Name: Ex vivo Hodowla wycinków móżdżku piskląt i przestrzennie ukierunkowana elektroporacja prekursorów komórek ziarnistych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji wycinków móżdżku piskląt w hodowli ex vivo do modyfikacji komórek ziarnistych. Technika ta pozwala badać migrację i różnicowanie progenitorów nerwowych w neurobiologii rozwojowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Metoda przedstawiona w tym artykule powstała w wyniku pracy finansowanej przez BBSRC BB/I021507/1 (TB, RJTW) oraz stypendium doktoranckiego MRC (MH).

Uwaga: Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi King's College London, UK i brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
1. Rozwarstwienie móżdżku e14
<ol>
	<li>Inkubować brązowe zapłodnione jaja kurze w temperaturze 38 °C do 14. dnia zarodka.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek do jaj odetnij głowę zarodkowi pisklęcia in ovo i przenieś głowę na szalkę Petriego zawierającą lodowaty PBS (ryc. 1A).</li>
	<li>Za pomocą standardowych kleszczy wykonaj nacięcia za każdym okiem na całej długości tkanki, usuwając oczy i górną szczękę. Wykonaj drugie nacięcie przez gardło, usuwając dolną szczękę (ryc. 1B).</li>
	<li>Za pomocą standardowych kleszczy usuń całą skórę z powierzchni czaszki, odrywając ją (ryc. 1C) i usuń kości czołowe i ciemieniowe, odsłaniając mózg.</li>
	<li>Od strony brzusznej usuń chrząstkę gardłową i mezenchymę pomocniczą.</li>
	<li>Od strony grzbietowej ostrożnie usuń mezenchymę grzbietową do tyłomózgowia, uważając, aby nie uszkodzić pia, i oddziel cały mózg (ryc. 1D).</li>
	<li>Wykonaj nacięcie przez całą długość tkanki między śródmózgowiem a tyłomózgowiem i oddziel tyłomózgowie, w tym móżdżek (ryc. 1E).</li>
	<li>Wykonując nacięcia na całej długości tkanki w obu bocznych połączeniach móżdżku i płytki grzbietowej tyłomózgowia, usuń cały móżdżek, dbając o zachowanie integralności pia podczas sekcji (ryc. 1F). Usuń tworzący się splot naczyniówkowy (ryc. 1G).</li>
	<li>Przenieś wypreparowany móżdżek do lodowatego HBSS.</li>
</ol>
2. Kultura Slice e14 Móżdżek
<ol>
	<li>Przenieś cały móżdżek na sterylną platformę rozdrabniacza tkanek za pomocą szpatułki lub pipety Pasteura o pojemności 3 ml z odciętą końcówką w celu poszerzenia otworu. Usuń nadmiar płynu za pomocą pipety.</li>
	<li>Wytnij cały móżdżek w wymaganej orientacji o grubości 300 μm za pomocą zestawu rozdrabniacza tkanek z prędkością cięcia 50% maksimum. Integralność tkanek jest najłatwiej zachowana w przekroju strzałkowym; jednak orientacja jest również ważnym czynnikiem w analizie komórek (dendryty komórek Purkinjego są wyrównane strzałkowo, podczas gdy aksony komórek ziarnistych biegną poprzecznie, prostopadle do płaszczyzny dendrytów komórek Purkinjego).</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura o pojemności 3 ml przykryj pokrojony móżdżek lodowatym HBSS.</li>
	<li>Przenieść plastry z HBSS na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą lodowato świeży HBSS za pomocą 3 ml pipety Pasteura z odciętą końcówką.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym oświetlonym światłowodowym źródłem światła należy zapewnić oddzielenie poszczególnych plastrów za pomocą kleszczyków zegarmistrzowskich. Zidentyfikuj plastry do elektroporacji na podstawie ich integralności tkankowej i pozycji przyśrodkowo-bocznej. 
	Uwaga: Każda sekcja od zarodka do inkubacji w plastrze trwa około 10-20 minut, w zależności od doświadczenia. Wykonuj sekcje pojedynczo, aby upewnić się, że móżdżek spędza minimalną ilość czasu między dekapitacją a posiewem ex vivo.</li>
</ol>
3. Elektroporacja plastrów
<ol>
