Laserowa mikrodysekcja ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego do analizy RNA
26 listopada 2015
Celem tego protokołu jest wykorzystanie mikro-dysekcji laserowej jako skutecznej metody izolowania czystych populacji typów komórek z heterogenicznych tkanek prostaty do dalszej analizy RNA.
Ogólnym celem tego protokołu mikrodyssekcji laserowej jest wyizolowanie całkowitego RNA z czystych populacji typów komórek nabłonka gruczołu krokowego z heterogenicznych zamrożonych tkanek prostaty w celu dalszych analiz ekspresji genów. Ta metoda może pomóc w analizie próbek pacjentów i odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem prostaty, takie jak różnice w ekspresji RNA w łagodnych i chorobowych próbkach tkanek protetycznych nabłonka lub w próbkach z badań klinicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że mikrodyspreparacja z wychwytem laserowym umożliwia izolację RNA jednorodnych populacji komórek nabłonka lub str z zamrożonej tkanki prostaty.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności z uzyskaniem wysokiej jakości RNA, ponieważ nie wiedzą, które kroki są kluczowe dla utrzymania RNA. Warunki wolne Zacznij od zebrania wszystkich odczynników i narzędzi potrzebnych do zabiegu. Po pozostawieniu zamrożonej tkanki prostaty do zrównoważenia wewnątrz kriostatu przez 30 minut, wstrzyknij pożywkę montażową na dno kasety i szybko zamontuj tkankę za pomocą schłodzonych kleszczy.
Umieść kasetę w chłodziarce kriostatu na pięć minut, aby ustawić medium mocujące. Po ustawieniu spryskaj zamrożony, montując medium na uchwycie i ostrożnie wciśnij w niego zamontowaną chusteczkę. Dnem do góry.
Pozostaw preparat na pięć minut do zastygnięcia. Przed umieszczeniem uchwytu w uchwycie zablokuj uchwyt na miejscu i włóż nowe ostrze do kriostatu. Po odblokowaniu uchwytu ostrożnie przesuwaj próbkę, aż do osiągnięcia pożądanej ekspozycji tkanki.
Gdy będziesz gotowy, ustaw kriostat na pięć mikronów i odetnij jedną lub dwie sekcje. Umieść te sekcje na naładowanym szkiełku w celu barwienia hematyny i eoiny. Natychmiast umieść szkiełko w zimnym, 100% etanolu na dwie minuty.
Po tym czasie wyjmij szkiełko i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Szkiełko barwione h i d zapewnia lepszą wizualizację tekstur jądrowych i powinno być używane przez patologa do oznaczania obszarów zainteresowania. Następnie umieść ramkę pióra o temperaturze pokojowej.
Wsuń do wspornika ramy, ustaw kriostat na 10 mikronów i utwórz sekcje. Na każdym szkiełku można umieścić od jednej do czterech sekcji, w zależności od rozmiaru tkanki. Natychmiast zanurz zjeżdżalnię w zimnym 100% etanolu.
Wyjmij szkiełko po dwóch minutach i przechowuj w zamrażarce do późniejszej analizy. W tym samym dniu, w którym dokonano mikrodysekcji laserowej, wyjmij szkiełka z ramki pióra z zamrażarki, pracując w obszarze wolnym od RNA. Nawodnij szkiełka, delikatnie zanurzając je w 90% etanolu na dwie minuty, a następnie w 75% etanolu na dwie minuty.
Po nawodnieniu zabarwić tkankę prostaty, delikatnie zanurzając szkiełka w 0,5% niebieskim toine na okres od pięciu do 30 sekund. Zatrzymaj chusteczkę, myjąc szkiełka dwukrotnie w głębokiej wodzie przez 15 sekund, a następnie 75% etanolem przez 30 sekund do trzech minut. Na koniec przenieś szkiełka z ramką pióra do suchego pojemnika wolnego od RNA na lodzie.
