zrębu, a obszary raka są pozbawione zrębu. LCM ułatwia fizyczną separację zrębu stercza i nabłonka RNA w celu dokładniejszego podpisania dwóch różnych typów komórek (Figura 1A). W porównaniu z makrodysekcj...

Gruczoł krokowy to niejednorodna tkanka złożona z nabłonka wydzielniczego ułożonego w gruczołowe ziarniaki otoczone zrębem włóknisto-mięśniowym złożonym głównie z mięśni gładkich1. Przedział nabłonkowy składa się z pięciu różnych, ale zorganizowanych typów komórek: komórek podstawnych, komórek wydzielniczych, komórek neuroendokrynnych, komórek wzmacniających tranzyt i komórek macierzystych2. W raku gruczołu krokowego (PCa), który powstaje z komórek nabłonka światła, wzrost gruczolakoraka powoduje wyraźny postępujący spadek przedziału zrębu3. Z tych powodów próbki tkanek będą miały wyraźne różnice w proporcji typów komórek zrębu i nabłonka w zależności od zasięgu PCa. Różnice te mogą prowadzić do tendencyjnych założeń dotyczących danych dotyczących ekspresji genów uzyskanych z całych tkanek bez uwzględnienia mikrodysekcji pożądanego typu komórki. Dlatego, aby usunąć to uprzedzenie, konieczne jest oddzielenie typów komórek przed ekstrakcją RNA i analizą ekspresji genów.
Makrodysekcja lub mikrodysekcja może być użyta do fizycznego oddzielenia dobrze scharakteryzowanych obszarów nabłonka od otaczającego zrębu 4-6. Makrodysekcja jest zwykle wykonywana za pomocą żyletki pod mikroskopem preparacyjnym i działa dobrze w oddzielaniu dużych guzków PCa od zrębu, ale nie jest w stanie usunąć łagodnego nabłonka z otaczającego zrębu (patrz przykład łagodnej histologii prostaty na rycinie 1). Mikrodysekcja za pomocą lasera (LCM) jest znacznie bardziej pracochłonna niż makrodyssekcja, ale może bardzo dokładnie wypreparować łagodny nabłonek4.
Ostatnie publikacje z naszego laboratorium wykazały, że RNA może być z powodzeniem ekstrahowane przez LCM zarówno z biopsji zatopionych w parafinie (FFPE) z formaliną, jak i z zamrożonej tkanki4,7-9. Głównymi wyzwaniami w ekstrakcji LCM-RNA są: 1) dokładne wypreparowanie pożądanych obszarów tkanki oraz 2) zachowanie integralności RNA podczas procesu LCM i izolacji4,10. RNA wyizolowane z czystych populacji komórkowych można wykorzystać do analizy ekspresji genów kilkoma metodami, w tym ilościowym PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR)7,8, mikromacierzą11 i głębokim sekwencjonowaniem12-14.
Celem tego protokołu jest wyizolowanie całkowitego RNA z nabłonka prostaty LCM z zamrożonej tkanki do dalszych analiz ekspresji genów.

<table><tbody><tr><td>RNase-AWAY&nbsp;</td><td>MBP</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice membranowe 4,0 mm&nbsp;</td><td>Szkiełka Leica</td><td>11600289</td><td></td></tr><tr><td>, Superfrost Plus</td><td>FisherBrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 proof</td><td>Decon labs.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>DEPC (pirowęglan dietylu)</td><td>Sigma</td><td>D-5758</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Coplins (Słoik do barwienia)</td><td>IHCWORLD</td><td>M900-12</td><td></td></tr><tr><td>Coplins (Stojak do barwienia)</td><td>IHCWORLD</td><td>M905-12</td><td></td></tr><tr><td>Aperio ScanScope</td><td>Aperio(Leica)</td><td>ScanScope&reg; </td><td></td>CS</tr><tr><td>Toluidine Blue</td><td>Fluka</td><td>89640-5G</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy system mikrodysekcji</td><td>Leica</td><td>LMD7000</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Cienkościenne probówki do LCM</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0350</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji RNAqueous&reg;-Micro</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td>Thermo Fisher Scientific Marka</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometr</td><td>Life Technologies</td><td>Q32866</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand Zestaw</td></tr><tr><td>do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand</td></tr><tr><td>Uniwersalny zestaw do syntezy cDNA II, 8-64 rxns</td><td>Zestaw Exiqon</td><td>203301</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan microRNA RT</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366597</td><td>Barwienie hematoksylinowe marki Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3536-16</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Y Richard</td><td>Allan Naukowy&nbsp;</td><td>Zobacz materiał 7111</td><td></td></tr></tbody></table> TGL

laserowa mikrodysekcja ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego do analizy rna

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

Gruczoł krokowy zawiera niejednorodne środowisko komórek zrębu, nabłonka, neuroendokrynnych i odpornościowych. Zdrowa prostata składa się ze zrębu włóknisto-mięśniowego otaczającego dyskretne światła wydzielnicze wyściełane nabłonkiem i bardzo małą populację komórek odpornościowych i neuroendokrynnych. Natomiast obszary raka prostaty mają zwiększony dysplastyczny nabłonek świetlny ze znacznie zmniejszoną populacją zrębu lub jej brakiem. Biorąc pod uwagę głęboką różnicę między typami komórek zrębu i nabłonka, konieczne jest oddzielenie typów komórek dla każdego rodzaju dalszej analizy molekularnej. Pomimo tej wiedzy, większość badań nad ekspresją genów porównuje łagodną prostatę z rakiem bez mikrorozwarstwienia, co prowadzi do odchylenia zrębu w łagodnych próbkach. Mikrodyssekcja z wychwytem laserowym (LCM) jest skuteczną metodą fizycznego oddzielania różnych typów komórek od przekroju próbki. Celem tego protokołu jest pokazanie, że RNA można z powodzeniem wyizolować z ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego pobranego za pomocą LCM i wykorzystać do dalszych badań ekspresji genów, takich jak RT-qPCR i RNAseq.

W poprzednim badaniu wykazaliśmy zastosowanie LCM do pobierania tkanek nabłonkowych i zrębowych w celu porównania profilowania ekspresji za pomocą RT-qPCR mRNA oraz mikroRNA z mrożonych tkanek prostaty oraz tkanek utrwalonych w FFPE pochodzących od tego samego pacjenta4. LCM jest czasochłonne, szczególnie gdy do analizy sekwencjonowania następnej generacji wymagana jest duża ilość RNA. Dlatego kluczowe jest utrzymanie przestrzeni roboczej i narzędzi w stanie wolnym od RNaz. Zaleca się badanie kontroli jakości ...

Celem tego protokołu jest wykorzystanie mikro-dysekcji laserowej jako skutecznej metody izolowania czystych populacji typów komórek z heterogenicznych tkanek prostaty do dalszej analizy RNA.

Laserowa mikrodysekcja ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego do analizy RNA

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu mikrosekcji laserowej (LCM) jest izolacja całkowitego RNA z czystych populacji typów komórek nabłonkowych prostaty z heterogenicznych zamrożonych tkanek prostaty do późniejszych analiz ekspresji genów. Metoda ta może pomóc w analizie próbek pacjentów i udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem prostaty, takie jak różnice w ekspresji RNA w łagodnych i chorych próbkach tkanki nabłonkowej prostaty lub w próbkach z badań klinicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że mikrosekcja laserowa umożliwia izolację RNA z homogenicznych populacji komórek nabłonkowych lub komórek zrębu z zamrożonej tkanki prostaty.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mają trudności z uzyskaniem wysokiej jakości RNA, ponieważ nie wiedzą, które etapy są kluczowe dla zachowania stabilności RNA. Rozpocznij od zgromadzenia wszystkich odczynników i narzędzi niezbędnych do przeprowadzenia procedury. Po pozostawieniu zamrożonej tkanki prostaty na 30 minut w kriostacie w celu wyrównania temperatury, nanieś medium montażowe na dno kasety i szybko zamocuj tkankę, używając schłodzonej pęsety.Umieść kasetkę w chłodnicy kriotomu na pięć minut, a

laser-capture-microdissection-human-prostatic-epithelium-for-rna

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) jest szybką i czułą metodą badania poziomów ekspresji różnych cząsteczek mikroRNA (miRNA) w próbkach nowotworowych. Zastosowanie tej metody pozwala na amplifikację, kwantyfikację i analizę ekspresji setek różnych cząsteczek miRNA z tej samej matrycy cDNA.

Wykrywanie mikroRNA w guzach prostaty za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Identyfikacja ekspresji poszczególnych loci HERV w oparciu o mikromacierze: zastosowanie do odkrywania biomarkerów w raku prostaty

Analiza ekspresji genów w podzbiorze komórek w określonej tkance stanowi duże wyzwanie. W tym artykule opisano, jak wyizolować wysokiej jakości całkowite RNA z określonej populacji komórek, łącząc metodę szybkiego znakowania immunologicznego z mikrodysekcją wychwytu laserowego.

Izolacja RNA z subpopulacji specyficznych dla komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej w połączeniu z szybkim znakowaniem immunologicznym

Tutaj opisujemy uproszczony protokół analiz ekspresji mikroRNA (miRNA) w archiwalnych tkankach klinicznych z utrwalonym formaliną, parafiną (FFPE) lub świeżo mrożonym rakiem prostaty (PCa) z wykorzystaniem ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR) i hybrydyzacji in situ (ISH).

Analizy ekspresji miRNA w tkankach klinicznych raka gruczołu krokowego

Tutaj opisujemy protokół powtarzalnej mikrodysekcji laserowej (LCM) do izolowania siatki beleczkowej (TM) do dalszej analizy RNA. Możliwość analizowania zmian w ekspresji genów w TM pomoże w zrozumieniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw chorób oczu związanych z TM.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji siatki beleczkowej o wysokiej czystości z oczu myszy do analizy ekspresji genów

Celem tego protokołu jest uzyskanie próbek RNA o wysokiej integralności z zwojów jelitowych wyizolowanych z nieutrwalonej, świeżo wyciętej tkanki jelita ludzkiego za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM). Protokół ten obejmuje przygotowanie błyskawicznie zamrożonych próbek ludzkiej tkanki jelitowej, kriosekcję, barwienie i odwodnienie etanolowe, LCM i ekstrakcję RNA.

Optymalizacja mikrodysekcji laserowej w celu izolacji zwojów jelitowych ze świeżo zamrożonej tkanki ludzkiej

Protokół mikrodysekcji laserowej (LCM) został opracowany w celu uzyskania wystarczającej ilości wysokiej jakości RNA do analizy ekspresji genów w komórkach kostnych. Obecne badanie koncentruje się na mysich odcinkach kości udowej. Jednak opisany tutaj protokół LCM może być wykorzystany do badania ekspresji genów w komórkach dowolnej tkanki twardej.

Protokół mikrodysekcji z wychwytem laserowym, który zapewnia wysokiej jakości RNA ze świeżo zamrożonych kości myszy

Ten protokół opisuje mikrodysekcję laserową do izolacji chrząstki i kości ze świeżo zamrożonych fragmentów zarodka myszy. Chrząstka i kość mogą być szybko uwidocznione przez barwienie fioletem krezylo i precyzyjnie zebrane w celu uzyskania wysokiej jakości RNA do analizy transkryptomicznej.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji chrząstki embrionalnej i kości myszy w celu analizy ekspresji genów

Oporność na terapię często rozwija się u pacjentów z zaawansowanym rakiem prostaty, a w niektórych przypadkach rak rozwija się do śmiertelnego podtypu zwanego neuroendokrynnym rakiem prostaty. Ocena niewielkich zmian molekularnych za pośrednictwem niekodującego RNA, które ułatwiają to przejście, pozwoliłaby na lepszą stratyfikację choroby i identyfikację mechanizmów przyczynowych, które prowadzą do rozwoju neuroendokrynnego raka gruczołu krokowego.

Sekwencjonowanie małego niekodującego RNA z tkanek utrwalonych formaliną i egzosomów pochodzących z surowicy od pacjentów z opornym na kastrację rakiem prostaty

Opisujemy protokół laserowej mikrodysekcji podsegmentów ludzkiej nerki, w tym kłębuszka nerkowego, kanalika proksymalnego, grubej kończyny wstępującej, przewodu zbiorczego i śródmiąższu. RNA jest następnie izolowane z uzyskanych przedziałów i przeprowadza się sekwencjonowanie RNA w celu określenia zmian w sygnaturze transkryptomicznej w każdym podsegmencie.

Zastosowanie mikrodysekcji laserowej do odkrycia regionalnej transkryptomiki w ludzkiej tkance nerkowej

Protokół ten opisuje metodę izolowania RNA z określonych histologicznych obszarów tkanki wątroby myszy z unieruchomioną o Optymalnej Temperaturze Cięcia z zastosowaniem złożonego tkanki wątroby za pomocą mikrosekcji laserowej, umożliwiającej ukierunkowaną analizę ekspresji genów w dalszej fazie.

Mikroskop laserowego przechwytywania tkanki wątroby myszy utrwalonej paraformaldehydem do analizy RNA

Poznaj mikrodysekcję laserową do izolacji RNA z nabłonka gruczołu krokowego. Ta metoda umożliwia analizę ekspresji genów w badaniach nad rakiem prostaty z czystych populacji komórek.

Laserowa mikrodysekcja ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego do analizy RNA

Przeglądaj więcej filmów