Opracowanie immunochromatograficznego paska testowego na bazie złota koloidalnego do wykrywania mioglobiny waleni

Ogólnym celem tego koloidalnego złota testu immunochromatograficznego jest odróżnienie mioglobiny waleni od mioglobiny fok oraz innych zwierząt. Metoda ta umożliwia szybkie i doraźne badanie przesiewowe mięsa waleni, co pozwala na ograniczenie jego nielegalnego handlu i spożycia. Główną zaletą tej techniki jest możliwość zaobserwowania pozytywnego wyniku bezpośrednio od pięciu do dziesięciu minut po homogenizacji 03 gram mięśnia, przy zachowaniu wyjątkowej specyficzności i czułości.

W związku z tym metoda ta umożliwia szybkie wykrywanie mięsa waleni w warunkach terenowych. Może ona zostać zastosowana również do innych rodzajów mięsa, takich jak mięso końskie lub wieprzowe. W celu zaprojektowania syntetycznych peptydów do wytworzenia przeciwciał monoklonalnych wykazujących reaktywność wobec mioglobiny waleni, przeanalizowano sekwencje aminokwasowe antygenowych regionów reaktywnych mioglobiny u różnych zwierząt.

Rozpocznij od pobrania z GenBank sekwencji aminokwasowych mioglobiny z tuńczyka, kurczaka, strusia, ssaków udomowionych, foki oraz 18 gatunków waleni. Następnie dopasuj sekwencje, korzystając z odpowiedniego oprogramowania. Uruchom Alignment Explorer, wybierając opcję Align Edit/Build Alignment na pasku uruchamiania.

Wybierz polecenie Create New Alignment i kliknij OK. Pojawi się okno dialogowe z pytaniem, czy tworzone wyrównanie dotyczy sekwencji DNA czy białek? Kliknij przycisk Protein, wybierz Data Open Retrieve sequences from File, a następnie wybierz plik z sekwencjami. Wybierz polecenie Edit Select All z menu, aby zaznaczyć wszystkie pozycje dla każdej sekwencji w zbiorze danych w celu utworzenia wielosekwencyjnego wyrównania.

Z głównego menu wybierz Align Alignment Align by ClustalW. Jako macierz wag białek wybierz BLOSUM, a następnie kliknij przycisk OK. Trzecim krokiem jest analiza dopasowania sekwencji.

Skupiono się na pięciu antygenowych miejscach reaktywnych i wyszukano fragment konserwowany u waleni. Gwiazdka symbolizuje konsensus w dopasowaniu i wskazuje pozycję, w której znajduje się pojedynczy, w pełni konserwowany aminokwas. Znaleziono dwa fragmenty konserwowane u waleni.

Następnie syntetyzuje się fragmenty sekwencji kandydackich i wykorzystuje je do wytworzenia przeciwciał monoklonalnych. Procedurę tę należy rozpocząć od wyznaczenia optymalnego pH dla roztworu złota koloidalnego, zdefiniowanego jako minimalne pH, przy którym mieszanina przeciwciała monoklonalnego i roztworu złota koloidalnego zachowuje czerwony kolor przez dwie godziny. Do 100 µL roztworu złota koloidalnego o wartościach pH w zakresie od pięciu do dziewięciu należy dodać 0,15 µg oczyszczonego detekcyjnego przeciwciała monoklonalnego.

Na potrzeby niniejszej demonstracji przetestowano pH 6 oraz pH 8. W tym etapie optymalizacji pH 8 uznano za wartość optymalną. Następnie należy wyznaczyć optymalne stężenie przeciwciała monoklonalnego, dodając różne ilości oczyszczonego wykrywającego przeciwciała monoklonalnego do 100 µl roztworu złota koloidalnego przy pH 8.

Optymalne stężenie, które w niniejszym badaniu wynosi 6 µg/mL, pozwoli zachować czerwony kolor mieszaniny bez powstania czarnego osadu. W oparciu o wyniki etapów optymalizacji, należy dodać po kropli 60 µg oczyszczonego wykrywającego przeciwciała monoklonalnego do 10 mL roztworu złota koloidalnego. Mieszaninę należy delikatnie emulgować w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut.

Do mieszaniny dodać 2 mL 5% roztworu BSA w PBS i delikatnie emulgować w temperaturze pokojowej przez 15 minut w celu zmniejszenia tła. Mieszaninę wirować przy 10 000 ×g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu ostrożnie usunąć nadosad zawierający nie sprzężone przeciwciała, a powstały osad zawiesić w 4 mL buforu PBS-T zawierającego 1% BSA i 0,1% Tween-20.

Powtórz wirowanie i resuspensję jeden lub dwa razy. Resuspenduj końcowe osady w 1mL PBS-T i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu użycia. Tutaj przedstawiono schemat konstrukcji paska immunochromatograficznego.

Wymiary tektury, podkładek i membrany nitrocelulozowej są wymienione w tekście protokołu. Aby przedłużyć okres trwałości, paski immunochromatograficzne należy przygotować i złożyć w warunkach laboratoryjnych o niskiej wilgotności. Za pomocą mikropipety należy nanieść roztwór przeciwciała monoklonalnego znakowanego koloidalnym złotem na podkładkę z koniugatem, aby ją nasycić, a następnie suszyć podkładkę w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę przed montażem.

