Opracowanie immunochromatograficznego paska testowego na bazie złota koloidalnego do wykrywania mioglobiny waleni

Ogólnym celem tego paska testowego immunochromatograficznego ze złota koloidalnego jest odróżnienie mioglobiny waleni od mioglobiny fok i innych zwierząt. Metoda ta może zapewnić szybką kontrolę przesiewową mięsa waleni na miejscu, ograniczając w ten sposób jego nielegalny handel i konsumpcję. Główną zaletą tej techniki jest to, że pomyślny wynik można zaobserwować bezpośrednio w ciągu pięciu do dziesięciu minut po homogenizacji 03 gramów mięśni, z wyjątkową specyficznością i czułością.

Tak więc ta metoda może zapewnić szybkie wykrycie mięsa waleni na polu. Może być również stosowany do innych rodzajów mięsa, takich jak konina lub wieprzowina. Aby zaprojektować syntetyczne peptydy do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych o reaktywności w stosunku do mioglobiny waleni, analizowane są sekwencje aminokwasowe antygenowych regionów reaktywnych mioglobiny od różnych zwierząt.

Zacznij od pobrania z GenBank sekwencji aminokwasowych mioglobiny od tuńczyka, kurczaka, strusia, ssaków domowych, fok i 18 gatunków waleni. Następnie wyrównaj sekwencje za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Uruchom Eksploratora wyrównania, wybierając pozycję Wyrównaj wyrównanie edycji/kompilacji na pasku uruchamiania.

Wybierz opcję Utwórz nową linię trasowania i kliknij przycisk OK. Pojawi się okno dialogowe z pytaniem, czy budujesz wyrównanie sekwencji DNA lub białka? Kliknij przycisk oznaczony Białko, wybierz Dane Otwórz Pobierz sekwencje z pliku i wybierz plik sekwencji. Wybierz polecenie menu Edytuj zaznacz wszystko, aby wybrać wszystkie lokalizacje dla każdej sekwencji w zestawie danych w celu utworzenia wyrównania wielu sekwencji.

Wybierz opcję Alignment Align by ClustalW z menu głównego. Wybierz BLOSUM jako macierz masy białka, a następnie kliknij przycisk OK. Trzecim krokiem jest analiza wyrównania sekwencji.

Skoncentruj się na pięciu antygenowych miejscach reaktywnych i znajdź fragment zachowany wśród waleni. Gwiazdka symbolizuje konsensus w wyrównaniu i wskazuje pozycję, która ma pojedynczą, w pełni zachowaną pozostałość. Znaleziono dwa zachowane fragmenty u waleni.

Fragmenty sekwencji kandydackiej są następnie syntetyzowane i wykorzystywane do wytworzenia przeciwciał monoklonalnych. Rozpocznij tę procedurę od określenia optymalnego pH dla roztworu złota koloidalnego, zdefiniowanego jako minimalne pH, które utrzymuje mieszaninę przeciwciał monoklonalnych i roztworu złota koloidalnego w kolorze czerwonym przez dwie godziny. Dodaj 0,15 mikrograma oczyszczonego wykrywającego przeciwciała monoklonalnego do 100 mikrolitrów koloidalnego roztworu złota o wartościach pH wahających się od pięciu do dziewięciu.

Na potrzeby tej demonstracji bada się pH 6 i pH 8. pH 8 uznano za optymalne pH na tym etapie optymalizacji. Następnie określ optymalne stężenie przeciwciała monoklonalnego, dodając różne ilości oczyszczonego wykrywającego przeciwciała monoklonalnego do 100 mikrolitrów roztworu złota koloidalnego o pH ośmiu.

Optymalne stężenie, które w tym badaniu wynosi sześć mikrogramów na mililitr, utrzyma kolor mieszaniny na czerwono bez czarnego osadu. Opierając się na wynikach etapów optymalizacji, dodaj 60 mikrogramów oczyszczonego, wykrywającego przeciwciała monoklonalnego kroplami do 10 ml roztworu złota koloidalnego. Delikatnie emulgować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut.

Dodaj dwa mililitry 5% roztworu BSA w PBS do mieszaniny i delikatnie emulguj w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby zmniejszyć zakłócenia tła. Odwirować mieszaninę 10 000 razy g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant z niesprzężonym przeciwciałem i zawiesić powstały osad w 4 ml PBS-T zawierającym 1% BSA i 0,1% Tween-20.

Powtórzyć wirowanie i zawiesinę raz lub dwa razy. Zawiesić końcowe osady w 1 ml PBS-T i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do zużycia. Grafika przedstawiająca projekt paska immunologicznego jest pokazana tutaj.

Wymiary tektury, bloczków i membrany nitrocelulozowej są podane w tekście protokołu. Aby przedłużyć okres przechowywania, paski immunologiczne powinny być przygotowane i zmontowane w warunkach laboratoryjnych o niskiej wilgotności. Za pomocą mikropipety dodaj roztwór przeciwciała monoklonalnego znakowanego złotem koloidalnym do podkładki sprzężonej w celu jej nasycenia, a następnie wysusz podkładkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę przed złożeniem.

