Name: Oczyszczanie i ponowne fałdowanie do włókienek amyloidowych rekombinowanego białka Shadoo znakowanego znakowanym 6 ekspresji jako ciała inkluzyjne w E. coli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania białka Shadoo z ciał inkluzyjnych E. coli i jego ponownego fałdowania do włókienek amyloidowych. Technika ta umożliwia badanie zaburzeń konformacyjnych białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Natalie Doude i Davidowi Westerwayowi (University of Alberta) za dostarczenie nam Sho cDNA, Christophe'a Chevaliera (INRA) za budowę plazmidu, Michela Brémonta (INRA) za dostarczenie nam bakterii BL21Sol; Christine Longin (INRA) za pomoc w TEM oraz Edith Pajot-Augy (INRA) za komentarze i korektę.

1. Generowanie plazmidu i ekspresja Shadoo
Uwaga: Gen kodujący mysie białko Shadoo (Shadoo25-122) został podklonowany do wektora ekspresyjnego pET-28 11. Klon ten wprowadzono do szczepu bakteryjnego E. coli SoluBL21 w celu ekspresji białka Shadoo z N-końcowym tagiem heksahistydynowym (HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG), zgodnie z wcześniejszym opisem 11. Plazmid można zamówić od autorów. Masa cząsteczkowa Shadoo obliczona na podstawie sekwencji aminokwasowej wynosi 12 243,2 Da.
Uwaga: Wszystkie manipulacje z bakteriami należy przeprowadzać pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza lub w pobliżu palnika Bunsena.
<ol>
	<li>Przeprowadź transformację kompetentnych bakterii SoluBL21 plazmidem pET-28-His6-Shadoo, stosując standardowy protokół szoku termicznego. Wymieszaj od 1 do 5 µl plazmidu (zazwyczaj od 10 pg do 100 ng) z 50 µl zawiesiny bakterii w probówce. Wykonaj szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 45 s.</li>
	<li>Hoduj transformowane bakterie w temperaturze 37 °C do osiągnięcia A600 na poziomie 0,5-0,7 w medium Luria-Bertani uzupełnionym o 40 mg/ml kanamycyny (Rysunek 1B).</li>
	<li>Indukuj ekspresję białka Shadoo przez noc (O/N), dodając do hodowli 240 µg/ml izopropyl-β-D-tiogalaktopiranozydu (ITPG). Hoduj bakterie przy wstrząsaniu z prędkością 150 rpm w temperaturze 37 °C. Uwaga: Zazwyczaj hodowla bakteryjna osiąga A600 równą 3 po całej nocy. 
		Uwaga: Transformowane bakterie można przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej produkcji białka. W tym celu do aliquotów hodowli bakteryjnej dodaj 10%-50% (v/v) sterylnego glicerolu i zamroź je w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
<img alt="Schemat klonowania białka Shadoo: transformacja genu, hodowla bakteryjna, proces ekspresji." src="/files/ftp_upload/53432/53432fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
	Rysunek 1. Schemat konstruktu ekspresyjnego Shadoo, transformacji bakterii i indukcji ekspresji Shadoo (zgodnie z opisem w kroku 1). (A) Konstrukt ekspresyjny dla Shadoo koduje znacznik heksahistydynowy połączony z N-końcem białka, Nt. Schemat przedstawia, że białko Shadoo zawiera zasadowe powtórzenia argininy/glicyny (zielony cylinder), domenę hydrofobową (HD) oraz pojedynczą stronę N-glikozylacji (CHO), a następnie C-koniec (Ct). (B) Plazmid pET-28-His6-Shadoo jest transformowany do bakterii SoluBL21 metodą szoku termicznego przez 45 sec w 42 °C. Transformowane bakterie są wysiewane na selektywny agar zawierający 40 µg/ml kanamycyny. Pojedyncza kolonia z płytki jest wykorzystywana do zaszczepienia hodowli w kolbie wytrząsowej o pojemności 1,000-3,000 ml. Ekspresja białka rekombinowanego jest indukowana 1 mM IPTG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
2. Oczyszczanie białka Shadoo za pomocą niskociśnieniowej chromatografii cieczowej (LPLC)
<ol>
	<li>Liza komórek i przygotowanie ciałek inkluzyjnych
		<ol>
			<li>Zebrać zawiesinę bakteryjną i przenieść ją do probówek do wirowania (Rysunek 2).</li>
			<li>Wirować przy 2,500 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C. Usunąć nadsącz przez zlanie i resuspender osad w 15 ml buforu (50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8 z koktajlem antyproteazowym) dla każdego osadu pochodzącego z 500 ml hodowli komórkowej. 
				Uwaga: Resuspenderowane osady można zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka dni. Zamrażanie ułatwia lizę komórek bakteryjnych.</li>
			<li>Sprawdzić nadekspresję białka rekombinowanego w surowych osadach bakteryjnych za pomocą analizy SDS-PAGE i barwienia Coomassie.
				<ol>
