Name: Sekwencyjna ekstrakcja rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej alfa-synukleiny z mózgów parkinsonowskich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T14:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej alfa-synukleiny z mózgów parkinsonowskich. Technika ultrawirówki i western blot pozwala badać agregację białka w tkance ludzkiej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękuję doktorowi Adamantios Mamais za ekstrakcję α-synukleiny z ludzkiej tkanki i prowadzenie plam. Prace te były częściowo wspierane przez grant MRC (MR/L010933/1), a częściowo przez nagrodę Wellcome Trust/MRC Joint Call in Neurodegeneration (WT089698) dla Brytyjskiego Konsorcjum ds. Choroby Parkinsona (UKPDC), którego członkowie pochodzą z Instytutu Neurologii UCL, Uniwersytetu w Sheffield i Jednostki Fosforylacji Białek MRC na Uniwersytecie w Dundee. RB otrzymał fundusze od fundacji MJFox na tę pracę i jest również finansowany przez Reta Lila Weston Trust.

Pośmiertna tkanka mózgowa została przekazana do Queen Square Brain Bank for neurological disorders, University College London, Institute of Neurology przy użyciu etycznie zatwierdzonych protokołów i przechowywana do celów badawczych na podstawie licencji wydanej przez Human Tissue Authority (HTA) UK (nr 12198). Patrz wykaz przypadków stosowanych w tym protokole (Tabela 1).
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotuj 1X TBS (buforowany solą fizjologiczną) bufor:
	<ol>
		<li>Przygotuj 10X TBS jako roztwór podstawowy z 500 mM Tris-HCl pH 7,4 i 1,500 mM NaCl.
		<ol>
			<li>Odważyć 60,5 g Tris-Cl o pH 7,6 i 87,6 g NaCl w 800 ml wody o wysokiej czystości. Dostosować pH za pomocą 1 M HCl i zwiększyć ostateczną objętość zapasu do 1 l.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj końcowe stężenie 1X TBS, rozcieńczając bulion 10 razy w wodzie destylowanej.</li>
		<li>Dodać inhibitory proteazy (PI) (1 tabletka na 50 ml buforu) i tabletki inhibitora fosfatazy Phos-stop (1 tabletka na 10 ml buforu) w celu zniesienia skutków nieswoistego działania enzymatycznego proteaz i fosfataz. 
		Uwaga: Tutaj użyliśmy tabletek z inhibitorami enzymów firmy Roche, ale równie dobrze inne dostępne na rynku inhibitory można stosować zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować bufor TBS-SDS, dodając 5% w/v dodecylosiarczanu sodu (SDS) do 1X TBS (pH 7,4) buforu. Podgrzać roztwór do temperatury 60 °C, ciągle mieszając, za pomocą mieszadła magnetycznego w celu rozpuszczenia SDS.</li>
	<li>Przygotować bufor TBS-SDS-Mocznik, dodając mocznik do końcowego stężenia 8 M w/v do 1x buforu TBS-SDS (pH 7,4). Podgrzać roztwór do temperatury 60 °C, ciągle mieszając na mieszadle magnetycznym w celu rozpuszczenia mocznika.</li>
</ol>
2. Homogenizacja próbki i ultrawirowanie różnicowe
Uwaga: Poniższa część pracy obejmuje postępowanie z ludzką tkanką mózgową zgodnie z zasadami HTA UK. Przez cały czas przestrzegane są lokalne standardowe procedury operacyjne. Próbki mózgu są wycinane z zamrożonych bloków mózgowych i materiału tkankowego homogenizowanego w mikrokomorze utrzymywanej pod podciśnieniem. Przez cały czas trwania zabiegu noszone są jednorazowe fartuchy, rękawiczki, maski na twarz, ochraniacze na obuwie i okulary ochronne. Odpady tkanek ludzkich są usuwane po sterylizacji w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut w celu bezpiecznego usunięcia. Ostre narzędzia (ostrza skalpela) są umieszczane w odpowiednim pojemniku na ostre przedmioty w celu ich przechowywania i bezpiecznej utylizacji.
<ol>
	<li>Weź kawałek zamrożonej tkanki ludzkiej (około 0,5 g wagi z okolicy zwojów podstawy) i szybko zmiel na małe fragmenty (około 1 mm2) na lodzie za pomocą małej szalki Petriego i sterylnego ostrza skalpela. Do każdej próbki należy użyć oddzielnej szalki Petriego i ostrza skalpela. Zebrać zmieloną tkankę do probówki o pojemności 15 ml i dodać do niej 10 objętości lodowatego buforu 1XTBS.</li>
	<li>Homogenizować próbki za pomocą homogenizatora mechanicznego z prędkością 20 000 obr./min przez 10 sekund. Schłodzić na lodzie przez 2 minuty. Powtórzyć ten krok trzy razy. 
	Uwaga: Odbywa się to w taki sposób, aby próbki nie były podgrzewane podczas homogenizacji.</li>
	<li>Klarować przez odwirowanie w stężeniu 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić osad z materiału niehomogenizowanego.</li>
	<li>Weź supernatant (surowy homogenat), dodaj do probówek wirówek z poliwęglanu (rozmiar probówki zależy od wielkości wirnika) i ostrożnie zbalansuj. Wirować przy 100 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zachować supernatant, ponieważ jest to frakcja rozpuszczalna w TBS.</li>
	<li>Przemyć osad dwukrotnie w pięciu objętościach buforu 1X TBS i odwirować za każdym razem w stężeniu 100 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatanty.
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić końcowy granul poprzez sonikację pastylki przez 10 sekund przy 20 KHz w około 5 woluminach 1X TBS-SDS przy RT. 
		Uwaga: Przed dodaniem karty charakterystyki zawierającej bufor próbki należy doprowadzić do temperatury 10 °C, aby uniknąć wytrącania się SDS.</li>
		<li>Ultrawirować przy 100 000 x g przez 30 minut w temperaturze 25 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zachować supernatant, ponieważ jest to frakcja rozpuszczalna SDS.
	<ol>
		<li>Przemyć osad dwukrotnie w 5 objętościach buforu 1X TBS-SDS w temperaturze pokojowej. Odwirować za każdym razem przy 100 000 x g przez 15 minut w temperaturze 25 °C.</li>
		<li>Rozpuścić końcową osadkę w 50 μl buforu 1X TBS-SDS-UREA za pomocą sonikatora ustawionego na 20 KHz przez 10 sekund, aby uzyskać pełną rozpuszczalność; nazywa się to frakcją rozpuszczalną w moczniku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznacz każdą frakcję pod kątem całkowitej zawartości białka przy użyciu komercyjnego zestawu do oznaczania białek zgodnie z protokołem producenta. Rozcieńczyć próbki TBS-SDS-Mocznik w stosunku 1:1 buforem 1X TBS, aby zapewnić kompatybilność z odczynnikami do oznaczania białek. Zamrażać próbki w małych porcjach (20 μl) w temperaturze -80 °C w celu skrócenia cykli zamrażania i rozmrażania. 
	Uwaga: Dodanie 10% glicerolu do próbek jest zalecane w przypadku długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Immunoblotting próbek i analiza wyników
<ol>
	<li>Próbki z ekstraktów TBS, TBS-SDS i TBS-SDS-Urea należy umieścić na 10-dołkowym żelu poliakrylamidowym Bis-Tris o stężeniu 4-12% z MOPS jako buforem bieżącym przy użyciu standardowych technik. Zobacz Gallagher i Chakravarti (2008)29, aby uzyskać szczegółowy protokół western blot.</li>
	<li>Załadować 10 μg białka z każdej próbki na każdy tor wraz ze znacznikiem masy cząsteczkowej dla TBS i SDS oraz frakcji mocznika.</li>
	<li>Uruchom żel pod napięciem 200 V przez 1 godzinę lub do momentu, gdy niebieski barwnik z bufora ładującego dotrze do dna żelu.</li>
	<li>Przenieść białka z żeli elektroforetycznie na membrany nylonowe28, wstępnie zwilżone najpierw w 100% metanolu, a następnie do buforu transferowego zawierającego 20% metanolu. Umieść znak identyfikacyjny na plamie, aby określić stronę białka i orientację markerów wielkości masy cząsteczkowej.
	<ol>
		<li>Ułóż żel warstwowo z membraną wzdłuż mokrej bibuły filtracyjnej. Prawidłowe ułożenie membrany ma kluczowe znaczenie w przypadku membrany między żelem a anodą. Wykonaj transfer przez 2 godziny przy 40 V.</li>
		<li>Uzupełnić 1X bufor PBS-tween (1X PBS-T): Rozpuść 1 tabletkę PBS w 200 ml wody, aby otrzymać 0,01 M bufor fosforanowy, 0,0027 M chlorek potasu i 0,137 M chlorek sodu, pH 7,4.</li>
		<li>Zablokować membranę w 5% roztworze BSA w 1X PBS-T na 30 minut z wytrząsaniem przy 70 obr./min. Zapobiega to nieswoistemu wiązaniu przeciwciała pierwszorzędowego z błoną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbadać białko blot 6 ml pierwszorzędowego przeciwciała α-syn Syn-1 (BD Biosciences; mysie przeciwciało monoklonalne) w rozcieńczeniu 1:750 (O/N w 4 °C), a następnie wykonać serię płukań 1X PBS-T (3 x 5 min za każdym razem)28.</li>
	<li>Inkubować blot z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP w rozcieńczeniu 1:2 000 przez 30 minut. Wykonać serię płukań (3 x 5 min za każdym razem) z 1X PBS-T.
	<ol>
		<li>Zanurz bloty w roztworze o wzmocnionej chemiluminescencji na 15 sekund w ciemnym pomieszczeniu. Przykryj kleksy folią spożywczą i umieść filmy autoradiograficzne na plamie stroną z białkiem do góry w kasecie odpornej na światło, aby uchwycić odpowiednie sygnały (pasma o odpowiedniej wielkości).</li>
		<li>Wywoływanie filmów autoradiograficznych w automatycznym wywoływaniu. 
		Uwaga: Bloty można również tworzyć ręcznie za pomocą programisty i fixera ze źródła komercyjnego w przypadku, gdy zautomatyzowana maszyna deweloperska nie jest dostępna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować western blot z 6 ml buforu do usuwania western blot przez 10 minut, stale wstrząsając, w celu pozbawienia blot sygnału przeciwciała α-syn. Wykonaj kroki od 3.43 do 3.6.2 przy użyciu pierwszorzędowego przeciwciała beta-aktyny (mysiego monoklonalnego) w rozcieńczeniu 1: 8 000.</li>
	<li>Zeskanuj i przekonwertuj ostateczny obraz na obraz Tiff i zmierz gęstości za pomocą NIH ImageJ do celów ilościowych (bezpłatne oprogramowanie do pobrania). 
	Uwaga: Oprogramowanie umożliwia odczyt gęstości względnego obszaru zainteresowania (odpowiednie pasma wielkości), a dane mogą być wyrażone albo jako stosunek gęstości α-syn / β-aktyny (gen utrzymania porządku) jako dowolne jednostki, lub samodzielnie, gdy gen utrzymania porządku nie jest prawidłowy (jak w przypadku próbek rozpuszczalnych w moczniku).</li>
</ol>

