Name: Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Poznaj metodę obrazowania mitochondriów i centrosomów w żywych zarodkach Danio rerio. Technika umożliwia badanie dynamiki organelli in vivo bez interwencji chirurgicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

P.E. jest wspierany przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 oraz Graduate School of the Technische Universität München (TUM-GS). G.P. był wspierany przez TUM-GS. L.T. jest wspierany przez stypendium EMBO (EMBO ALTF 108-2013). Prace D.P. nad danio pręgowanym były wspierane przez DFG za pośrednictwem Sonderforschungsbereich "Molekularne mechanizmy neurodegeneracji" (SFB 596); Centrum Zintegrowanych Nauk o Białkach (Monachium) oraz Siódmego Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej (7PR/2007-2013) na podstawie umowy o grant nr 200611 (MEMOSAD). Obecnie jest stypendystą New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow i był stypendystą Niemieckiej Akademii Nauk Leopoldina. L.G. jest wspierany przez DFG w ramach projektu SFB 870 "Assembly and Function of Neuronal Circuits" (Montaż i funkcja obwodów neuronalnych). 
Jesteśmy wdzięczni Kristinie Wullimann za utrzymanie naszego obiektu do ryb, Yvonne Hufnagel za wsparcie techniczne i Thomasowi Misgeldowi za komentarze do manuskryptu. Jesteśmy wdzięczni R. Kösterowi (Technische Universität Braunschweig) za dostarczenie wektora M1 Medusa (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP), z którego sklonowaliśmy Centrin-YFP oraz S.C. Suzuki i T. Yoshimatsu (University of Washington) za dostarczenie kasety 14xUAS:MA-cerulean, której użyliśmy do wygenerowania konstrukcji reportera do stworzenia CentrinFish. Podziękowania kierujemy również do S.C. Suzuki i T. Yoshimatsu (University of Washington) za linię transgeniczną Otx2:Gal4, A. Sagastiego za konstrukt Sensory:Gal4-VP16 (UCLA) oraz M. Noneta (Washington University w St. Louis) za wektor pCold Heart Tol2. Dziękujemy Bettinie Schmid, Alexandrowi Hruscha i Christianowi Haassowi (Niemieckie Centrum Chorób Neurodegeneracyjnych w Monachium - DZNE) za wkład w rozwój MitoFish.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu demonstrujemy wszechstronność systemu ekspresji Gal4-UAS do fluorescencyjnego znakowania mitochondriów, centrosomów i błon komórkowych określonych typów komórek in vivo w zarodkach danio pręgowanego. Wiele fluorescencyjnych białek fuzyjnych, które znakują inne organelle lub struktury subkomórkowe, można znaleźć w opublikowanej literaturze i można je uzyskać z odpowiedniego laboratorium, źródeł komercyjnych lub niekomercyjnych depozytów plazmidowych (np . Addgene). Aby zaprojektować nowe fl...

Obrazowanie in vivo zapewnia bezpośrednią wizualizację zachowań komórek w najbardziej fizjologicznym kontekście. Przezroczystość zarodków danio pręgowanego, ich szybki i zewnętrzny rozwój oraz bogaty wachlarz narzędzi genetycznych, które umożliwiają znakowanie fluorescencyjne, przyczyniły się do coraz powszechniejszego stosowania mikroskopii in vivo w celu wyjaśnienia dynamiki kluczowych zdarzeń rozwojowych. Na przykład badania obrazowe rozwoju układu nerwowego u danio pręgowanego znacznie poszerzyły naszą wiedzę na temat zachowania neuronalnych komórek progenitorowych i losu ich potomstwa, w tym ich późniejszej migracji, różnicowania i integracji obwodów.
