Laserowa mikrodysekcja ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego do analizy RNA

Ogólnym celem niniejszego protokołu mikrosekcji laserowej (LCM) jest izolacja całkowitego RNA z czystych populacji typów komórek nabłonkowych prostaty z heterogenicznych zamrożonych tkanek prostaty do późniejszych analiz ekspresji genów. Metoda ta może pomóc w analizie próbek pacjentów i udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem prostaty, takie jak różnice w ekspresji RNA w łagodnych i chorych próbkach tkanki nabłonkowej prostaty lub w próbkach z badań klinicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że mikrosekcja laserowa umożliwia izolację RNA z homogenicznych populacji komórek nabłonkowych lub komórek zrębu z zamrożonej tkanki prostaty.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mają trudności z uzyskaniem wysokiej jakości RNA, ponieważ nie wiedzą, które etapy są kluczowe dla zachowania stabilności RNA. Rozpocznij od zgromadzenia wszystkich odczynników i narzędzi niezbędnych do przeprowadzenia procedury. Po pozostawieniu zamrożonej tkanki prostaty na 30 minut w kriostacie w celu wyrównania temperatury, nanieś medium montażowe na dno kasety i szybko zamocuj tkankę, używając schłodzonej pęsety.

Umieść kasetkę w chłodnicy kriotomu na pięć minut, aby utrwalić medium montażowe. Po utwardzeniu nanieś zamrożone medium montażowe na uchwyt i ostrożnie dociśnij do niego zamontowaną tkankę. Stroną dolną do góry.

Pozostawić preparat do utrwalenia na pięć minut. Przed umieszczeniem uchwytu w holderze, zablokować rączkę w odpowiedniej pozycji i założyć nowe ostrze do kriotomu. Po odblokowaniu rączki, ostrożnie posuwać próbkę, aż do uzyskania pożądanej ekspozycji tkanki.

Po przygotowaniu ustaw kriosztat na pięć mikronów i wykonaj jeden lub dwa przekroje. Umieść te przekroje na naładowanym szkiełku przedmiotowym do barwienia hematoksyliną i eozyną. Natychmiast umieść szkiełko w zimnym, 100% etanolu na dwie minuty.

Po tym czasie należy wyjąć preparat i pozostawić go do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Preparat barwiony H&E zapewnia lepszą wizualizację tekstury jąder komórkowych i powinien zostać wykorzystany przez patomorfologa do zaznaczenia obszarów zainteresowania. Następnie należy nałożyć ramkę do rysowania w temperaturze pokojowej.

Wsuń próbkę do stabilizatora ramowego, ustaw kriosat na 10 µm i wykonaj cięcia. Na każdym szkiełku można umieścić od jednego do czterech skrawków, w zależności od wielkości tkanki. Następnie natychmiast zanurz szkiełko w zimnym 100% etanolu.

Wyjąć preparat po dwóch minutach i przechowywać w zamrażarce do późniejszej analizy. W dniu przeprowadzania laserowej mikrodysekcji przechwytywania (LCM), wyjąć preparaty w ramkach z zamrażarki, pracując w obszarze wolnym od RNA. Nawodnić preparaty, delikatnie zanurzając je w 90% etanolu przez dwie minuty, a następnie w 75% etanolu przez dwie minuty.

Po nawodnieniu należy zbarwić tkankę prostaty, delikatnie zanurzając preparaty w 0,5% toluidyny niebieskiej na czas od 5 do 30 sekund. Następnie należy odbarwić tkankę, płucząc preparaty dwukrotnie w wodzie destylowanej przez 15 sekund, a następnie w 75% etanolu od 30 sekund do 3 minut. Na koniec preparaty w ramkach należy przenieść do wolnego od RNA pojemnika do suszenia w lodzie.

Przed rozpoczęciem procedury należy umieścić preparat do wysuszenia na podgrzewaczu do szkiełek przez 15 minut. Suszyć należy tylko ten preparat, który będzie przetwarzany, a pozostałe przechowywać w lodzie do momentu użycia. Włączyć komponenty LCM w następującej kolejności.

Włącz zasilanie mikroskopu, klucz lasera, przełącznik lasera, a następnie komputer. Następnie uruchom oprogramowanie do mikrodyssekcji laserowej. Poleć mikroskopowi załadowanie preparatów i probówek do zbierania próbek.

Kliknij „unload sample holder” i umieść preparat na uchwycie do szkiełek, kierując tkankę do dołu. Wsuń uchwyt do odpowiedniego slotu w mikroskopie i kliknij „continue”. Następnie kliknij „unload collection tubes”.

Oznakuj probówki, umieść je w uchwycie i wsuń do odpowiedniego otworu. Zakręć szczelnie nakrętki i dodaj 35 µL buforu lizującego, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza.

Po załadowaniu nakrywek do zbierania próbek kliknij OK. Użyj oprogramowania, aby wybrać pozycję preparatu w uchwycie, a następnie wybierz nakrywkę do pobrania próbki. Zwizualizuj preparat i ustaw ostrość za pomocą komputera przy powiększeniu 10x.

Użyj oprogramowania, aby skalibrować laser, wybierając opcję laser. Następnie przeprowadź kalibrację oraz dostosuj moc, aperturę i prędkość lasera, wybierając opcję laser, a następnie control. Kontynuuj wprowadzanie korekt, aż laser całkowicie przetnie tkankę.

Kluczowe jest wyznaczenie obszarów zainteresowania, co zazwyczaj wykonuje certyfikowany patomorfolog, aby precyzyjnie wyciąć pożądane fragmenty tkanki poddawanej LCM, posługując się jako przewodnikiem wizualnym oznaczeniami patomorfologa na preparacie H&E o wymiarach 8x11 cali. Użyj narzędzia do rysowania kształtów w oprogramowaniu, aby obrysować w widoku pożądane obszary nabłonka, unikając pobierania zrębu. Kliknij „cut”, aby uruchomić laser.

Jeśli jakiś obszar nie został całkowicie wycięty, należy użyć narzędzia do przesuwania i cięcia, aby przejść przez niego ręcznie. Należy kontynuować przesuwanie obiektywu do nowych pól widzenia i powtarzać cięcie laserowe do momentu całkowitego wycięcia preparatu lub zebrania pożądanej ilości tkanki. Po zakończeniu należy ostrożnie wyjąć probówki z uchwytu zbiorczego i zakręcić nakrętki, zwracając uwagę na obecność lizatu, buforu i tkanki w nakrętkach.

W skrócie, wiruj przez 30 sekund, aby zebrać ciecz i tkankę na dnie probówki. Inkubuj próbki w temperaturze 42 °C przez 30 minut i przechowuj w temperaturze -80 °C do momentu izolacji RNA. Przedstawione przykłady pokazują reprezentatywne przekroje prostaty barwione błękitem toluidyny na szkiełku z ramką przed i po laserowym wycinaniu specyficznych kontroli dla typu komórek nabłonka łagodnego.

Potwierdź specyficzność obszaru tkanki wyciętego laserowo. Nabłonek łagodny i zręb. Brak ekspresji genu specyficznego dla raka prostaty, A-M-A-C-R.

Zstroma nie wykazywała ekspresji genu specyficznego dla nabłonka oraz KX 3.1. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pracować w środowisku wolnym od RNA w celu zapobiegania jego degradacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat izolacji RNA z homogenicznych populacji komórek nabłonkowych lub zstromy z zamrożonej tkanki na potrzeby licznych technik analizy downstream.

Należy pamiętać, że praca z kriostatem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak odpowiednie przeszkolenie i zachowanie szczególnej uwagi w kontakcie z nożem.