Name: Test bezkomórkowy do badania dekondensacji chromatyny pod koniec mitozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Poznaj test bezkomórkowy do badania dekondensacji chromatyny pod koniec mitozy z wykorzystaniem ekstraktu z jaj Xenopus laevis i chromatyny z komórek HeLa. Ta metoda umożliwia izolację procesu od innych zdarzeń cyklu komórkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Niemiecką Fundację Badawczą i ERC (AN377/3-2 i 309528 CHROMDECON do W.A.) oraz stypendium doktoranckie Boehringer Ingelheim Fonds dla A.K.S. Rysunek 1 i 2 są przedrukowane z Developmental Cell 31(3), Magalska et al., ATPazy podobne do RuvB funkcjonują w dekondensacji chromatyny na końcu mitozy, 305-318, 2014, za uprzejmą zgodą Elsevier.

<ol><li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220, 719-721 (1983).</li>
<li>de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+mitotic+chromosomes+in+Xenopus+egg+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg extract.</a> Methods Mol Biol. 119, 219-229 (1999).</li>
<li>Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+spindle+assembly+and+chromosome+condensation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).</li>
<li>Galy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+gp210+in+mitotic+nuclear-envelope+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A role for gp210 in mitotic nuclear-envelope breakdown.</a> J Cell Sci. 121, 317-328 (2008).</li>
<li>Chan, R. C., Forbes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+nuclear+assembly+and+nuclear+import+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).</li>
<li>Gillespie, P. J., Gambus, A., Blow, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+use+of+Xenopus+egg+extracts+to+study+DNA+replication+and+chromatin+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation and use of Xenopus egg extracts to study DNA replication and chromatin associated proteins.</a> Methods. 57, 203-213 (2012).</li>
<li>Gant, T. M., Wilson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear assembly.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 669-695 (1997).</li>
<li>Magalska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvB-like+ATPases+function+in+chromatin+decondensation+at+the+end+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">RuvB-like ATPases function in chromatin decondensation at the end of mitosis.</a> Developmental Cell. 31, 305-318 (2014).</li>
<li>Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+structure+and+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome structure and condensation.</a> Curr Opin Cell Biol. 18, 632-638 (2006).</li>
<li>Lavoie, B. D., Tuffo, K. M., Oh, S., Koshland, D., Holm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+condensation+requires+Brn1p%2C+the+yeast+homologue+of+Barren%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome condensation requires Brn1p, the yeast homologue of Barren.</a> Mol Biol Cell. 11, 1293-1304 (2000).</li>
<li>Philpott, A., Leno, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoplasmin+remodels+sperm+chromatin+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 69, 759-767 (1992).</li>
<li>Philpott, A., Leno, G. H., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+decondensation+in+Xenopus+egg+cytoplasm+is+mediated+by+nucleoplasmin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sperm decondensation in Xenopus egg cytoplasm is mediated by nucleoplasmin.</a> Cell. 65, 569-578 (1991).</li>
<li>Burglin, T. R., Mattaj, I. W., Newmeyer, D. D., Zeller, R., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+nucleoplasmin+from+Xenopus+laevis+oocytes+and+analysis+of+its+developmental+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cloning of nucleoplasmin from Xenopus laevis oocytes and analysis of its developmental expression.</a> Genes Dev. 1, 97-107 (1987).</li>
<li>Whitaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+at+fertilization+and+in+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Calcium at fertilization and in early development.</a> Physiological reviews. 86, 25-88 (2006).</li>
<li>Gasser, S. M., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+the+isolation+of+individual+and+clustered+mitotic+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes.</a> Exp Cell Res. 173, 85-98 (1987).</li>
<li>Eisenhardt, N., Schooley, A., Antonin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+in+vitro+assays+to+analyze+the+function+of+transmembrane+nucleoporins+and+targeting+of+inner+nuclear+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus in vitro assays to analyze the function of transmembrane nucleoporins and targeting of inner nuclear membrane proteins.</a> Methods Cell Biol. 122, 193-218 (2014).</li>
<li>Wignall, S. M., Deehan, R., Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+condensin+complex+is+required+for+proper+spindle+assembly+and+chromosome+segregation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts.</a> J Cell Biol. 161, 1041-1051 (2003).</li>
<li>Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+formation+of+nucleus-like+structures+around+bacteriophage+DNA+microinjected+into+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs.</a> Cell. 34, 13-23 (1983).</li>
<li>Hartl, P., Olson, E., Dang, T., Forbes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+assembly+with+lambda+DNA+in+fractionated+Xenopus+egg+extracts%3A+an+unexpected+role+for+glycogen+in+formation+of+a+higher+order+chromatin+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear assembly with lambda DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate.</a> J Cell Biol. 124, 235-248 (1994).</li>
<li>Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+repression+by+nucleosomes+but+not+H1+in+reconstituted+preblastoderm+Drosophila+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Transcriptional repression by nucleosomes but not H1 in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin.</a> EMBO J. 13, 373-379 (1994).</li>
<li>Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+membrane+protein-DNA+interactions+required+early+in+nuclear+envelope+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly.</a> J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).</li>
<li>Zhang, C., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin-independent+nuclear+envelope+assembly+induced+by+Ran+GTPase+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin-independent nuclear envelope assembly induced by Ran GTPase in Xenopus egg extracts.</a> Science. 288, 1429-1432 (2000).</li>
<li>Paulson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+chromosome+clusters+from+metaphase-arrested+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Isolation of chromosome clusters from metaphase-arrested HeLa cells.</a> Chromosoma. 85, 571-581 (1982).</li>
<li>Ramadan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc48%2Fp97+promotes+reformation+of+the+nucleus+by+extracting+the+kinase+Aurora+B+from+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin.</a> Nature. 450, 1258-1262 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ekstrakty z jaj Xenopus laevis są bardzo przydatnym narzędziem do wiernego odtworzenia procesów komórkowych in vitro, a system ten został z powodzeniem wykorzystany w charakterystyce cyklu komórkowego i zdarzeń podziału komórki 2,3,5,6,17. Ze względu na duże zapasy składników jądrowych sekwestrowanych w jaju podczas oogenezy, ekstrakty z jaj są doskonałym źródłem składników komórkowych. W porównaniu z innymi podejściami, takimi jak RNAi na liniach komórkowych tkanek ssaków lub mani...

