Sekwencyjna ekstrakcja rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej alfa-synukleiny z mózgów parkinsonowskich

Ogólnym celem tej metodologii jest ekstrakcja rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej alfa-synukleiny z pośmiertnych mózgów z chorobą Parkinsona. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach nad chorobą Parkinsona. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to stosunkowo prosta technika wykorzystująca popularne odczynniki i instrumenty laboratoryjne.

Po przygotowaniu niezbędnych roztworów i należy rozpocząć od umieszczenia 0,5 grama próbki zamrożonej tkanki zwojów podstawy na małej szalce Petriego. Użyj sterylnego ostrza skalpela, aby szybko zmielić na kawałki o powierzchni jednego milimetra kwadratowego. Zbierz zmieloną tkankę do 15-mililitrowej probówki i dodaj do niej 10 objętości lodowatego tłuszczu o pojemności 1 TBS.

Homogenizować próbki za pomocą homogenizatora mechanicznego z prędkością 20 000 obr./min przez 10 sekund. Następnie schłodzić na lodzie przez dwie minuty. Powtórzyć homogenizację trzy razy, za każdym razem schładzając na lodzie.

Odwirować homogenat w temperaturze 10 000 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść surowy supernatant homogenatu do probówek wirówek z poliwęglanu i odwirować w temperaturze 100 000 g przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do schłodzonych probówek na lodzie i zachować go jako frakcję rozpuszczalną TBS.

Przemyć w pięciu tomach buforu 1X TBS i odwirować w 100 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessać i wyrzucić supernatant. Następnie powtórz pranie.

Dokładne mycie granulek pomiędzy etapami ultrawirowania ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tej procedury. Po pozostawieniu próbek do osiągnięcia temperatury 10 stopni Celsjusza, aby uniknąć wytrącania się SDS, dodaj pięć objętości 1X TBS-SDS i ponownie zawiesić końcowe osady przez sonikację przez 10 sekund przy 20 kilohercach w temperaturze pokojowej. Ultrawirować w temperaturze 100 000 g przez 30 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Po ultraodwirowaniu przenieść supernatant do schłodzonych probówek na lodzie i zachować jako frakcję rozpuszczalną SDS. Dodaj pięć objętości buforu 1X TBS-SDS o temperaturze pokojowej do osadu i odwiruj przy 100 000 g przez 15 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Wyrzuć bufor do mycia i powtórz pranie.

Po odrzuceniu supernatantu dodać 50 mikrolitrów 1X TBS-SDS-Mocznik i rozpuścić za pomocą sonikatora ustawionego na 20 kiloherców przez 10 sekund. Oznaczyć tę próbkę jako frakcję rozpuszczalną w moczniku. Konieczne jest dokładne upewnienie się, że wszystkie nierozpuszczalne białka zostały wyekstrahowane podczas zabiegu.

Rozcieńczyć próbki TBS-SDS-Mocznik jeden do jednego buforem 1X TBS, aby umożliwić kompatybilność z odczynnikami do oznaczania białek i oznaczyć każdą frakcję pod kątem całkowitej zawartości białka przy użyciu komercyjnego zestawu do oznaczania białek zgodnie z protokołem producenta. Podwielokrotność próbek na 20 mikrolitrów z 10% glicerolem w celu skrócenia przyszłych cykli zamrażania i rozmrażania i przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Załaduj 10 mikrolitrów ekstraktów TBS, TBS-SDS i TBS-SDS-Urea do markera masy cząsteczkowej na 10 dołkach, od czterech do 12 procent żelu poliakryloamidowego Bis-Tris z MOPS jako buforem do biegania przy użyciu standardowych technik.

Uruchom żel pod napięciem 200 woltów przez godzinę lub do momentu, gdy niebieski barwnik z bufora ładującego dotrze do dna żelu. Zwilż nylonową membranę w 100% metanolu, a następnie zanurz w buforze transferowym zawierającym 20% metanolu. Wykonaj znak identyfikacyjny na plamie, aby określić stronę białka i orientację markerów wielkości masy cząsteczkowej.

Ułóż żel warstwowo z membraną wzdłuż mokrej bibuły filtracyjnej. Wykonuj transfer przez dwie godziny przy napięciu 40 woltów. Zablokuj 5% roztwór BSA w 1X PBS-T na 30 minut z wytrząsaniem przy 70 obr./min, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciała pierwszorzędowego z błoną.

Zbadaj białko blot, inkubując z sześcioma mililitrami pierwszorzędowego przeciwciała alfa-synukleiny Syn-1 rozcieńczonego w stosunku 1 do 750 w PBS-T przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia umyj membranę 1X PBS-T trzy razy przez pięć minut za każdym razem. Następnie inkubować blot z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP, rozcieńczonym od 1 do 2 000 w PBS-T przez 30 minut.

Umyj membranę jak poprzednio za pomocą 1X PBS-T. Zanurz bloty w roztworze o wzmocnionej chemiluminescencji zgodnie z instrukcjami producenta w ciemnym pomieszczeniu. Przykryj plamy folią spożywczą i uchwyć sygnał za pomocą autoradiografii.

Po zobrazowaniu inkubować western blot z sześcioma mililitrami buforu do usuwania western blot przez 10 minut z ciągłym wstrząsaniem, aby usunąć blot z sygnału przeciwciała alfa-synukleiny. Powtórz procedurę western blot, aby zbadać błonę pierwszorzędowym przeciwciałem beta-aktyny w rozcieńczeniu od jednego do 8 000. Zeskanuj i przekształć ostateczny obraz w obraz Tiff i zmierz gęstości za pomocą NIH ImageJ do celów ilościowych.

Poniższe obrazy są reprezentatywnymi immunoplamami poziomów alfa-synukleiny z PD i kontrolują ludzką tkankę zwojów podstawy. TBS, SDS i frakcje rozpuszczalne w moczniku analizowano pod kątem obecności alfa-synukleiny przy użyciu zachodniego immunoblotu. Do każdego toru załadowano 10 miligramów białka.

We frakcji TBS monomery alfa-synukleiny są obecne we wszystkich przypadkach. Gwiazdka prawdopodobnie reprezentuje C-końcowo skróconą formę alfa-synukleiny. We frakcji SDS niektóre oligomery alfa-synukleiny są widoczne wraz z monomerami, na co wskazuje stały grot strzałki w tkance PD.

We frakcji mocznikowej monomery, oligomery i zagregowana alfa-synukleina ulegają zmiennej ekspresji w przypadkach PD, odzwierciedlając ich odpowiedni ładunek ciał Lewy'ego. Neurologicznie normalne próbki kontrolne wykazują obecność tylko niewielkich ilości monomerycznej alfa-synukleiny. Po opanowaniu, tę technikę ekstrakcji białka można wykonać w ciągu jednego dnia roboczego, a następnie western immunoblot następnego dnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią ciał Lewy'ego do badania nierozpuszczalnych i zagregowanych gatunków alfa-synukleiny w patologicznych tkankach ludzkich oraz w modelach zwierzęcych in vivo. Nie zapominaj, że praca z nieutrwaloną tkanką ludzką wymaga środków ostrożności, a rękawice i fartuchy laboratoryjne powinny być noszone przez cały czas podczas wszystkich procedur obchodzenia się