Name: Analiza filtra z próbką powietrza pod kątem endotoksyn i zawartości DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji endotoksyn i DNA z filtrów powietrza w celu analizy aerozoli biologicznych. Technika ta umożliwia badanie zanieczyszczeń powietrza w środowisku zamkniętym i otwartym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Yoavowi Barakowi z Wydziału Chemii Instytutu Weizmanna za wsparcie i rady. Badanie to było wspierane przez Izraelską Fundację Naukową (grant # 913/12) oraz przez Fundację Minerva z finansowaniem z Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań Naukowych.

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+of+Air+Sampling+and+Analysis%22">Methods of Air Sampling and Analysis</a>. Lodge, J. P. J. , 3rd ed, Lewis Publishers, Inc. (1988).</li>
<li>Costa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+carbonaceous+aerosols+in+Emilia-Romagna+%28Northern+Italy%29+based+on+two+fall%2Fwinter+field+campaigns%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos.+Res%22%5BJournal%5D)">Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns.</a> Atmos. Res. , (2015).</li>
<li>Brent, L. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development%2C+enhancement%2C+and+evaluation+of+aircraft+measurement+techniques+for+national+ambient+air+quality+standard+criteria+pollutants+%5B%5D%22">Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]</a>. , University of Maryland, College Park. Thesis 3682591 (2014).</li>
<li>Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+elemental+analysis+of+atmospheric+aerosols+for+evaluating+human+health+impacts+of+aerosols+in+East+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos.+Environ%22%5BJournal%5D)">Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia.</a> Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).</li>
<li>Hospodsky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+airborne+fungal+and+bacterial+concentrations+and+emission+rates+in+six+occupied+children%27s+classrooms%5BTitle%5D)+AND+%22Indoor+air%22%5BJournal%5D)">Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children's classrooms.</a> Indoor air. , (2014).</li>
<li>Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airborne+Bacterial+Populations+Above+Desert+Soils+of+the+McMurdo+Dry+Valleys%2C+Antarctica%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica.</a> Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).</li>
<li>Ovadnevaite, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submicron+NE+Atlantic+marine+aerosol+chemical+composition+and+abundance%3A+Seasonal+trends+and+air+mass+categorization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Geophys.+Res.+Atmos%22%5BJournal%5D)">Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization.</a> J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).</li>
<li>Lodge, J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ES%26T+Books%3A+Methods+of+Air+Sampling+and+Analysis%2C+3rd+ed%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed.</a> Environ. Sci. Technol. 23, 938(1989).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Aerosol+Measurement%3A+Principles%2C+Techniques%2C+and+Applications%22">Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications</a>. Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. , John Wiley & Sons. (2011).</li>
<li>Vincent, J. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVincent%2C+JH+%22Aerosol+Sampling%3A+Science%2C+Standards%2C+Instrumentation+and+Applications%22">Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications</a>. , John Wiley & Sons. (2007).</li>
<li>Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Endotoxins+in+Bioaerosols+at+Workplace%3A+A+Critical+Review+of+Literature+and+a+Standardization+Issue%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Occup.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue.</a> Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).</li>
<li>Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+elemental+analysis+of+atmospheric+aerosols+for+evaluating+human+health+impacts+of+aerosols+in+East+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos.+Environ%22%5BJournal%5D)">Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia.</a> Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).</li>
<li>Lewtas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+pollution+combustion+emissions%3A+Characterization+of+causative+agents+and+mechanisms+associated+with+cancer%2C+reproductive%2C+and+cardiovascular+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.-Rev.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects.</a> Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).</li>
<li>Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+aerosol+as+a+possible+source+for+endotoxins+in+coastal+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Total.+Environ%22%5BJournal%5D)">Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas.</a> Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).</li>
<li>Levin, J., Bang, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clottable+protein+in+Limulus%3A+its+localization+and+kinetics+of+its+coagulation+by+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Diath.+Haemorrh%22%5BJournal%5D)">Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin.</a> Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6, 986-994 (1996).</li>
<li>O'Dowd, C. D., de Leeuw, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+aerosol+production%3A+a+review+of+the+current+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R.+Soc.+A%22%5BJournal%5D)">Marine aerosol production: a review of the current knowledge.</a> Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).</li>
<li>O'Dowd, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenically+driven+organic+contribution+to+marine+aerosol%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biogenically driven organic contribution to marine aerosol.</a> Nature. 431, 676-680 (2004).</li>
<li>Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+next-generation+droplet+digital+PCR+%28ddPCR%29+with+quantitative+PCR+%28qPCR%29+for+enumeration+of+Cryptosporidium+oocysts+in+faecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples.</a> Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).</li>
