Ulepszone wytwarzanie indukowanych kardiomiocytów przy użyciu konstruktu politronicznego wyrażającego optymalny stosunek Gata4, Mef2c i Tbx5

Ogólnym celem tego protokołu jest pokazanie, jak skutecznie generować indukowane kardiomiocyty z fibroblastów serca za pomocą policyonicznego konstruktu MGT, wyrażającego optymalny stosunek gata cztery, F dwa C i TBX pięć. Metoda ta stanowi cenną platformę do badań nad indukowanymi kardiomiocytami i ułatwi badania kliniczne indukowanego programowania kardiomiocytów poprzez badania przesiewowe i mechanistyczne, jednocześnie przesuwając tę dziedzinę w kierunku zastosowań klinicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że przy użyciu tylko jednego konstruktu retrowirusowego, fibroblasty serca mogą być skutecznie przekształcane w kardiomiocyty.

Oczyść noworodkową transgeniczną mysz transgeniczną GFP o ciężkim łańcuchu alfa o objętości 75%. Etanol przeprowadza eutanazję. Następnie otwórz jamę ciała, wykonując poziome nacięcie od jednej pachy do drugiej za pomocą sterylnych, i zgiętych kleszczy.

Wytnij serce i umieść je w jednym dołku z 24-dołkowej płytki zawierającej lód. Zimny PBS obserwuje ekspresję GFP w całym sercu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Umieść trzy do 4G FP dodatnie serca w 60-milimetrowym naczyniu do hodowli studzienek środkowych za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek, zmiel serca na małe kawałki mniejsze niż jeden milimetr sześcienny.

Przełóż zmielone serca do 10-centymetrowego naczynia i przykryj dwoma mililitrami podłoża fiberblast lub FB. Pozostaw płytki w spokoju przez co najmniej trzy godziny w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji powoli dodaj osiem mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki FB do naczynia zawierającego mieloną tkankę serca.

Następnie inkubuj tkankę bez zakłóceń, z wyjątkiem zmiany pożywki co trzy dni. W siódmym dniu odessać pożywkę hodowlaną i przemyć komórki DPBS. Dodaj trzy mililitry 0,05% płynów EDTA do każdej płytki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Dodaj pięć mililitrów pożywki FB, aby dezaktywować trypsynę, a następnie delikatnie odłącz komórki za pomocą skrobaka do komórek. Następnie zbierz komórki i przefiltruj przez sitka do komórek o średnicy 40 mikronów, aby uniknąć zanieczyszczenia fragmentami tkanki serca. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 200 razy G przez pięć minut, zaczynając od izolowanych serc noworodków myszy.

Pokrój każde serce na cztery części, które są nadal luźno połączone. Przenieś serca do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej osiem mililitrów ciepłej 0,05% tripsin EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po inkubacji odrzuć tripyny w EDTA i dodaj pięć mililitrów ciepłego wiru kolagenazy typu drugiego przez jedną minutę ze średnią prędkością, a następnie inkubuj probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu minut.

Następnie ponownie wiruj rurkę przez jedną minutę. Pozwól, aby kawałki tkanki opadły i zbierz supernatant do nowej probówki zawierającej pięć mililitrów zimnego podłoża FB. Dodaj pięć mililitrów świeżej kolagenazy typu drugiego do kawałków tkanek i powtórz etapy wirowania i inkubacji.

Połącz wszystkie komórki zawierające supernatanty, filtrując je przez sitko do komórek o wielkości 40 mikronów. Odwiruj te komórki w temperaturze 200 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Stosując dowolną metodę izolacji fibroblastów serca.

Umyj końcową osadkę komórkową jednorazowo w 10 mililitrach aktywowanego magnetycznie sortowania komórek lub maksymalnego buforu. Usunąć 10 mikrolitrów do liczenia żywych komórek i odwirować pozostałe komórki w temperaturze 200 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez mniej niż jeden razy 10 do siódmej komórki. Zawiesić osad komórkowy z 10 mikrolitrami 1,2 sprzężonych mikrokulek magnetycznych uda w 90 mikrolitrach schłodzonego buforu max i wymieszać.

Dobrze inkubuj koraliki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Aby zagnieździć komórki, dodaj 10 mililitrów maksymalnego buforu i odwiruj próbki w temperaturze 200 razy G przez pięć minut. Przemyć raz 10 mililitrami maksymalnego buforu i ponownie zawiesić osad komórkowy w łącznej objętości dwóch mililitrów w kapturze do hodowli komórkowych.

Ustaw maksymalny separator i dodaj kolumnę LS. Zrównoważyć kolumnę trzema mililitrami maksymalnego buforu. Przepuścić zawiesinę komórek przez kolumnę LS i przemyć trzykrotnie dwoma mililitrami maksymalnego buforu.

Następnie wyjmij kolumnę LS z separatora i wymyj trzykrotnie dwoma mililitrami maksymalnego buforu. Zbieranie EIT w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Odwirować EIT w temperaturze 200 razy G przez pięć minut.

Ponownie zawiesić izolowane fibroblasty w 10 mililitrach pożywki FB i policzyć komórki, wysiać komórki do naczyń do hodowli tkankowych o odpowiedniej gęstości na żelatynowej wstępnie zakodowanej 24-dołkowej płytce w celu przeprogramowania fibroblastów serca. Dodać 500 mikrolitrów indukowanej pożywki kardiomiocytów lub ICM zawierającej poli mózg do każdej studzienki z 24 dołków osadzonych z komórkami. Dodaj 10 mikrolitrów retrowirusa do każdej studzienki izolowanych fibroblastów.

Inkubować płytkę z cząstkami retrowirusowymi przez 24 do 48 godzin w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnie zastąp pożywkę zawierającą wirusa 500 mikrolitrami świeżej pożywki ICM, zmieniając pożywkę co dwa do trzech dni. Rozpocznij pozytywną selekcję komórek transdukowanych wirusem, uzupełniając pożywkę ICM dwoma mikrogramami na mililitr pur mycyny.

Po trzech dniach selekcji zmień pożywkę na dawkę podtrzymującą jednego mikrograma na mililitr pur mycyny, aby uwidocznić konwersję fibroblastów serca do kardiomiocytów. Obserwować wybrane płytki pur mycyny pod kątem ekspresji GFP za pomocą mikroskopu odwróconego. Na koniec, 14 dni po leczeniu wirusem, zastąp pożywkę ICM witaminą B 27.

Średnie spontaniczne bicie loci komórek może pojawić się po trzech do czterech tygodniach od ekspresji markerów sercowych w wyniku transdukcji wirusa, w tym troponiny sercowej t i alfa. Aktininę można wykryć za pomocą immunochemii w dniach od 10 do 14. Tutaj ekspresję troponiny sercowej T obserwuje się w I CMS przekształconym z fibroblastów, które wyrażają ekspresję alfa-aktyniny GFP w ICM.

Analiza za pomocą cytometrii przepływowej wykazuje podobny wzrost ekspresji troponiny T w sercu, zwłaszcza po selekcji indukowanych kardiomiocytów metodą pur mycyny. Opisana tu mitologia pozwala na efektywne generowanie indukowanych kardiomiocytów w oparciu o retrowirusowe dostarczanie czynników transkrypcyjnych NGT w jednym konstrukcie.