Scena jest teraz gotowa do zbadania dynamiki subkomórkowej leżącej u podstaw tych zachowań komórkowych. Danio pręgowany jest już wykorzystywany jako narzędzia w biologii komórki in vivo. Obecnie możliwe jest uwidocznienie mitochondriów9-11, centrosomów2,8,12-14, Golgiego15, cytoszkieletu mikrotubuli4 i aktyny16, endosomów17 i składników kompleksu błony wierzchołkowej1,18, wśród innych struktur subkomórkowych w zarodkach danio pręgowanego in vivo. Jak dotąd wiele z tego, co wiadomo o funkcji tych organelli, pochodzi z badania ich zachowania w hodowanych komórkach. Podczas gdy badania in vitro przyniosły ogromny wgląd w biologię komórki, komórki w hodowli nie reprezentują w pełni złożoności sytuacji in vivo, a zatem niekoniecznie odzwierciedlają funkcję i dynamikę organelli subkomórkowych in vivo. Zarodki danio pręgowanego stanowią realną alternatywę in vivo dla badania dynamiki subkomórkowej.
Jako kręgowce, danio pręgowany posiada wiele układów narządów (np. siatkówkę nerwową), które są homologiczne do tych występujących u gatunków ssaków. Ponadto zarodki danio pręgowanego są coraz częściej wykorzystywane do modelowania chorób człowieka19,20, w tym związanych z funkcją centrosomalną (np. małogłowie21 i wrodzona ślepota Lebera22) oraz funkcją mitochondriów (np. choroba Parkinsona23, tauopapatie10,24 i zespół Bartha25). Obrazowanie in vivo na poziomie komórkowym i subkomórkowym w tych przypadkach pozwoli lepiej zrozumieć biologię komórki leżącą u podstaw tych stanów patologicznych.
Ogólnym celem opisanych tutaj metod jest dostarczenie kompleksowego przewodnika do badania organelli i innych struktur subkomórkowych w zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii świetlnej in vivo. Opisano cały przepływ pracy związany z wizualizacją i śledzeniem struktur subkomórkowych in vivo - od podejść do znakowania genetycznego, przez generowanie przejściowo eksprymujących i stabilnych ryb transgenicznych, a na końcu do obrazowania za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej. Podczas gdy każda z tych procedur jest stosowana przez liczne laboratoria danio pręgowanego, opisane protokoły są zoptymalizowane i usprawnione pod kątem badania dynamiki struktur subkomórkowych. Warto wspomnieć o dwóch konkretnych aspektach opisanej tu pracy: Po pierwsze, zastosowanie systemu ekspresji Gal4-UAS w wielu konfiguracjach do genetycznego znakowania organelli w określonych typach komórek. Po drugie, bezpośrednie porównanie mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej z obrazowaniem struktur subkomórkowych in vivo.
Obecne strategie genetycznego znakowania organelli i innych struktur subkomórkowych u ryb danio pręgowanych wykorzystują mRNA1,4,8 z czapeczką lub konstrukty oparte na DNA, gdzie elementy promotora bezpośrednio sterują ekspresją białek fuzyjnych9,14,15. Transkrybowane in vitro ograniczone RNA powoduje szybką i szeroką ekspresję, która nie jest jednak specyficzna dla tkanki. Ponadto poziomy ekspresji zmniejszają się z czasem, gdy zakryte RNA jest rozcieńczane lub degradowane. W związku z tym zastosowanie konstruktów opartych na RNA do badania dynamiki organelli na późniejszych etapach rozwoju jest ograniczone (zwykle do 3 dni po zapłodnieniu).
Te ograniczenia można przezwyciężyć za pomocą konstrukcji DNA, gdzie przestrzenna i czasowa kontrola ekspresji jest określana przez określone elementy promotora. Gdy konstrukty oparte na DNA są używane w kontekście systemu Gal4-UAS, obserwuje się znaczną poprawę poziomów ekspresji transgenów26,27. W tym dwudzielnym systemie ekspresji elementy promotora specyficzne dla typu komórki napędzają ekspresję aktywatora transkrypcji Gal4, podczas gdy geny reporterowe są klonowane poniżej sekwencji aktywującej wiązanie Gal4 (UAS). Łącząc reportery UAS z odpowiednimi sterownikami Gal4, ekspresja może być ograniczona do określonych typów komórek, omijając potrzebę klonowania genów reporterowych za różnymi promotorami za każdym razem, gdy pożądany jest określony wzorzec ekspresji. Co więcej, ekspresja wielu genów reporterowych UAS może być sterowana przez pojedynczy aktywator Gal4. System Gal4-UAS zapewnia zatem wszechstronne i elastyczne podejście genetyczne do znakowania subkomórkowego.