Po wyschnięciu podkładki sprzężonej użyj taśmy dwustronnej, aby najpierw wkleić membranę nitrocelulozową na tekturę. Za pomocą drukarki immunostrip rozprowadzić specyficzne przeciwciało monoklonalne wychwytujące antygen i szybki anty-mysi IGG odpowiednio w strefie testowej i strefie kontrolnej na membranie nitrocelulozowej. Zachowaj odległość większą niż pięć milimetrów między dwiema strefami.

Następnie wklej podkładkę sprzężoną po jednej stronie membrany nitrocelulozowej, a podkładkę chłonną po drugiej stronie, zachodząc na pady z każdej strony na około dwa milimetry. Umieść podkładkę na próbkę na elektropuszce sprzężonej na dwa milimetry i wklej ją na karton. Użyj gilotyny do papieru, aby utworzyć paski o szerokości sześciu milimetrów.

Zapakuj paski w torebkę z folii aluminiowej ze środkiem osuszającym i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia. Aby przygotować próbkę do testu reaktywności krzyżowej, dodaj 1 ml PBS zawierającego 0,1% BSA do 0,03 grama surowego mięśnia. I użyj bambusowego patyczka lub pręta szlifierskiego, aby homogenizować próbkę.

Przytrzymaj pasek immunologiczny za koniec przeciwny do obszaru testowego i zanurz część podkładki na próbkę w próbce na pięć do dziesięciu minut. Obserwuj wynik bezpośrednio. Przetestuj różne próbki mięśni w trzech egzemplarzach.

Linia testowa T jest zaprojektowana tak, aby pokazywać pozytywny sygnał, gdy oba przeciwciała monoklonalne wykryją mioglobinę waleni. Ponieważ mioglobina od zwierząt innych niż może być wykryta tylko przez jedno z tych dwóch przeciwciał monoklonalnych, linia testowa wykazuje wynik negatywny, gdy badane są próbki mięśni innych zwierząt. Linia kontrolna C powinna zawsze wykazywać wynik pozytywny, ponieważ szybki anty-mysi IGG wiąże przeciwciało wykrywające znakowane złotem koloidalnym.

Nieudany wynik w linii kontrolnej wskazuje, że jakość materiałów na pasku jest niska. Zachodnia analiza krwi przy użyciu supernatantów hybrydoma pokazuje, że przeciwciało monoklonalne CGF5H9 wykrywa i inne ssaki jako pojedyncze barwione prążki o przewidywanej masie cząsteczkowej około 17 kDa. Pospolity płetwal karłowaty ma stosunkowo słabsze prążki niż prążki innych waleni.

Nie ma pasm dla tuńczyka, foki i kurczaka. Natomiast dla świni obserwuje się pasmo o wartości około 50 kDa. Identyczne wyniki uzyskuje się za pomocą analizy krwi punktowej.

Chociaż zachodnia analiza krwi przy użyciu CSF1H13 przeciwciała monoklonalnego wykazuje wiele niespecyficznych prążków dla świń i tuńczyków, CSF1H13 jest wysoce specyficzny, ponieważ reaguje tylko z waleniami. A foka ma pasmo o przewidywanej masie cząsteczkowej około 17 kDa. Identyczne wyniki uzyskuje się za pomocą analizy krwi punktowej.

Wyniki pośredniego testu ELISA ekstraktów mięśniowych różnych gatunków przy użyciu oczyszczonego CGF5H9 wykazują pozytywne sygnały dla krów, kóz, psów, królików i waleni, słaby sygnał dodatni dla świń i ujemne sygnały dla tuńczyka, kurczaka i foki. CSF1H13 wykazuje wysokie powinowactwo do waleni i fok. Oba przeciwciała monoklonalne mogą silnie reagować ze wszystkimi czterema gatunkami waleni, które należą do różnych rodzin, co wskazuje na ich szeroką reaktywność na różne gatunki waleni.

O swoistości immunologicznego paska złota koloidalnego świadczą te reprezentatywne wyniki. Użycie próbek mięśni innych niż powoduje, że na linii kontrolnej występuje tylko jedno prążki. Jednak w przypadku stosowania próbek mięśni waleni pasma sygnałowe są obecne zarówno na linii testowej, jak i kontrolnej.

Po opanowaniu, przygotowanie znakowanych przeciwciał i ta konstrukcja pasków może być wykonana w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując tej procedury, należy pamiętać o starannym zaprojektowaniu peptydu. Należy stosować kilka metod badania przesiewowego odpowiednich przeciwciał monoklonalnych.

I użyj wysokiej jakości złota koloidalnego do przygotowania znakowanych przeciwciał. Zgodnie z tymi procedurami można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza DNA oparta na PCR, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak gatunek waleni i skąd pochodzą. CSF1H13 przeciwciało monoklonalne, które jest silne i wykazuje powinowactwo tylko do ssaków morskich, może być stosowane w różnych formatach ELISA, które oferują wiele innych możliwości badania biologicznych, fizjologicznych i chemicznych aspektów mioglobiny u ssaków morskich.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytworzyć specyficzne przeciwciała monoklonalne, a następnie zastosować je na szybkim pasku testowym.