<ol><li>Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+disease+a+decade+od+discoveries+paves+the+way+for+therapeutic+breakthroughs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative disease a decade od discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs.</a> Nat Med. 10, 1055-1063 (2004).</li>
<li>Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A-synuclein+in+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A-synuclein in Lewy bodies.</a> Nature. 388, 839-840 (1997).</li>
<li>Spillantini, M. G., Crowther, R. A., Jakes, R., Hasegawa, M., Goedert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+in+filamentous+inclusions+of+Lewy+bodies+from+Parkinson%27s+disease+and+dementia+with+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies.</a> Proc Natl Acad Sci. 95, 6469-6473 (1998).</li>
<li>Baba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+alpha-synuclein+in+Lewy+bodies+of+sporadic+Parkinson%27s+disease+and+dementia+with+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies.</a> Am J Pathol. 152, 879-884 (1998).</li>
<li>Ahmed, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropathology%2C+pathophysiology+and+genetics+of+multiple+system+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroptahol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The neuropathology, pathophysiology and genetics of multiple system atrophy.</a> Neuroptahol Appl Neurobiol. 38 (1), 4-24 (2012).</li>
<li>Ploymeropoulos, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+in+the+alpha-synuclein+gene+identified+in+families+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease.</a> Science. 276, 2045-2047 (1997).</li>
<li>Kruger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ala30Pro+mutation+in+the+gene+encoding+alpha-synuclein+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in Parkinson's disease.</a> Nat Genet. 18, 106-108 (1998).</li>
<li>Zarranz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+mutation%2C+E46K%2C+of+alpha-synuclein+causes+Parkinson+and+Lewy+Body+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The new mutation, E46K, of alpha-synuclein causes Parkinson and Lewy Body dementia.</a> Ann. Neurol. 55, 164-173 (2004).</li>
<li>Proukakis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+alpha-synuclein+missense+mutation+in+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">A novel alpha-synuclein missense mutation in Parkinson disease.</a> Neurology. 80 (11), 1062-1064 (2013).</li>
<li>Kiely, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synucleinopathy+associated+with+G51D+SNCA+mutation%3A+a+link+between+Parkinson%27s+disease+and+Multiple+System+atrophy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Synucleinopathy associated with G51D SNCA mutation: a link between Parkinson's disease and Multiple System atrophy?</a> Acta Neuropathol. 125 (5), 753-769 (2013).</li>
<li>Lesage, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G51D+alpha-synuclein+mutation+causes+a+novel+Parkinson-pyramidal+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">G51D alpha-synuclein mutation causes a novel Parkinson-pyramidal syndrome.</a> Ann Neurol. 73 (4), 459-471 (2013).</li>
<li>Singleton, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+locus+triplication+causes+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein locus triplication causes Parkinson's disease.</a> Science. 302, 841(2003).</li>
<li>Chartier-Harlin, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+locus+duplication+as+a+cause+of+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease.</a> Lancet. 364, 1167-1169 (2004).</li>
<li>Cookson, M. R., Hardy, J., Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+neuropathology+of+PD%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Clin+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Genetic neuropathology of PD.</a> Int J Clin Exp Pathol. 1 (3), 217-231 (2008).</li>
<li>Fauvet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-synuclein+in+central+nervous+system+and+from+erythrocytes%2C+mammalian+cells%2C+and.+Escherichia+coli+exists+predominantly+as+disordered+monomer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">α-synuclein in central nervous system and from erythrocytes, mammalian cells, and. Escherichia coli exists predominantly as disordered monomer.</a> J Biol Chem. 287, 15345-15364 (2012).</li>
<li>Bartels, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-synuclein+occurs+physiologically+as+a+helically+folded+tetramer+that+resists+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">α-synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation.</a> Nature. 477, 107-110 (2011).</li>
<li>Campbell, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+insoluble+alpha-synuclein+in+dementia+with+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+of+Dis%22%5BJournal%5D)">Accumulation of insoluble alpha-synuclein in dementia with Lewy bodies.</a> Neurobiol of Dis. 7 (3), 192-200 (2000).</li>
<li>Campbell, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+solubility+of+alpha-synuclein+in+multiple+system+atrophy+differs+from+that+of+dementia+with+Lewy+bodies+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The solubility of alpha-synuclein in multiple system atrophy differs from that of dementia with Lewy bodies and Parkinson's disease.</a> J Neurochem. 76, 87-96 (2001).</li>
<li>Miller, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+in+blood+and+brain+from+familial+Parkinson%27s+disease+with+SNCA+locus+triplication%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein in blood and brain from familial Parkinson's disease with SNCA locus triplication.</a> Neurology. 62, 1835-1838 (2004).</li>
<li>Anderson, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Ser-129+is+the+dominant+pathological+modification+of+alpha-synuclein+in+familial+and+sporadic+Lewy+body+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease.</a> J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+solubility+and+phosphorylation+of+alpha-synuclein+over+the+course+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Changes in the solubility and phosphorylation of alpha-synuclein over the course of Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathol. 121, 695-704 (2013).</li>
<li>Mamais, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+solubility+and+aggregation+properties+in+G2019S+LRRK2+Parkinson%27s+disease+brains+with+Lewy+Body+pathology+compared+to+idiopathic+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+of+Dis%22%5BJournal%5D)">Divergent solubility and aggregation properties in G2019S LRRK2 Parkinson's disease brains with Lewy Body pathology compared to idiopathic cases.</a> Neurobiol of Dis. 58, 183-190 (2013).</li>
<li>Lashley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+clinical%2C+pathological%2C+biochemical+and+genetic+study+of+fused+in+sarcoma+proteinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A comparative clinical, pathological, biochemical and genetic study of fused in sarcoma proteinopathies.</a> Brain. 134 (pt9), 2548-2564 (2011).</li>
<li>Brelstaff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transportin-1%3A+a+marker+of+FTLD-FUS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Transportin-1: a marker of FTLD-FUS.</a> Acta Neuropathol. 122 (5), 591-600 (2011).</li>
<li>Kahle, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperphosphorylation+and+insolubility+of+alpha-synuclein+in+transgenic+mouse+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Hyperphosphorylation and insolubility of alpha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes.</a> EMBO reports. 3 (6), 583-588 (2002).</li>
<li>Nuber, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+progressive+dopaminergic+phenotype+associated+with+neurotoxic+conversion+of+%CE%B1-synuclein+in+BAC-transgenic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A progressive dopaminergic phenotype associated with neurotoxic conversion of α-synuclein in BAC-transgenic rats.</a> Brain. 136, 412-432 (2013).</li>
<li>Tofaris, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+changes+in+dopaminergic+nerve+cells+odf+the+substantia+nigra+and+olfactory+bulb+in+mice+transgenic+for+truncated+human+a-synuclein+%281-120%29%3A+implications+for+Lewy+Body+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathological changes in dopaminergic nerve cells odf the substantia nigra and olfactory bulb in mice transgenic for truncated human a-synuclein (1-120): implications for Lewy Body disorders.</a> J Neurosci. 26 (15), 3942-3950 (2006).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FET+proteins+TAF15+and+EWS+are+selective+markers+that+distinguish+FTLD+with+FUS+pathology+from+amyotrophic+lateral+sclerosis+with+FUS+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations.</a> Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).</li>
<li>Gallagher, S., Chakravarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis+%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis .</a> J Vis. Exp. (16), e759(2008).</li>
<li>Tong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+alpha-synuclein+accumulation+in+multiple+system+atrophy%2C+Parkinson%27s+disease+and+progressive+supranuclear+palsy%3A+a+comparative+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Brain alpha-synuclein accumulation in multiple system atrophy, Parkinson's disease and progressive supranuclear palsy: a comparative investigation.</a> Brain. 133, 172-188 (2010).</li>
<li>Paleologou, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+elevated+levels+of+soluble+%CE%B1-synuclein+oligomers+in+post-mortem+brain+extracts+from+patients+with+dementia+with+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Detection of elevated levels of soluble α-synuclein oligomers in post-mortem brain extracts from patients with dementia with Lewy bodies.</a> Brain. 132, 1093-1101 (2009).</li>
<li>Culvenor, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-A%CE%B2+component+of+Alzheimer+s+disease+Amyloid+%28NAC%29+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Non-Aβ component of Alzheimer s disease Amyloid (NAC) revisited.</a> American Journal of Pathology. 155 (4), 1173-1181 (1999).</li>
<li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+of+brain+pathology+related+to+sporadic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol Aging. 24, 197-211 (2003).</li>
<li>McKeith, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+dementia+with+Lewy+bodies%3A+third+report+of+the+DLB+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies: third report of the DLB consortium.</a> Neurology. 65, 1863-1872 (2005).</li>
<li>Lee, B. R., Kamitani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+immunodetection+of+endogenous+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Improved immunodetection of endogenous α-synuclein.</a> PLoS ONE. 6, e23939(2011).</li>
<li>Newman, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+quantitative+immunoblotting+of+endogenous+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new method for quantitative immunoblotting of endogenous α-synuclein.</a> PLoS ONE. 8 (11), e81314(2013).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