Ekstrakt z jaj Xenopus laevis jest potężnym i szeroko stosowanym narzędziem do badania skomplikowanych zdarzeń komórkowych w prostocie testu bezkomórkowego. Od czasu ich pierwszego opisu przez Lohkę i Masui 1 były one szeroko wykorzystywane do badania procesów mitotycznych, takich jak kondensacja chromatyny 2, montaż wrzeciona 3, rozpad otoczki jądrowej 4, ale także transport nukleocytoplazmatyczny 5 lub replikacja DNA6. Zdarzenia zachodzące pod koniec mitozy, niezbędne do reformacji jądra międzyfazowego, takie jak reformacja otoczki jądrowej i ponowne złożenie kompleksu porów jądrowych, są znacznie mniej zrozumiałe w porównaniu z wczesnymi zdarzeniami mitotycznymi, ale mogą być podobnie badane przy użyciu ekstraktu z jaj Xenopus 7. Niedawno opracowaliśmy test oparty na ekstrakcie z jaj Xenopus do badania dekondensacji chromatyny pod koniec mitozy 8, niedostatecznie zbadanego procesu, który czeka na szczegółową charakterystykę.
U metazoanów, chromatyna jest wysoce zagęszczona przy wejściu mitotycznym, aby przeprowadzić wierną segregację materiału genetycznego. Aby zapewnić dostęp chromatyny do ekspresji genów i replikacji DNA podczas interfazy, należy ją zdezagęścić pod koniec mitozy. U kręgowców chromatyna jest do pięćdziesięciu razy bardziej zagęszczona podczas mitozy w porównaniu z interfazą 9, w przeciwieństwie do drożdży, u których zagęszczenie mitotyczne jest zwykle znacznie niższe, np. tylko dwukrotnie u S. cerevisiae 10. Dekondensacja chromatyny kręgowców była najczęściej badana w kontekście reorganizacji DNA plemników po zapłodnieniu komórki jajowej. Mechanizm molekularny, w którym nukleoplazmina, obfite białko oocytów, wymienia specyficzne dla plemników protaminy na histony H2A i H2B przechowywane w komórce jajowej. Proces ten został również wyjaśniony przy użyciu ekstraktu z jaj Xenopus 11,12. Jednak ekspresja nukleoplazminy jest ograniczona do oocytów 13, a chromatyna mitotyczna nie zawiera tych protamin specyficznych dla plemników. Dlatego dekondensacja chromatyny pod koniec mitozy jest niezależna od nukleoplazminy 8.
Do reakcji dekondensacji in vitro używamy ekstraktu generowanego z aktywowanych jaj X.laevis oraz klastrów chromatyny wyizolowanych z synchronizowanych komórek HeLa. Traktowanie jaj jonoforem wapnia naśladuje uwalnianie wapnia do oocytu generowane przez wejście plemników podczas zapłodnienia. Fala wapniowa wyzwala wznowienie cyklu komórkowego, a komórka jajowa, zatrzymana w drugiej metafazie mejozy, przechodzi do pierwszej interfazy 14. Dlatego ekstrakty jajowe przygotowane z aktywowanych jaj reprezentują mitotyczny stan wyjścia / interfazy i są zdolne do wywoływania zdarzeń specyficznych dla wyjścia mitotycznego, takich jak dekondensacja chromatyny, otoczka jądrowa i reformacja kompleksu porów. Do izolacji klastrów chromatyny mitotycznej użyliśmy nieco zmodyfikowanej wersji protokołu opublikowanego przez Gasser & Laemmli 15, w którym klastry chromosomów są uwalniane przez lizę z komórek HeLa zsynchronizowanych w mitozie i izolowanych w zawierających poliaminy przez wirowanie gradientowe.