	<li>Zbuduj komorę elektroporacyjną, mocując anodę elektroporatora do podstawy szalki Petriego o średnicy 60 mm za pomocą taśmy izolacyjnej. Dodać około 1 ml HBSS w celu przykrycia elektrody.</li>
	<li>Umieść wkładkę hodowlaną 0,4 μm na elektrodzie pokrytej HBSS. Pozwól, aby wkładka hodowlana spoczywała na elektrodzie, upewniając się, że zawsze jest kontakt między wkładką a elektrodą. 
	Uwaga: W tej konfiguracji wkładka hodowlana z plastrami będzie spoczywać na powierzchni roztworu, utrzymując obwód, ale umożliwiając przestrzenne ukierunkowanie katody.</li>
	<li>Przenieść zidentyfikowane wycinki (do pięciu na wkładkę hodowlaną) do wkładki hodowlanej za pomocą 3 ml pipety Pasteura z odciętą końcówką. Oddzielić i pozostawić do osadzenia się na wkładce hodowlanej w orientacji strzałkowej.</li>
	<li>Za pomocą pipety usuń nadmiar HBSS, aby plastry nie były już skąpane w roztworze.</li>
	<li>Używając końcówki do pipety P10, odpipetuj DNA (w stężeniu 1 μg/μl) rozcieńcz 20% szybką zielenią na powierzchni docelowego obszaru plasterka. 20% fast green zapewnia lepki roztwór DNA i zapobiega zbyt szerokiemu rozproszeniu DNA. Do każdej warstwy dodać około 5 μl DNA/szybko zielonego roztworu (ryc. 2B).</li>
	<li>Umieść katodę na żądanej tkance docelowej i poddaj elektroporację impulsom 3 x 10 V, o czasie trwania 10 ms. Unikaj bezpośredniego kontaktu katody z tkanką. Zamiast tego wykorzystaj napięcie powierzchniowe cieczy, aby utrzymać przewodność (umieść katodę jak najbliżej tkanki, nie dotykając jej).</li>
	<li>W razie potrzeby powtórz dostarczanie DNA i elektroporację do wielu regionów EGL na każdym pojedynczym wycinku móżdżku.</li>
	<li>Po zakończeniu elektroporacji przenieść kulturę bakterii na szalkę Petriego o średnicy 30 mm.</li>
	<li>Do każdej kultury dodać 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej (Basal Medium Eagle, 0,5% (w/v) D-(+)-glukozy, 1% suplementu B27, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny) pod wkładką hodowlaną tak, aby wkładka hodowlana stykała się z podłożem, ale plastry nie były w niej kąpane.</li>
	<li>Inkubować kultury w temperaturze 37 °C/6% CO2 przez okres do 3 dni. Wymieniaj całą pożywkę hodowlaną co 24 godziny na świeżą, wstępnie podgrzaną pożywkę.</li>
	<li>Po przeprowadzeniu hodowli utrwalić plastry na wkładkach hodowlanych na 1 godzinę w 4% paraformaldehydzie (lub O/N w temperaturze 4 °C) w świeżym naczyniu o średnicy 30 mm bez pożywki hodowlanej.</li>
</ol>
4. Obrazowanie wycinków móżdżku
<ol>
	<li>Po utrwaleniu umyj plastry 3 razy przez 5 minut w PBS.</li>
	<li>Za pomocą żyletki wypreparuj każdy elektroporowany i wyhodowany plasterek móżdżku z wkładki hodowlanej, przecinając wokół wycinka i usuwając plasterek oraz obszar wkładki, do którego jest przyklejony. Nie próbuj usuwać plastra z powierzchni wkładki hodowlanej.</li>
	<li>Umieścić plastry w około 1 ml podłoża mocującego zawierającego DAPI (w razie potrzeby) pod szkiełkiem nakrywkowym, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków, i zobrazować za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej. 
	Uwaga: Parametry obrazowania mogą być zmieniane w zależności od elektroporowanych konstrukcji i według uznania indywidualnego użytkownika.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje metodę preparowania, elektroporowania i hodowli wycinków embrionalnego móżdżku dnia 14 od pisklęcia. Protokół ten umożliwia ukierunkowanie elektroporacji na małe ogniskowe obszary EGL, w tym izolowane celowanie w poszczególne płaty móżdżku. Umożliwia analizę genetyczną i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i wygodzie oraz przy niskich kosztach w porównaniu z ustalonymi technikami u gryzoni43-47. Taka analiza nie jest obecnie możliwa in vivo ze względu na wydłużon...