Mikroskopy konfokalne i szerokokątne są najdoskonalszymi narzędziami większości laboratoriów. Systemy szerokokątne zazwyczaj wykorzystują lampę łukową jako źródło światła i wykrywają emitowane światło za pomocą czułej kamery, która jest umieszczona na końcu ścieżki światła. Ta metoda obrazowania jest zwykle ograniczona do cienkich próbek, ponieważ nieostre światło przesłania ostre informacje w grubszych próbkach. Mikroskopy konfokalne różnią się od systemów szerokokątnych tym, że są zbudowane tak, aby faworyzować sygnały pochodzące z płaszczyzny ogniskowej nad tymi, które pochodzą z nieostrości (tj. "sekcja optyczna")28. Aby uzyskać przekrój optyczny, na ścieżce emisji umieszcza się otworek w pozycji sprzężonej z punktowym źródłem światła. Jako źródła światła stosuje się lasery, a sygnały są wykrywane za pomocą fotopowielaczy (PMT). W praktyce wiązka laserowa jest przesuwana po próbce punkt po punkcie, a emisja fluorescencji w każdym punkcie (pikselu) jest wykrywana przez PMT.
Tutaj obrazujemy dokładnie te same struktury subkomórkowe w żywych zarodkach danio pręgowanego, używając zarówno mikroskopii szerokokątnej, jak i konfokalnej, aby zapewnić bezpośrednie porównanie obu modalności mikroskopii. Podstawowym celem takich porównań jest przedstawienie wskazówek dotyczących wyboru najbardziej odpowiedniej techniki mikroskopowej dla konkretnego pytania.
Korzystając z opisanych tutaj metod, demonstrujemy genetyczne znakowanie mitochondriów i centrosomów oparte na Gal4-UAS. Organelle te są obrazowane w różnych typach komórek układu nerwowego oraz w komórkach mięśniowych za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej, aby wykazać przydatność każdej metody obrazowania. Opisane tutaj metody można łatwo dostosować do badania innych organelli i struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego.

<table><tbody><tr><td>Agaroza (2-hydroksyetyloagaroza)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4018-10G</td><td>Niska temperatura żelowania Typ VII</td></tr><tr><td>Grzejnik blokowy</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Thermomixer compact</td></tr><tr><td>Ca(NO3)2 Hydrat azotanu wapnia, 99.996%&nbsp;</td><td>Aldrich</td><td>202967-50g</td><td>Aby przygotować 30x kamerę</td></tr><tr><td>CCD</td> Danieau <td>Qimaging</td><td>Retiga Exi Fast 1394</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5 z powłoką ceramiczną</td><td>Dumont - Fine Science Tools</td><td>11252-50</td><td>#5</td></tr><tr><td>Kleszcze Konfokalny laserowo-skaningowy mikroskop Olympus</td><td></td><td>FV1000 Fluoview</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewacz do naczyń</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>DH-35</td><td>Pierścień grzewczy</td></tr><tr><td>Sól metanosiarczanu 3-aminobenzoesanu etylu</td><td>PharmaQ</td><td>Tricaine PharmaQ-25g</td><td>Tricaine (znieczulający)</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop preparacyjny</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw GeneClean</td><td>MP Biomedicals</td><td>111001200</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli ze szklanym dnem</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td>szalka Petriego 35 mm, mikrostudzienka 14 mm, szkło nakrywkowe nr 0</td></tr><tr><td>Igły szklane</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>Do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-250g</td><td>Do przygotowania 30x wysokopróżniowego smaru Danieau's</td></tr><tr><td></td><td>Dow Corning&nbsp;</td><td>DCC000001242 150g</td><td>Smar z dwutlenku krzemu</td></tr><tr><td>KCl 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7643-5kg</td><td>Do