Po wyschnięciu podkładki z koniugatami, użyj dwustronnej taśmy, aby najpierw przykleić membranę nitrocelulozową do tektury. Za pomocą drukarki do pasków immunologicznych nanieś specyficzne przeciwciało monoklonalne wychwytujące antygen w strefie testowej oraz szybkie przeciwciało anty-mysie IGG w strefie kontrolnej na membranie nitrocelulozowej. Zachowaj odległość większą niż pięć milimetrów pomiędzy obiema strefami.

Następnie przyklej podkładkę z koniugatem do jednej strony membrany nitrocelulozowej, a podkładkę absorbującą do drugiej strony, tak aby podkładki nachodziły na membranę o około dwa milimetry z każdej strony. Umieść podkładkę na próbkę tak, aby nachodziła na podkładkę z koniugatem o dwa milimetry, a następnie przyklej ją do tektury. Użyj gilotyny do papieru, aby wyciąć paski o szerokości sześciu milimetrów.

Zapakuj paski do aluminiowej folii z osuszaczem i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Aby przygotować próbkę do testu reakcji krzyżowej, dodaj 1 mL PBS zawierającego 0,1% BSA do 0,03 g surowego mięśnia. Następnie użyj patyczka bambusowego lub pręta do rozcierania, aby zhomogenizować próbkę.

Trzymaj pasek immunochemiczny za koniec przeciwległy do obszaru testowego i zanurz część z podkładką do próbek w badanym materiale na pięć do dziesięciu minut. Odczytaj wynik bezpośrednio. Przetestuj różne próbki mięśni w trzech powtórzeniach.

Linia testowa T została zaprojektowana tak, aby wykazać sygnał dodatni, gdy oba przeciwciała monoklonalne wykryją mioglobinę waleni. Ponieważ mioglobina zwierząt innych niż walenie może zostać wykryta tylko przez jedno z tych dwóch przeciwciał monoklonalnych, linia testowa wykazuje wynik ujemny w przypadku badania próbek mięśni innych zwierząt. Linia kontrolna C powinna zawsze wykazywać wynik dodatni, ponieważ szybkie przeciwciała anty-mysie IgG wiążą znakowane koloidalnym złotem przeciwciało detekcyjne.

Brak wyniku w linii kontrolnej wskazuje na niską jakość materiałów na pasku. Analiza krwi metodą Western blot z wykorzystaniem supernatantów hybridom wykazała, że przeciwciało monoklonalne CGF5H9 wykrywa walenie oraz inne ssaki w postaci pojedynczego zabarwionego prążka o przewidywanej masie cząsteczkowej około 17kDa. U minke (walenia minke) prążek jest porównawczo słabszy niż w przypadku innych waleni.

Prążki nie występują dla tuńczyka, foki i kurczaka. Natomiast dla świni obserwuje się prążek o masie około 50kDa. Identyczne wyniki uzyskano w analizie kropelkowej krwi.

Choć analiza krwi zachodniej z użyciem przeciwciała monoklonalnego CSF1H13 wykazuje wiele niespecyficznych prążków dla świni i tuńczyka, CSF1H13 jest wysoce specyficzne, ponieważ reaguje wyłącznie z waleniami. W przypadku foki występuje prążek o przewidywanej masie cząsteczkowej około 17kDa. Identyczne wyniki uzyskano w analizie krwi metodą dot blot.

Wyniki pośredniego testu ELISA ekstraktów mięśniowych różnych gatunków z użyciem oczyszczonego CGF5H9 wykazują sygnały dodatnie dla krowy, kozy, psa, królika i waleni, słaby sygnał dodatni dla świni oraz sygnały ujemne dla tuńczyka, kurczaka i foki. CSF1H13 wykazuje wysokie powinowactwo do waleni i fok. Oba przeciwciała monoklonalne mogą silnie reagować ze wszystkimi czterema gatunkami waleni z różnych rodzin, co wskazuje na ich szeroką reaktywność wobec różnorodnych gatunków waleni.

Swoistość immunochromatograficznej paskowej analizy z użyciem złota koloidalnego została wykazana na podstawie tych reprezentatywnych wyników. Użycie próbek mięśni innych niż od waleni skutkuje pojawieniem się tylko jednego prążka na linii kontrolnej. Jednak w przypadku użycia próbek mięśni waleni, prążki sygnałowe pojawiają się zarówno na linii testowej, jak i kontrolnej.

Po opanowaniu techniki, przygotowanie znakowanych przeciwciał oraz konstrukcja pasków mogą zostać wykonane w ciągu czterech godzin, jeśli procedura zostanie przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby starannie zaprojektować peptyd. Należy zastosować kilka metod w celu przesiewania odpowiednich przeciwciał monoklonalnych.

Należy użyć wysokiej jakości złota koloidalnego do przygotowania znakowanych przeciwciał. Po zastosowaniu tych procedur można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza DNA oparta na PCR, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące gatunku walenia oraz jego pochodzenia. Przeciwciało monoklonalne CSF1H13, które jest silne i wykazuje powinowactwo wyłącznie do ssaków morskich, może być wykorzystane w różnych formatach testu ELISA, co stwarza wiele innych możliwości badania aspektów biologicznych, fizjologicznych i chemicznych mioglobiny u ssaków morskich.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak opracować specyficzne przeciwciała monoklonalne, a następnie zastosować je w szybkim teście paskowym.