Analiza filtra z próbką powietrza pod kątem endotoksyn i zawartości DNA

Ogólnym celem tej procedury jest opisanie sposobu dokładnej analizy zawartości endotoksyn i DNA w wyekstrahowanych cząstkach zawieszonych w powietrzu, pobranych na filtry. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad biologicznymi aerozolami wewnątrz i na zewnątrz pomieszczeń, takich jak zrozumienie kwestii zdrowotnych. Procedurę pobierania próbek na filtr zaprezentuje Yinon Mazar, doktorant z mojego laboratorium.

Do poboru próbek o dużej objętości należy stosować filtry z włókien kwarcowych. Można również wybrać konkretny rodzaj filtra oraz wielkość odcięcia filtra, które najlepiej odpowiadają potrzebom badawczym. Filtry przeznaczone do pobierania związków organicznych i biologicznych należy poddać uprzedzaniu poprzez ich wcześniejsze indywidualne zawinięcie w folię aluminiową.

Następnie należy wypalić je w piecu laboratoryjnym w temperaturze 450 °C przez co najmniej pięć godzin. Pozwoli to na usunięcie wszelkich istniejących pozostałości organicznych. Wypalone filtry należy przechowywać w temperaturze 20 °C do momentu ich wykorzystania do pobierania próbek.

Następnie należy wyczyścić i zdezynfekować próbnik o dużym przepływie, taki jak opisany w towarzyszącym protokole tekstowym. Potem należy umieścić upieczony wcześniej filtr w kasecie filtra i uruchomić próbnik zgodnie z instrukcjami producenta w celu pobrania odpowiedniej próbki. W komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II należy wyciąć 22 okrągłe kawałki czystego, upieczonego wcześniej materiału filtracyjnego, używając czystego wycinaka do korków o średnicy 1,12 centymetra.

Użyj tych elementów do przygotowania serii filtrów wzbogaconych endotoksyną, które posłużą jako kontrole. Następnie wytnij z filtrów zawierających zebraną próbkę fragmenty o średnicy 1,12 cm za pomocą czystego wycinaka do korków i umieść każdą próbkę w osobnej, wolnej od pirogenów probówce o pojemności 2 ml. Przenieś również wysuszone filtry wzbogacone endotoksyną do oddzielnych, wolnych od pirogenów probówek o pojemności 2 ml.

Do każdej probówki należy dodać 1 ml wody wolnej od pirogenów. Następnie wstrząsać nimi przez 60 minut w temperaturze pokojowej za pomocą wytrząsarki laboratoryjnej. Kolejno, probówki z próbkami należy odwirować w mikrocentryfudze przy 375 ×g przez 10 minut.

Następnie przenieś supernatant zawierający endotoksyny do nowej, wolnej od pirogenów probówki o pojemności 2 ml. Przygotuj wolną od pirogenów mikropłytkę 96-dołkową z płaskim dnem i pokrywką do testu na endotoksyny, wyznaczając najpierw rozmieszczenie próbek.

Następnie włącz czytnik mikropłytek i zaprogramuj go na reakcję kinetyczną w temperaturze 37 °C z wstrząsaniem co pięć minut. Następnie przeprowadź pomiary przy 405 nm. Powtórz pięciominutowe wstrząsanie i odczyt płytki 18 razy.

Napełnij płytkę, umieszczając 50 µL standardowych roztworów endotoksyn, wcześniej użytych do wzbogacenia filtrów, w rzędach od A1 do A10 oraz od B1 do B10. Próbki ślepe umieść w polach A11, A12, B11 i B12. Następnie dodaj nadosad z odwirowanego ekstraktu ze wzbogaconych filtrów oraz odpowiadające im próbki ślepe do rzędów C i D. Na koniec dodaj nadosady z próbek eksperymentalnych i próbek ślepych do pozostałych studniek, zależnie od potrzeb.

Aby aktywować test, szybko dodaj 50 µL roztworu glikatu amebocytów limulusa do każdej studzienki. Delikatnie potrząśnij płytką w poziomie. Następnie umieść ją w czytniku płytek i rozpocznij przebieg eksperymentu.