Przed rozpoczęciem zabiegu umieść szkiełko do wyschnięcia na podgrzewaczu do szkiełek na 15 minut. Wysuszyć tylko szkiełko, które zostanie przetworzone, a resztę przechowywać na lodzie, aż będzie potrzebne. Włącz komponenty LCM w następującej kolejności.
Moc mikroskopu, lasera, przełącznik lasera, a następnie komputer. Następnie uruchom oprogramowanie do mikrodysekcji laserowej za pomocą oprogramowania. Poprowokuj mikroskop do załadowania szkiełek i probówek zbiorczych.
Kliknij na rozładuj uchwyt próbki i załaduj szkiełko na uchwyt szkiełka chusteczką skierowaną w dół. Włóż uchwyt szkiełka do odpowiedniego otworu w mikroskopie i kliknij przycisk Kontynuuj. Następnie kliknij na rozładuj probówki zbiorcze.
Oznacz i załaduj rurki na uchwyt probówki i włóż do odpowiedniego gniazda. Zabezpiecz nakrętki i dodaj 35 mikrolitrów buforu do lizy. Uważaj, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
Po załadowaniu zakrętek kolekcji kliknij przycisk OK. Użyj oprogramowania, aby wybrać pozycję szkiełka w uchwycie, a następnie wybierz nasadkę zbierającą, aby pobrać próbkę. Wizualizuj slajd i ustawiaj ostrość na nim w komputerze w 10-krotnym powiększeniu.
Użyj oprogramowania, aby skalibrować laser, wybierając laser. Następnie skalibruj, dostosuj moc, aperturę i prędkość lasera, wybierając laser, a następnie kontroluj. Kontynuuj regulacje, aż laser całkowicie przetnie tkankę.
Kluczowe znaczenie ma nakreślenie obszarów zainteresowań zwykle wykonywanych przez certyfikowanego patologa w celu dokładnego przeanalizowania pożądanych obszarów tkanki poddanych LCM, używając znaczników patologa osiem na 11 godzin i e jako wizualnego przewodnika. Użyj narzędzia do rysowania kształtu w oprogramowaniu, aby oznaczyć żądane obszary nabłonka w widoku i uniknąć zbierania zrębu. Kliknij cięcie, aby uruchomić laser.
Jeśli obszar nie jest całkowicie przycięty, użyj narzędzia Przesuń i wytnij, aby ręcznie go przesunąć. Kontynuuj przesuwanie celu do nowych widoków i powtarzaj cięcie laserowe, aż szkiełko zostanie całkowicie wypreparowane lub pożądana ilość tkanki zostanie pobrana. Po zakończeniu ostrożnie wyjmij probówki z pojemnika na próbki i zamknij nakrętki, zwracając uwagę na lizę, bufor i tkankę w nakrętkach.
Krótko odwirować przez 30 sekund, aby zebrać płyn i tkankę na dnie probówki. Próbki inkubować w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 minut i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do izolacji RNA. Przykłady te pokazują reprezentatywne skrawki prostaty zabarwione na niebiesko toluidyną na szkiełku z ramką pióra przed i po laserowym uchwyceniu łagodnych kontroli specyficznych dla komórek nabłonka.
Potwierdź specyficzność przechwyconego laserowo obszaru tkanki. Łagodny nabłonek i zrąb. Nie ulega ekspresji genu specyficznego dla raka prostaty, A-M-A-C-R.
Zrąb nie wykazywał ekspresji genu specyficznego dla nabłonka i KX 3.1 Podczas próby tej procedury. Ważne jest, aby pamiętać, aby pracować w środowisku wolnym od RNA, aby zapobiec degradacji RNA. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować RNA z jednorodnych populacji nabłonka lub komórek burzowych z zamrożonej tkanki dla wielu dalszych technik analizy.