W artykule opisano biochemiczny protokół ekstrakcji i badania zróżnicowanych właściwości rozpuszczalności monomerycznych, oligomerycznych i zagregowanych α-syn z chorych mózgów przy użyciu denaturujących warunków pracy żelu. Jest to dobrze znana technika badania zagregowanych α-syn17, 18, 20, 21 białka, które jest normalnie rozpuszczalne w swojej natywnej postaci, ale uzyskuje amyloidogenne lub zwiększone właściwości agregacyjne wraz z postępem choroby lub mutacjami genetycznymi. Niemniej jednak niektóre grupy stosowały niewielkie różnice w stężeniach SDS w swoich (8% lub 10% zamiast 5%)21,22,30. SDS jest anionowym detergentem i rozpuszcza oligomery α-syn, które mogą zawierać formy α-syn związane z błoną, podczas gdy mocznik, odczynnik chaotropowy, denaturuje nierozpuszczalne zagregowane i fibrylarne lub amyloidogenne formy α-syn20. W związku z tym w systematycznym badaniu przeprowadzonym przez Paleologou iwsp.31 zbadano stabilność oligomerów i włókienek α-syn przy różnych stężeniach mocznika (6,5 - 8 M) lub SDS (0,25-2%) i stwierdzono, że oligomery są stabilne w stężeniach SDS, ale nie przy wysokich stężeniach mocznika. Ich przeciwciało FILA-1, specyficzne dla oligomerów i włókienek α-syn, wykryło wyższe stężenia włókienek przy stężeniach mocznika 6,5 M w warunkach niedenaturujących. Stężenia buforowe stosowane w tym protokole ściśle odzwierciedlają to, co zostało opisane w Culvenor i wsp. (1999)Lokal mieszkalny 32.
Anatomiczne obszary mózgu do biochemicznej ekstrakcji nierozpuszczalnego α-syn powinny być starannie dobrane, co powinno odzwierciedlać obciążenie α-syn LB i LN w zależności od postępu choroby33,34. Użyte tutaj przypadki to próbki zwojów podstawy z podtypów kory nowej i limbicznej PD, odzwierciedlające późne i pośrednie etapy progresji PD według McKeith ctriteria34. W Queen Square Brain Bank jedna połowa mózgu jest rutynowo utrwalana w formalinie do analizy histochemicznej, a druga połowa jest starannie preparowana na różne obszary anatomiczne i błyskawicznie zamrażana i przechowywana w zamrażarkach o temperaturze -80 oC do dalszych badań biochemicznych i analizy DNA/RNA. Po utrwaleniu mózgów formaliną i rozbiorzeniu przez neuropatologów, przeprowadza się immunohistochemię przy użyciu przeciwciała α-syn, a wyniki archiwizuje. Również rutynowo mierzy się pH tkanki mózgowej po przybyciu jako miarę stanu agonalnego tkanki mózgowej. Stanowi to solidną podstawę dla jakości konserwacji tkanek do analizy biochemicznej.
Nasze dane pokazują, że w przypadkach PD jest więcej rozpuszczalnego monomeru α-syn SDS w porównaniu z grupą kontrolną; w szczególności przypadki PD w korze nowej mają wyższe obciążenie α-syn w porównaniu z odmianą limbiczną PD. Przypadki kory nowej reprezentują większy postęp patologii PD α-syn w obszarach kory nowej, takich jak kora czołowa i ciemieniowa33,34. Przypadki limbicznej choroby Parkinsona mają wyższe wyniki LB w obszarach podstawy przodomózgowia / limbicznych, takich jak ciało migdałowate, obszary przezśródwęchowe i obręcz. Aby uzyskać miarodajne dane i analizę statystyczną, należy przeprowadzić co najmniej 4 przypadki z każdej kohorty. Podobnie, nie podjęliśmy próby analizy statystycznej przedstawionych tutaj danych dotyczących plam.
Należy również zauważyć, że różne przeciwciała mogą rozpoznawać różne formy/skład oligomerów α-syn wyższego rzędu, a każdy z nich może mieć swoją własną względną czułość i preferencje. Wynika to wyraźnie z wyników Tong i wsp. 29 , w których wykazują, że 4 różne przeciwciała α-syn (Syn-1, SS, Onco i LB509) dają zmienne wyniki przynajmniej dla oligomerów/agregatów α-syn. Monomery α-syn zostały rozpoznane w podobnym stopniu przez wszystkie 4 przeciwciała, chociaż mogą one różnić się w zależności od tego, czy epitop przeciwciała α-syn znajduje się w N-końcu, czy C-końcu29. Podobnie, swoiste przeciwciała przeciwko fosfo-alfa synukleiny determinują odrębne gatunki α synukleiny o wysokiej masie cząsteczkowej 20,21 o dużej masie cząsteczkowej20,21. W opisanym tutaj protokole zastosowano wysoce scharakteryzowane przeciwciało Syn-119-21.
Jednak ważne jest, aby rozważyć walidację każdego nowego przeciwciała na western blot poprzez eksperymenty przed wchłanianiem przeciwciał, a także nadekspresję i knockdown białka w komórkach.
Ważne jest, aby wziąć pod uwagę inne warianty, które zostały zastosowane przez badaczy do określenia mniejszych fragmentów form α-syn i/lub niestabilnych tetramerycznych form α-syn. Może to obejmować łagodne wiązanie błon za pomocą 0,4% PFA w PBS w celu zachowania skróconych form α-syn35 lub traktowanie homogenatów próbki sieciami w celu stabilizacji tetramerów36.
Dokładna ocena biochemiczna białek za pomocą tkanek pośmiertnych wymaga zminimalizowania enzymatycznej degradacji i modyfikacji białek. Dlatego zaleca się stosowanie tkanek z najkrótszymi opóźnieniami pośmiertnymi i/lub wybieranie dopasowanych próbek w obrębie kohort przypadków. Przed rozpoczęciem protokołu izolacji należy przeprowadzić immunohistochemię z użyciem standardowych przeciwciał do immunohistochemii α-syn. Zakres patologii α-syn jest bardzo zmienny i może się różnić w zależności od wybranych regionów. Wskazane jest, aby wybierać regiony z obfitą patologią jako kontrolę pozytywną w celu uzyskania optymalnej wydajności przy każdym biegu. Kluczowe znaczenie ma stosowanie inhibitorów proteazy i, w razie potrzeby, inhibitorów fosfatazy w celu zapobieżenia niepożądanej degradacji enzymatycznej po uwolnieniu wewnątrzkomórkowych proteaz lub fosfataz występujących podczas lizy komórek i utrzymywania próbek w temperaturze 4 °C.
Ważne jest, aby wszystkie próbki w partii doświadczeń były traktowane równomiernie i konsekwentnie, aby uniknąć zmian między użytkownikami; Należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ może to potencjalnie cofnąć modyfikacje potranslacyjne, takie jak fosforylacja. Krytycznym punktem, o którym należy pamiętać podczas badania dużej liczby próbek, jest to, że dane z immunoblotów powinny być znormalizowane do jednej próbki, która powinna przebiegać równolegle do wszystkich innych próbek na żelach i wszystkich danych odnoszących się do tej próbki. Ma to na celu zapewnienie normalizacji danych immunoblot między kilkoma plamami. Jest to metoda przyjęta w naszym niedawnym badaniu22.
Należy zauważyć, że w celu utrzymania niskiego poziomu ECL w tle, nie należy dopuścić do wyschnięcia blot w żadnym momencie podczas protokołu western blot. Ponadto należy unikać bardzo długich ekspozycji (>10 min) na kliszach autoradiograficznych, ponieważ doprowadzi to do nasycenia sygnału ECL i doprowadzi do niedokładnej oceny ilościowej.
Powyższy protokół jest stosunkowo prostą techniką wykorzystującą powszechnie stosowane odczynniki i instrumenty laboratoryjne i może być cennym narzędziem do badania patofizjologii białka α-syn w badaniach nad chorobą Parkinsona. Metodologia ta może być nie tylko rozszerzona o odpowiednie modyfikacje do badania biologii α-syn u zwierząt transgenicznych α-syn, ale także do innych chorób neurodegeneracyjnych charakteryzujących się nieprawidłowymi złogami zagregowanych białek, takich jak AD, MSA, DLB, HD i demencje czołowo-skroniowe. Jednak opisane tutaj dane dotyczące western blot można również zweryfikować za pomocą testów immunoenzymatycznych z użyciem przeciwciał przeciwko specyficznym formom α-syn31.