<table><tbody><tr><td>Tetrachlorowodorek sperminy</td><td>Fluka analityczny</td><td>85610-25G</td><td></td></tr><tr><td>trichlorowodorek spermidyny</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S2501-5G</td><td></td></tr><tr><td>digitonina o wysokiej czystości</td><td>Millipore</td><td>300410-1GM</td><td>toksyczny</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Applichem</td><td>A0999,0100</td><td>toksyczna</td></tr><tr><td>tymidyna</td><td>Calbiochem</td><td>6060</td><td></td></tr><tr><td>nokodazol</td><td>Calbiochem</td><td>487928</td><td>toksyczny</td></tr><tr><td>37% roztwór formaldehydu</td><td>Roth</td><td>7398-1</td><td>toksyczny</td></tr><tr><td>roztwór błękitu trypanowego (0,4% )</td> <td>Sigma</td><td>T8154</td><td>toksyczny</td></tr><tr><td>1,4-ditiotreitol (DTT)</td><td>Roth</td><td>6908.2</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek AEBSF</td><td>Applichem</td><td>A1421,0001</td><td></td></tr><tr><td>pepstatyna</td><td>Roth</td><td>2936.1/2/3</td><td></td></tr><tr><td>leupeptyna</td><td></td><td>Roth CN334</td><td></td></tr><tr><td>aprotynina</td><td>Roth</td><td>A162.3</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (koloidalne cząstki krzemionki roztwór)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&sup2; kolby do hodowli tkankowych</td><td>Greiner Bio-one</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator (40 ml maszynka do mielenia tkanek)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Komora Neubauera</td><td>Assistent</td><td>441/1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Probówki wirówkowe Oak Ridge, poliwęglan (50 ml)</td><td>Nalgene</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m sitko komórkowe, nylon</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>cytochalazyna B</td><td>Applichem</td><td>A7657,0010</td><td>toksyczny</td></tr><tr><td>cykloheksymid</td><td>Roth</td><td>8682.3</td><td>toksyczna</td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Merck</td><td>1 028 381 000</td><td></td></tr><tr><td>hCG dostępny jako Ovogest</td><td>MSD</td><td>1431593</td><td></td></tr><tr><td>PMSG dostępny jako Intergonan</td><td>MSD</td><td>1431015</td><td></td></tr><tr><td>A23187 (mieszanina soli wapniowo-magnezowej)</td><td>Enzo</td><td>ALX-450-002-M010</td><td>toksyczne</td></tr><tr><td>igły do strzykawek (1,20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2")</td><td>Braun</td><td>4665120</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Serva</td><td>10920.03</td><td></td></tr><tr><td>GTP, 2 Na x 3 H20</td><td>Roth</td><td>K056.1/2/3/4</td><td></td></tr><tr><td>sól disodowa fosforanu kreatyny</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>Fosfokinaza kreatynowa</td><td>Sigma</td><td>C3755-35KU</td><td></td></tr><tr><td>DMAP</td><td>Sigma</td><td>D2629-1G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>Toksyczne</td>probówki wirowe<td></td><td>PFA Sigma</td><td>P-6148</td></tr><tr><td>do TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 cala)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343775</td><td></td></tr><tr><td>"Cell-Saver" (końcówki z szerokim otworem, 1,000 &micro; l)</td><td>Biozym</td><td>729065</td><td></td></tr><tr><td>50% roztwór aldehydu glutarowego, stopień I</td><td>Sigma alderich</td><td>G7651-10 ml</td><td>toksyczny</td></tr><tr><td>0,1% (w/v) roztwór poli-L-lizyny</td><td>Sigma</td><td>P8920-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>probówki płaskodenne (6 ml, 16,0/55 mm)</td><td>Greiner Bio-one</td><td>145211</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield podłoże montażowe</td><td>Vector laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>rurki do TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 cala)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>"Cell-Saver" (końcówki z szerokim otworem, 200 &mikro; Szkiełka</td> nakrywkowe <td>Biozym</td><td>729055</td><td></td></tr><tr><td>12 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>0784 #1</td><td></td></tr></tbody></table>