					<li>W tym celu odwirować 1 ml hodowli bakteryjnej, aby uzyskać osad komórek. Do osadu dodać 100 µl roztworu denaturującego Laemmli (277.8 mM Tris-HCl, pH 6.8, 4.4% SDS, 44.4% w/v glicerolu, 0.02% błękitu bromofenolowego) i podgrzać w temperaturze 100 °C przez 5 min.</li>
					<li>Nanieść 10 µl próbki na żel akryloamidowy 12%, przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE i zwizualizować rozdzielone białka poprzez barwienie Coomassie.</li>
				</ol>
			</li>
			<li>Do całkowicie resuspenderowanego osadu z etapu 2.1.2) dodać Triton X-100 do stężenia końcowego 0.5%.</li>
			<li>Inkubować zawiesinę w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 min.</li>
			<li>Sonikować zawiesinę przez 5 min przy amplitudzie szczyt-szczyt 6-12 mikronów w lodowatej wodzie, aby przeprowadzić lizę komórek bakteryjnych.</li>
			<li>Przenieść sonikowaną zawiesinę do czystych probówek do wirowania o pojemności 50 ml.</li>
			<li>Wirować probówki przy 15,000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Usunąć nadsącz przez zlanie i dodać 5 ml buforu wiążącego (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.5 M NaCl, 8 M mocznika, 5 mM imidazolu) do każdej probówki.</li>
			<li>Umieścić probówki na rotatorze na noc (O/N), aby całkowicie resuspenderować białka z ciałek inkluzyjnych.</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat ekstrakcji białek bakteryjnych; wirowanie, inkubacja, sonikacja; analiza SDS-PAGE." src="/files/ftp_upload/53432/53432fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
	Rycina 2. Schemat oczyszczania ciał inkluzyjnych (zgodnie z opisem w kroku 2.1). Ztransformowane bakterie ekspresyjne Shadoo są zbierane przez wirowanie i resuspenderowane w buforze do lizy. Zawiesinę inkubuje się w temperaturze 37 °C przez 30 min, a następnie poddaje sonikacji w celu mechanicznego rozbicia komórek bakteryjnych. Sonikację przeprowadza się na lodzie, aby zapobiec nagrzewaniu się próbki. Rozbite komórki są zbierane przez wirowanie i resuspenderowane w buforze zawierającym 8 M mocznika w celu solubilizacji białek z ciał inkluzyjnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig2highres.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<ol start="2">
	<li>Chromatografia powinowactwa do Ni2+ 
		Uwaga: Chromatografię przeprowadza się na systemie FPLC przy użyciu kolumny chelatującej Sepharose 5 ml naładowanej Ni2+ (Rycina 3A). Wszystkie roztwory są nakładane na kolumnę z szybkością przepływu 1 ml/min.
		<ol>
			<li>Wstrzyknąć 10 ml wodnego roztworu 0,2 M NiSO4 do kolumny Sepharose w celu naładowania jej jonami Ni2+.</li>
			<li>Urównoważyć kolumnę naładowaną jonami Ni2+ poprzez wstrzyknięcie 30-50 ml buforu wiążącego o niskim stężeniu imidazolu (bufor 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M mocznika, 5 mM imidazolu).</li>
			<li>Nakładać białka rozpuszczone w moczniku, używając pętli wtryskowej o pojemności 50 ml.</li>
			<li>Odzyskać frakcję przepływową, dokładnie przemywając kolumnę 10 ml buforu wiążącego z niskim stężeniem imidazolu (bufor 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M mocznika, 5 mM imidazolu), aby usunąć z kolumny maksymalną ilość niewiązących białek.</li>
			<li>Przemyć kolumnę 50-100 ml buforu płuczącego (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M mocznika, 80 mM imidazolu), aby eluować białka nieswoiście związane z kolumną.</li>
			<li>Zastosować 15-minutowy gradient liniowy imidazolu od 80-800 mM w buforze zawierającym 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M mocznika. Podczas stosowania gradientu zbierać frakcje o objętości 1 ml. Uwaga: Białka z tagiem His są eluowane gradientem buforu zawierającego imidazol (pełniącego rolę kompetytora).</li>
			<li>Pobrać alikwot 8 µl z każdej frakcji i dodać 4 µl 4x roztworu denaturującego Laemmliego (patrz 2.1.3.1). Ogrzewać roztwory w temperaturze 100 °C przez 5 min.</li>
			<li>Nałożyć 10 µl markera wielkości białek i 10 µl każdej próbki na 12% żel akrylamidowy, przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE i zwizualizować rozdzielone białka poprzez barwienie Coomassie. Uwaga: Masa cząsteczkowa Shadoo obliczona na podstawie sekwencji aminokwasowej wynosi 12 243,2 Da.</li>
			<li>Połączyć wszystkie frakcje zawierające Shadoo.</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Trzystopniowe oczyszczanie białka przy użyciu kolumny Ni²⁺, chromatografii wykluczania molekularnego i odsolenia; wyniki SDS-PAGE." src="/files/ftp_upload/53432/53432fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