Jedną z kluczowych cech patologicznych wspólnych dla wielu chorób neurodegeneracyjnych jest tworzenie nieprawidłowych agregatów białkowych, które występują w sposób specyficzny dla białka/choroby1. Tak więc w chorobie Alzheimera (AD) występują charakterystyczne pozaneuronalne blaszki beta-amyloidowe i zagregowane hiperfosforylowane złogi tau w neuronach; zagregowane złogi α-syn w ciałach Lewy'ego (LB), które są inkluzjami wewnątrzneuronalnymi, a także w dystroficznymi procesach neuronalnych zwanych neurytami Lewy'ego (LN) w PD, otępieniu PD i otępieniu z ciałami Lewy'ego (DLB)2-4. Nieprawidłowe złogi α-syn obserwuje się również w charakterystycznych zmianach glejowych wtrąceń cytoplazmatycznych w MSA5. W chorobie Huntingtona występują charakterystyczne złogi Poly-Q, a nieprawidłowe białko wiążące DNA smoło-43 i połączone białka mięsaka (FUS) odkładają się w otępieniach czołowo-skroniowych. Co ważne dla choroby Parkinsona, stwierdzono, że mutacje genu α-syn powodują autosomalną dominującą chorobę PD6-11. Dodatkowo, tryplikacja genu α-syn12 i duplikacja13 również powoduje rodzinną chorobę Parkinsona, łącząc w ten sposób zwiększoną ekspresję α-syn z patomechanizmami PD. Warto zauważyć, że zarówno sporadyczne, jak i rodzinne przypadki PD zawierają nieprawidłowe depozyty patologii α-syn14. Obecnie dostępne metody leczenia choroby Parkinsona są wyłącznie paliatywne i nie mają wpływu na zatrzymanie lub opóźnienie nieubłaganego postępu choroby.
α-syn występuje obficie w ludzkim mózgu i stanowi około 1% całego białka mózgowego. Jest obecny bardziej szczegółowo w neuronach, ale może istnieć, choć w mniejszych ilościach w komórkach glejowych. Kwestią sporną jest natywna struktura α-syn, która może istnieć jako losowy monomer15 lub jako złożony tetramer16. Podczas choroby α-syn zmienia swoją konformację, co pozwala na jego nieprawidłowe fałdowanie, a proces ten uważa się za przyczynę patogenezy choroby. Pomimo kilku lat badań nad patofizjologicznymi aspektami α-syn i choroby, dokładne przyczyny mechanizmów chorobowych pozostają nieuchwytne14.
Badania wykorzystujące analizę pośmiertną mózgów Parkinsona dostarczyły do tej pory ważnych wskazówek dotyczących normalnej i nieprawidłowej biologii α-syn zarówno w sporadycznych PD, jak i PD związanych z mutacjami w genie LRRK217-22. W tym miejscu opisano protokół ekstrakcji biochemicznej (patrz schemat przedstawiony na rysunku 1) dla coraz bardziej nierozpuszczalnych złogów α-syn z ludzkiej pośmiertnej tkanki mózgowej PD, które w różnym stopniu zawierają agregaty α-syn. Technika ta może być również zaadaptowana z modyfikacjami w składzie do badania białek zbiorczych z innych chorób neurodegeneracyjnych23,24, a także z transgenicznej tkanki mózgowej zwierząt25-27. Głównym czynnikiem branym pod uwagę przy adaptacjach są różnice w rozpuszczalności i całkowitych ilościach odpowiednich białek, z których niektóre są głównie jądrowe i mogą wymagać o wysokiej zawartości soli w celu optymalnej ekstrakcji, jak pokazano dla FUS28.