<li>Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+enumeration+of+airborne+biocontaminants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Detection and enumeration of airborne biocontaminants.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).</li>
<li>Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+housing+characteristics+on+bacterial+and+fungal+communities+in+homes+of+asthmatic+children%5BTitle%5D)+AND+%22Indoor+air%22%5BJournal%5D)">Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children.</a> Indoor air. , (2015).</li>
<li>Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indoor+emissions+as+a+primary+source+of+airborne+allergenic+fungal+particles+in+classrooms%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms.</a> Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-size+distributions+and+seasonal+diversity+of+allergenic+and+pathogenic+fungi+in+outdoor+air%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air.</a> ISME J. 6, 1801-1811 (2012).</li>
<li>Karottki, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+and+lung+function+in+relation+to+outdoor+and+indoor+exposure+to+fine+and+ultrafine+particulate+matter+in+middle-aged+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Int%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects.</a> Environ Int. 73, 372-381 (2014).</li>
<li>Guy, D. Endotoxins and Depyrogenation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuy%2C+D+%22Industrial+Pharmaceutical+Microbiology%3A+Standards+and+Controls%22">Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls</a>. Hodges, N., Hanlon, G. , Euromed. 12.1-12.15 (2003).</li>
<li>Associates of Cape Cod Incorporated. Limulus Amebocyte Lysate - PYROTELL-T. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/inserts/PyrotellT.pdf">http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/inserts/PyrotellT.pdf</a> (2006).</li>
<li>Associates of Cape Cod Incorporated. Endotoxin (E. coli O113:H10) Control Standard Endotoxin (CSE). , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/pisheets/CSE%200.5ug.pdf">http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/pisheets/CSE%200.5ug.pdf</a> (2007).</li>
<li>Associates of Cape Cod Incorporated. Cape Cod Certificate of Analysis. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.acciusa.com/pageCOA.php">http://www.acciusa.com/pageCOA.php</a> (2015).</li>
<li>Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Five+Extraction+Protocols+for+Quantification+of+Endotoxin+in+Metalworking+Fluid+Aerosol%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Occup.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol.</a> Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).</li>
<li>Thornton, B., Basu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+%28qPCR%29+primer+design+using+free+online+software%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Mol.+Biol.+Educ%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software.</a> Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).</li>
<li>Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMadigan%2C+MT+%22Brock+Biology+of+Microorganisms%22">Brock Biology of Microorganisms</a>. , 13th ed, Benjamin Cummings. (2011).</li>
<li>Watson, J. G., Chow, J. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWatson%2C+JG+%22Aerosol+Measurement%3A+Principles+and+Techniques%22">Aerosol Measurement: Principles and Techniques</a>. , 3rd ed, John Wiley & Sons, Inc. 591-613 (2011).</li>
<li>Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+endotoxin+concentrations+in+PM10+from+Southern+California%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California.</a> Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).</li>
<li>Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy%2C+Precision%2C+and+Method+Detection+Limits+of+Quantitative+PCR+for+Airborne+Bacteria+and+Fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).</li>
<li>Kutyavin, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%E2%80%B2-Minor+groove+binder-DNA+probes+increase+sequence+specificity+at+PCR+extension+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures.</a> Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).</li>
<li>Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+absolute+quantification+method+correcting+for+quantitative+PCR+efficiency+variations+for+microbial+community+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).</li>
<li>Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStrober%2C+W+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+and+enhancement+in+the+analysis+of+airborne+endotoxin+levels+in+various+occupational+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Ind+Hyg+Assoc+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments.</a> Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).</li>
<li>Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKennedy%2C+S+%22PCR+troubleshooting+and+optimization+%3A+the+essential+guide%22">PCR troubleshooting and optimization : the essential guide</a>. , Caister Academic Press. (2011).</li>
<li>Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Endotoxin+Testing+Methods+for+Pharmaceutical+Products%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm+Compd%22%5BJournal%5D)">Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products.</a> Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).</li>
<li>Ebentier, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+repeatability+and+reproducibility+of+a+suite+of+qPCR-based+microbial+source+tracking+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods.</a> Water Res. 47, 6839-6848 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W pracy opisano metody ekstrakcji i wykrywania do ilościowego określania zarówno endotoksyn, jak i DNA obecnego w próbkach aerozoli pobranych na filtrach. Metody te wymagają dokładnych procedur i mogą być łatwo wykonane, o ile eksperymentator przestrzega kilku podstawowych i ważnych punktów omówionych tutaj.
Na etapie wykrywania endotoksyn należy pamiętać, że roztwór lizatu jest dość lepki i ma tendencję do wytwarzania pęcherzyków podczas pipetowania. Trudno jest usunąć te pęcherzyki, a prowad...

Pobieranie próbek powietrza na filtrach jest podstawowym narzędziem w badaniach aerozoli atmosferycznych. 1 Próbkowane filtry są punktem wyjścia dla różnych charakterystyk chemicznych, fizycznych i biologicznych zebranych cząstek otoczenia. 2-11 Zaletą tego podejścia jest to, że różne analizy mogą być wykonywane off-line na tej samej próbce. Zestawienie danych z różnych analiz umożliwia badaczowi dobre zrozumienie charakterystyki zebranych cząstek i pomaga w rozwiązywaniu złożonych problemów w naukach o atmosferze. 12,13 Na przykład próbki powietrza morskiego i śródlądowego pobrane w tym samym okresie można porównać pod względem toksyczności cząstek i składu biologicznego. 14 W tym badaniu lipopolisacharydy (LPS), składniki ścian komórkowych bakterii Gram-ujemnych, znane również jako endotoksyny, wyekstrahowano z filtrów, od których pobrano próbki na lądzie i w głębi lądu, i oceniono je za pomocą testu lizatu amebocytów limulusa (LAL). Równolegle przeprowadzono genomową ocenę zawartości bakterii (bakterie ogółem, Gram-ujemne i cyjanobakterie) na tej samej próbce przy użyciu ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (q-PCR). Test LAL opiera się na pomiarach zmętnienia powstałego po dodaniu wodnego ekstraktu amebocytów z kraba podkowiastego, Limulus polyphemus, do roztworu wodnego zawierającego endotoksyny. Im wyższe stężenie endotoksyn w próbce, tym szybciej rozwija się zmętnienie. 15 Analiza q-PCR opiera się na sygnale fluorescencyjnym emitowanym podczas amplifikacji określonego fragmentu DNA. 16 Dzięki monitorowaniu sygnału w czasie rzeczywistym w fazie wykładniczej reakcji PCR i kalibracji za pomocą krzywej wzorcowej można określić ilościowo początkową ilość DNA. Połączenie tych dwóch analiz z innymi, jak opisano w innym miejscu,14 może zapewnić dobre oszacowanie poziomów endotoksyn i ilości bakterii źródłowych w próbkach.
Celem przedstawionej tutaj metody jest uzyskanie bardzo dokładnej i wiarygodnej analizy zawartości endotoksyn i DNA w bioaerozolach ekstrahowanych z filtrów. Podczas gdy metody pobierania próbek fizycznych i nieorganicznych właściwości chemicznych aerozoli są dobrze znane, a ostatnio opracowano metody badania ich składnika materii organicznej17, przeprowadzono niewiele badań nad biologicznym składnikiem aerozoli. 18 Uzasadnieniem dla obecnej metody jest wypełnienie tej luki poprzez szczegółowe przedstawienie solidnej metody ekstrakcji, analizy i identyfikacji frakcji biologicznej aerozoli unoszących się w powietrzu. 14
Opisana tutaj metoda powinna znaleźć szerokie zastosowanie w biologicznych projektach badawczych nad aerozolami wewnętrznymi i zewnętrznymi, obejmujących analizę filtrów. 20-24 Rozdział

<table><tbody><tr><td>Filtr do pobierania próbek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiVol 3000 - Próbnik powietrza o dużej objętości</td><td>Ecotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwarcowe filtry z mikrofibry</td><td>Whatman</td><td>1851-865</td><td>203 mm x 254 mm</td></tr><tr><td>ELF - Laboratoryjne piece komorowe</td><td>Carbolite</td><td>ELF 11series</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Opal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Endotoxin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16368&nbsp;</td><td>Odczynnik laboratoryjny, 96%</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego Airstream klasy II AC-4E1</td><td>ESCO</td><td>10011712</td><td></td></tr><tr><td>Pyrotell -T</td><td>Associates of Cape Cod, Inc.</td><td>T0051</td><td></td></tr><tr><td>Kontrola standardowej endotoksyny</td><td>Associates firmy Cape Cod, Inc.</td><td>E0005-1</td><td>Escherichia coli&nbsp; O113:H10, 0,5 &mikro; g / fiolka 1 opakowanie Odczynnik</td></tr><tr><td>LAL Water</td><td>Associates of Cape Cod, Inc.</td><td>W0051</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna strzykawka 10 ml z końcówką Luer-Lok</td><td>Becton-Dickinson & Co.</td><td></td><td></td>309605</tr><tr><td>Igła do strzykawki BD Precisionglide</td><td>Becton-Dickinson & Co.</td><td>305129</td><td>Sterylne&nbsp;</td></tr><tr><td>Taśma uszczelniająca Parafilm-M</td><td>Parafilm</td><td>P7543</td><td>Sigma Nr katalogowy</td></tr><tr><td>Mikroprobówki</td><td>Axigen</td><td>MCT-200-C</td><td>2 ml, bez pirogenów</td></tr><tr><td>o średnicy 1,12 cm Świdr</td><td>korkowy Boekel Scientific</td><td>1601 BD Series - Stal</td><td>Część zestawu świdrów korkowych zawierającego wiertła o różnych średnicach.&nbsp;</td></tr><tr><td>50 mm Szalka Petriego</td><td>Miniplast Ein-Shemer</td><td>72050-01</td><td>Aseptyczny</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2&nbsp;</td><td>Przemysł naukowy, inc.</td><td>SI-0297</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka 5415 D</td><td>Eppendorf</td><td>22621408</td><td></td></tr><tr><td>TC MicroWell 96 F SI z pokrywką</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td>Studzienki z płaskim dnem (z pokrywką (pakowane pojedynczo)), sterylne, wolne od pirogenów</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Synergy HT Multi-Detection</td><td>Biotek</td><td>7091000</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA away</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe DNA gatunków drobnoustrojów będących przedmiotem zainteresowania</td><td>ATCC lub inna kolekcja</td><td></td> kultur <td>Albo odpowiedni szczep drobnoustrojów do ekstrakcji DNA, albo wyekstrahowane DNA</td></tr><tr><td>Ulepszony przez Neubauera</td> bufor <td>hemocytometru</td><td>Marienfeld</td><td>640030</td></tr><tr><td>TE, Low EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 8,0)&nbsp; 0,1 mM EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>Woda bez nukleaz klasy PCR&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3315959001</td><td></td></tr><tr><td>Startery PCR</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Ukierunkowane na interesujące gatunki drobnoustrojów</td></tr><tr><td>Podwójnie znakowane sondy</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Ukierunkowane na interesujące gatunki drobnoustrojów</td></tr><tr><td>Probówki z nakrętką</td><td>Axigen</td><td>ST-200-SS</td><td>2 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji DNA PowerSoil&nbsp;</td><td>Mo Bio Laboratories</td><td>12888-100</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki szklane, płukane kwasem 425-600 &mikro; m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772-100G</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki szklane, myte kwasem < 106 &mikro; m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4649-100G</td><td></td></tr><tr><td>PowerSoil Solution C1</td><td>Mo Bio Laboratories</td><td>12888-100-1</td><td>Bufor do lizy komórek, zestaw Power Soil Wiadro</td></tr> na <tr><td>lód Magic Touch</td><td>Bel-Art</td><td>18848-4001</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>BioSpec</td><td>607EUR</td><td></td></tr><tr><td>System PCR w czasie rzeczywistym StepOnePlus</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>Szybki SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4385612</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4370048</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Szybka optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna z kodem kreskowym, 0,1 ml</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Splash-Free 96-well Base</td><td>Applied Biosystems</td><td>4312063</td><td></td></tr><tr><td>Optyczna folia</td> <td>samoprzylepna MicroAmpApplied Biosystems</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.010</td><td>Rotor A-4-62 z wiadrami MTP&nbsp;</td></tr></tbody></table>

