Test bezkomórkowy do badania dekondensacji chromatyny pod koniec mitozy

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wierne odtworzenie chromatyny de kondensacji, tak jak to się dzieje pod koniec mitozy, w prostocie testu bezkomórkowego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad mitozą, ponieważ umożliwia scharakteryzowanie molekularnego mechanizmu chromatyny, dekolonizacji i identyfikacji czynnika zaangażowanego w regulację. Główną zaletą tej techniki jest to, że można nią łatwo manipulować biochemicznie i chromatyną.

Dekolonizację można badać w izolacji, oddzielonej od innych zdarzeń cyklu komórkowego. Aby rozpocząć, należy wyizolować klastry chromatyny mitotycznej z komórek helo i przygotować do przygotowania ekstraktu z jaj IIC xenopus lavis, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym. Po przygotowaniu użyj pięciomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 27, aby wstrzyknąć 500 jednostek międzynarodowych ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej do żab wywołanych owulacją.

Wstrzyknąć żaby pod skórę grzbietowego worka limfatycznego wieczorem przed eksperymentem, aby wywołać uwolnienie jaj Po wywołaniu utrzymuj żaby w temperaturze 18 stopni Celsjusza przez 13 do 17 godzin w indywidualnych zbiornikach zawierających 1,2 litra zmodyfikowanego bufora dzwonka Marka. Po tym, jak żaby złożą jaja, usuń jaja, które są już aktywowane, wraz z wszelkimi źle wyglądającymi jajami. Zbierz je, wylewając zbiorniki do szklanych zlewek o pojemności od 600 do 1000 mililitrów.

Sortowanie jaj ma kluczowe znaczenie, ponieważ ogólna dodatkowa jakość zależy od etapu. Usuń aktywowane, żylaste i w inny sposób źle wyglądające jajka. Również w późniejszych krokach kontynuuj usuwanie złych jaj.

Zdekantować supernatant S, gdy jaja opadną, a następnie ponownie napełnić zlewkę świeżym buforem. Powtórz ten proces cztery razy, aby umyć jajka po ostatnim myciu. Usuń supinat jeszcze raz, a następnie napełnij zlewkę 2% litrowym roztworem cysteiny, aby nakreślić jaja.

Po dwóch do czterech minutach zmień na świeży bufor zawierający L-cysteinę. Za zakończone żelowanie należy uznać za zakończone, gdy objętość jaj drastycznie się zmniejsza, a jaja stają się gęściej upakowane po około pięciu do siedmiu minutach. Następnie ostrożnie umyj jaja w zmodyfikowanym buforze obrączkarza Marka, dekantując i ponownie napełniając bufor supinacyjny na ściance zlewki zamiast bezpośrednio na jaja.

Następnie aktywuj jaja w 100 mililitrach zmodyfikowanego buforu dzwonka Marksa zawierającego osiem mikrolitrów po dwa miligramy na mililitr. Jon wapnia. Po czwarte, zatrzymaj aktywację, gdy skurcz czapki zwierzęcia stanie się widoczny.

Lub po 10 minutach od aktywacji, dokładnie umyć jaja w zmodyfikowanym buforze Ringera Marka, dekantując i uzupełniając supinat buforu po ostatnim myciu. Inkubować jaja w temperaturze pokojowej przez 20 minut w zmodyfikowanym buforze dzwonka Marka. Następnie przygotuj pięć mililitrów probówek wirówkowych z 50 mikrolitrami buforu sacharozy, 50 mikrolitrami 100-krotnego inhibitora proteazy.

Wymieszaj pięć mikrolitrów jednego molowca DTT, 12,5 mikrolitra cyclo heide i 2,5 mikrolitra cyto. B. Umyj jaja dwukrotnie zimnym buforem sacharozy, a następnie przenieś je do probówek wirówkowych. Za pomocą plastikowej pipety pastwiskowej z szerokim otworem zapakuj jaja, obracając probówki przez jedną minutę w temperaturze 130 G. Po odwirowaniu usuń nadmiar buforu za pomocą plastikowej pipety pastwiskowej i wypełnij dodatkowe pomieszczenie większą ilością jaj.

Następnie odwiruj probówki wypełnione jajami w wirniku wahadłowym o wymiarach sześć na pięć mililitrów przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 21 000 razy g. Po rozdzieleniu roztworu na trzy warstwy, wepchnij pięciomililitrową strzykawkę z igłą o rozmiarze 16 przez bok probówki i do środkowej warstwy między żółtym żółtkiem na górze i tuż nad ciemnymi rozbitymi resztkami jaj na dole. Przenieś ekstrakt fazowy o niskiej prędkości do świeżej probówki na lodzie, a następnie dodaj 10 mikrolitrów 100-krotnego inhibitora proteazy.