Móżdżek znajduje się na przednim końcu tyłomózgowia i jest odpowiedzialny za integrację przetwarzania sensorycznego i motorycznego w dojrzałym mózgu, a także za regulację wyższych procesów poznawczych1. U ssaków i ptaków ma skomplikowaną morfologię i jest silnie ulistniony, co jest produktem rozległej amplifikacji tranzytowej przodków podczas rozwoju, która wytwarza ponad połowę neuronów w dorosłym mózgu. Móżdżek jest przedmiotem badań neurobiologów od wieków, a w erze molekularnej również otrzymał znaczną uwagę. Odnosi się to nie tylko do jego z natury interesującej biologii, ale także do faktu, że jest silnie związany z chorobami ludzkimi, w tym z genetycznymi zaburzeniami rozwojowymi, takimi jak zaburzenia ze spektrum autyzmu2 i przede wszystkim z rakiem móżdżku, rdzeniakiemzarodkowym 3, który jest najbardziej rozpowszechnionym guzem mózgu u dzieci. Co ważne, jest to doskonały system modelowy, w ramach którego można badać alokację losu i neurogenezę podczas rozwoju mózgu4. W ostatnich latach został również uznany za system modelowy do badań porównawczych rozwoju mózgu, ze względu na ogromną różnorodność form móżdżku obserwowanych w filogenezie kręgowców5-10.
Móżdżek rozwija się z grzbietowej połowy rombomeru 1 w tyłomózgowiu11 i rozwojowo składa się z dwóch głównych populacji progenitorów, rombowej wargi i strefy komorowej. Warga rombowa rozciąga się wokół grzbietowej części nabłonka nerwowego tyłomózgowia na granicy z płytą dachową. Jest to miejsce narodzin glutaminergicznego neuronów pobudzających móżdżku12-14. Strefa komorowa daje początek hamującym neuronom móżdżku GABA-ergicznym, przede wszystkim dużym neuronom Purkinjego14,15. W późniejszym okresie rozwoju (od około 13,5 dnia embrionalnego u myszy; e6 u piskląt16), przodkowie glutaminergiczny migrują stycznie z rombowej wargi i tworzą warstwę przodków: drugorzędową strefę progenitorową zwaną zewnętrzną warstwą ziarnistą (EGL). To właśnie ta warstwa ulega rozległemu wzmocnieniu tranzytu, co prowadzi do ogromnej liczby neuronów ziarnistych znajdujących się w dojrzałym mózgu.
Proliferacja w EGL od dawna jest związana z sub-pialnym położeniem, które wynika z migracji stycznej z rombowej wargi17, z przejściem na wyjście z cyklu komórkowego i różnicowaniem neuronalnym progenitorów związanym z ich wyjściem z zewnętrznej warstwy EGL do środkowej EGL18. Rozległa migracja styczna postmitotycznych komórek ziarnistych w osi przyśrodkowej i bocznej zachodzi w środkowej i wewnętrznej EGL19, przed końcową migracją promieniową do wewnętrznej warstwy ziarnistej dojrzałej kory móżdżku. Migracja komórek z rombowej wargi przez powierzchnię móżdżku jest zależna od sygnalizacji CXCL12 z pia20-22, a komórki ziarniste wyrażają receptor CXCL12 CXCR4. Ich migracja styczna przypomina zatem migrację stycznie migrujących hamujących populacji interneuronówkory nowej 23-25. Co ciekawe, badania pod mikroskopem elektronowym17 sugerują, że komórki EGL o morfologii proliferacyjnej utrzymują kontakt wzrokowy, łącząc zachowanie komórek ze zdolnością proliferacyjną w sposób przypominający podstawowych przodków kory ssaków26. Znajduje to odzwierciedlenie we wspomnianej wcześniej stratyfikacji EGL na trzy podwarstwy, które są zdefiniowane przez odrębne środowiska zewnątrzkomórkowe i w których prekursory granulek mają wyraźne sygnatury ekspresji genów18.
Proliferacja komórek progenitorowych w oEGL następuje przy normalnym rozkładzie wielkości klonów, tak że gdy przodkowie są indywidualnie genetycznie znakowani pod koniec rozwoju embrionalnego u myszy, powodują one powstanie średniej 250-500 postmitotycznych neuronów ziarnistych27,28. Proliferacja jest zależna od mitogennej sygnalizacji SHH z leżących u podstaw neuronów Purkinjego29-32. Wykazano, że zdolność do reagowania na SHH jest całkowicie zależna od autonomicznej ekspresji czynnika transkrypcyjnego Atoh1 w komórce, zarówno in vitro33, jak i in vivo34,35. Podobnie, wykazano, że wyjście z cyklu komórkowego i różnicowanie się zależy od ekspresji czynnika transkrypcyjnego NeuroD136, który jest prawdopodobnie bezpośrednim represorem Atoh137.
Pomimo tego postępu i znacznego postępu w rozszyfrowaniu biologicznych podstaw wyjścia z cyklu komórkowego38-42, podstawowych mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw decyzji o wyjściu z cyklu komórkowego i przejściu od neuronu progenitorowego do różnicującego, oraz związanej z tym postmitotycznej migracji stycznej w wewnętrznym EGL, jak również późniejszej migracji radialnej, pozostają nie w pełni zrozumiałe. Wynika to w dużej mierze z eksperymentalnej nierozwiązywalności EGL: rozwija się on późno i jest trudny do genetycznego ukierunkowania, ponieważ wiele z tych samych cząsteczek neurogennych jest również kluczowych we wcześniejszym okresie życia prekursorów granulek w rombowej wardze. Aby przezwyciężyć ten problem, wielu autorów opracowało elektroporację in vivo i ex vivo jako metodę celowania w móżdżek po urodzeniu u gryzoni43-48. W tym przypadku jesteśmy pionierami w stosowaniu elektroporacji ex vivo u piskląt do badania EGL, co przynosi znaczne korzyści pod względem kosztów i wygody. Nasza metoda elektroporacji i hodowli ex vivo w warstwach tkanki móżdżku piskląt wykorzystuje tkankę wypreparowaną z embrionalnych piskląt dnia 14 w szczytowym momencie proliferacji EGL. Metoda ta pozwala na genetyczne ukierunkowanie EGL niezależnie od rombowej wargi i przygotuje grunt pod genetyczną analizę przejścia od progenitora ziarnistości do postmitotycznego neuronu ziarnistego w móżdżku.

<table><tbody><tr><td>Rozdrabniacz tkanek McIlwain</td><td>Mickle Laboratory Engineering Ltd</td><td></td><td>Cięcie przy 300 &mu; m dla najlepszych wyników.</td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle (Gibco)</td><td>Life Technologies</td><td>41010-026</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>penicylina/streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>0,4 &mu; m Wkładka hodowlana</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>TSS20 Elektroporator Ovodyne&nbsp;</td><td>Intracel</td><td>01-916-02</td><td>Do elektroporacji należy użyć 3 impulsów 10 V, 10 ms.</td></tr></tbody></table>

ex vivo hodowla wycinków móżdżku piskląt i przestrzennie ukierunkowana elektroporacja prekursorów komórek ziarnistych

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Zewnętrzna warstwa granulatu móżdżku (EGL) jest miejscem największego wzmocnienia tranzytu w rozwijającym się mózgu i doskonałym modelem do badania proliferacji i różnicowania neuronów. Ponadto ewolucyjne modyfikacje jego zdolności proliferacyjnych były odpowiedzialne za dramatyczne rozszerzenie rozmiaru móżdżku u owodniowców, co czyni móżdżek doskonałym modelem do badań evo-devo mózgu kręgowców. Komórki składowe EGL, przodkowie ziarnistości móżdżku, stanowią również istotną komórkę pochodzenia rdzeniaka, najczęstszego nowotworu neuronalnego u dzieci. Po amplifikacji tranzytu prekursory granulek migrują promieniście do wewnętrznej warstwy ziarnistej móżdżku, gdzie reprezentują największą populację neuronów w dojrzałym mózgu ssaków. U piskląt szczyt proliferacji EGL przypada na koniec drugiego tygodnia ciąży. Aby ukierunkować modyfikację genetyczną na tę warstwę w szczytowym momencie proliferacji, opracowaliśmy metodę manipulacji genetycznej poprzez elektroporację ex vivo wycinków móżdżku z embrionalnych zarodków piskląt dnia 14. Metoda ta podsumowuje kilka ważnych aspektów rozwoju neuronów ziarnistych in vivo i będzie przydatna w generowaniu dokładnego zrozumienia proliferacji i różnicowania komórek ziarnistych móżdżku, a tym samym rozwoju, ewolucji i choroby móżdżku.

W tej sekcji przedstawiono przykłady wyników, jakie można uzyskać przy użyciu elektroporacji skrawków i hodowli móżdżku zarodka kurczaka z 14. dnia inkubacji. Disekcję móżdżku zilustrowano na Rysunku 1, a konfigurację komory do elektroporacji pokazano na Rysunku 2. Wykazujemy, że możliwe jest przeprowadzenie elektroporacji i pomyślna hodowla skrawków móżdżku, które zachowują swoją strukturę i morfologię komórkową in vitro (Rysunek 3A</str...

Zewnętrzna warstwa granulatu móżdżku jest miejscem największego wzmocnienia tranzytu w rozwijającym się mózgu. W tym miejscu przedstawiamy protokół ukierunkowany na modyfikację genetyczną tej warstwy w szczycie proliferacji przy użyciu elektroporacji ex vivo i hodowli plastrów móżdżku z embrionalnych zarodków piskląt dnia 14.

Ex vivo Hodowla wycinków móżdżku piskląt i przestrzennie ukierunkowana elektroporacja prekursorów komórek ziarnistych

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest skierowanie modyfikacji genetycznej do zewnętrznej warstwy ziarnistej móżdżku kurczego, aby móc obserwować, badać i modyfikować morfologię oraz zachowanie komórek ziarnistych w warunkach ex vivo. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii rozwoju, takie jak sposób, w jaki progenitorzy neuronalni migrują, proliferują i różnicują się. Główną zaletą tej techniki są znaczne korzyści w zakresie kosztów i wygody, jakie wiążą się z prowadzeniem takich badań.Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat rozwoju granulek u kurczaka, można ją zastosować również do innych organizmów modelowych, takich jak gady i ssaki. Aby rozpocząć, należy umieścić zapłodnione brązowe jaja kurze w inkubatorze w temperaturze 38 °C, aż osiągną 14. dzień rozwoju zarodkowego. W 14. dniu rozwoju zarodkowego należy wykonać otwór w skorupce jaja, aby odsłonić zarodek, a następnie przeprowadzić dekapitację zarodka kurczaka in ovo.Umieść głowę w szalce Petriego zawierającej lodowaty PBS pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą standardowej pęsety wykonaj nacięcie za każdym okiem, przechodząc przez całą tkankę, a następnie usuń oczy i górną szczękę. Następnie wykonaj drugie nacięcie przez całą gardziel, aby usunąć dolną szczękę.Następnie, za pomocą standardowej pęsety, usuń skórę z powierzchni czaszki, odrywając ją. Następnie usuń kości czołowe i ciemieniowe, odsłaniając mózg od strony brzusznej. Usuń chrząstkę gardzielną oraz pomocniczą mezenchymę.Następnie należy położyć mózg grzbietową stroną do góry i ostrożnie usunąć mezenchymę znajdującą się grzbietowo względem mózgu tylnego, dbając o to, aby nie uszkodzić p. Następnie należy wykonać nacięcie przez całą grubość tkanki pomiędzy mózgiem środkowym a mózgiem tylnym, aby oddzielić mózg tylny, w tym móżdżek. Należy wykonać nacięcia przez całą grubość tkanki w obu bocznych połączeniach móżdżku oraz w płytce aller mózgu tylnego.Usuń cały móżdżek, dbając o zachowanie ciągłości błony miękkiej (PIA) przez cały czas trwania sekcji. Następnie usuń formujący się splot naczyniowy i przenieś wypreparowany móżdżek do schłodzonego w lodzie roztworu HBSS. Przenieś cały móżdżek na sterylną platformę przecinarki do tkanek (tissue chopper), używając szpachelki lub pipety Pasteura o objętości 3 ml z odciętą końcówką.Aby poszerzyć otwór, należy usunąć nadmiar cieczy za pomocą pipety. Ustaw prędkość cięcia w krojonce do tkanek na 50% jej wartości maksymalnej. Następnie przetnij móżdżek w wymaganej orientacji, uzyskując grubość 300 micrometers, używając pipety Pasteura o pojemności trzech mililitrów.Przykryj plasterki móżdżku zimnym roztworem HBSS. Następnie przenieś roztwór HBSS wraz z plasterkami do 60 milimetrowej szalki Petri zawierającej 20 mililitrów lodowatego HBSS, używając trzech litrowej pipety Pasteura z odciętą końcówką; umieść szalkę Petri pod mikroskopem stereoskopowym oświetlonym światłowodowym źródłem światła. Następnie za pomocą pęsety zegarmistrzowskiej oddziel poszczególne plasterki tkanki mózgowej i wybierz plasterki do elektroporacji na podstawie ich integralności tkankowej oraz położenia przyśrodkowo-bocznego.Zbuduj komorę do elektroporacji, mocując anodę elektrody do podstawy 60-milimetrowej szalki Petriego. Używając taśmy izolacyjnej, dodaj około 1 ml HBSS, aby zakryć elektrodę. Następnie umieść filtr kultury o rozmiarze 0,4 µm.Umieść na elektrodzie przykrytej HBSS. Użyj pipety Pasteura o pojemności trzech mililitrów z odciętą końcówką, aby przenieść zidentyfikowane skrawki (do pięciu na wkład) na wkład hodowlany. Następnie rozdziel skrawki i pozwól im osiąść na podłożu hodowlanym.Wprowadzić w orientacji strzałkowej. Za pomocą pipety usunąć nadmiar medium z plastrów mózgu. Pozostawić wkładkę na elektrodzie w taki sposób, aby zapewnić kontakt między wkładką a elektrodą.W tej konfiguracji insert hodowlany z plastrami będzie spoczywać na powierzchni medium, utrzymując obwód, a jednocześnie umożliwiając przestrzenne celowanie katodą. Za pomocą końcówki do pipety P 10 nanieś pięć µL DNA rozcieńczonego w 20% fast green na powierzchnię wyznaczonego obszaru każdego plastra.Dodanie fast green zapewnia odpowiednią lepkość roztworu DNA, co zapobiega jego szerokiemu rozproszeniu. Następnie należy umieścić katodę przy wybranej tkance docelowej i przeprowadzić elektrolizę próbek. Należy unikać bezpośredniego kontaktu katody z tkanką, umieszczając ją jak najbliżej tkanki, ale bez dotykania jej.Powtórz elektroporację w wielu obszarach zewnętrznej warstwy ziarnistej na każdym pojedynczym skrawku móżdżku, zależnie od potrzeb. Po zakończeniu przenieś wkład kulturacyjny do 30 milimetrowej szalki Petriego. Do każdej kultury dodaj jeden mililitr podgrzanego wcześniej pożywki pod wkład kulturacyjny.Należy upewnić się, że wkładka nie pływa na powierzchni medium. Wkładka hodowlana powinna stykać się z medium, jednak skrawki nie mogą być w nim zanurzone. Hodowle inkubuje się do trzech dni, wymieniając w całości medium hodowlane.Wymieniaj medium co 24 godziny na świeże, uprzednio ogrzane medium po inkubacji kultur. Przenieś plastry z wkładów hodowlanych do szalki 30 mm zawierającej 4% paraformaldehydu na jedną godzinę. Upewnij się, że paraformaldehyd został dodany na wierzch hodowli.Wstawić po utrwaleniu. Płukać plastry trzykrotnie w PBS przez pięć minut każdego razu. Następnie za pomocą nożyczek okulistycznych wyciąć każdy z elektroporowanych i hodowanych plastrów móżdżku z hodowli.Wyciąć każdy plaster, usuwając go wraz z przylegającym fragmentem wkładki. Nie należy próbować oddzielać plastra od powierzchni wkładki. Plasterki zamontować w około jednym mililitrze wybranego medium montującego pod szkiełkiem zakrywowym, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.Po wyschnięciu preparatów należy je zebrać i obrazować za pomocą skanowania laserowego. Mikroskopia konfokalna calbindyny. Barwienie tkanki móżdżku E 14 przedstawiono tutaj na czerwono po elektroporacji kontrolnym plazmidem GFP w pierwszym, drugim i trzecim dniu in vitro.Spójne barwienie kalbindyną pokazuje, że integralność tkanki jest utrzymywana w kulturze przez co najmniej trzy dni in vitro. Przedstawiono tutaj obrazy przy małym powiększeniu plazmidów kodujących RFP i GFP, które zostały pomyślnie wprowadzonych metodą elektroporacji do zewnętrznej warstwy ziarnistej w różnych miejscach. Plazmid GFP został skierowany do pojedynczego fumu, co zaznaczono gwiazdką.Przedstawiono tutaj przykład, w którym konstrukt kodujący GFP pod kontrolą enhancera 8 0 1 został wprowadzony drogą elektroporacji do zewnętrznej warstwy ziarnistej. Ekspresja 8 0 1 definiuje prekursory komórek ziarnistych w obrębie zewnętrznej warstwy ziarnistej. Po trzech dniach in vitro wyraźnie widoczne są różne morfologie komórek, co pozwala na monitorowanie ich zachowania.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak elektroporować pojedyncze plasterki móżdżku, wykorzystując różnorodne narzędzia genetyczne w celu obserwacji i manipulowania rozwojem komórek ziarnistych. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące integralności strukturalnej tkanki oraz względnego rozmieszczenia różnych typów komórek, takich jak komórki Purkinjego czy glej Bergmanna. Po opanowaniu tej techniki, jej wykonanie dla kilkunastu embrionów kurzych zajmuje około dwóch godzin, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procesu.