analiza filtra z próbką powietrza pod kątem endotoksyn i zawartości dna

Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content

Badania aerozoli na zewnątrz często wykorzystują cząstki stałe pobierane na filtrach. Procedura ta umożliwia równoległe wykonywanie różnych charakterystyk zebranych cząstek. Celem przedstawionej metody jest uzyskanie wysoce dokładnej i wiarygodnej analizy zawartości endotoksyn i DNA w bioaerozolach wyekstrahowanych z filtrów. Ekstrakcja cząsteczek organicznych o dużej masie cząsteczkowej, takich jak lipopolisacharydy, z próbek filtrów polega na wytrząsaniu próbki w wolnym od pirogenów środowisku na bazie wody. Dalsza analiza opiera się na reakcji enzymatycznej, którą można wykryć za pomocą pomiaru mętnościowego. Ze względu na wysoką zawartość substancji organicznych w próbkach filtrów, ekstrakcja DNA z próbek odbywa się przy użyciu komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA, który został pierwotnie zaprojektowany dla gleb i zmodyfikowany w celu poprawy wydajności DNA. Opisano wykrywanie i kwantyfikację określonych gatunków drobnoustrojów za pomocą ilościowej analizy łańcuchowej reakcji polimerazy (q-PCR) i porównano je z innymi dostępnymi metodami.

Powszechną praktyką w badaniu aerozoli atmosferycznych jest stosowanie analiz „off-line” pobranych filtrów (patrz Rycina 2).32 Analizy chemiczne pobranej materii obejmują zawartość związków organicznych (np. białek, cząsteczek węglowodorów, sacharydów) oraz nieorganicznych (np. metali, soli). Analizy biologiczne obejmują zawartość drobnoustrojów żywych i nieżyjących, identyfikację gatunków z wykorzystaniem metod analizy DNA lub mikroskopii, a ...

Dwie uzupełniające analizy atmosferycznych cząstek biologicznych z filtrów próbek powietrza są opisane tutaj: ekstrakcja i wykrywanie endotoksyny oraz DNA.

Analiza filtra z próbką powietrza pod kątem endotoksyn i zawartości DNA

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles ...

Ogólnym celem tej procedury jest opisanie sposobu dokładnej analizy zawartości endotoksyn i DNA w wyekstrahowanych cząstkach zawieszonych w powietrzu, pobranych na filtry. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad biologicznymi aerozolami wewnątrz i na zewnątrz pomieszczeń, takich jak zrozumienie kwestii zdrowotnych. Procedurę pobierania próbek na filtr zaprezentuje Yinon Mazar, doktorant z mojego laboratorium.Do poboru próbek o dużej objętości należy stosować filtry z włókien kwarcowych. Można również wybrać konkretny rodzaj filtra oraz wielkość odcięcia filtra, które najlepiej odpowiadają potrzebom badawczym. Filtry przeznaczone do pobierania związków organicznych i biologicznych należy poddać uprzedzaniu poprzez ich wcześniejsze indywidualne zawinięcie w folię aluminiową.Następnie należy wypalić je w piecu laboratoryjnym w temperaturze 450 °C przez co najmniej pięć godzin. Pozwoli to na usunięcie wszelkich istniejących pozostałości organicznych. Wypalone filtry należy przechowywać w temperaturze 20 °C do momentu ich wykorzystania do pobierania próbek.Następnie należy wyczyścić i zdezynfekować próbnik o dużym przepływie, taki jak opisany w towarzyszącym protokole tekstowym. Potem należy umieścić upieczony wcześniej filtr w kasecie filtra i uruchomić próbnik zgodnie z instrukcjami producenta w celu pobrania odpowiedniej próbki. W komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II należy wyciąć 22 okrągłe kawałki czystego, upieczonego wcześniej materiału filtracyjnego, używając czystego wycinaka do korków o średnicy 1,12 centymetra.Użyj tych elementów do przygotowania serii filtrów wzbogaconych endotoksyną, które posłużą jako kontrole. Następnie wytnij z filtrów zawierających zebraną próbkę fragmenty o średnicy 1,12 cm za pomocą czystego wycinaka do korków i umieść każdą próbkę w osobnej, wolnej od pirogenów probówce o pojemności 2 ml. Przenieś również wysuszone filtry wzbogacone endotoksyną do oddzielnych, wolnych od pirogenów probówek o pojemności 2 ml.Do każdej probówki należy dodać 1 ml wody wolnej od pirogenów. Następnie wstrząsać nimi przez 60 minut w temperaturze pokojowej za pomocą wytrząsarki laboratoryjnej. Kolejno, probówki z próbkami należy odwirować w mikrocentryfudze przy 375 ×g przez 10 minut.Następnie przenieś supernatant zawierający endotoksyny do nowej, wolnej od pirogenów probówki o pojemności 2 ml. Przygotuj wolną od pirogenów mikropłytkę 96-dołkową z płaskim dnem i pokrywką do testu na endotoksyny, wyznaczając najpierw rozmieszczenie próbek.Następnie włącz czytnik mikropłytek i zaprogramuj go na reakcję kinetyczną w temperaturze 37 °C z wstrząsaniem co pięć minut. Następnie przeprowadź pomiary przy 405 nm. Powtórz pięciominutowe wstrząsanie i odczyt płytki 18 razy.Napełnij płytkę, umieszczając 50 µL standardowych roztworów endotoksyn, wcześniej użytych do wzbogacenia filtrów, w rzędach od A1 do A10 oraz od B1 do B10. Próbki ślepe umieść w polach A11, A12, B11 i B12. Następnie dodaj nadosad z odwirowanego ekstraktu ze wzbogaconych filtrów oraz odpowiadające im próbki ślepe do rzędów C i D. Na koniec dodaj nadosady z próbek eksperymentalnych i próbek ślepych do pozostałych studniek, zależnie od potrzeb.Aby aktywować test, szybko dodaj 50 µL roztworu glikatu amebocytów limulusa do każdej studzienki. Delikatnie potrząśnij płytką w poziomie. Następnie umieść ją w czytniku płytek i rozpocznij przebieg eksperymentu.Po zakończeniu pomiaru wyjmij płytkę z czytnika płytek. Określ poziom endotoksyn w każdej próbce, korzystając z krzywej wzorcowej, a następnie oblicz wydajność ekstrakcji endotoksyn z filtrów próbek. W pierwszej kolejności przygotuj filtry z dodatkiem DNA zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym.Dla każdej próbki filtra przygotuj mieszaninę przemytych kwasem szklanych kulek w sterylnych probówkach o pojemności 0,5 mililitra, stosując 0,1 grama kulek o średnicy od 425 do 600 mikrometrów oraz 0,3 grama kulek o średnicy mniejszej niż lub równej 106 mikrometrów. Następnie, używając zdezynfekowanego wycinaka do korków o średnicy 1,12 centymetra, wytnij trzy okrągłe fragmenty z losowo wybranych miejsc każdej próbki filtra. Umieść próbki filtra w oddzielnych probówkach z nakrętką o pojemności dwóch mililitrów.Następnie do każdej probówki dodaj mieszankę szklanych kulek oraz 60 µL buforu do lizy komórek dołączonego do zestawu do ekstrakcji DNA. Zamknij probówki i umieść próbki w homogenizatorze kuleczkowym. Użyj homogenizatora do mechanicznego rozbicia przefiltrowanych komórek przez jedną minutę, a następnie schłodź próbki, umieszczając je na lodzie przez kolejną minutę.Powtórz ten cykl pięć razy. Postępuj zgodnie z protokołem dostawcy zestawu i wyekstrahuj DNA z lizowanych komórek. Po elucji ponownie przepuść eluowaną próbkę przez kolumnę ekstrakcyjną, aby zwiększyć wydajność DNA.Włącz urządzenie do ilościowej PCR z wyprzedzeniem, aby umożliwić mu rozgrzanie. W nowym pliku programu wprowadź szczegóły przebiegu ilościowej PCR w oprogramowaniu sterującym urządzeniem. Następnie zdezynfekuj powierzchnię roboczą środkiem do usuwania DNA z powierzchni i pracuj wyłącznie ze sterylnymi probówkami, końcówkami oraz odczynnikami.Dodatkowo ustaw wiadro z lodem obok stanowiska pracy i umieść w nim mieszaninę tac polemoraris. Przygotuj mieszaninę reakcyjną do ilościowego PCR zgodnie z opisem w tabeli cztery dołączonego protokołu tekstowego. Mieszaninę reakcyjną przechowuj w ciemności i w lodzie do momentu użycia.Następnie umieść czystą mikropłytkę w uchwycie, aby zapobiec jej kontaktowi z powierzchnią roboczą i zachować jej czystość. Do studni mikropłytki do ilościowego PCR dodaj w trzech powtórzeniach po jednym mikrolitrze standardowego DNA, DNA z próbki lub wody wolnej od nukleaz. Następnie do każdej studni reakcyjnej dodaj dziewięć mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej (master mix).Po zakończeniu przykryj płytkę optyczną folią klejącą i szczelnie zaklej ją ze wszystkich stron. Wiruj płytkę w wirówce wyposażonej w koszyczki do płytek przez jedną minutę przy 1000 ×g przed umieszczeniem jej w termocyklerze. Na koniec uruchom przygotowany program ilościowej PCR.Podczas ekstrakcji endotoksyn próbki na filtrach są wirowane w wirówce w celu wydobycia endotoksyn z filtra. Różne prędkości wirowania prowadzą do różnej wydajności ekstrakcji, szczególnie przy wyższych stężeniach endotoksyn.Należy przeprowadzić wstępny test wydajności ekstrakcji dla wybranego filtra i zastosowanego protokołu. Wyższą wydajność ekstrakcji uzyskuje się w przypadku wzbogacania czystych filtrów w porównaniu z próbkowanymi filtrami kwarcowymi, a obie te wartości są niższe niż wydajność osiągana podczas bezpośredniej detekcji roztworu wzorcowego. Po opanowaniu metody analiza endotoksyn może zostać przeprowadzona w trzy i pół godziny, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak sekwencjonowanie DNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące transportu organizmów w atmosferze. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak efektywnie izolować endotoksyny i DNA z filtrów próbek powietrza oraz jak poddać je dokładnej analizie.