<table><tbody><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>VWR</td><td>27800.291</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fluka</td><td>71727</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy tabletki&nbsp;</td><td>Roche</td><td>04 693 116001</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki z inhibitorem fosfatazy&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td>04 906 837001</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki soli fizjologicznej buforowane fosforanami&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Bufor biegowy NuPAGE MOPS SDS</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Bufor transferowy NuPAGE</td><td>Membrana Invitrogen</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Hybond-P&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303F</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman 3MM</td><td>Sigma</td><td>WHA30306185</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris żele 4-12%&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td></td>NP0322BOX</tr><tr><td>Podłoże chemiluminescencyjne Supersignal West Pico</td><td>Pierce</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Bio-RAD DC&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td></td></tr><tr><td>Grubościenne rurki poliwęglanowe</td><td>Beckman Beckman</td><td>355630</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do usuwania Western blot</td><td>Thermo scientific</td><td>46430</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe Syn-1 (mysie przeciwciało monoklonalne)</td><td>BD Biosciences</td><td>610786</td><td></td></tr><tr><td>Pierwotne przeciwciało beta-aktyny (monoklonalne mysie&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>HRP sprzężone kozie przeciwciało wtórne przeciwko myszom</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2031</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Instrument</td><td>Company</td><td>Rotor / model nr&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka stołowa Optima Max</td><td>Beckman</td><td>MLA-80</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Heat Systems</td><td>XL20-20</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator</td><td>Jenke i Kunkel</td><td>TP18/10</td><td></td></tr></tbody></table>

sekwencyjna ekstrakcja rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej alfa-synukleiny z mózgów parkinsonowskich