Po zakończeniu pomiaru wyjmij płytkę z czytnika płytek. Określ poziom endotoksyn w każdej próbce, korzystając z krzywej wzorcowej, a następnie oblicz wydajność ekstrakcji endotoksyn z filtrów próbek. W pierwszej kolejności przygotuj filtry z dodatkiem DNA zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym.

Dla każdej próbki filtra przygotuj mieszaninę przemytych kwasem szklanych kulek w sterylnych probówkach o pojemności 0,5 mililitra, stosując 0,1 grama kulek o średnicy od 425 do 600 mikrometrów oraz 0,3 grama kulek o średnicy mniejszej niż lub równej 106 mikrometrów. Następnie, używając zdezynfekowanego wycinaka do korków o średnicy 1,12 centymetra, wytnij trzy okrągłe fragmenty z losowo wybranych miejsc każdej próbki filtra. Umieść próbki filtra w oddzielnych probówkach z nakrętką o pojemności dwóch mililitrów.

Następnie do każdej probówki dodaj mieszankę szklanych kulek oraz 60 µL buforu do lizy komórek dołączonego do zestawu do ekstrakcji DNA. Zamknij probówki i umieść próbki w homogenizatorze kuleczkowym. Użyj homogenizatora do mechanicznego rozbicia przefiltrowanych komórek przez jedną minutę, a następnie schłodź próbki, umieszczając je na lodzie przez kolejną minutę.

Powtórz ten cykl pięć razy. Postępuj zgodnie z protokołem dostawcy zestawu i wyekstrahuj DNA z lizowanych komórek. Po elucji ponownie przepuść eluowaną próbkę przez kolumnę ekstrakcyjną, aby zwiększyć wydajność DNA.

Włącz urządzenie do ilościowej PCR z wyprzedzeniem, aby umożliwić mu rozgrzanie. W nowym pliku programu wprowadź szczegóły przebiegu ilościowej PCR w oprogramowaniu sterującym urządzeniem. Następnie zdezynfekuj powierzchnię roboczą środkiem do usuwania DNA z powierzchni i pracuj wyłącznie ze sterylnymi probówkami, końcówkami oraz odczynnikami.

Dodatkowo ustaw wiadro z lodem obok stanowiska pracy i umieść w nim mieszaninę tac polemoraris. Przygotuj mieszaninę reakcyjną do ilościowego PCR zgodnie z opisem w tabeli cztery dołączonego protokołu tekstowego. Mieszaninę reakcyjną przechowuj w ciemności i w lodzie do momentu użycia.

Następnie umieść czystą mikropłytkę w uchwycie, aby zapobiec jej kontaktowi z powierzchnią roboczą i zachować jej czystość. Do studni mikropłytki do ilościowego PCR dodaj w trzech powtórzeniach po jednym mikrolitrze standardowego DNA, DNA z próbki lub wody wolnej od nukleaz. Następnie do każdej studni reakcyjnej dodaj dziewięć mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej (master mix).

Po zakończeniu przykryj płytkę optyczną folią klejącą i szczelnie zaklej ją ze wszystkich stron. Wiruj płytkę w wirówce wyposażonej w koszyczki do płytek przez jedną minutę przy 1000 ×g przed umieszczeniem jej w termocyklerze. Na koniec uruchom przygotowany program ilościowej PCR.

Podczas ekstrakcji endotoksyn próbki na filtrach są wirowane w wirówce w celu wydobycia endotoksyn z filtra. Różne prędkości wirowania prowadzą do różnej wydajności ekstrakcji, szczególnie przy wyższych stężeniach endotoksyn.

Należy przeprowadzić wstępny test wydajności ekstrakcji dla wybranego filtra i zastosowanego protokołu. Wyższą wydajność ekstrakcji uzyskuje się w przypadku wzbogacania czystych filtrów w porównaniu z próbkowanymi filtrami kwarcowymi, a obie te wartości są niższe niż wydajność osiągana podczas bezpośredniej detekcji roztworu wzorcowego. Po opanowaniu metody analiza endotoksyn może zostać przeprowadzona w trzy i pół godziny, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak sekwencjonowanie DNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące transportu organizmów w atmosferze. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak efektywnie izolować endotoksyny i DNA z filtrów próbek powietrza oraz jak poddać je dokładnej analizie.