Wymieszaj jeden mikrolitr jednego molowca DTT 2,5 mikrolitra cyclo heide w stężeniu 20 miligramów na mililitr i 0,5 mikrolitra cyto B. Dodaj 10 miligramów na mililitr do każdego mililitra ekstraktu o niskiej prędkości. Wiruj ekstrakt fazowy o niskiej prędkości przez 12 minut w temperaturze 355 000 razy G w wirniku o wymiarach 10 na dwa mililitry. Następnie delikatnie usuń warstwę lipidową na wierzchu i przenieś supinat zawierający ekstrakt o dużej prędkości do świeżej probówki.

Ten etap ma kluczowe znaczenie dla uzyskania próbki wysokiej jakości. Uważaj, aby usunięty płyn nie zawierał zanieczyszczeń z warstwy lipidowej na wierzchu lub irytującej dolnej warstwie. Odpipetować 18 mikrolitrów ekstraktu o dużej prędkości do 1,5 mililitrowej probówki reakcyjnej, a następnie dodać 0,5 mikrolitra glikogenu 0,5 mikrolitra mieszanki energetycznej.

Punkt trzeci, mikrolitry sześciu puryn dimetylowych i 0,7 mikrolitra klastrów mitotycznych. Użyj końcówek z szerokim otworem, aby wymieszać reakcję zaraz po dodaniu chromatyny, aby zapobiec ścinaniu dekompensującej chromatyny. Po wymieszaniu inkubować mieszaninę reakcyjną do dwóch godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Następnie utrwal próbkę, dodając 0,5 mililitra lodowatego utrwalacza zawierającego 4% paraldehydu, 0,5% aldehydu glutarowego i 0,1 miligrama na mililitr dpi. Za pomocą końcówek z szerokim otworem inkubować próbkę na lodzie przez 20 do 30 minut. Następnie oznacz 12-milimetrowe okrągłe szkiełka nakrywkowe roztworem poli L lizyny o stężeniu wagowym 0,1% do objętości i inkubuj szkiełka nakrywkowe przez pięć minut, aby zwiększyć powinowactwo szkiełek nakrywkowych.

Aby wysuszyć chromatynę, okładkę należy następnie nałożyć na bibułę filtracyjną. Po wyschnięciu dodaj powlekane szkiełka nakrywkowe na dno sześciomililitrowych probówek wirówkowych z płaskim dnem, tak aby powlekana strona była skierowana do góry. Następnie dodaj 800 mikrolitrów 30% poduszki sacharozy i ułóż całą utrwaloną próbkę na wierzchu.

Wirować próbkę przez 15 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza i 2 500 razy G. Następnie usunąć supernatant S i usunąć szkiełka nakrywkowe z probówek, ostrożnie szturchając dno probówki wirówkowej igłą o rozmiarze 16. Gdy szkiełko nakrywkowe zostanie podniesione przez igłę z jednej strony, użyj pęsety, aby usunąć szkiełko nakrywkowe, szybko umyj szkiełko nakrywkowe, zanurzając je w wodzie dejonizowanej, a następnie delikatnie wysusz, dotykając jego boku bibuły filtracyjnej. Następnie umieść kroplę materiału montażowego na szkiełku mikroskopowym i opuść stronę próbki pokrywy.

Wsuń na nośnik montażowy. Delikatnie osusz szkiełko nakrywkowe papierową chusteczką uszczelniającą wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci i trzymaj szkiełko w ciemności, aż zostanie zobrazowane. Oto typowy przebieg czasowy testu dekompensacji.

Skupisko chromosomów widoczne na początku reakcji ulega dekonsumacji, kondensacji i łączeniu się w jedno okrągłe i gładkie jądro. Kiedy ekstrakt z jaj jest zastępowany buforem sacharozy, klaster chromosomów pozostaje skondensowany, co sugeruje, że w ekstrakcie z jaja występuje aktywność dekompensacyjna. W pokazanym tutaj eksperymencie do reakcji dodano niezhydrolizowane analogi A TP lub GTP.

Oba te dodatki hamują de kondensację, co dowodzi, że ten aktywny proces jest zależny zarówno od hydrolizy A TP, jak i GTP. Po opanowaniu tej techniki można wykonać w około dwie godziny w przypadku przygotowania ekstraktu z jaj na poziomie Singapuru i trzy godziny w przypadku testu promowania dekolonizacji. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że sukces zależy w dużej mierze od jakości ekstraktu.

Szczególnie w przypadku niedoborów odporności zaleca się stosowanie świeżo przygotowanego ekstraktu po tej procedurze. Inne metody, takie jak wyczerpanie odporności i dodanie rekombinowanych białek, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak czynniki, które są zaangażowane. Technika ta utoruje drogę naukowcom zajmującym się mitozą lub strukturą i funkcją jądrową do zbadania dehumanizacji chromatyny, tak jak ma to miejsce pod koniec mitozy w komórkach zwierzęcych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować ekstrakty z wątroby ex xenopus i jak zastosować tę metodę do odtworzenia dekolonizacji chromatyny. Nie zapominaj, że praca z Paraform Hyde, Hyde i DARPA może być niebezpieczna i należy podjąć środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek.