Name: Ulepszone wytwarzanie indukowanych kardiomiocytów przy użyciu konstruktu politronicznego wyrażającego optymalny stosunek Gata4, Mef2c i Tbx5 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Poznaj metodę generowania indukowanych kardiomiocytów z fibroblastów sercowych myszy przy użyciu konstruktu politronicznego zawierającego czynniki transkrypcyjne Gata4, Mef2c i Tbx5.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni za fachową pomoc techniczną ze strony UNC Flow Cytometry Core i UNC Microscopy Core. Dziękujemy członkom laboratorium Qian i laboratorium Liu za pomocne dyskusje i krytyczne recenzje manuskryptu. Badanie to było wspierane przez grant NIH / NHLBI R00 HL109079 dla dr Liu i American Heart Association (AHA) Scientist Development Grant 13SDG17060010 oraz Ellison Medical Foundation (EMF) New Scholar Grant AG-NS-1064-13 dla dr Qian.

Opisany tutaj protokół wykorzystuje noworodki myszy. Opieka nad zwierzętami i eksperymenty są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez Wydział Medycyny Zwierząt Laboratoryjnych (DLAM) na Uniwersytecie Karoliny Północnej w Chapel Hill.
1. Przygotowanie i pożywek
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę z fibroblastami (FB): Uzupełnij 500 ml pożywki IMDM ze 100 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 6 ml penicyliny/streptomycyny.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę iCM: Uzupełnij 400 ml pożywki DMEM 100 ml pożywki M199 i 50 ml FBS.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę B27: Uzupełnij 490 ml pożywki RPMI1640 10 ml pożywki B27.</li>
	<li>Przygotować pożywkę Plat-E: Uzupełnić 500 ml pożywki DMEM o 50 ml FBS, 5 ml penicyliny/streptomycyny i 5 ml aminokwasów endogennych.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę do transfekcji Plat-E: Uzupełnij 500 ml pożywki DMEM o 50 ml FBS i 5 ml aminokwasów endogennych.</li>
	<li>Przygotować 24-dołkową płytkę pokrytą żelatyną: Dodać 0,5 ml 0,1% roztworu żelatyny do dołka z 24-dołkową płytką, inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 10 minut i odessać bezpośrednio przed użyciem.</li>
	<li>Przygotować bufor do znakowania FACS: Uzupełnij 500 ml DPBS 10 ml FBS i 2 ml EDTA (0,5 M), aby osiągnąć końcowe stężenie 2 mM. Przepuścić przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować bufor sortujący MACS: Uzupełnić 500 ml DPBS o 2,5 g BSA i 2 ml EDTA (0,5 M), aby osiągnąć końcowe stężenie 2 mM. Przepuścić przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj 2x bufor HBS do transfekcji: uzupełnij 500 ml buforu HEPES (50 mM) z 280 mM NaCl (8,1816 g), 10 mM KCl (0,37275 g), 1,5 mM Na2HPO4 (0,10647 g), 12 mM glukozy (1,08096 g). Dodać około 650 μl 10 N NaOH, aby dostosować pH do 7,05-7,12. Przefiltrować przez filtr porowy 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 2,5 M roztwór CaCl2 do transfekcji: Dodać 18,376 g CaCl2 do 50 ml ddH2O. Przefiltrować przez filtr porowy 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować bufor wiążący ICC (immunocytochemia): Dodać 5 ml paraformaldehydu (PFA, 32%) do 35 ml DPBS, aby osiągnąć końcowe stężenie 4%.</li>
	<li>Przygotować bufor do permeabilizacji ICC: Dodać 0,1 ml Triton do 100 ml DPBS, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,1%.</li>
	<li>Przygotować bufor blokujący ICC: Dodać 5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 100 ml DPBS, aby osiągnąć końcowe stężenie 5%.</li>
	<li>Przygotować bufor barwiący ICC: Dodać 1 g BSA do 100 ml DPBS, aby osiągnąć końcowe stężenie 1%.</li>
</ol>
2. Generacja fibroblastów serca u noworodków myszy
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Generowanie fibroblastów serca metodą hodowli eksplantatów
	<ol>
		<li>Oczyść noworodkową transgeniczną mysz αMHC-GFP (P1 do P2) 75% etanolem. Odetnij głowę sterylnymi nożyczkami. Następnie wykonaj poziome nacięcie od jednej pachy do drugiej. Użyj sterylnych, i zgiętych kleszczy, aby wyciąć serce i umieścić je w jednym dołku 24-dołkowej płytki zawierającej lodowaty bufor PBS.
		<ol>
			<li>Alternatywnie wyciśnij serce po poziomym nacięciu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Sprawdź ekspresję GFP w sercu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Ponieważ ekspresja GFP jest napędzana przez promotor αMHC, który jest promotorem specyficznym dla serca, serce transgenicznej myszy powinno być w kolorze zielonym15, podczas gdy ujemne serce jest przyciemnione w dowolnej fluorescencji.</li>
		<li>Weź 3-4 serca z dodatnim wynikiem GFP do naczynia hodowlanego o średnicy 60 mm i zmiel je na małe kawałki o wielkości mniejszej niż 1 mm3 za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy.</li>
		<li>Umieść 3-4 mielone serca w jednym 10 cm naczyniu z 2 ml pożywki FB. Pozwól tkankom osiąść na 3 godziny.</li>
		<li>Powoli dodawaj 8 ml podgrzanej pożywki FB do naczyń zawierających tkanki serca. Nie naruszaj tkanek przez trzy dni.</li>
		<li>Wymieniaj nośnik co trzy dni.</li>
		<li>W dniu 7 odessać pożywkę hodowlaną i przepłukać komórki DPBS. Dodać 3 ml 0,05% trypsyny do każdej płytki i trawić w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Dodaj 5 ml pożywki FB, aby ugasić trypsynę. Delikatnie odłącz komórki za pomocą skrobaka do komórek. Pipetować pożywkę w górę i w dół, aby jeszcze bardziej mechanicznie zdysocjować tkankę.</li>
		<li>Zebrać komórki i przefiltrować przez sitka do komórek 40 μm, aby uniknąć zanieczyszczenia fragmentów tkanki serca, a następnie osadzać komórki, wirując z prędkością 200 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Umyj komórki raz buforem MACS, a komórki są gotowe do sortowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie fibroblastów serca metodą trawienia enzymatycznego
	<ol>
		<li>Zbierz serca z dodatnim wynikiem GFP jako 2.1.1. Przełóż wszystkie serca do 10 cm naczynia z 10 ml lodowatego DPBS.</li>
		<li>Ściśnij komory sterylnymi kleszczami, aby usunąć krew i spłucz raz lodowatym DPBS.</li>
		<li>Przytnij serca, aby były wolne od innych tkanek i tłuszczu.</li>
		<li>Pokrój każde serce na około 4 części, które są nadal luźno połączone.</li>
		<li>Jeśli jest mniej niż 20 serc, przenieść serca do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z 8 ml ciepłej 0,05% trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
		<ol>
			<li>Jeśli jest 20-30 serc, przenieś serca do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z 10 ml ciepłej 0,05% trypsyny-EDTA i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyrzuć trypsynę i dodaj 5 ml (dla mniej niż 20 serc) lub 10 ml (dla 20-30 serc) ciepłej kolagenazy typu II (0,5 mg/ml) w HBSS.</li>
		<li>Wiruj rurkę na wirowniku przez 1 minutę z prędkością około 4 do 6 (jeśli płyn nie dostanie się do pokrywki, prędkość jest w porządku).</li>
		<li>Inkubować probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 3-5 minut.</li>
		<li>Obracaj rurkę przez 1 minutę.</li>
		<li>Osad przez 1 minutę grawitacyjnie, aż kawałki tkanki osiądą, zebrać płyn do nowej probówki zawierającej 5 ml zimnego podłoża FB.</li>
		<li>Powtórz kroki 2.2.6-2.2.10 3-5 razy.</li>
		<li>Połącz wszystkie kolekcje, filtrując przez sitko o wielkości 40 μm, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.</li>
		<li>Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zawiesić komórki w 10 ml buforze MACS i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Opcjonalnie: Jeśli jest dużo krwinek, ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml buforu do lizy RBC (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 i 0,1 mM EDTA), trzymać na lodzie przez 1 minutę, następnie rozcieńczyć 10 ml buforu MACS i odwirować przy 200 x g przez 5 minut. Przemyć jeszcze raz buforem MACS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja fibroblastów Thy1.2+ za pomocą MACS (sortowanie komórek aktywowane magnetycznie)
	<ol>
		<li>Określ liczbę żywotnych komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym.
		<ol>
			<li>Pobrać 10 μl komórek z 10 ml zawiesiny komórek w kroku 2.2.14. Wymieszać z 10 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego.</li>
			<li>Dodaj mieszaninę do hemocytometru. Odstawić na 3-5 minut, a następnie natychmiast zbadać pod mikroskopem. Martwe komórki są barwione na niebiesko, a żywe komórki są niebarwione.</li>
			<li>Policz wszystkie żywotne komórki w czterech kwadratach narożnych hemocytometru o średnicy 1 mm. Określ liczbę żywotnych komórek: średnia liczba na kwadrat x 2 (współczynnik rozcieńczenia) x 104 x 10 (całkowita objętość zawiesiny komórek).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku komórek mniejszych niż 1 x 107 należy ponownie zawiesić komórki z 10 μl mikrogranulek Thy1,2 w schłodzonym buforze MACS o pojemności 90 μl. Dodaj proporcjonalnie więcej koralików, jeśli jest więcej niż 1 x 107 komórek. Dobrze wymieszać i inkubować w lodówce (2-8 °C) przez 30 minut.</li>
		<li>Dodać 10 ml buforu MACS i wirować próbki o sile 200 x g przez 5 minut; przemyć 10 ml buforu MACS i ponownie odwirować.</li>
		<li>Doprowadzić objętość do 2 ml w buforze MACS.</li>
		<li>Skonfiguruj separator MACS w okapie. Wstaw kolumnę LS do separatora. Nałóż 3 ml buforu MACS na kolumnę, aby ją zrównoważyć.</li>
		<li>Przepuścić zawiesinę komórek przez zrównoważoną kolumnę LS.</li>
		<li>Przemyć 3 razy 2 ml buforu MACS za każdym razem.</li>
		<li>Zdjąć kolumnę LS z separatora i wymyć 3 razy za pomocą 2 ml buforu MACS do nowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Wirować z prędkością 200 x g przez 5 min.</li>
		<li>Zawiesić komórki w 10 ml pożywki FB, policzyć komórki i nasiona na płytkach o odpowiedniej gęstości. W przypadku fibroblastów generowanych metodą hodowli eksplantatów gęstość komórek wysiewu może wynosić około 2-3 x 104 komórek / dołek na płytce 24-dołkowej. W przypadku fibroblastów generowanych metodą trawienia enzymatycznego gęstość komórek może wynosić około 4-5 x 104 komórek / dołek na płytce 24-dołkowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Generacja retrowirusa do przeprogramowania iCM
Uwaga: Wykonaj następujące kroki w Szafie Bezpieczeństwa Biologicznego BSL2 w sterylnych warunkach. Zaleca się właściwą utylizację transfekowanych komórek, końcówek pipet i probówek, aby uniknąć ryzyka zagrożeń dla środowiska i zdrowia.
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Utrzymuj komórki Plat-E w pożywce Plat-E uzupełnionej 1 μg/ml puromycyny i 10 μg/ml blasticydyny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>W dniu 2 należy zastąpić pożywkę pożywką Plat-E pozbawioną puromycyny i blasticydyny.</li>
	<li>W dniu 0 podziel komórki Plat-E na 10 cm szalki dzień przed transfekcją w ilości około 4-5 x 106 komórek na płytkę. Komórki powinny być zlewające się w ~80-90% w dniu transfekcji.</li>
	<li>W pierwszym dniu zmień pożywkę hodowlaną na pożywkę do transfekcji na komórkach w ciągu 1 godziny przed transfekcją. Procedura transfekcji jest następująca:
	<ol>
		<li>Transfekcja przy użyciu zestawów komercyjnych
		<ol>
			<li>Zmieszać 20 μl odczynnika do transfekcji (np. Lipofektaminy) i 500 μl zredukowanej pożywki surowicy (np. Opti-MEM). Dodać 10 μg plazmidu retrowirusowego do kolejnych 500 μl zredukowanej pożywki w surowicy. Inkubować każdą mieszaninę w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.</li>
			<li>Powoli dodawać mieszaninę plazmidu do mieszaniny transfekcyjnej. Ten krok może zająć 15-30 sekund. Inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej (roztwór może wydawać się mętny).</li>
			<li>Dodaj mieszaninę kroplami do komórek.</li>
			<li>Inkubować przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Transfekcja przy użyciu fosforanu wapnia.
		<ol>
			<li>Zmieszać 40 μl 2,5 M CaCl2 i 440 μl ddH2O, a następnie dodać 20 μg plazmidu retrowirusowego (dostosować ilość ddH2O tak, aby całkowita objętość wynosiła 500 μl).</li>
			<li>Dodaj 500 μl 2x HBS do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
			<li>Odwiruj HBS i w międzyczasie dodaj mieszaninę wapnia-DNA do HBS kroplami. Ten krok trwa około 30 sekund dla każdej próbki. Więc maksymalnie wykonaj 3-4 próbki jednocześnie.</li>
			<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty Inkubacja przez dłuższy czas prowadzi do większego osadu i mniej komórek wchłonie osad.</li>
			<li>Dodaj mieszaninę kroplami do komórek i obserwuj pod mikroskopem 20X. Powinny być widoczne drobne osady (wiele małych jest dobrych, ale kilka dużych nie jest dobrych).</li>
			<li>Inkubować przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu 2 zmień pożywkę na komórkach z 8 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej. Inkubować przez 24 godziny.</li>
	<li>W dniu 3 i 4 należy pobrać supernatant z naczyń za pomocą sterylnej jednorazowej strzykawki o pojemności 10 ml, przefiltrować go przez filtr z octanu celulozy o wielkości porów 0,45 μm i przenieść do probówki o pojemności 50 ml. Dodać 2 ml roztworu do wytrącania retrowirusa na każde 8 ml supernatantu zawierającego wirusa. Delikatnie wymieszać i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>W 5 dniu wirować mieszaninę wirusową w temperaturze 1 500 × g w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Cząsteczki wirusa powinny pojawić się w postaci białego osadu na dnie probówki.</li>
	<li>Odrzucić supernatant. Odwirować pozostały roztwór przez odwirowanie z stężeniem 1 500 × g przez 5 minut. Usunąć wszelkie ślady płynu przez aspirację, bardzo uważając, aby nie naruszyć wytrąconych cząstek retrowirusowych w granulkach.</li>
	<li>Zawiesić osady retrowirusowe ze 100 μl buforu DPBS na każde 8 ml supernatantu wirusowego. Porcjować wirusa na lodzie. Zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
4. Przeprogramowanie fibroblastów serca

<ol>
	<li>Dodać 4 μl roztworu polibrenu o stężeniu 10 mg/ml do 10 ml pożywki iCM i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół. Końcowe stężenie polibrenu wynosi 4 μg/ml.</li>
	<li>Dodać 500 μl pożywki iCM zawierającej polibren do każdej studzienki z 24-dołkową płytką wysianą fibroblastami.</li>
	<li>Dodać 10 μl retrowirusa do każdej studzienki zawierającej 2-3 x 104 komórek z hodowli eksplantatów lub 4-5 x 104 komórek z metody trawienia enzymatycznego. Ilość wirusa powinna być proporcjonalnie zwiększana wraz ze wzrostem liczby komórek w różnych płytkach hodowlanych lub szalkach. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 24-48 godzin, aby umożliwić infekcję wirusową. Oś czasu przeprogramowania serca pokazano na rysunku 1.</li>
	<li>Po transdukcji wirusa zastąp pożywkę zawierającą wirusa zwykłą pożywką iCM o pojemności 500 μl.</li>
	<li>Zmieniaj nośniki co 2-3 dni. W celu pozytywnej selekcji komórek transdukowanych wirusem należy dodać do komórek docelowych pożywkę iCM uzupełnioną puromycyną w stężeniu 2 μg/ml. Trzymaj go przez trzy dni. Następnie utrzymuj puromycynę w pożywce iCM w stężeniu 1 μg/ml.</li>
	<li>Trzy dni po zakażeniu wirusowym wyjmij płytkę z inkubatora i umieść ją pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym (20X), aby obserwować ekspresję GFP. 
	Uwaga: Dziesięć dni po infekcji wirusowej komórki można pobrać do analizy FACS i analizy ICC w celu określenia wydajności przeprogramowania (w kroku 5 i 6).</li>
	<li>Czternaście dni po infekcji wirusowej zastąp pożywkę iCM pożywką B27. Zmieniaj nośniki co trzy dni. Spontaniczne bicie loci komórek może pojawić się po trzech (komórki z metody trawienia enzymatycznego) lub czterech (komórki z metody hodowli eksplantacyjnej) tygodni po transdukcji wirusa.</li>
</ol>
5. Immunocytochemiczna analiza skuteczności przeprogramowania
<ol>
	<li>Przepłucz komórki lodowatym PBS trzy razy; usuń nadmiar roztworu.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml buforu utrwalającego ICC do każdego dołka z 24 płytkimi dołkowymi. Ustaw komórki w RT na 15-20 min.</li>
	<li>Przepłukać komórki trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml buforu do permeabilizacji ICC do każdej studzienki z 24 płytek dołkowych. Przepuszczalność komórek w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Przepłukać komórki trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml buforu blokującego ICC do każdej studzienki na płytce 24-dołkowej, inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Rozcieńczone przeciwciała pierwszorzędowe buforem barwiącym ICC. Dodać 200 μl roztworów przeciwciał do każdej studzienki i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Współczynniki rozcieńczania przeciwciał są wymienione w Materiałach.</li>
	<li>Następnego dnia trzykrotnie przemyj komórki PBS.</li>
	<li>Dodać 200 μl roztworów przeciwciał drugorzędowych do komórek i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Umyj komórki PBS trzy razy.</li>
	<li>Do każdej studzienki dodać 150 μl roztworu montażowego zawierającego DAPI. Pozostawić do zabarwienia jąder na 1 minutę. Następnie przykryj każdą studzienkę okrągłym szklanym szkiełkiem nakrywkowym i delikatnie dociśnij szkiełko do dolnej powierzchni za pomocą kleszczyków, aby usunąć pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Odessać nadmiar roztworu, a próbki są gotowe do obrazowania. Reprezentatywne obrazy przedstawiające przeprogramowane komórki, które wyrażają marker sercowy cTnT i αaktyninę w d14, pokazano na rysunku 2B.</li>
</ol>
6. Analiza FACS efektywności przeprogramowania
<ol>
	<li>Dokładnie umyj komórki raz za pomocą DPBS. Dodać 0,3 ml trypsyny (0,05%) do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Delikatnie postukaj w płytkę, aby ułatwić podnoszenie komórek. Sprawdź odłączenie komórki pod mikroskopem. Dodaj 1 ml buforu FACS do każdej studzienki, gdy większość komórek jest zdysocjowana. Pipetuj w górę i w dół, aby jeszcze bardziej mechanicznie zdysocjować komórki.</li>
	<li>Przenieść komórki z płytki 24-dołkowej do płytki z 96 dołkami do studni. Wirować w czasie 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby zebrać komórki.</li>
	<li>Umyj komórki raz buforem FACS.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworów utrwalających/przepuszczalnych, aby ponownie zawiesić komórki na 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie 1x roztworem myjącym, granulką i usuń supernatant.</li>
	<li>Przygotować pierwszorzędowy roztwór przeciwciał przeciwko GFP i cTnT w 1x buforze do płukania. Dokładnie zawiesić każdą próbkę z 50 μl roztworu przeciwciał i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Umyj komórki raz w 1x roztworze myjącym, granulce i usuń supernatant.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać 50 μl roztworu przeciwciała drugorzędowego zawierającego sprzężoną anty-króliczą IgG osła Alexa Fluor 488 i sprzężoną anty-mysią IgG osła Alexa Fluor 647. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut w ciemności.</li>
	<li>Umyj komórki raz w 1x roztworze myjącym, granulce i usuń supernatant.</li>
	<li>Zawieś komórki w buforze utrwalającym 400 μl (DPBS z 1% PFA). Przenieś komórkę do probówki FACS z nasadką sitka do komórek. Próbki są gotowe do wykrycia FACS. Reprezentatywna analiza FACS wydajności przeprogramowania przy użyciu konstruktu pMxs-puromycyna-MGT z selekcją puromycyny lub bez niej pokazano na rysunku 2A.</li>
</ol>

<ol><li>Mozaffarian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics--2015+Update%3A+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics--2015 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. , (2014).</li>
<li>Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+the+pathogenesis+of+heart+disease%3A+mechanisms+and+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance.</a> Annu Rev Physiol. 72, (2010).</li>
<li>Senyo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+heart+renewal+by+pre-existing+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes.</a> Nature. 493, 433-436 (2013).</li>
<li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cardiomyocyte+DNA+synthesis+in+normal+and+injured+adult+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts.</a> Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).</li>
<li>Hosoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonality+of+mouse+and+human+cardiomyogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17169-17174 (2009).</li>
<li>Choi, W. Y., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cardiac regeneration.</a> Curr Top Dev Biol. 100, 319-344 (2012).</li>
<li>Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+fibroblast%3A+the+renaissance+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac fibroblast: the renaissance cell.</a> Circ Res. 105, 1164-1176 (2009).</li>
<li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+fibroblasts+regulate+myocardial+proliferation+through+beta1+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling.</a> Dev Cell. 16, 233-244 (2009).</li>
<li>Moore-Morris, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+fibroblast+lineages+mediate+pressure+overload-induced+cardiac+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Resident fibroblast lineages mediate pressure overload-induced cardiac fibrosis.</a> J Clin Invest. 124, 2921-2934 (2014).</li>
<li>Addis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+direct+fibroblast+reprogramming+to+cardiomyocytes+using+calcium+activity+as+a+functional+measure+of+success%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success.</a> J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).</li>
<li>Chen, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+reprogramming+of+fibroblasts+into+cardiomyocytes+using+Gata4%2C+Mef2c%2C+and+Tbx5%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Inefficient reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes using Gata4, Mef2c, and Tbx5.</a> Circ Res. 111, 50-55 (2012).</li>
<li>Christoforou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+MYOCD%2C+SRF%2C+Mesp1+and+SMARCD3+enhance+the+cardio-inducing+effect+of+GATA4%2C+TBX5%2C+and+MEF2C+during+direct+cellular+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming.</a> PLoS One. 8, e63577(2013).</li>
<li>Fu, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+human+fibroblasts+toward+a+cardiomyocyte-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state.</a> Stem Cell Reports. 1, 235-247 (2013).</li>
<li>Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+cardiomyocyte-like+cells+with+the+MyoD+transactivation+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain.</a> Cardiovasc Res. 100, 105-113 (2013).</li>
<li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142, 375-386 (2010).</li>
<li>Inagawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cardiomyocyte-like+cells+in+infarct+hearts+by+gene+transfer+of+Gata4%2C+Mef2c%2C+and+Tbx5%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of cardiomyocyte-like cells in infarct hearts by gene transfer of Gata4, Mef2c, and Tbx5.</a> Circ Res. 111, 1147-1156 (2012).</li>
<li>Islas, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+ETS2+and+MESP1+transdifferentiate+human+dermal+fibroblasts+into+cardiac+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 13016-13021 (2012).</li>
<li>Jayawardena, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-mediated+in+vitro+and+in+vivo+direct+reprogramming+of+cardiac+fibroblasts+to+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes.</a> Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).</li>
<li>Muraoka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-133+promotes+cardiac+reprogramming+by+directly+repressing+Snai1+and+silencing+fibroblast+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures.</a> Embo J. 33, 1565-1581 (2014).</li>
<li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141, 4267-4278 (2014).</li>
<li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+fibroblasts+toward+a+cardiac+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).</li>
<li>Protze, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+transcription+factor+screening+for+reprogramming+of+fibroblasts+to+cardiomyocyte-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).</li>
<li>Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+mouse+fibroblasts+into+cardiomyocyte-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro.</a> Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+Molecules+Enable+Cardiac+Reprogramming+of+Mouse+Fibroblasts+with+a+Single+Factor%2C+Oct4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4.</a> Cell Rep. , (2014).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+Gata4%2C+Mef2c%2C+and+Tbx5+Influences+the+Efficiency+and+Quality+of+Induced+Cardiac+Myocyte+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming.</a> Circ Res. , (2014).</li>
<li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485, 599-604 (2012).</li>
<li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485, 593-598 (2012).</li>
<li>Mathison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cardiac+cellular+reprogramming+efficacy+is+enhanced+by+angiogenic+preconditioning+of+the+infarcted+myocardium+with+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor.</a> J Am Heart Assoc. 1, e005652(2012).</li>
<li>Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+with+thymosin+beta4+and+cardiac+reprogramming+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+NY+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors.</a> Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).</li>
<li>Muraoka, N., Ieda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+transcription+factors+is+critical+for+cardiac+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming.</a> Circ Res. , 116-216 (2015).</li>
<li>Srivastava, D., Ieda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+factors+for+cardiac+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Critical factors for cardiac reprogramming.</a> Circ Res. 111, 5-8 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby pomyślnie generować iCM podczas korzystania z tego protokołu, istnieje kilka ważnych czynników, które mają wpływ na ogólną wydajność. W szczególności warunki uruchamiania fibroblastów i jakość kodowania retrowirusa MGT mogą mieć duży wpływ na wydajność przeprogramowywania.
Ważne jest, aby wytwarzać fibroblasty tak świeże i zdrowe, jak to tylko możliwe. W przypadku metody hodowli eksplantatów fibroblasty można użyć przed upływem siedmiu dni po posianiu eksplantatów na szalkach. Do metody tr...

Choroby układu krążenia pozostają główną przyczyną zgonów na całym świecie, odpowiadając za 17,3 miliona zgonówrocznie1. Utrata kardiomiocytów wynikająca z zawału mięśnia sercowego (MI) lub postępującej niewydolności serca jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności2. Ze względu na ograniczoną zdolność regeneracyjną, serca dorosłych ssaków zwykle cierpią z powodu upośledzenia funkcji pompy i niewydolności serca po urazie3-6. W związku z tym skuteczna (re)generacja kardiomiocytów in vivo i in vitro w celu leczenia chorób serca i modelowania chorób jest krytyczną kwestią, którą należy się zająć.
Niedawny rozwój bezpośredniego przeprogramowania, które bezpośrednio przeprogramowuje komórki z jednego zróżnicowanego fenotypu na inny, bez przechodzenia przez stan pluripotencjalny, oferuje obiecujące alternatywne podejście dla medycyny regeneracyjnej. Serce ssaków zawiera obfite fibroblasty serca (CF), które stanowią około połowy komórek w sercu i masowo namnażają się po urazie7-9. W związku z tym ogromna pula CF może służyć jako endogenne źródło nowych CM do terapii regeneracyjnej, jeśli można je bezpośrednio przeprogramować na funkcjonalne CM. Wykazano, że kombinacja czynników transkrypcyjnych, takich jak Gata4 (G), Mef2c (M) i Tbx5 (T), z mikroRNA lub małymi cząsteczkami lub bez nich, może przeprogramować fibroblasty w iCM10-26. Co ważne, konwersja ta może być również indukowana in vivo i skutkuje poprawą funkcji serca oraz zmniejszeniem rozmiaru blizny w zawale serca16,27-29. Badania te wskazują, że bezpośrednie przeprogramowanie serca może być potencjalną drogą do wyleczenia uszkodzonego serca. Jednak niska skuteczność przeprogramowania iCM stała się główną przeszkodą dla dalszych badań mechanistycznych. Ponadto powtarzalność przeprogramowania serca jest kolejną kontrowersyjną kwestią związaną z tą technologią11,30,31. 
Całkiem niedawno, wygenerowaliśmy kompletny zestaw policistronicznych konstruktów kodujących G,M,T we wszystkich możliwych porządkach splicingu z identycznymi sekwencjami 2A w pojedynczym mRNA. Te policistroniczne konstrukty dały różne poziomy ekspresji białek G, M i T, co doprowadziło do znacząco różnej wydajności przeprogramowania25. Najbardziej wydajny konstrukt, nazwany MGT, który wykazał stosunkowo wysoką ekspresję Mef2c i niską ekspresję Gata4 i Tbx5, znacznie poprawił wydajność przeprogramowania i wytworzył duże ilości iCM z ekspresją markerów CM, silnymi oscylacjami wapnia i spontanicznym dudnieniem25. Co więcej, dzięki zastosowaniu konstruktu policistronicznego MGT, w naszym badaniu uniknęliśmy użycia wielu wektorów i wygenerowaliśmy komórki o jednorodnym stosunku ekspresji G,M,T, zapewniając w ten sposób ulepszoną platformę do badań nad przeprogramowaniem serca. Aby zwiększyć odtwarzalność eksperymentalną, tutaj szczegółowo opisujemy, jak wyizolować fibroblasty, wyprodukować kasetę MGT przenoszącą retrowirusa, wygenerować iCM i ocenić skuteczność przeprogramowania.

<table><tbody><tr><td>troponina przeciwsercowa T</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-295-PO</td><td>1:200 dla FACS i 1:400 dla ICC</td></tr><tr><td>anty-GFP</td><td>Life Technologies</td><td>A11122</td><td>1:500 zarówno dla FACS, jak i ICC</td></tr><tr><td>anty-aActinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td>1:500 zarówno dla FACS, jak i ICC</td></tr><tr><td>anty-Connexin43</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6219</td><td>1:500 dla&nbsp; ICC</td></tr><tr><td>anit-Mef2c</td><td>Abcam</td><td>ab64644</td><td>1:1,000 dla ICC&nbsp;</td></tr><tr><td>anty-GATA4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-1237</td><td>1:200 dla ICC</td></tr><tr><td>anty-Tbx5</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17866</td><td>1:200 dla ICC</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&ndash; sprzężony osł anty-królik IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>711-545-152</td><td>1:500 zarówno dla FACS, jak i ICC</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647&ndash; sprzężony osł anty-mysie IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>715-605-150</td><td>1:500 zarówno dla FACS, jak i ICC</td></tr><tr><td>Zestaw Cytofix/Cytoperm do barwienia wewnątrzkomórkowego</td><td>BD Biosciences</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do obrazowania wapnia Rhod-3</td> Life <td>Technologies</td><td>R10145</td><td></td></tr><tr><td>Mikrogranulki Thy1.2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-101</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Vectashield z DAPI</td><td>Vector labs</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-2442</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%)</td><td>Corning</td><td>25-052</td><td></td></tr><tr><td>PRMI1640 średni</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Zredukowana surowica Medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>M199 medium</td><td>Life Technologies</td><td>10-060</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoki poziom glukozy</td><td>Life Technologies</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Corning</td><td>30-002</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Life Technologies</td><td>11130-050</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamina 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668500</td><td></td></tr><tr><td>blasticydyna</td><td>Life Technologies</td><td>A11139-03</td><td></td></tr><tr><td>puromycyna</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>polibren</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PX1405</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Fisher</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>EMS</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do wytrącania retrowirusów</td><td>ALSTEM</td><td>VC-200</td><td></td></tr><tr><td>0,4% roztwór błękitu trypanowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>PBS firmy Dulbecco bez CaCl2 i MgCl2 (D-PBS, 1x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hanks Zrównoważony roztwór soli)</td><td>Kolumna Corning</td><td>21022</td><td></td></tr><tr><td>LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; Filtr z octanu celulozy&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Naczynia do hodowli tkankowych&nbsp;</td><td></td> Naczynie do hodowli studzienek <td>centralnych Thermo Scientific</td> 172958 <td></td></tr><tr><td>60 mm&nbsp; &nbsp;</td><td>Corning</td><td>3260</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polipropylenowa płytka głębinowa</td><td>Denville Scientific</td><td>P9639</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowe probówki okrągłodenne z nasadką sitkową&nbsp;</td>Wirówka do <td>352235</td><td></td> <td>BD Biosciences</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer MINI</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL System automatycznego obrazowania komórek</td><td>Technologie życia</td><td>AMAFD1000</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Separator MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe okrągłe</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>72195-15</td><td></td></tr></tbody></table>

ulepszone wytwarzanie indukowanych kardiomiocytów przy użyciu konstruktu politronicznego wyrażającego optymalny stosunek gata4, mef2c i tbx5

Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5

Bezpośrednia konwersja fibroblastów serca (CF) w indukowane kardiomiocyty (iCMs) ma ogromny potencjał dla medycyny regeneracyjnej, oferując alternatywne strategie leczenia chorób serca. Konwersja ta została osiągnięta przez wymuszoną ekspresję zdefiniowanych czynników, takich jak Gata4 (G), Mef2c (M) i Tbx5 (T). Tradycyjnie, iCM są generowane przez koktajl wirusów wyrażających te poszczególne czynniki. Jednak skuteczność przeprogramowania jest stosunkowo niska, a większość fibroblastów transdukowanych in vitro G,M i T nie ulega pełnemu przeprogramowaniu, co utrudnia badanie mechanizmów przeprogramowywania. Niedawno wykazaliśmy, że stechiometria G,M,T ma kluczowe znaczenie dla skutecznego przeprogramowania iCM. Optymalna stechiometria G,M,T ze względnie wysokim poziomem M i niskimi poziomami G i T osiągnięta dzięki zastosowaniu naszego policistronicznego wektora MGT (zwanego dalej MGT) znacznie zwiększyła wydajność przeprogramowania i poprawiła jakość iCM in vitro. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis metodologii zastosowanej do generowania iCM za pomocą konstruktu MGT z fibroblastów serca. Izolacja fibroblastów serca, generowanie wirusa do przeprogramowania i ocena procesu przeprogramowania są również uwzględnione, aby zapewnić platformę do wydajnego i powtarzalnego generowania iCM.

Etapy przeprogramowania zostały podsumowane na schemacie w Rysunku 1. Po transdukcji MGT ekspresję GFP w przeprogramowanych komórkach można wykryć już w 3. dniu. Selekcja puromycyną komórek transdukowanych rozpoczyna się w 3. dniu i jest kontynuowana przez pierwsze dwa tygodnie, jeśli użyto konstruktu pMx-puro-MGT. Między 10. a 14. dniem ekspresję markerów kardiologicznych, takich jak cTnT i αActinin, można wykryć zarówno za pomocą ICC (Rysunek 2B, krok 5), jak i FACS (Rysunek 2A...

Opisujemy tutaj protokół generowania iCM za pomocą retrowirusowego dostarczania Gata4, Tbx5 i Mef2c w konstrukcji policistronicznej. Protokół ten daje stosunkowo jednorodną populację przeprogramowanych komórek o zwiększonej wydajności i jakości, co jest cenne dla przyszłych badań nad przeprogramowaniem iCM.

Ulepszone wytwarzanie indukowanych kardiomiocytów przy użyciu konstruktu politronicznego wyrażającego optymalny stosunek Gata4, Mef2c i Tbx5

Direct conversion of cardiac fibroblasts (CFs) into induced cardiomyocytes (iCMs) holds great potential for regenerative medicine by offering alternative ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zademonstrowanie, jak efektywnie generować indukowane kardiomiocyty z fibroblastów serca przy użyciu polikistronowej konstrukcji MGT, wyrażającej optymalny stosunek gata4, Gata4, Mef2c i Tbx5. Metoda ta stanowi cenną platformę do badań nad indukowanymi kardiomiocytami i ułatwi wysokoprzepustowe przesiewanie oraz badania mechanistyczne programowania indukowanych kardiomiocytów, przybliżając jednocześnie tę dziedzinę do zastosowań klinicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że przy użyciu tylko jednej konstrukcji retrowirusowej fibroblasty serca mogą zostać efektywnie przekształcone w kardiomiocyty.Oczyścić noworodka transgenicznej myszy z GFP w łańcuchu ciężkim alfa-miozyny za pomocą 75% objętościowo etanolu i przeprowadzić eutanazję. Następnie otworzyć jamę ciała, wykonując poziome nacięcie od jednej pachy do drugiej za pomocą sterylnej, tępej i zagiętej pęsety.Wypreparuj serce i umieść je w jednym dołku płytki 24-dołkowej zawierającej lód. W zimnym PBS obserwuj ekspresję GFP w całym sercu przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Za pomocą sterylnej pęsety i nożyczek przenieś od trzech do czterech serc wykazujących ekspresję GFP do 60-milimetrowej szalki hodowlanej z centralnym dołkiem, a następnie posiekaj serca na małe kawałki o rozmiarze mniejszym niż 1 mm³.Przenieść posiekane serca do naczynia o średnicy 10 cm i przykryć dwiema mililitrami pożywki fiberblast lub FB. Pozostawić płytki w spokoju przez co najmniej trzy godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Po inkubacji powoli dodać osiem mililitrów podgrzanej pożywki FB do naczynia zawierającego posiekaną tkankę serca.Następnie inkubować tkankę niezakłócając jej stanu, z wyjątkiem wymiany pożywki co trzy dni. Siódmego dnia odessać pożywkę hodowlaną i przemyć komórki DPBS. Do każdej płytki dodać trzy mililitry 0,05% tripsyny w EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez pięć minut.Dodaj pięć mililitrów pożywki FB, aby zneutralizować trypsynę, a następnie delikatnie odklej komórki za pomocą skrobaka do komórek. Następnie zbierz komórki i przefiltruj je przez sitka komórkowe o oczkach 40 µm, aby uniknąć zanieczyszczenia fragmentami tkanki serca. Zwiruj komórki w celu otrzymania osadu przy 200 ×g przez pięć minut, rozpoczynając od wyizolowanych serc noworodków myszy.Każde serce należy przekroić na cztery części, zachowując luźne połączenie między nimi. Serca należy przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 8 ml ciepłego 0,05% tripsyny z EDTA i inkubować w temperaturze 37°C przez 15 minut. Po inkubacji należy odpiąć tripsynę z EDTA i dodać 5 ml ciepłej kolagenazy typu II, wymieszać na wirówce typu vortex przez jedną minutę z umiarkowaną prędkością, a następnie inkubować probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez trzy do pięciu minut.Następnie ponownie wierzchołkuj probówkę przez jedną minutę. Pozostaw fragmenty tkanki do osadzenia się, a nadsącz zbierz do nowej probówki zawierającej 5 mL zimnej pożywki FB. Do fragmentów tkanki dodaj 5 mL świeżej kolagenazy typu dwa i powtórz etapy wierzchołkowania oraz inkubacji.Połączyć wszystkie nadnadstąpienia zawierające komórki, filtrując je przez sitko komórkowe o oczkach 40 µm. Odwirować komórki z prędkością 200 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Następnie zastosować jedną z metod izolacji fibroblastów serca.Przemyj końcowy osad komórkowy jednokrotnie w 10 ml buforu do magnetycznego sortowania komórek (MACS) lub buforu Max. Pobierz 10 µl do liczenia żywych komórek, a pozostałe komórki odwiruj z prędkością 200 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C (w przypadku liczby komórek mniejszej niż 1 × 10⁷). Resuspenduj osad komórkowy w 10 µl skoniugowanych magnetycznych mikrokulek Thigh 1.2 w 90 µl schłodzonego buforu Max i wymieszaj.Kuleczki inkubujemy w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Aby zgranulować komórki, należy dodać 10 mL buforu max i odwirować próbki z prędkością 200 ×g przez pięć minut. Próbki przemywamy raz 10 mL buforu max, a następnie w dygestorium do hodowli komórkowej resuspenderujemy osad komórkowy do całkowitej objętości 2 mL.Przygotuj separator max i dodaj kolumnę LS. Zrównoważ kolumnę, przepuszczając przez nią 3 mL buforu max. Przepuść zawiesinę komórkową przez kolumnę LS i przemyj ją trzykrotnie 2 mL buforu max.Następnie należy wyjąć kolumnę LS z separatora i przeprowadzić trzy elucje za pomocą dwóch mililitrów buforu max. Eluat (EIT) należy zebrać do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Następnie EIT należy wirować z prędkością 200 ×g przez pięć minut.Resuspender wyizolowane fibroblasty w 10 mililitrach medium FB i policzyć komórki, a następnie wysiać je w odpowiednich zagęszczeniach do płytek tkankowych w 24-dołkowej płytce uprzednio pokrytej żelatyną w celu przeprogramowania fibroblastów serca. Do każdego dołka 24-dołkowej płytki z wysianymi komórkami dodać 500 mikrolitrów medium do indukowanych kardiomiocytów (ICM) zawierającego poly brain. Do każdego dołka z wyizolowanymi fibroblastami dodać 10 mikrolitrów retrowirusa.Inkubować płytkę z cząsteczkami retrowirusowymi przez 24 do 48 godzin w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnie zastąpić pożywkę zawierającą wirusa 500 µL świeżej pożywki ICM, wymieniając pożywkę co dwa do trzech dni. Rozpocząć selekcję pozytywną komórek przetransdukowanych wirusem poprzez uzupełnienie pożywki ICM o purmycynę w stężeniu 2 µg/mL.Po trzech dniach selekcji należy zmienić medium na dawkę podtrzymującą purmycyny w stężeniu 1 µg/mL, aby zwizualizować konwersję fibroblastów serca w kardiomiocyty. Płytki poddane selekcji purmycyną należy obserwować pod kątem ekspresji GFP za pomocą mikroskopu odwróconego. Ostatecznie, 14 dni po traktowaniu wirusowym, należy zastąpić medium ICM suplementem B 27.Ogniska komórek wykazujących spontaniczne bicie mogą pojawić się od trzeciego do czwartego tygodnia po ekspresji markerów kardiologicznych indukowanej transdukcją wirusową, w tym troponiny T serca oraz alfa-aktyniny. Ekspresja alfa-aktyniny może zostać wykryta za pomocą immunohistochemii między 10. a 14. dniem. Tutaj widoczna jest ekspresja troponiny T serca w iCMs przekształconych z fibroblastów, które wykazują ekspresję GFP; tutaj można zobaczyć ekspresję alfa-aktyniny w iCMs.Analiza metodą cytometrii przepływowej wykazuje podobne wzrosty ekspresji troponiny T serca, szczególnie po selekcji indukowanych kardiomiocytów za pomocą puromycyny. Opisana tutaj metodologia umożliwia efektywne generowanie indukowanych kardiomiocytów w oparciu o retrowiralną dostawę czynników transkrypcyjnych NGT w pojedynczym konstrukcie.

improved-generation-induced-cardiomyocytes-using-polycistronic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Generowanie wyrównanej tkanki mięśnia sercowego jest kluczowym wymogiem dla dostosowania najnowszych osiągnięć w biologii komórek macierzystych do klinicznie użytecznych celów. W tym artykule opisujemy podejście do druku mikrokontaktowego w celu precyzyjnej kontroli kształtu i funkcji komórki. Korzystając z wysoce oczyszczonych populacji embrionalnych komórek progenitorowych serca pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych, generujemy anizotropową funkcjonalną tkankę mięśnia sercowego.

Generowanie wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego poprzez drukowanie mikrokontaktowe

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Ten protokół opisuje, jak wytworzyć funkcjonalną tkankę węzłową zatok z mysich pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC). Nadekspresja T-Box3 (TBX3) oraz dobór antybiotyków promotora miozyny o ciężkim łańcuchu (Myh6) prowadzi do wysoce czystych agregatów komórek rozrusznika serca. Te "indukowane ciała zatokowo-przedsionkowe" ("iSAB") zawierają ponad 80% komórek rozrusznika serca, wykazują znacznie zwiększoną szybkość bicia i są w stanie nadawać tempo mięśnia sercowego ex vivo.

Generowanie agregatów komórek mysiego rozrusznika serca w oparciu o programowanie komórek ES w połączeniu z selekcją promotora Myh6

Ten manuskrypt opisuje krok po kroku protokół generowania i kwantyfikacji różnych przeprogramowanych podtypów serca przy użyciu retrowirusowego dostarczania Gata4, Hand2, Mef2c i Tbx5 za pośrednictwem retrowirusa.

Ocena podtypów kardiomiocytów po przeprogramowaniu fibroblastów embrionalnych myszy za pośrednictwem czynnika transkrypcyjnego

Tutaj prezentujemy solidną metodę przeprogramowania pierwotnych fibroblastów embrionalnych w funkcjonalne kardiomiocyty poprzez nadekspresję GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 i miR-133 (GHMT2m) wraz z hamowaniem sygnalizacji TGF-β. Nasz protokół generuje bicie kardiomiocytów już po 7 dniach od transdukcji z wydajnością do 60%.

Tłumienie sygnalizacji pro-fibrotycznej nasila przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy w indukowane kardiomiocyty za pośrednictwem czynników

Tutaj opisujemy skalowalną metodę, wykorzystującą prostą kombinację Activiny A i nadekspresji Id1 za pośrednictwem lentiwirusa, do generowania pierwszych komórek progenitorowych serca podobnych do pola serca i kardiomiocytów komorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Generacja pierwszych sercopodobnych progenitorów serca i kardiomiocytów komorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół treningu populacji komórek za pomocą bodźców elektrycznych i mechanicznych naśladujących fizjologię serca. Ta elektromechaniczna stymulacja zwiększa potencjał kardiomiogenny leczonych komórek i jest obiecującą strategią dla dalszej terapii komórkowej, modelowania choroby i badań przesiewowych leków.

Jednoczesna stymulacja elektryczna i mechaniczna w celu zwiększenia potencjału kardiomiogennego komórek

Celem tej metody jest generowanie in vitro komórek progenitorowych serca specyficznych dla pola serca w celu zbadania specyfikacji komórek progenitorowych i właściwości funkcjonalnych, a także generowanie komórek serca specyficznych dla komory do modelowania chorób serca.

Wytwarzanie in vitro komórek progenitorowych serca specyficznych dla pola serca

Opisujemy tutaj, założenie i zastosowanie mysiej linii reporterowej Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (określanej poniżej jako αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) do oceny przeprogramowania serca. Noworodkowe fibroblasty serca (NCF) wyizolowane ze szczepu myszy są przekształcane w indukowane kardiomiocyty (iCM), co pozwala na wygodną i efektywną ocenę skuteczności przeprogramowania i funkcjonalnego dojrzewania iCM poprzez strumień wapnia (Ca2+).

Ocena in vitro przeprogramowania serca poprzez pomiar specyficznego dla serca strumienia wapnia za pomocą reportera GCaMP3

Ten protokół przedstawia szczegółowe ramy metodologiczne dla opartej na elektroporacji transgenezy komórek serca w rozwijających się sercach myszy. Udostępnione tutaj materiały wideo ułatwią naukę tej wszechstronnej techniki.

Skuteczne podejście do transgenezy w dostarczaniu genów w embrionalnym sercu myszy

Poznaj metodę generowania indukowanych kardiomiocytów z fibroblastów sercowych myszy przy użyciu konstruktu politronicznego zawierającego czynniki transkrypcyjne Gata4, Mef2c i Tbx5.

Ulepszone wytwarzanie indukowanych kardiomiocytów przy użyciu konstruktu politronicznego wyrażającego optymalny stosunek Gata4, Mef2c i Tbx5 (Wideo) | JoVE Journal

Ulepszone wytwarzanie indukowanych kardiomiocytów przy użyciu konstruktu politronicznego wyrażającego optymalny stosunek Gata4, Mef2c i Tbx5

Przeglądaj więcej filmów