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Białko alfa-synukleiny (α-syn) występuje obficie głównie w neuronach i występuje w wielu różnych formach - monomerów, tetramerów, oligomerów i włókienek. Podczas choroby α-syn ulega zmianom konformacyjnym, tworząc oligomery i agregaty o dużej masie cząsteczkowej, które mają tendencję do uczynienia białka bardziej nierozpuszczalnym. Nieprawidłowo zagregowane α-syn jest neuropatologiczną cechą choroby Parkinsona (PD), otępienia z ciałami Lewy'ego (DLB) i zaniku wieloukładowego (MSA). Charakterystyka biochemiczna i analiza nierozpuszczalnych α-syn przy użyciu o rosnącej mocy detergentu i szybkiego ultrawirowania stanowi potężne narzędzie do określenia rozwoju patologii α-syn związanej z postępem choroby. Protokół ten opisuje izolację coraz bardziej nierozpuszczalnych/zagregowanych α-syn z pośmiertnej ludzkiej tkanki mózgowej. Metodologia ta może być dostosowana z modyfikacjami do badań normalnej i nieprawidłowej biologii α-syn w transgenicznych modelach zwierzęcych zawierających różne mutacje α-syn, a także w innych chorobach neurodegeneracyjnych, które charakteryzują się nieprawidłowymi złogami fibrylarnymi białek związanych z ich odpowiednimi patologiami.

Białka rozpuszczalne w TBS, SDS i moczniku, wyekstrahowane z jąder podstawy zgodnie z protokołem przedstawionym na Rysunku 1, rozdzielono w żelach i poddano analizie immunoblotting z użyciem mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko α-syn (przeciwciało pierwotne Syn-1). Frakcje rozpuszczalne w TBS wykazały obecność monomerów α-syn (cząsteczki o masie ~14 KDa) w badanych przypadkach PD oraz w grupie kontrolnej (Rysunek 2A). Frakcje rozpuszczalne w SDS również wykazały obfitą obecność monomerów α-syn we wszystkich trzech badanych podtypach przypadków, co przedstawiono na blotcie z niską ekspozycją (Rysunek 2C). W przypadkach PD na blotcie z wysoką ekspozycją widoczne były również formy α-syn o wyższej masie cząsteczkowej (MW), które prawdopodobnie są oligomerami (Rysunek 2C). Frakcje rozpuszczalne w moczniku w przypadkach PD wykazały podwyższone ilości monomerów, oligomerów i form zagregowanych α-syn w porównaniu z przypadkami kontrolnymi. Przypadki idiopatycznego PD z zajęciem nowokory wykazały wyższe ilości zagregowanych form α-syn, podczas gdy przypadki limbiczne wykazały pośrednie poziomy nierozpuszczalnej α-syn. Zarówno we frakcjach SDS, jak i mocznika w przypadkach idiopatycznego PD stwierdzono zmienne poziomy uciętych produktów α-syn o masach 12 kDa i 6 kDa, jak opisano w literaturze 20. W przeciwieństwie do nich, w przypadkach kontrolnych nie stwierdzono obecności nierozpuszczalnej lub zagregowanej α-syn (Rysunek 2E). Półilościowe pomiary gęstości odzwierciedlają ilość ciał Lewy’ego (LB) sklasyfikowaną za pomocą immunohistochemii α-syn, co potwierdza nierozpuszczalny charakter zagregowanej α-syn (Rysunek 2B, 2D, 2F) w nowokorowych i limbicznych przypadkach PD.
<img alt="Schemat ekstrakcji białek; etapy wirowania; frakcje TBS/SDS; przygotowanie do immunoblotingu." src="/files/ftp_upload/53415/53415fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat procedury ekstrakcji nierozpuszczalnej α-synucleiny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53415/53415fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Analiza Western blot; rozdział białek przy użyciu TBS, SDS i mocznika; wykresy słupkowe gęstości białek." src="/files/ftp_upload/53415/53415fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywne immunobloty poziomu α-syn w tkankach ludzkich od osób z PD i grupy kontrolnej. Frakcje rozpuszczalne w TBS, SDS i moczniku z jąder podstawy (obszaru, w którym występuje patologia α-syn w przypadkach PD) od osób z idiopatyczną PD oraz z mózgów neurologicznie zdrowych (kontrola) zostały poddane analizie w celu wykrycia obecności α-syn przy użyciu western immunoblotu. Na każdą ścieżkę naniesiono 10 μg białka. W frakcjach TBS (A) we wszystkich przypadkach występują głównie monomery α-syn. W frakcjach SDS (C) w tkankach PD obserwuje się niektóre oligomery α-syn wraz z monomerami. W frakcjach mocznika (C) monomery, oligomery i agregaty α-syn są wyrażone w różnym stopniu w przypadkach PD, co odzwierciedla ich odpowiednie obciążenie ciałkami Lewy'ego (LB). Próbki kontrolne od osób neurologicznie zdrowych wykazują obecność jedynie niewielkich ilości monomerów α-syn. Należy zauważyć, że w niektórych przypadkach z wysokim obciążeniem LB widoczne są możliwe produkty degradacji α-syn. Pełna strzałka reprezentuje formę monomeryczną α-syn. Symbol * prawdopodobnie reprezentuje formę α-syn z uciętym końcem C-terminalnym, jak opisano wcześniej20,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53415/53415fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Przypadek </td>
			<td >Płeć</td>
			<td >wiek w chwili śmierci (lata)</td>
			<td >czas po śmierci (godz.)</td>
			<td >pH tkanki </td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neocortical 1</td>
			<td >M</td>
			<td >82</td>
			<td >40</td>
			<td >6.3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neocortical 2</td>
			<td >F</td>
			<td >75</td>
			<td >35.3</td>
			<td >6.4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Limbic 1</td>
			<td >M</td>
			<td >81</td>
			<td >28.5</td>
			<td >6.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Limbic 2</td>
			<td >F</td>
			<td >79</td>
			<td >36.5</td>
			<td >6.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Control 1</td>
			<td >M</td>
			<td >80</td>
			<td >38</td>
			<td >6.1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Control 2</td>
			<td >F</td>
			<td >83</td>
			<td >32.5</td>
			<td >6.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Ograniczone dane demograficzne analizowanych przypadków

Tutaj prezentujemy protokół izolacji coraz bardziej nierozpuszczalnej/zagregowanej alfa-synukleiny (α-syn) z pośmiertnej ludzkiej tkanki mózgowej. Dzięki zastosowaniu o zwiększonej mocy detergentu i technikom ultrawirowania z dużą prędkością, można badać zmienne właściwości agregacji α-syn w tkankach chorych i niechorych.