	Rycina 3. Procedura oczyszczania (opisana w krokach 2.2-2.4). (A) Jony Ni2+ mogą być koordynowane przez reszty histydyny, co umożliwia selektywne oczyszczanie białek z tagiem polihistydynowym. Imidazol jest wykorzystywany do elucji białka dzięki zdolności do koordynacji z jonem Ni2+ i wyparcia związanego białka. (B) Białka o różnym promieniu hydrodynamicznym, które zostały zatrzymane na kolumnie Ni2+, są rozdzielane na kolumnie do wykluczania molekularnego. Białka są eluowane od największych do najmniejszych. (C) Przed użyciem frakcje zawierające Shadoo są łączone i odsalane w celu usunięcia mocznika, imidazolu i soli. Badania kontroli jakości obejmują SDS-PAGE z barwieniem Coomassie oraz Western blotting. Oczyszczone białko Shadoo może zostać poddane liofilizacji. Liofilizowane Shadoo jest stabilne przez wiele miesięcy przy przechowywaniu w temperaturze -20 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="3">
	<li>Chromatografia wykluczania 
		Uwaga: Drugim etapem oczyszczania jest chromatografia wykluczania, która oddziela białko Shadoo od pozostałych białek współelowanych podczas pierwszego etapu oczyszczania (Rycina 3B).
		<ol>
			<li>Równoważyć kolumnę Superdex o całkowitej objętości złoża 120 ml poprzez wstrzyknięcie 250 ml buforu 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.5 M NaCl, 8 M Urea przy szybkości przepływu 1.5 ml/min.</li>
			<li>Nanieść połączone frakcje zawierające Shadoo z punktu 2.2.9 na zrównoważoną kolumnę. Zbierać frakcje o objętości 1 ml po osiągnięciu objętości martwej kolumny wynoszącej 40 ml, przy stałym przepływie powyższego buforu.</li>
			<li>Pobrać alikwot 10 µl z każdej frakcji i przeprowadzić analizę SDS-PAGE oraz barwienie Coomassie zgodnie z powyższym opisem, aby ustalić, które frakcje zawierają Shadoo.</li>
			<li>Połączyć frakcje zawierające Shadoo.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Odsalanie 
		Uwaga: Procedura odsalania usuwa sole, imidazol i mocznik w celu otrzymania rekombinowanego białka Shadoo w buforze odpowiednim do dalszych badań biofizycznych i biochemicznych (Rycina 3C). Taki sam rezultat można uzyskać poprzez dializę próbek przeciwko buforowi.
		<ol>
			<li>Równoważyć kolumnę do odsalania o objętości 53 ml za pomocą 150 ml buforu 10 mM octanu amonu, pH 5, przy szybkości przepływu 5 ml/min.</li>
			<li>Nanieść połączone frakcje Shadoo na kolumnę. Po wstrzyknięciu buforu octanu amonu ręcznie zbierać frakcje wykazujące wzrost sygnału przy 280 nm na wyjściu detektora UV.</li>
			<li>Liofilizować odsolone białko Shadoo i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
			<li>Przed użyciem rozpuścić liofilizowane białko Shadoo w odpowiednim buforze, np. w buforze 10 mM octanu sodu, pH 5. 
				Uwaga: Znacznik polihistydynowy można usunąć za pomocą enterokinazy.</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
3. In Vitro Montaż białka Shadoo w amyloidowe włókna w pH fizjologicznym
Uwaga: Białko Shadoo agreguje i spontanicznie tworzy włókna przy pH ≥ 7 11.
<img alt="Schemat agregacji białka z pH i Gdn-HCl, rozwijanie się w włókna amyloidowe w 37°C." src="/files/ftp_upload/53432/53432fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
	Rycina 4. Schemat refoldingu Shadoo do włókien amyloidowych (opisany w kroku 3). Oczyszczone Shadoo samoistnie przekształca się we włókna amyloidowe po rozpuszczeniu w buforze o pH ≥ 7. W roztworze kwasowym Shadoo przekształca się we włókna amyloidowe podczas inkubacji z 1 M Gdn-HCl przy wstrząsaniu. Analizy kontroli jakości obejmują mikroskopię elektronową i barwienie ThT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol>
	<li>Rozcieńczyć białko Shadoo do stężenia końcowego 2 µM w buforze Tris-HCl 20 mM o pH 7,4. Stężenie należy wyznaczyć poprzez pomiar gęstości optycznej roztworu przy 280 nm, wykorzystując współczynnik ekstynkcji wynoszący 20 970, wyliczony na podstawie składu aminokwasowego białka Shadoo.</li>
	<li>Inkubować 500 µl roztworu w stożkowatej probówce plastikowej w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni, aby umożliwić spontaniczną konwersję białka w struktury amyloidowe (Rycina 4).</li>
	<li>Do 100 µl alikwoty roztworu Shadoo dodać świeżo przygotowaną tioflawinę T (ThT) do stężenia końcowego 10 µM. Inkubować roztwór przez 5 min w temperaturze pokojowej. Zmierzyć emisję fluorescencji w zakresie od 460 do 520 nm przy długości fali wzbudzenia 435 nm, aby potwierdzić obecność struktur amyloidowych 17.</li>
</ol>
4. Montowanie Shadoo do włókien amyloidowych in vitro przy niskich wartościach pH