air-sampled-filter-analysis-for-endotoxins-and-dna-content

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Ten film demonstruje szybki test biologiczny do badania aktywności endotoksyn w próbce krwi pełnej za pomocą metody opartej na chemiluminescencji. Ten test jest szybkim i czułym testem biomarkerowym do wczesnej diagnozy sepsy zależnej od endotoksyn.

Test aktywności endotoksyn: test biologiczny oparty na chemiluminescencji do badania aktywności endotoksyn w próbce krwi

Ten film opisuje mętny format testu lizatu amebocytów Limulus (LAL) do oszacowania zanieczyszczenia endotoksynami w pegylowanych liposomalnych nanopreparatach doksorubicyny. Zmętnienie roztworu po reakcji endotoksyny z odczynnikiem LAL pomaga oszacować endotoksynę w próbce.

Turbidymetryczny test lizatu amoebocytów limulusowych: technika wykrywania i ilościowego określania zanieczyszczenia endotoksynami w lekach o nanoformach

Ten film opisuje test żelowo-skrzepowy w celu określenia obecności endotoksyn bakteryjnych w nanopreparatach przy użyciu lizatu lizatu lizatu lizatu pochodzącego z komórek krwi krabów podkowiastych. Test pomaga w testowaniu pod kątem zanieczyszczenia endotoksynami produktów farmaceutycznych, w tym preparatów na bazie nano.

Test lizatu amebocytów żelowo-skrzepowych limulus: metoda wykrywania endotoksyn bakteryjnych w preparatach nanocząsteczkowych

Ten film demonstruje test do zbadania zależnej od receptora toll-like (TLR) aktywności czynników transkrypcyjnych: czynnika jądrowego-kappa-B (NF-κB) i białka aktywatora-1 (AP-1) w makrofagach. TLR uruchamiają prozapalną kaskadę sygnalizacyjną po rozpoznaniu wzorców molekularnych związanych z uszkodzeniem (DAMP), aktywując NF-κB i AP-1. Zmodyfikowane makrofagi reporterowe wytwarzają embrionalny enzym fosfatazę alkaliczną (SEAP) po aktywacji NF-κB i AP-1, który jest wykrywany w reakcji...