test bezkomórkowy do badania dekondensacji chromatyny pod koniec mitozy

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

Podczas cyklu komórkowego kręgowców chromatyna ulega rozległym zmianom strukturalnym i funkcjonalnym. Po wejściu mitotycznym masowo kondensuje się w chromosomy w kształcie pręcików, które są poruszane indywidualnie przez aparat wrzeciona mitotycznego. Kondensacja chromatyny mitotycznej daje chromosomy zagęszczone pięćdziesięciokrotnie gęstsze niż w interfazie. Podczas wychodzenia z mitozy chromosomy muszą ponownie ustanowić swój funkcjonalny stan interfazy, który jest otoczony otoczką jądrową i jest zdolny do replikacji i transkrypcji. Proces dekondensacji jest morfologicznie dobrze opisany, ale w kategoriach molekularnych słabo poznany: brakuje nam wiedzy na temat leżących u ich podstaw zdarzeń molekularnych i w dużym stopniu zaangażowanych czynników, a także ich regulacji. Opisujemy tutaj system bezkomórkowy, który wiernie odwzorowuje dekondensację chromatyny in vitro, w oparciu o mitotyczne klastry chromatyny oczyszczone ze zsynchronizowanych komórek HeLa i ekstraktu z jaj X. laevis. Nasz bezkomórkowy system stanowi ważne narzędzie do dalszej molekularnej charakterystyki dekondensacji chromatyny i jej koordynacji z procesami zachodzącymi jednocześnie podczas wyjścia mitotycznego, takimi jak otoczka jądrowa i ponowne składanie kompleksu porowego.