Nie zapominaj, że praca z kriostatem może być bardzo niebezpieczna w środkach ostrożności, takich jak dobre szkolenie i bardzo duża uwaga na ostrze podczas wykonywania tej procedury.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje stosowanie mikrodyskcji laserowej do izolowania czystych populacji typów komórek nabłonka prostaty z heterogenicznych mrożonych tkanek prostaty. Ta metoda ułatwia dalszą analizę RNA, pomagając w badaniach nad rakiem prostaty.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia
- Onkologia
Tło
- Badania nad rakiem prostaty wymagają precyzyjnej analizy RNA z określonych typów komórek.
- Heterogeniczne tkanki komplikują izolację czystych populacji komórek.
- Mikrodyskcja laserowa oferuje rozwiązanie dla wysokiej jakości ekstrakcji RNA.
- Rozumienie różnic w ekspresji RNA może wpłynąć na praktyki kliniczne.
Cel badania
- Izolacja całkowitego RNA z czystych populacji komórek nabłonka prostaty.
- Analiza ekspresji RNA w tkankach łagodnych i chorobowych.
- Zgłębienie rozumienia raka prostaty poprzez analizy ekspresji genów.
Zastosowane metody
- Technika mikrodyskcji laserowej.
- Izolacja RNA z mrożonych próbek tkanki prostaty.
- Krytyczne kroki mające na celu zachowanie jakości RNA podczas procedury.
- Użycie schłodzonych kleszczy i medium montażowego do manipulacji tkanką.
Główne wyniki
- Udana izolacja wysokiej jakości RNA z określonych populacji komórek.
- Zdolność do różnicowania profili ekspresji RNA w różnych próbkach tkanki.
- Demonstracja skuteczności mikrodyskcji laserowej w badaniach.
- Potencjał dla ulepszonych analiz próbek pacjentów w badaniach klinicznych.
Wnioski
- Mikrodyskcja laserowa jest cennym narzędziem w badaniach nad rakiem prostaty.
- Izolowany RNA może dostarczyć wglądu w mechanizmy choroby.
- Ta metoda zwiększa zdolność do efektywnego badania heterogenicznych tkanek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Laser-capture microdissection (LCM) enables precise isolation of pure prostatic epithelial cell populations from heterogeneous tissue, directly addressing stromal bias in gene expression studies. This capability enhances predictive confidence in target validation and supports robust biomarker discovery for prostate cancer research. Integrating LCM-derived RNA analysis at early discovery and translational stages improves portfolio decision-making by reducing biological ambiguity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-type specific gene expression in benign versus diseased prostate tissue.
- Supports functional target validation by isolating homogeneous epithelial or stromal populations.
- Reduces confounding stromal signals, increasing predictive confidence in molecular findings.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying cell-type contributions to disease phenotypes.
Screening & Assay Development
- Provides validated RNA samples for downstream RT-qPCR and RNAseq workflows.
- Improves assay reproducibility by ensuring sample homogeneity and reducing variability.
- Enables standardization of gene expression assays across clinical and preclinical specimens.
- Supports reliable compound evaluation by linking molecular readouts to defined cell populations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene expression profiles with disease-relevant epithelial compartments for biomarker development.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by maintaining cell-type specificity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust, cell-specific molecular data.
- Supports translational research by providing high-quality RNA for clinical trial specimen analysis.
Pipeline & Workflow Integration
LCM-based RNA isolation fits at the interface of early discovery, target validation, and translational research, enabling seamless progression from hypothesis testing to preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing by isolating pure epithelial or stromal populations for differential gene expression analysis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNA samples for assay development and validation.
- Analytics: Provides high-quality molecular readouts for comparing benign and diseased tissue conditions.
- Translational Research: Maintains disease relevance by aligning molecular outputs with specific tissue compartments.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for cell-type specific RNA analysis across multiple studies and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of RNA-based assays.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, cryostat operation, and RNA preservation techniques.
- Demands access to LCM instrumentation and RNA analysis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for sample preparation and data interpretation.
- Adaptation may be needed for different tissue types or disease models.
- RNA integrity is highly sensitive to handling and environmental conditions.