<ol>
	<li>Rozcieńczyć Shadoo w 1 M GdnHCl i buforze octanu sodu 20 mM, pH 5, do stężenia końcowego 2 µM.</li>
	<li>Inkubować 500 µl tego roztworu w probówce stożkowej przy ciągłym mieszaniu w temperaturze 37 °C przez 3-7 dni.</li>
	<li>Sprawdzić obecność włókien amyloidowych, dodając ThT do alikwotu roztworu zgodnie z opisem w punkcie 3.3.</li>
	<li>Dializować otrzymaną zawiesinę przeciwko buforowi octanu sodu 10 mM, pH 5,0, aby oczyścić włókna amyloidowe Shadoo.</li>
	<li>Przechowywać oczyszczone włókna w temperaturze +4 °C.</li>
</ol>
<img alt="Analiza SDS-PAGE, żele barwione Coomassie A, B, frakcjonowanie białek, wynik Western blot C." src="/files/ftp_upload/53432/53432fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
	Rycina 5. Reprezentatywne wyniki. Frakcje białek eluowane z kolumny chelatującej naładowanej Ni2+ (A) oraz kolumny do wykluczania rozmiarowego (B) przeanalizowano za pomocą SDS-PAGE i barwienia Coomassie. Identyfikację oczyszczonego białka Shadoo oceniono z użyciem przeciwciała anty-Shadoo SPRN (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<ol><li>Biasini, E., Turnbaugh, J. A., Unterberger, U., Harris, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+protein+at+the+crossroads+of+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Prion protein at the crossroads of physiology and disease.</a> Trends in Neurosciences. 35, 92-103 (2012).</li>
<li>Colby, D. W., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+generation+of+prion+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">De novo generation of prion strains.</a> Nature Reviews. Microbiology. 9, 771-777 (2011).</li>
<li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+functional+amyloid%2C+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, functional amyloid, and human disease.</a> Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).</li>
<li>Nelson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+cross-beta+spine+of+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils.</a> Nature. 435, 773-778 (2005).</li>
<li>Murphy, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+amyloid+formation+and+membrane+interaction+with+amyloidogenic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Kinetics of amyloid formation and membrane interaction with amyloidogenic proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1923-1934 (2007).</li>
<li>Steunou, S., Chich, J. F., Rezaei, H., Vidic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensing+of+lipid-prion+interactions%3A+insights+on+charge+effect%2C+Cu%28II%29-ions+binding+and+prion+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Biosensing of lipid-prion interactions: insights on charge effect, Cu(II)-ions binding and prion oligomerization.</a> Biosensors & Bioelectronics. 26, 1399-1406 (2010).</li>
<li>Watts, J. C., Westaway, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prion+protein+family%3A+diversity%2C+rivalry%2C+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The prion protein family: diversity, rivalry, and dysfunction.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1772, 654-672 (2007).</li>
<li>Westaway, D., Daude, N., Wohlgemuth, S., Harrison, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PrP-like+proteins+Shadoo+and+Doppel%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+Current+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The PrP-like proteins Shadoo and Doppel.</a> Topics in Current Chemistry. 305, 225-256 (2011).</li>
<li>Baillod, P., Garrec, J., Tavernelli, I., Rothlisberger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+versus+doppel+protein+misfolding%3A+new+insights+from+replica-exchange+molecular+dynamics+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Prion versus doppel protein misfolding: new insights from replica-exchange molecular dynamics simulations.</a> Biochemistry. 52, 8518-8526 (2013).</li>
<li>Daude, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+Shadoo+proteins+convert+to+amyloid-like+forms+under+native+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Wild-type Shadoo proteins convert to amyloid-like forms under native conditions.</a> Journal of Neurochemistry. 113, 92-104 (2010).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shadoo+binds+lipid+membranes+and+undergoes+aggregation+and+fibrillization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Shadoo binds lipid membranes and undergoes aggregation and fibrillization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 438, 519-525 (2013).</li>