Zależność reakcji dekondensacji od czasu
Rysunek 1 przedstawia typowy przebieg czasowy testu dekondensacji. Zagregowane chromosomy widoczne na początku reakcji ulegają dekondensacji i zlewają się w jedno, okrągłe i gładkie jądro komórkowe. W przypadku zastąpienia ekstraktu z jajecznych buforem sacharozowym klaster chromosomów pozostaje skondensowany, co sugeruje, że w ekstrakcie z jajecznym obecna jest aktywność odpowiedzialna za dekondensację.
Deko...

Molekularne mechanizmy dekondensacji wysoce zagęszczonej chromatyny mitotycznej są źle zdefiniowane. Przedstawiamy bezkomórkowy test oparty na mitotycznych klastrach chromatyny wyizolowanych z komórek HeLa i ekstraktu z jaj Xenopus laevis, który wiernie odtwarza proces dekondensacji in vitro.

Test bezkomórkowy do badania dekondensacji chromatyny pod koniec mitozy

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wierna rekonstrukcja dekondensacji chromatyny, jaka zachodzi pod koniec mitozy, w uproszczonym układzie testowym bezkomórkowym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad mitozą, ponieważ umożliwia charakteryzację molekularnego mechanizmu dekondensacji chromatyny oraz identyfikację czynników zaangażowanych w jej regulację. Główną zaletą tej techniki jest możliwość łatwej manipulacji biochemicznej chromatyną.Dekondensację można badać w izolacji, oddzielnie od innych zdarzeń cyklu komórkowego. Aby rozpocząć, należy wyizolować klastry chromatyny mitotycznej z komórek helo i przygotować bufory do sporządzenia ekstraktu z jaj Xenopus laevis IIC, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Po przygotowaniu należy użyć strzykawki o pojemności pięciu mililitrów wyposażonej w igłę 27G, aby wstrzyknąć 500 jednostek międzynarodowych gonadotropiny kosmórki ludzkiej żabom z indukowaną owulacją.Wieczorem przed eksperymentem wykonaj żabom iniekcję pod skórę grzbietowego worka limfatycznego, aby wywołać uwalnianie jaj. Po indukcji utrzymuj żaby w temperaturze 18°C przez 13 do 17 godzin w osobnych zbiornikach zawierających 1,2 litra zmodyfikowanego buforu Ringera według Marka. Po złożeniu jaj przez żaby, usuń te, które są już aktywne, a także wszystkie jaja wyglądające na uszkodzone. Zbierz je, przelewając zawartość zbiorników do szklanych zlewów o pojemności od 600 do 1000 ml w sposób prawidłowy.Sortowanie jaj jest krytyczne, ponieważ ogólna jakość ekstraktu zależy od tego etapu. Należy usunąć jajka aktywowane, ciągnące oraz inne, które wyglądają na uszkodzone. Należy również kontynuować usuwanie uszkodzonych jaj w kolejnych krokach.Po opadnięciu jaj zlej supernatant S, a następnie ponownie napełnij zlewkę świeżym buforem. Powtórz ten proces cztery razy, aby wypłukać jaja po ostatnim płukaniu. Odlej supernatant jeszcze raz, a następnie napełnij zlewkę 2% roztworem cysteiny w celu oddzielenia jaj.Po dwóch do czterech minutach należy wymienić bufor na świeży, zawierający L-cysteinę. Odżelowanie uznaje się za zakończone, gdy objętość jaj drastycznie spadnie, a jaja staną się gęściej upakowane po około pięciu do siedmiu minutach. Następnie jaja należy ostrożnie wypłukać w zmodyfikowanym buforze Ringera według Marka, odlewając i dolewając bufor po ściance zlewki, aby nie strumieniować go bezpośrednio na jaja.Następnie aktywować jaja w 100 mililitrach buforu Ringera zmodyfikowanego przez Marxa zawierającego osiem mikrolitrów roztworu jonów wapnia o stężeniu dwóch miligramów na mililitr. Po czwarte, przerwać aktywację, gdy widoczny stanie się skurcz czepka zwierzęcego.Lub po 10 minutach od aktywacji, ostrożnie przemyj jaja w zmodyfikowanym buforze Ringera Marka poprzez odlewanie i ponowne napełnianie buforem, z wyjątkiem ostatniego przemywania. Inkubuj jaja w temperaturze pokojowej przez 20 minut w zmodyfikowanym buforze Ringera Marka. Następnie przygotuj probówki do wirowania o pojemności pięciu mililitrów z 50 µL buforu sacharozowego i 50 µL 100-krotnego inhibitora proteaz.Wymieszaj 5 µL 1 M DTT, 12,5 µL cykloheksanidu oraz 2,5 µL cyto. B. Przemyj jaja dwukrotnie zimnym buforem sacharozowym, a następnie przenieś je do probówek do wirowania. Używając plastikowej pipety Pasteura z szerokim otworem, zbierz jaja, wirując probówki przez jedną minutę przy 130 ×g. Po wirowaniu usuń nadmiar buforu za pomocą plastikowej pipety Pasteura i wypełnij wolną przestrzeń kolejnymi jajami.Następnie wirowarkę z probówkami wypełnionymi jajkiem w rotorze kątowym 6 × 5 ml przez 20 minut w temperaturze 4 °C przy 21 000 ×g. Po rozdzieleniu roztworu na trzy warstwy, wprowadź strzykawkę 5 ml z