Sekwencyjna ekstrakcja rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej alfa-synukleiny z mózgów parkinsonowskich

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

Ogólnym celem niniejszej metodologii jest ekstrakcja rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej alfa-synukleiny z mózgów osób z chorobą Parkinsona pobranych po śmierci. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad chorobą Parkinsona. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona stosunkowo prostą procedurą, wykorzystującą powszechnie dostępne odczynniki i instrumenty laboratoryjne.Po przygotowaniu niezbędnych roztworów i buforów, należy umieścić 0,5 g próbki zamrożonej tkanki jąder podstawy na małej szalce Petriego. Za pomocą sterylnego ostrza skalpela szybko posiekać tkankę na fragmenty o wielkości 1 mm². Posiekaną tkankę przenieść do probówki o pojemności 15 ml i dodać do niej 10 objętości lodowatego, 1X TBS.Próbki należy zhomogenizować za pomocą homogenizatora mechanicznego przy 20 000 rpm przez 10 sekund. Następnie schłodzić na lodzie przez dwie minuty. Proces homogenizacji należy powtórzyć trzykrotnie, za każdym razem chłodząc próbki na lodzie.Odwiruj homogenat z prędkością 10 000 gs przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś nadsącz surowego homogenatu do poliwęglanowych probówek do wirowania i wiruj z prędkością 100 000 gs przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś nadsącz do schłodzonych probówek w lodzie i zachowaj go jako frakcję rozpuszczalną w TBS.Przemyć pięciokrotnością objętości buforu 1X TBS i odwiruj z prędkością 100 000 gs przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessać i usunąć nadsącz. Następnie powtórzyć przemywanie.Dokładne przemywanie osadów pomiędzy etapami ultrawirowania jest kluczowe dla powodzenia tej procedury. Po doprowadzeniu próbek do temperatury 10 °C w celu uniknięcia wytrącania się SDS, należy dodać pięciokrotność objętości 1X TBS-SDS i ponownie zawiesić końcowy osad, sonikując go przez 10 sekund przy częstotliwości 20 kHz w temperaturze pokojowej. Następnie należy przeprowadzić ultrawirowanie przy 100 000 g przez 30 minut w temperaturze 25 °C.Po ultrawirowaniu przenieś nadsącz do schłodzonych probówek w lodzie i zachowaj go jako frakcję rozpuszczalną w SDS. Do osadu dodaj pięciokrotność jego objętości buforu 1X TBS-SDS o temperaturze pokojowej i wiruj z prędkością 100 000 gs przez 15 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Odlej bufor płuczący i powtórz proces płukania.Po odlaniu nadsączu dodać 50 µL 1X TBS-SDS-Urea i solubilizować za pomocą sonikatora ustawionego na 20 kHz przez 10 sekund. Próbkę tę należy oznaczyć jako frakcję rozpuszczalną w moczniku. Niezbędne jest dokładne upewnienie się, że w tej procedurze wyekstrahowano wszystkie białka nierozpuszczalne.Próbki TBS-SDS-Urea rozcieńczyć w stosunku jeden do jednego buforem 1X TBS, aby zapewnić kompatybilność z odczynnikami do oznaczania białka, a następnie oznaczyć całkowistą zawartość białka w każdej frakcji przy użyciu komercyjnego zestawu do oznaczania białka zgodnie z protokołem producenta. Próbki rozdzielić na aliquoty po 20 µL z dodatkiem 10% glicerolu, aby ograniczyć liczbę przyszłych cykli zamrażania i rozmrażania, i przechowywać w temperaturze -80 °C. Na 10-dołkowy żel poliakrylamidowy Bis-Tris o stężeniu od 4 do 12% z MOPS jako buforem do elektroforezy nanieść 10 µL ekstraktów TBS, TBS-SDS oraz TBS-SDS-Urea oraz marker masy cząsteczkowej, stosując standardowe techniki.Prowadź elektroforezę żelu przy napięciu 200 V przez jedną godzinę lub do momentu, gdy niebieski barwnik z buforu do nakładania próbek dotrze do dolnej krawędzi żelu. Namocz membranę nylonową w 100% metanolu, a następnie zanurz ją w buforze do transferu zawierającym 20% metanolu. Nanieś na blot znak identyfikacyjny, aby określić stronę z białkiem oraz orientację markerów masy cząsteczkowej.Umieść żel i membranę pomiędzy mokrymi papierami filtracyjnymi. Przeprowadź transfer przez dwie godziny przy napięciu 40 V. Zablokuj membranę w 5% roztworze BSA w 1X PBS-T przez 30 minut, wytrząsając z prędkością 70 rpm, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciała pierwszorzędowego z membraną.Przeprowadź detekcję białek na błonie poprzez inkubację z sześcioma mililitrami przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko alfa-synukleinie Syn-1, rozcieńczonego w stosunku 1:750 w PBS-T, przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia przemyj błonę 1X PBS-T trzykrotnie po pięć minut za każdym razem. Następnie inkubuj błonę z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP, rozcieńczonym w stosunku 1:2 000 w PBS-T, przez 30 minut.Przemyj membranę jak poprzednio w 1X PBS-T. Zanurz bloty w roztworze do wzmocnionej chemiluminescencji zgodnie z instrukcją producenta w ciemni. Przykryj bloty folią spożywczą i zarejestruj sygnał za pomocą autoradiografii.Po obrazowaniu inkubuj western blot w sześciu mililitrach buforu do usuwania przeciwciał (stripping buffer) przez 10 minut przy stałym wstrząsaniu, aby usunąć sygnał przeciwciała przeciwko alfa-synukleinie z blotu. Powtórz procedurę western blot, aby przeprowadzić detekcję na membranie z użyciem przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko beta-aktynie w rozcieńczeniu 1:8 000. Zeskanuj i przekonwertuj końcowy obraz do formatu Tiff, a następnie zmierz gęstość optyczną za pomocą programu NIH ImageJ w celu przeprowadzenia analizy ilościowej.Poniższe obrazy przedstawiają reprezentatywne immunobloty poziomu alfa-synukleiny w tkance jąder podstawy u ludzi z chorobą PD oraz w grupie kontrolnej. Frakcje rozpuszczalne w TBS, SDS i moczniku przeanalizowano pod kątem obecności alfa-synukleiny za pomocą western immunoblotu. Na każdą ścieżkę naniesiono 10 milligrams białka.W frakcji TBS we wszystkich przypadkach obecne są monomery alfa-synukleiny. Gwiazdka prawdopodobnie oznacza formę alfa-synukleiny z uciętym końcem C. W frakcji SDS, obok monomerów, widoczne są niektóre oligomery alfa-synukleiny, zaznaczone pełną grotą strzałki w tkance PD.W frakcji mocznika monomery, oligomery oraz zagregowana alfa-synukleina wykazują zróżnicowaną ekspresję w przypadkach PD, co odzwierciedla odpowiednie obciążenie ciałkami Lewy. Próbki kontrolne od osób neurologicznie zdrowych wykazują obecność jedynie niewielkich ilości monomerycznej alfa-synukleiny. Po opanowaniu ta technika ekstrakcji białek może zostać przeprowadzona w ciągu jednego dnia roboczego, a następnego dnia można wykonać western immunoblot, pod warunkiem właściwego przeprowadzenia procedury.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii ciał Lewy'ego do analizy nierozpuszczalnych i zagregowanych form alfa-synukleiny w patologicznych tkankach ludzkich oraz w modelach zwierzęcych in vivo. Należy pamiętać, że praca z niefiksowaną tkanką ludzką wymaga zachowania środków ostrożności, a podczas wszystkich procedur manipulacyjnych należy nosić rękawiczki i fartuchy laboratoryjne.

