Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

Ogólnym celem tego testu inwazji steroidów na komórki rakowe jest umożliwienie monitorowania inwazji komórek rakowych z bolusa komórkowego do otaczającej trójwymiarowej matrycy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii raka, takie jak identyfikacja warunków, które sprzyjają lub hamują inwazję komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że różne niuanse inwazji komórek można ocenić w bardziej fizjologicznie odpowiednich warunkach in vitro.

Na początek wyjmij z inkubatora naczynie hodowlane zawierające przylegające komórki rakowe. Umyj komórki raz PBS i dodaj 1,5 mililitra 0,05% tripsin EDTA. Następnie inkubuj komórki przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po odłączeniu komórek przepuść komórki z trypsami przez pięciomililitrową pipetę, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki, a następnie dodaj 8,5 mililitra pożywki do hodowli komórkowej do kolby. Policz zawiesinę komórek za pomocą licznika komórek. Rozcieńczyć zawiesinę komórek do 500 do 1000 komórek na 20 mikrolitrów.

W pożywce hodowlanej użyj pipety wielokanałowej, aby uformować 20 mikrolitrowych kropelek na wewnętrznej powierzchni 10-centymetrowej pokrywki naczynia We wszystkich pipetach pięć rzędów po osiem kropli, co daje w sumie 40 kropli. Następnie odpipetuj pięć mililitrów sterylnego PBS na dno 10-centymetrowej naczynia. Ostrożnie odwróć pokrywkę i umieść ją na 10-centymetrowym naczyniu.

Następnie inkubuj wiszące kultury kroplowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez okres do 72 godzin, aby utworzyć sterydy. Aby wygenerować matrycę 3D, rozmrozić podwielokrotność czynnika wzrostu, zredukowany roztwór błony podstawnej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnie zbierz sterydy, przechylając pokrywę 10-centymetrowego naczynia, aby zebrać kropelki.

Przenieś pożywkę do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej i pozostaw probówkę na 10 minut, aby OID osiadły na dnie. Następnie wymieszaj 100 mikrolitrów rozmrożonego roztworu błony podstawnej ze 100 mikrolitrami po 2,3 miligrama na mililitr zimna. Roztwór kolagenu typu pierwszego we wstępnie schłodzonej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra.

Inkubować macierz zewnątrzkomórkową lub mieszaninę ECM na lodzie. Odpipetuj 40 mikrolitrów sterydów komórek rakowych z dna 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej i w połączeniu z mieszaniną ECM, teraz pipetuj 40 mikrolitrów kropli tej lepkiej mieszaniny do środka poszczególnych studzienek w 24-dołkowej płytce do hodowli komórek. Trzymając płytkę poziomo, umieść ją w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozostaw w spokoju na 30 minut.

Gdy kultury 3D ulegną polimeryzacji, powoli odpipetuj jeden mililitr pożywki do hodowli ciepłokomórkowych do każdej studzienki, aby zanurzyć kulturę. Następnie zwróć kultury 3D do inkubatora za pomocą odwróconego obrazu mikroskopowego, atakując komórki rakowe. Korzystanie z obiektywu 20 x w określonych punktach czasowych.

Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pomiędzy punktami czasowymi obrazowania w celu analizy danych należy określić ilościowo zdolność inwazyjną komórek za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak Image J, w celu określenia odległości komórki od krawędzi sferoidy. Użyj narzędzia do rysowania prostego, aby zaznaczyć promień.

Następnie kliknij Analizuj w górnym menu, a następnie Zmierz, aby wyświetlić pomiar długości. Aby określić inwazyjny obszar sferoidy, użyj narzędzia do rysowania odręcznego, aby prześledzić granicę sferoidy, a następnie obszar komórek inwazyjnych. Ponownie kliknij Analizuj w górnym menu, a następnie Zmierz, aby wyświetlić pomiar powierzchni.

Podczas testowania panelu linii komórek rakowych zaobserwowano, że większość z nich tworzy sterydy przy użyciu metody hodowli w wiszącej kropli. Kilka linii komórkowych, jednak, nie były w stanie tworzyć sterydów podczas korzystania z tej metody hodowli. Dodatkowo stwierdzono zmienność w grupie linii komórek nowotworowych tworzących sfery pod względem ich zdolności do inwazji na otaczający ECM.

Dane te zostały potwierdzone wizualnie, a inwazja komórkowa stała się wyraźna w ciągu 24 godzin dla kilku badanych linii komórkowych Po opanowaniu tej techniki można wykonać za pomocą zaledwie kilku godzin pracy, która ma miejsce w ciągu pięciu dni. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkiej pracy i unikaniu uwięzienia pęcherzyków powietrza w mieszaninie, która będzie składać się z kultury 3D. Technika ta może być modyfikowana w celu zbadania wpływu leków, kokultury komórkowej lub różnych składników ECM na inwazję komórek rakowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oceniać i ilościowo określać inwazję komórek rakowych w warunkach 3D.