Test sygnalizacji czynnika transkrypcyjnego NF-&kcy;B/AP-1 zależnego od TLR w makrofagach

Opisujemy protokół filtracji próbek wody za pomocą wkładu filtrującego i ekstrakcji środowiskowego DNA (eDNA) bez konieczności rozcinania obudowy w celu wyjęcia filtra. Protokół ten został opracowany do metabarkodowania eDNA ryb, ale ma również zastosowanie do eDNA z innych organizmów.

Zastosowanie wkładu filtracyjnego do filtracji próbek wody i ekstrakcji środowiskowego DNA

Określanie różnorodności grzybów w środowisku jest metodą wykorzystywaną w badaniach nad zdrowiem zawodowym do identyfikacji zagrożeń dla zdrowia. Protokół ten opisuje ekstrakcję DNA z próbek powietrza zawodowego w celu amplifikacji i sekwencjonowania regionów ITS grzybów. Takie podejście wykrywa wiele gatunków grzybów, które mogą zostać pominięte przez tradycyjne metody oceny.

Pobieranie i ekstrakcja próbek powietrza w miejscu pracy do analizy DNA grzybów

Niniejszym przedstawiamy protokół do pomiaru przy łóżku pacjenta aktywności endotoksyn w próbkach ludzkiej krwi pełnej. Test aktywności endotoksyn jest prostym do wykonania testem i może być użytecznym biomarkerem u krytycznie chorych pacjentów z sepsą.

Test aktywności endotoksyn w celu wykrycia endotoksemii krwi pełnej u pacjentów w stanie krytycznym

Zrozumienie składu biologicznego pyłu zawieszonego w środowisku jest ważne dla badania jego znaczącego wpływu na zdrowie ludzi i rozprzestrzenianie się chorób. W tym przypadku zastosowaliśmy trzy rodzaje metod pobierania próbek bioaerozoli oraz analizę biologiczną drobnoustrojów unoszących się w powietrzu, aby lepiej zbadać społeczności drobnoustrojów unoszących się w powietrzu w różnych warunkach środowiskowych.

Analiza składu i rozmieszczenia bioaerozoli w różnych warunkach środowiskowych

Wykrywanie endotoksyn w nanomateriałach inżynieryjnych stanowi jedno z największych wyzwań w dziedzinie nanomedycyny. W tym miejscu przedstawiamy studium przypadku, które opisuje ramy składające się z trzech różnych formatów LAL w celu oszacowania potencjalnego zanieczyszczenia endotoksynami w nanocząstkach.

Wykrywanie endotoksyn w nanopreparatach za pomocą testów lizatu amebocytów limulusa (LAL)

Ten protokół dostarcza badaczom szybkiej, pośredniej metody pomiaru aktywności czynnika transkrypcyjnego NF-кB/AP-1 zależnego od TLR w linii komórkowej mysich makrofagów w odpowiedzi na różnorodne powierzchnie polimerowe i zaadsorbowane warstwy białek, które modelują mikrośrodowisko implantu biomateriału.

Test komórek reporterowych makrofagów do zbadania sygnalizacji NF-kB/AP-1 za pośrednictwem receptora toll-podobnego na zaadsorbowanych warstwach białek na powierzchniach polimerowych

Niezawodne i dokładne formy analizy DNA w terenie są kluczowe dla wielu branż. Niniejszy artykuł oferuje dwie metody analizy mikroorganizmów środowiskowych w terenie: 1) izolację DNA mikroorganizmów z próbek środowiskowych za pomocą zestawu terenowego do ekstrakcji biologicznej oraz 2) analizę DNA za pomocą jednostki qPCR w terenie.

Analiza DNA mikroorganizmów w terenie z wykorzystaniem zestawu do ekstrakcji biologicznej oraz jednostki qPCR

Poznaj metodę ekstrakcji endotoksyn i DNA z filtrów powietrza w celu analizy aerozoli biologicznych. Technika ta umożliwia badanie zanieczyszczeń powietrza w środowisku zamkniętym i otwartym.

Analiza filtra z próbką powietrza pod kątem endotoksyn i zawartości DNA

Przeglądaj więcej filmów