sequential-extraction-soluble-insoluble-alpha-synuclein-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje test immunofluorescencyjny do wykrywania specyficznych dla choroby neurodegeneracyjnej agregatów alfa-synukleiny na odcinkach biopsji skóry. Swobodne barwienie immunologiczne stosuje się do fluorescencyjnego znakowania hydrolazy karboksylowej i agregatów alfa-synukleiny w neuronach skórnych. Pod mikroskopem konfokalnym komórki z fluorescencją obu przeciwciał wskazują na obecność agregatów alfa-synukleiny w neuronach skóry.

Test immunofluorescencyjny do wykrywania agregatów alfa-synukleiny w sekcji biopsji skóry

Ten film pokazuje proces ilościowego określania akumulacji alfa-synukleiny w embrionalnych mysich neuronach dopaminowych wstępnie potraktowanych wstępnie uformowanymi włókienkami alfa-synukleiny. Przedstawia etapy utrwalania, barwienia i ilościowego oznaczania neuronów dopaminowych zawierających agregaty alfa-synukleiny za pomocą immunofluorescencji.

Badanie akumulacji alfa-synukleiny w pierwotnych embrionalnych mysich neuronach dopaminowych

Źródło: Bétemps, D.,  i wsp.,  Wykrywanie α-synukleiny związanej z chorobą za pomocą wzmocnionego testu ELISA w mózgu myszy transgenicznych z nadekspresją ludzkiej zmutowanej α-synukleiny A53T. J. Vis. Exp. (2015). Ten film przedstawia procedurę wykrywania białka związanego z chorobą neurodegeneracyjną α-synukleiny w tkance mózgowej myszy transgenicznych za pomocą testu ELISA. Etapy obejmują homogenizację tkanek, wirowanie i wykrywanie ELISA białka α-synukleiny w celu ilościowego określenia...

Wykrywanie białka α-synukleiny związanego z chorobą neurodegeneracyjną za pomocą testu ELISA

Korzystając z mikroskopii sił atomowych w połączeniu z technologią biopanoramowania, stworzyliśmy negatywny i pozytywny system biopanowania, aby uzyskać przeciwciała przeciwko specyficznym dla choroby wariantom białek obecnym w dowolnym materiale biologicznym, nawet w niskich stężeniach.  Udało nam się uzyskać przeciwciała przeciwko wariantom białka TDP-43 zaangażowanym w stwardnienie zanikowe boczne.

Nowatorski biopanning oparty na mikroskopii sił atomowych do izolacji odczynników specyficznych dla morfologii przeciwko wariantom TDP-43 w stwardnieniu zanikowym bocznym

Opisano zostało ELISA oferujące nowatorskie podejście ilościowe. Specyficznie wykrywa związane z chorobą α-synukleina (αSD) w transgennym modelu myszym (M83) synucleinopatii za pomocą kilku przeciwciał skierowanych albo przeciw fosforylowanej w Ser129 formie αS, albo przeciwko C-końcowej części białka.

Wykrywanie białka α-synucleiny związanego z chorobą za pomocą ulepszonego testu ELISA w mózgu transgenicznych myszy nadmiernie ekspresujących ludzkie α-synucleinę z mutacją A53T

Celem tego protokołu jest dostarczenie systemu opartego na komórkach, który replikuje tworzenie agregatów alfa-synukleiny in vivo. Wewnątrzkomórkowe inkluzje alfa-synukleiny są wysiewane w pierwotnych neuronach przez internalizację i propagację egzogennych, podawanych natywnych agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami wyizolowanych z chorych myszy transgenicznych alfa-synukleiny.

Egzogenne podawanie agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami do neuronów pierwotnych jako potężny model komórkowy tworzenia włókienek

Tutaj prezentujemy protokół swobodnego pośredniego testu immunofluorescencyjnego na odcinkach biopsji skóry, który pozwala na identyfikację specyficznych dla choroby wariantów konformacji alfa synukleiny związanej z chorobą Parkinsona i wielu białek obwodowego układu nerwowego.

Celowanie w agregaty alfa synukleiny w obwodowych włóknach nerwowych skóry za pomocą swobodnego testu immunofluorescencji

Celem tego artykułu jest nakreślenie kroków wymaganych do wytworzenia włókienek z monomerycznej alfa-synukleiny, późniejszej kontroli jakości i użycia wstępnie uformowanych włókienek in vivo.

Wytwarzanie włókienek preformowanych alfa-synukleiną z monomerów i stosowanie in vivo

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania akumulacji neuronalnej α-synukleiny w pierwotnych mysich neuronach dopaminowych. Fosforylowane agregaty α-synukleiny w neuronach są indukowane za pomocą wstępnie uformowanych włókienek α-synukleinowych. Zautomatyzowane obrazowanie komórek znakowanych immunofluorescencyjnie i bezstronna analiza obrazu sprawiają, że ten solidny protokół nadaje się do średnio- i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, które hamują akumulację α-synukleiny.

Badanie indukowanej wcześniej fibrylami akumulacji α-synukleiny w pierwotnych embrionalnych neuronach dopaminowych śródmózgowia myszy

Ta praca analizuje dawkę wektora i czas ekspozycji wymagane do wywołania zapalenia nerwów, neurodegeneracji i upośledzenia motorycznego w tym przedklinicznym modelu choroby Parkinsona. Te wektory kodujące ludzką α-synukleinę są dostarczane do istoty czarnej w celu podsumowania patologii synukleiny związanej z chorobą Parkinsona.

Analiza mysiego modelu choroby Parkinsona indukowanego przez wektory wirusowe związane z adenowirusem kodujące ludzką α-synukleinę

Obecny protokół opisuje metodę donosowego podawania agregatów α-synukleiny. Metoda ta dostarcza informacji na temat propagacji α-synukleiny z błony śluzowej węchu do opuszki węchowej w chorobie Parkinsona.

Technika donosowego podawania agregatów α-synukleiny

Poznaj metodę ekstrakcji rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej alfa-synukleiny z mózgów parkinsonowskich. Technika ultrawirówki i western blot pozwala badać agregację białka w tkance ludzkiej.

Sekwencyjna ekstrakcja rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej alfa-synukleiny z mózgów parkinsonowskich

Przeglądaj więcej filmów