igłą 16G przez ściankę probówki do warstwy środkowej, znajdującej się między żółtym żółtkiem na górze a ciemnymi szczątkami jajka na dole. Przenieś ekstrakt fazowy z niskich obrotów do nowej probówki umieszczonej w lodzie, a następnie dodaj 10 µL inhibitora proteaz w stężeniu 100-krotnym.Wymieszać 1 µL 1 M DTT, 2,5 µL cykloheksanidu w stężeniu 20 mg/ml oraz 0,5 µL cyto B. Dodać 10 mg/ml do każdego mililitra ekstraktu otrzymanego przy niskich obrotach. Wirować fazowy ekstrakt niskoprędkościowy przez 12 minut przy 355 000 ×g w rotorze 10 × 2 ml. Następnie ostrożnie usunąć górną warstwę lipidową i przenieść nadsącz zawierający ekstrakt wysokoprędkościowy do nowej probówki.Ten krok jest krytyczny dla uzyskania próbki wysokiej jakości. Należy zadbać o to, aby pobrany płyn nie zawierał zanieczyszczeń z górnej warstwy lipidowej ani z niepożądanej warstwy dennej. Pipetować 18 µL ekstraktu z wirowania wysokoobrotowego do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 mL, a następnie dodać 0,5 µL glikogenu oraz 0,5 µL mieszaniny energetycznej (energy mix).Dodaj 3 µL 6-dimetylopuryny oraz 0,7 µL klastrów mitotycznych. Do wymieszania reakcji bezpośrednio po dodaniu chromatyny należy użyć końcówek o szerokim otworze, aby zapobiec ścinaniu rozluźnionej chromatyny. Po wymieszaniu inkubować mieszaninę reakcyjną do dwóch godzin w temperaturze 20 °C.Następnie należy utrwalić próbkę, dodając 0,5 ml lodowatego utrwalacza zawierającego 4% paraformaldehydu, 0,5% glutaraldehydu i 0,1 mg/ml dpi. Przy użyciu końcówek o szerokim otworze należy inkubować próbkę na lodzie przez 20 do 30 minut. Następnie należy pokryć okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm 0,1% (w/v) roztworem poli-L-lizyny i inkubować szkiełka przez pięć minut w celu zwiększenia ich powinowactwa.Aby osuszyć chromatynę, należy pozostawić szkiełka podstawowe do wyschnięcia na papierze filtracyjnym. Po wyschnięciu umieścić powlekone szkiełka na dnie probówek do wirowania o objętości sześciu mililitrów z płaskim dnem, tak aby strona powlekona była skierowana do góry. Następnie dodać 800 µL poduszki z 30% sacharozy i nanieść na nią całą utrwaloną próbkę.Wiruj próbkę przez 15 minut w temperaturze 4 °C przy 2 500 ×g. Następnie zlej supernatant i wyjmij szkiełko zakrywkowe z probówki, ostrożnie nakłuwając dno probówki wirówkowej igłą o rozmiarze 16 G. Gdy jedna krawędź szkiełka zostanie uniesiona przez igłę, użyj pęsety, aby je wyjąć, szybko opłucz szkiełko, zanurzając je w wodzie dejonizowanej, a następnie delikatnie osusz, dotykając jego krawędzi papierem filtracyjnym. Następnie nanieś kroplę medium montażowego na preparat szkiełkowy i nałóż na nią stronę szkiełka zakrywkowego z próbką.Nałóż medium montażowe. Delikatnie osusz szkiełko nakrywkowe papierowym ręcznikiem, uszczelnij krawędź szkiełka lakierem do paznokci i przechowuj preparat w ciemności do momentu wykonania obrazowania. Poniżej przedstawiono typowy przebieg czasowy testu dekompensacji.Klastry chromosomów widoczne na początku reakcji, decon, kondensują się i zlewają w jedno, okrągłe i gładkie jądro. Po zastąpieniu ekstraktu z jaja buforem sacharozowym klastry chromosomów pozostają skondensowane, co sugeruje, że w ekstrakcie z jaja występuje aktywność dekompensacyjna. W przedstawionym tutaj eksperymencie do reakcji dodano niehydrolizowane analogi ATP lub GTP.Oba te dodatki hamują dekondensację, co dowodzi, że ten aktywny proces jest zależny zarówno od hydrolizy ATP, jak i GTP. Po opanowaniu techniki, przygotowanie ekstraktu z jaj w stężeniach odpowiednich dla Singapuru zajmuje około dwóch godzin, a test promujący dekolonizację – trzy godziny. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że sukces krytycznie zależy od jakości ekstraktu.Szczególnie w przypadku immunodeplecji zaleca się stosowanie świeżo przygotowanego ekstraktu zgodnie z tą procedurą. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące tego, które czynniki są zaangażowane, można zastosować inne metody, takie jak immunodeplecje i dodawanie białek rekombinowanych. Technika ta utoruje drogę badaczom z zakresu mitozy lub struktury i funkcji jądra komórkowego do badania dehumanizacji chromatyny, która zachodzi pod koniec mitozy w komórkach zwierzęcych.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotować ekstrakty z jaj Xenopus oraz jak zastosować tę metodę do rekonstytucji dekolonizacji chromatyny. Pamiętaj, że praca z Paraform Hyde, Hyde i DARPA może być niebezpieczna i należy zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek.