ex-vivo-culture-chick-cerebellar-slices-spatially-targeted

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przedstawiamy metodę izolacji i hodowli progenitorowych komórek ziarnistych neuronów móżdżku oraz neuronów ziarnistych móżdżku z myszy w okresie postnatalnym. <br...

Izolacja i hodowla postnatalnych progenitorów neuronów ziarnistych oraz neuronów z móżdżku myszy

W tym filmie wykonujemy elektroporację wycinków móżdżku zarodka pisklęcia za pomocą plazmidów genu reporterowego. Technika ta ułatwia wizualizację rozwoju i migracji prekursorów komórek ziarnistych do postaci warstwy ziarnistej.

Elektroporacja ex vivo wycinków móżdżku zarodka pisklęcia: metoda wprowadzania plazmidowego DNA kodującego zielone białko fluorescencyjne w celu wizualizacji rozwoju komórek ziarnistych

Film pokazuje przygotowanie plastrów móżdżku. Przedstawia szczegółową procedurę izolowania móżdżku od zarodka pisklęcia. Plastry są następnie przygotowywane z wypreparowanego móżdżku za pomocą rozdrabniacza tkanek do dalszej analizy eksperymentalnej.

Uzyskiwanie plastrów móżdżku z embrionalnego mózgu pisklęcia

Źródło: Chan, U., et al., wykorzystując elektroporację poporodową in vivo do badania morfologii neuronów ziarnistości móżdżku i rozwoju synaps.J. Vis. Exp. (2021).Ten film przedstawia analizę rozwoju neuronów ziarnistości móżdżku poprzez obrazowanie wstępnie ustalonych wycinków tkanki mózgowej od myszy znakowanych białkiem fluorescencyjnym, Przechwytywanie obrazów stosu Z o wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopu konfokalnego i pomiar parametrów strukturalnych, w tym długości neurytów,...