<li>Watts, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CNS+glycoprotein+Shadoo+has+PrP%28C%29-like+protective+properties+and+displays+reduced+levels+in+prion+infections%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The CNS glycoprotein Shadoo has PrP(C)-like protective properties and displays reduced levels in prion infections.</a> The EMBO Journal. 26, 4038-4050 (2007).</li>
<li>Watts, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-resistant+prions+selectively+decrease+Shadoo+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Protease-resistant prions selectively decrease Shadoo protein.</a> PLoS Pathogens. 7, e1002382(2011).</li>
<li>Westaway, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+Shadoo+in+prion+infections+traces+a+pre-clinical+event+inversely+related+to+PrP%28Sc%29+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of Shadoo in prion infections traces a pre-clinical event inversely related to PrP(Sc) accumulation.</a> PLoS Pathogens. 7, e1002391(2011).</li>
<li>Chevalier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PB1-F2+influenza+A+virus+protein+adopts+a+beta-sheet+conformation+and+forms+amyloid+fibers+in+membrane+environments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">PB1-F2 influenza A virus protein adopts a beta-sheet conformation and forms amyloid fibers in membrane environments.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 13233-13243 (2010).</li>
<li>Tarus, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+paths+of+the+nucleoprotein+of+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Oligomerization paths of the nucleoprotein of influenza A virus.</a> Biochimie. 94, 776-785 (2012).</li>
<li>Biancalana, M., Koide, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+Thioflavin-T+binding+to+amyloid+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of Thioflavin-T binding to amyloid fibrils.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1804, 1405-1412 (2010).</li>
<li>Minic, J., Sautel, M., Salesse, R., Pajot-Augy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+system+as+a+screening+tool+for+pharmacological+assessment+of+g+protein+coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Yeast system as a screening tool for pharmacological assessment of g protein coupled receptors.</a> Current Medicinal Chemistry. 12, 961-969 (2005).</li>
<li>Schein, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cool+way+to+make+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A cool way to make proteins.</a> Nature Biotechnology. 22, 826-827 (2004).</li>
<li>Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+genetic+strategies+for+recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli.</a> Journal of Biotechnology. 115, 113-128 (2005).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+glycosylation+enhances+ubiquitin-mediated+proteasomal+degradation+of+Shadoo+in+Scrapie-infected+rodents+and+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Disruption of glycosylation enhances ubiquitin-mediated proteasomal degradation of Shadoo in Scrapie-infected rodents and cultured cells.</a> Molecular Neurobiology. 49, 1373-1384 (2014).</li>
<li>Englund, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+biosynthesis+of+glycosyl+phosphatidylinositol+protein+anchors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The structure and biosynthesis of glycosyl phosphatidylinositol protein anchors.</a> Annual Review of Biochemistry. 62, 121-138 (1993).</li>
<li>Puig, B., Altmeppen, H., Glatzel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GPI-anchoring+of+PrP%3A+implications+in+sorting+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">The GPI-anchoring of PrP: implications in sorting and pathogenesis.</a> Prion. 8, 11-18 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiono łatwy i skuteczny protokół zarówno do ekspresji, jak i oczyszczania dużej ilości rekombinowanego białka Shadoo myszy. Opisana metoda pozwala na pomyślne rozpuszczanie i oczyszczanie rekombinowanego białka Shadoo znakowanego (His6). Ważne jest, jak wskazano w tytule, że po ekspresji w bakterii prokariotycznej E. coli Shadoo gromadzi się w ciałach inkluzyjnych. Przed oczyszczeniem Shadoo, bakterie muszą zostać poddane lizie przez sonikację w buforze zawierającym Triton X-100. Następnie cia...