a-cell-free-assay-to-study-chromatin-decondensation-at-end

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza oddziaływań chromatyny za pomocą sekwencjonowania parowanych końców (ChIA-PET) jest metodą detekcji oddziaływań chromatyny de novo, służącą lepszemu zrozumieniu kontroli transkrypcyjnej.

Analiza oddziaływań chromatyny z sekwencjonowaniem parowanych końców (ChIA-PET) w celu mapowania oddziaływań chromatyny i zrozumienia regulacji transkrypcji

Przejście z metafazy do anafazy jest inicjowane poprzez zależną od kompleksu anafazy-promującego (APC/C) ubikwitynację i następującą po niej degradację cykliny B. W niniejszej pracy opracowaliśmy system, który po zastosowaniu znakowania metodą pulse-chase umożliwia monitorowanie proteolizy cykliny B w całych populacjach komórek oraz ułatwia wykrywanie interferencji wywołanej przez punkt kontrolny mitozy.

Badanie proteolizy cykliny B na poziomie pojedynczej komórki w populacjach całych komórek

Niniejszy protokół opisuje metodę wizualizacji białka sygnałowego pęknięć dwuniciowych DNA, aktywowanego w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, a także jego lokalizacji podczas mitozy.

Dwuwymiarowe i trójwymiarowe obrazowanie żywych komórek w celu badania białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA

Ten film opisuje protokół ścinania chromatyny za pomocą trawienia enzymatycznego nukleazy mikrokokowej. Ścinanie chromatyny jest niezbędnym krokiem w immunoprecypitacji chromatyny lub przepływie pracy ChIp, który pomaga badać interakcję białko-DNA w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki szpikowej. W protokole funkcji ścinanie chromatyny odbywa się za pomocą sonikacji.