Wizualizacja synaptogenezy neuronów ziarnistych móżdżku na różnych etapach rozwoju

Źródło: Bénard, M.,  i wsp. Ex vivo Obrazowanie migracji komórek ziarnistych móżdżku po urodzeniu za pomocą makroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje konfokalną metodę makroskopową do śledzenia ex vivo migracji komórek ziarnistych w wycinkach móżdżku z postnatalnych mózgów szczurów.

Obrazowanie ex vivo migracji komórek ziarnistych móżdżku po urodzeniu za pomocą makroskopii konfokalnej

Morfogeneza i migracja neuronów są kluczowymi wydarzeniami leżącymi u podstaw prawidłowego rozwoju mózgu. W tym miejscu opisujemy metody genetycznej manipulacji hodowanymi neuronami ziarnistymi móżdżku i rozwijającym się móżdżkiem w celu oceny morfologii i cech migracyjnych neuronów.

Manipulacja genetyczna neuronów ziarnistych móżdżku in vitro i in vivo w celu zbadania morfologii i migracji neuronów

Podczas rozwoju móżdżku po urodzeniu, niedojrzałe komórki ziarniste pochodzące ze strefy zarodkowej wykazują różne sposoby migracji, aby dotrzeć do miejsca docelowego i ustanowić sieci neuronowe. Protokół ten opisuje przygotowanie wycinków móżdżku i konfokalne podejście makroskopowe stosowane do badania czynników regulujących migrację neuronów.

Ex vivo Obrazowanie pourodzeniowej migracji komórek ziarnistych móżdżku za pomocą makroskopii konfokalnej

Ten protokół opisuje prostą metodę izolowania i hodowli pierwotnych mysich neuronów ziarnistych (CGN) od 6-7 dniowych szczeniąt, efektywną transdukcję CGN dla badań nad utratą i zyskiem funkcji, oraz modelowanie ekscytotoksyczności neuronów indukowanej przez NMDA, śmierci komórek indukowanej niskim poziomem potasu, uszkodzeń DNA i stresu oksydacyjnego przy użyciu tego samego modelu hodowli.

Modelowanie śmierci i zwyrodnienia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Konwencjonalne badania utraty funkcji genów przy użyciu zwierząt nokautujących często były kosztowne i czasochłonne. Mutageneza somatyczna oparta na CRISPR oparta na elektroporacji jest potężnym narzędziem do zrozumienia funkcji genów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy metodę analizy fenotypów nokautu w proliferujących komórkach móżdżku.

Analiza utraty funkcji za pośrednictwem CRISPR w komórkach ziarnistych móżdżku przy użyciu transferu genów opartego na elektroporacji in utero

Tutaj opisujemy metodę wizualizacji synaptogenezy ziarnistych neuronów w móżdżku myszy w trakcie poporodowego rozwoju mózgu, kiedy te komórki udoskonalają swoje struktury synaptyczne i tworzą synapsy, aby zintegrować się z ogólnym obwodem mózgu.

Wykorzystanie elektroporacji poporodowej in vivo do badania morfologii neuronów ziarnistych móżdżku i rozwoju synaps

Tutaj prezentujemy powtarzalny protokół elektroporacji in vitro do manipulacji genetycznej pierwotnych prekursorów komórek ziarnistych móżdżku (GCP), który jest opłacalny, wydajny i opłacalny. Co więcej, protokół ten demonstruje również prostą metodę badania molekularnego pierwotnych szlaków sygnałowych Hedgehog zależnych od rzęsek w pierwotnych komórkach GCP.

Wydajna i ekonomiczna metoda elektroporacji do badania pierwotnych szlaków sygnałowych zależnych od rzęsek w prekursorze komórek ziarnistych

Poznaj metodę elektroporacji wycinków móżdżku piskląt w hodowli ex vivo do modyfikacji komórek ziarnistych. Technika ta pozwala badać migrację i różnicowanie progenitorów nerwowych w neurobiologii rozwojowej.

Ex vivo Hodowla wycinków móżdżku piskląt i przestrzennie ukierunkowana elektroporacja prekursorów komórek ziarnistych

Przeglądaj więcej filmów