Choroby neurodegeneracyjne prionów, do których zalicza się gąbczastą encefalopatię bydła u bydła, trzęsawkę owiec i chorobę Creutzfeldta-Jakoba u ludzi, są śmiertelne i nieuleczalne. Choroby prionowe charakteryzują się zmianami konformacyjnymi komórkowego białka prionowego składającego się głównie z α-helis, w konformer amyloidowy wzbogacony β krzyżowo 1,2. Struktury krzyżowe β zawierają gęsto upakowane i wysoce uporządkowane warstwy β przypominające kryształy, stabilizowane wiązaniami wodorowymi 3,4. Amyloidy prionowe mogą się samoreplikować dzięki β-niciom na krawędzi wzrostu, które stanowią matrycę do rekrutacji i przekształcania monomerycznej jednostki białkowej.
Zgodnie z hipotezą "tylko białko", jedynym czynnikiem zakaźnym jest konformer amyloidu białka prionowego. Zaproponowano jednak, że niektóre inne biomolekuły są niezbędne w zaburzeniach prionowych. Na przykład uważa się, że błony komórkowe są miejscem, w którym zachodzi konwersja, a niektóre ujemnie naładowane lipidy usprawniają proces konwersji 5,6. Ponadto niektóre białka mogą być również zaangażowane w patologie prionowe. W szczególności istnieją dwaj inni członkowie rodziny białek prionowych: Doppel i Shadoo 7,8. Doppel ma stosunkowo sztywną strukturę stabilizowaną mostkami dwusiarczkowymi i nie ulega samopolimeryzacji i agregacji do włókienek amyloidowych 9. W przeciwieństwie do białka prionowego, Shadoo może przyjąć strukturę wzbogaconą o β arkusz i samoasocjować się w struktury fibryli amyloidowych. Wykazano, że Shadoo może migotać w warunkach natywnych lub po związaniu ujemnie naładowanych błon 10,11. Konwersja Shadoo do włókien podobnych do amyloidu może być związana z patologiami. Rzeczywiście, mechanizmy, za pomocą których struktury podobne do amyloidu powodują chorobę, są słabo poznane.
Shadoo posiada domenę hydrofobową (HD) i serię tandemowych powtórzeń Arg/Gly podobnych do N-końcowej części białka prionowego (Rysunek 1A). Jako N-końcowa część białka prionowego, Shadoo jest wysoce dodatnio naładowany i wydaje się być natywnie nieustrukturyzowanym białkiem 11,12. Shadoo wydaje się być funkcjonalnie związany z zaburzeniami prionowymi, ponieważ może bezpośrednio wiązać białko prionowe. Ponadto jego ekspresja jest regulowana w dół podczas patologii prionów 13,14. Jednak rola Shadoo w chorobie prionowej nie została jeszcze ustalona.
Opracowaliśmy plazmid przenoszący sekwencję kodującą mysi gen Shadoo. Plazmid został wykorzystany do transformacji E. coli do produkcji N-końcowego białka fuzyjnego His6 Shadoo. Ten system ekspresji jest dobrze przyjęty w naszym laboratorium i jest powszechnie stosowany w naszych bieżących projektach 6,15,16. Ważną kwestią dla ekspresji Shadoo jest wybór szczepu E. coli. Podczas gdy kompetentny szczep bakteryjny BL21 jest powszechnie stosowany do ekspresji rekombinowanych białek, Shadoo został z powodzeniem poddany ekspresji i oczyszczony tylko z przekształconego szczepu bakteryjnego SoluBL21. Kompetentna E. coli SoluBL21 jest ulepszonym mutantem szczepu gospodarza BL21 opracowanym do produkcji białek, których ekspresja w macierzystym BL21 nie dawała wykrywalnego rozpuszczalnego produktu. Wysoki poziom ekspresji Shadoo w SoluBL21 E. coli prowadzi do akumulacji białka w ciałach inkluzyjnych. Ogólnie rzecz biorąc, gdy nienatywne białko jest silnie eksprymowane w E. coli, białko to ma tendencję do gromadzenia się w nierozpuszczalnych ciałach inkluzyjnych. Shadoo prawdopodobnie agreguje się poprzez niekowalencyjne oddziaływania hydrofobowe lub jonowe (lub kombinację obu) do wysoce wzbogaconych dynamicznych struktur utworzonych przez białko pofałdowane w różnym stopniu. W związku z tym oczyszczanie składa się z co najmniej dwóch etapów: (i) selektywnego oddzielenia białka od innych biomolekuł w pożywce denaturacyjnej oraz (ii) renaturacji oczyszczonego białka przy użyciu technik fałdowania in vitro.
Selektywne oddzielenie Shadoo zostało osiągnięte w roztworze buforowym zawierającym 8M mocznik (lub alternatywnie 6M guanidyna-HCl). Usuwanie mocznika i renaturyzację białka można przeprowadzić poprzez zastosowanie różnych protokołów: (i) renaturyzacji w roztworze o kwaśnym pH w celu uzyskania nieustrukturyzowanego monomerycznego białka Shadoo lub (ii) renaturacji w roztworze o pH ≥ 7 w celu uzyskania Shadoo spolimeryzowanego w stabilne włókna amyloidowe z charakterystycznymi motywami β krzyżującymi się arkuszami.

<table><tbody><tr><td>AKTA FPLC&nbsp;</td><td>GE, Amersham</td><td># 1363</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1069-01</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap IMAC</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0920-05</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep26/10 Kolumna odsalająca</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-5087-01</td><td></td></tr><tr><td>SoluBL21 Kompetentny E. coli</td><td>Genlantis</td><td>C700200</td><td></td></tr><tr><td>pET-28b+</td><td>Novogen</td><td>69865-3</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>LB-Bulion</td><td>medium Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Biophotometar</td><td>Eppendorf</td><td>550507804</td><td></td></tr><tr><td>Trito X-100</td><td>Life Technologies</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>NiSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>656895</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES3098T</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy Tabletki koktajlowe</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Gdn-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>marker wielkości białka&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>26620</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie i ponowne fałdowanie do włókienek amyloidowych rekombinowanego białka shadoo znakowanego znakowanym 6 ekspresji jako ciała inkluzyjne w e. coli

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

System ekspresji Escherichia coli jest potężnym narzędziem do produkcji rekombinowanych białek eukariotycznych. Używamy go do produkcji Shadoo, białka należącego do rodziny prionów. Opisano chromatograficzną metodę oczyszczania rekombinowanego Shadoo znakowanego (Jego)6 wyrażonego jako ciała inkluzyjne. Ciała inkluzyjne rozpuszcza się w 8 M moczniku i wiąże z kolumną naładowaną Ni2+ w celu przeprowadzenia chromatografii powinowactwa jonowego. Związane białka są eluowane przez gradient imidazolu. Frakcje zawierające białko Shadoo poddawane są chromatografii wykluczania wielkości w celu uzyskania wysoko oczyszczonego białka. W ostatnim etapie oczyszczony Shadoo jest odsalany w celu usunięcia soli, mocznika i imidazolu. Rekombinowane białko Shadoo jest ważnym odczynnikiem do badań biofizycznych i biochemicznych zaburzeń konformacji białek występujących w chorobach prionowych. Wiele doniesień wykazało, że prionowe choroby neurodegeneracyjne powstają w wyniku odkładania się stabilnych, uporządkowanych włókienek amyloidowych. Przedstawiono przykładowe protokoły opisujące sposób migotania Shadoo na fibryle amyloidowe przy pH kwaśnym i obojętnym/zasadowym. Metody produkcji i fibrylacji Shadoo mogą ułatwić badania w laboratoriach zajmujących się chorobami prionowymi, ponieważ pozwalają na produkcję dużych ilości białka w szybki i tani sposób.

Z jednego litra hodowli bakteryjnej uzyskuje się około 5-10 mg oczyszczonego białka Shadoo. Aby otrzymać rekombinowane Shadoo o wysokiej czystości, konieczne jest dwuetapowe oczyszczanie. Pierwszy etap polega na chromatografii powinowactwa z użyciem kolumny naładowanej Ni2+, która zatrzymuje białka z etykietą His. Eluowane frakcje poddawane są elektroforezie SDS-PAGE i barwieniu błękitem Coomassie Brilliant Blue (Rycyna 5A). Frakcje zawierające białko Shadoo są łączone i dalej oczyszczane meto...

Opisana jest dwuetapowa metoda chromatograficzna oczyszczania rekombinowanego białka Shadoo wyrażonego jako ciała inkluzyjne w Escherichia coli, a także protokół migotania oczyszczonego Shadoo do struktur amyloidowych.

Oczyszczanie i ponowne fałdowanie do włókienek amyloidowych rekombinowanego białka Shadoo znakowanego znakowanym 6 ekspresji jako ciała inkluzyjne w E. coli

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest oczyszczenie rekombinowanego białka shadu, wyrażanego w postaci ciałek inkluzyjnych w Esia coli, oraz jego refolding do postaci włókien amyloidowych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie molekularnych mechanizmów zaburzeń konformacyjnych białek, takich jak te występujące w chorobach typu pre. Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania dużych ilości białka w sposób szybki i niskokosztowy. Aby przeprowadzić transformację kompetentnych bakterii solu BBL 21 plazmidem PET 28, his six SHADU, należy wymieszać od 10 do 100 pg plazmidu lub od 1 do 5 µL do 50 µL bakterii w probówce.Poddaj komórki szokowi termicznemu w temperaturze 42 °C przez 45 sekund. Dodaj pożywkę LB uzupełnioną o 40 mg/mL kanamycyny i inkubuj bakterie. Bakterie transformowane hoduj w temperaturze 37 °C, aż osiągną absorbancję od 0,5 do 0,7 przy 600 nm, następnie indukuj ekspresję, dodając 240 µg/mL IPTG i kontynuuj hodowlę.Bakterie inkubowano w temperaturze 37°C przy 150 RPM przez noc. Aby oczyścić białko, przenieś zawiesinę bakteryjną do probówek wirówkowych i wiruj przy 2 500 ×g w temperaturze 4°C przez 20 minut. Do resuspensji uż

purification-refolding-to-amyloid-fibrils-his-6-tagged-recombinant

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy opisujemy protokół oczyszczania wysoce aktywnego białka Hsp104, heksamerycznego białka AAA+ z drożdży, które sprzęga hydrolizę ATP z disagregacją białek. Schemat ten wykorzystuje konstrukt z oznakowaniem His6 do oczyszczania powinowactwa z E. coli, a następnie chromatografię wymiany anionowej, usunięcie znacznika His6 za pomocą proteazy TEV oraz chromatografię wykluczania cząsteczkowego.

Oczyszczanie Hsp104, białkowej dysagregazy

Opisano metodę wielkoskalowego oczyszczania wewnątrzkomórkowej domeny białka APP (AICD). Opisano również metodologię indukcji agregacji AICD in vitro oraz jej wizualizację za pomocą mikroskopii sił atomowych. Przedstawione metody są przydatne do biochemicznej i strukturalnej charakterystyki AICD oraz badania wpływu chaperonów molekularnych na jej agregację.

Oczyszczanie i agregacja domeny wewnątrzkomórkowej białka prekursorowego amyloidu

Białka mogą albo przyjąć natywną strukturę, albo nieprawidłowo sfałdować się w nierozpuszczalny amyloid. Warunki, które sprzyjają szlakowi nieprawidłowego fałdowania, prowadzą do powstawania różnych typów włókienek amyloidowych. Opisane tu metody pozwalają na szybką konwersję natywnych białek do amyloidu in vitro.

Szybkie wytwarzanie amyloidu z białek natywnych in vitro

β-beczkowate białka błony zewnętrznej (OMP) pełnią wiele funkcji w zewnętrznych błonach bakterii Gram-ujemnych, mitochondriów i chloroplastów. W tym miejscu mamy nadzieję złagodzić znane wąskie gardło w badaniach strukturalnych poprzez przedstawienie protokołów produkcji β-beczkowych OMP w ilościach wystarczających do określenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub spektroskopii NMR.

Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

Niniejszym opisujemy dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który daje peptydy amyloidu beta 42 (Aβ42) o wysokiej czystości i amyloidu beta 40 (Aβ40), zdolne do tworzenia oligomerów. Amyloid beta jest wysoce podatnym na agregację, hydrofobowym peptydem związanym z chorobą Alzheimera. Amyloidogenny charakter peptydu sprawia, że jego oczyszczanie jest wyzwaniem.

Dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który pozwala uzyskać peptydy amyloidu beta 42 i beta-amyloidu beta 40 o wysokiej czystości, zdolne do tworzenia oligomerów

Analizy biochemiczne i strukturalne glikozylowanych białek wymagają stosunkowo dużej ilości jednorodnych próbek. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę chemiczną specyficznej dla miejsca glikozylacji rekombinowanych białek oczyszczonych z bakterii poprzez celowanie w reaktywne tiole Cys.

Ukierunkowanie tioli cysteinowych na glikozylację białek rekombinowanych in vitro specyficzną dla miejsca

Przedstawiono procedurę ponownego fałdowania domeny wiążącej ligand peryplazmatyczny dCACHE chemoreceptora Campylobacter jejuni Tlp3 z ciał inkluzyjnych i oczyszczania w celu uzyskania miligramowych ilości białka.

Metoda skutecznego ponownego fałdowania i oczyszczania domeny wiążącej ligand chemoreceptora

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania enzymów pirofosfokinazy znakowanych histydyną i wykorzystanie chromatografii cienkowarstwowej radioznakowanych substratów i produktów do badania aktywności enzymatycznej in vitro. Test aktywności enzymatycznej ma szerokie zastosowanie do dowolnej kinazy, cyklazy nukleotydowej lub reakcji przenoszenia fosforu, której mechanizm obejmuje hydrolizę trifosforanu nukleotydów.

Test oczyszczania i aktywności in vitro dla syntetazy (p)ppGpp z Clostridium difficile

Ekspresja i oczyszczanie białek zawierających hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu jest opisane przykładami (ekspresja w E. coli, FPLC). Oczyszczone białka są używane do krystalizacji i produkcji przeciwciał oraz wykorzystywane do testów enzymatycznych. Przedstawiono wybrane testy fotometryczne w celu wykazania wielofunkcyjności FAHD1 jako dekarboksylazy szczawiooctanu i hydrolazy acylopirogronianowej.

Ekspresja, oczyszczanie, krystalizacja i oznaczanie enzymatyczne białek zawierających hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu

Ta metoda biochemicznego oczyszczania z analizą proteomiczną opartą na spektrometrii mas ułatwia solidną charakterystykę rdzeni włókienkowych amyloidu, co może przyspieszyć identyfikację celów zapobiegania chorobie Alzheimera.

Biochemiczne oczyszczanie i charakterystyka proteomiczna rdzeni fibryli amyloidowych z mózgu

Poznaj metodę oczyszczania białka Shadoo z ciał inkluzyjnych E. coli i jego ponownego fałdowania do włókienek amyloidowych. Technika ta umożliwia badanie zaburzeń konformacyjnych białek.

Oczyszczanie i ponowne fałdowanie do włókienek amyloidowych rekombinowanego białka Shadoo znakowanego znakowanym 6 ekspresji jako ciała inkluzyjne w E. coli (Wideo) | JoVE Journal

Oczyszczanie i ponowne fałdowanie do włókienek amyloidowych rekombinowanego białka Shadoo znakowanego znakowanym ₆ ekspresji jako ciała inkluzyjne w E. coli

Przeglądaj więcej filmów