Ścinanie chromatyny: metoda generowania fragmentów chromatyny za pomocą trawienia enzymatycznego

Opisujemy solidną metodę immunoprecypitacji chromatyny przy użyciu pierwotnych limfocytów T. Metoda opiera się na standardowych podejściach, ale wykorzystuje określony zestaw warunków i odczynników, które poprawiają wydajność dla ograniczonej liczby komórek. Co ważne, przedstawiono szczegółowy opis fazy analizy danych.

Wydajna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu ograniczonych ilości biomasy

Wiadomo, że oogeneza u ssaków jest podatna na błędy, szczególnie z powodu błędnej segregacji chromosomów. W tym manuskrypcie opisano metody przygotowania rozprzestrzeniania się chromatyny dla mysich oocytów z profazą, metafazą I i II stopnia. Te podstawowe techniki pozwalają na badanie białek związanych z chromatyną i morfologii chromosomów w trakcie oogenezy ssaków.

Preparaty do rozprzestrzeniania chromatyny do analizy progresji oocytów myszy od profazy do metafazy II

Plastyczność architektury jądrowej jest kontrolowana przez dynamiczne mechanizmy epigenetyczne, w tym niekodujące RNA, metylację DNA, repozycjonowanie nukleosomów, a także skład i modyfikację histonów. W tym miejscu opisujemy protokół izolacji elementów regulatorowych wspomaganej formaldehydem (FAIRE), który umożliwia określenie dostępności chromatyny w powtarzalny, niedrogi i prosty sposób.

Izolacja elementów regulatorowych wspomagana formaldehydem w celu pomiaru dostępności chromatyny w komórkach ssaków

Obrazowanie żywych komórek dostarcza bogactwa informacji o pojedynczych komórkach lub całych populacjach, które są nieosiągalne przez samo obrazowanie komórek stałych. W tym miejscu opisano protokoły obrazowania żywych komórek w celu oceny decyzji dotyczących losu komórek po leczeniu lekiem antymitotycznym paklitakselem.

Długoterminowe obrazowanie żywych komórek w celu oceny losu komórek w odpowiedzi na paklitaksel

Ten protokół opisuje łatwą i wygodną metodę oznaczania i wizualizacji żywych chromosomów w komórkach mitotycznych za pomocą etykiety Histone2B-GFP BacMam 2.0 i systemu mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.

Obrazowanie żywych komórek segregacji chromosomów podczas mitozy

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest potężnym narzędziem do zrozumienia molekularnych mechanizmów regulacji genów. Metoda ta wiąże się jednak z trudnościami w uzyskaniu powtarzalnej fragmentacji chromatyny przez mechaniczne ścinanie. W tym miejscu przedstawiamy ulepszony protokół testu ChIP z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego.

Test immunoprecypitacji chromatyny z wykorzystaniem nukleaz mikrokokowych w komórkach ssaków

Mikroskopia poklatkowa jest cennym narzędziem do badania mejozy u pączkujących drożdży. Protokół ten opisuje metodę, która łączy synchronizację cyklu komórkowego, mikroskopię poklatkową i warunkowe wyczerpanie białka docelowego, aby zademonstrować, jak badać funkcję określonego białka podczas segregacji chromosomów mejotycznych.

Zastosowanie mikroskopii poklatkowej i specyficznego dla etapu zubożenia komórek białek do badania mejozy u S. cerevisiae

Poznaj test bezkomórkowy do badania dekondensacji chromatyny pod koniec mitozy z wykorzystaniem ekstraktu z jaj Xenopus laevis i chromatyny z komórek HeLa. Ta metoda umożliwia izolację procesu od innych zdarzeń cyklu komórkowego.

Test bezkomórkowy do badania dekondensacji chromatyny pod koniec mitozy

Przeglądaj więcej filmów