przygotowania 30x</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O &nbsp; &nbsp; Siarczan magnezu siedmiowodny 98+% Odczynnik A.C.S</td><td>. Sigma-Aldrich</td><td>230291-500g</td><td>Do przygotowania 30x</td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz Danieau&nbsp;</td><td>Końcówki do mikroładowarek Eppendorf</td><td></td><td>FemtoJet</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>0,5-20 ul</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Maerzhaeuser Wetzlar</td><td>MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na mikropipety</td><td>Intracel</td><td>P/N 50-00XX-130-1</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Zestaw do transkrypcji</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>Do transkrypcji PCS-Transposase</td></tr><tr><td>NaCl BioXtra >99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1kg</td><td>Do przygotowania 30x</td></tr><tr><td>Nanofotometr</td><td></td><td></td> Danieau <td>Do pomiaru stężenia DNA/RNA</td></tr><tr><td>Ściągacz igieł</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Flaming/Brown</td></tr><tr><td>NIR Apo 40x/0.80W&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>Obiektyw stożkowy zanurzany w wodzie</td></tr><tr><td>N-fenylotiomocznik klasy I, ok. 98%</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td>PTU (zapobiega pigmentacji)</td></tr><tr><td>szalki</td><td>Petriego Sarstedt AG&nbsp;</td><td>821472</td><td>92 x 16mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Formy plastikowe&nbsp;</td><td>Adaptacyjne narzędzia naukowe</td><td>TU-1</td><td>Do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Osłona z pleksiglasu - z otworem</td><td>Wykonane</td><td></td> na zamówienie <td>Otwór w osłonie z pleksiglasu powinien być o 3 mm większy niż średnica obiektywu stożka do zanurzania w wodzie</td></tr><tr><td>Sitko do herbaty (plastikowe)</td><td></td><td></td><td>Do zbierania ikry danio pręgowanego</td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>TC-344B</td><td>Podwójna automatyczna temperatura Kontroler</td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Sarstedt AG&nbsp;</td><td>86.1171</td><td>Plastikowe pipety transferowe 3,5 ml</td></tr><tr><td>UMPlanFI 100x/1,00 W</td><td>Olympus</td><td></td><td>Obiektyw stożkowy do zanurzania w wodzie</td></tr><tr><td>UMPlanFLN 20x/0,50W&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Obiektyw ze stożkiem zanurzanym w wodzie</td></tr><tr><td>Mikroskop szerokokątny</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>PTU (50x Stock)</td><td></td><td></td><td>Rozpuść 76 mg PTU w 50 ml wody destylowanej Mieszaj energicznie w temperaturze pokojowej&nbsp; Przechowywać w temperaturze -20 oC w 1 ml porcji Stosować w 1x roztwór roboczy</td></tr><tr><td>Trikaina (20x Stock)</td><td></td><td></td><td>Rozpuść 200 mg Trikainy w 48 ml wody destylowanej Dodaj 2 ml 1M zasady Tris (pH9) Dostosuj do pH 7&nbsp; Przechowywać w temperaturze -20 oC w 1 ml porcji Stosować przy 1x roztworze roboczym</td></tr><tr><td>Roztwór Danieau (30x Stock)</td><td></td><td></td><td>1,740 mM&nbsp; NaCl&nbsp; 21 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; KCl&nbsp; 12 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; MgSO4.7H2O&nbsp; 18 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Ca (NO3)2 150 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; Bufor HEPES&nbsp; Woda destylowana do 1 l&nbsp; Przechowywać pod adresem 4 oC&nbsp; Stosować w 0,3x roztworze roboczym</td></tr></tbody></table>

obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Obrazowanie in vivo zapewnia bezprecedensowy dostęp do dynamicznego zachowania struktur komórkowych i subkomórkowych w ich naturalnym kontekście. Przeprowadzanie takich eksperymentów obrazowych u wyższych kręgowców, takich jak ssaki, zazwyczaj wymaga chirurgicznego dostępu do badanego systemu. Dostępność optyczna embrionalnych i larwalnych danio pręgowanego pozwala na obejście takich inwazyjnych procedur i umożliwia obrazowanie w nienaruszonym organizmie. Rzeczywiście, danio pręgowany jest obecnie dobrze ugruntowanym modelem do wizualizacji dynamicznych zachowań komórkowych przy użyciu mikroskopii in vivo w szerokim zakresie kontekstów rozwojowych, od proliferacji po migrację i różnicowanie. Nowszym osiągnięciem jest coraz częstsze wykorzystanie danio pręgowanego do badania zdarzeń subkomórkowych, w tym transportu mitochondrialnego i dynamiki centrosomów. Względna łatwość, z jaką te subkomórkowe struktury mogą być genetycznie znakowane przez białka fluorescencyjne i zastosowanie technik mikroskopii świetlnej do ich obrazowania, przekształca danio pręgowanego w model biologii komórki in vivo. Tutaj opisujemy metody generowania konstruktów genetycznych, które fluorescencyjnie znakują organelle, podkreślając mitochondria i centrosomy jako konkretne przykłady. Używamy dwuczęściowego systemu Gal4-UAS w wielu konfiguracjach, aby ograniczyć ekspresję do określonych typów komórek i zapewnić protokoły do generowania przejściowo eksprymujących i stabilnych ryb transgenicznych. Na koniec podajemy wskazówki dotyczące wyboru metod mikroskopii świetlnej, które są najbardziej odpowiednie do obrazowania dynamiki subkomórkowej.

W niniejszej pracy bezpośrednio porównano i zestawiono zastosowanie mikroskopii szerokopolowej oraz konfokalnej do obrazowania mitochondriów i centrosomów w żywych embrionach zebrafish. W zależności od położenia komórek, w których badana jest dynamika organelli, oraz wrodzonej częstotliwości konkretnych zdarzeń subkomórkowych, zazwyczaj lepszym wyborem jest albo mikroskopia szerokopolowa, albo konfokalna. Obrazowano organelle w neuronach RB znajdujących się na powierzchni embrionu oraz w ...

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Ogólnym celem tej metody obrazowania jest badanie organelli subkomórkowych in vivo u kręgowca. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórki neuronalnej, takie jak dynamika mitochondriów lub centrosomów w kontekście in vivo. Główną zaletą tej techniki jest możliwość przeprowadzenia całego eksperymentu na nienaruszonym kręgowcu, bez konieczności stosowania jakichkolwiek procedur chirurgicznych.Metoda ta może dostarczyć informacji nie tylko na temat dynamiki wewnątrzkomórkowej w warunkach fizjologicznych, ale może być również zastosowana w badaniach nad modelami chorób, takimi jak choroba Alzheimera. Po wygenerowaniu embrionów z przejściową ekspresją za pomocą mikroiniekcji lub otrzymaniu embrionów ze stabilnych linii transgenicznych, zgodnie z protokołem tekstowym, pod koniec pierwszego dnia należy odsiać martwe lub niezapłodnione jaja. Używając plastikowej pipety transferowej, przenieś żywotne embriony do roztworu Danieau zawierającego 1x PTU w celu zapobiegania powstawaniu pigmentu i utrzymuj embriony w roztworze Danieau zawierającym 1x PTU do momentu przesiewania pod kątem ekspresji transgenu.W dniu eksperymentu obrazowania należy użyć fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego, aby przesiewowo sprawdzić ekspresję transgenu u znieczulonych embrionów. Następnie wybrane embriony należy przenieść do oddzielnej szalki Petriego zawierającej bufor Danieau z 1x PTU i 1x trikainą. Po znieczuleniu embrionów należy ostrożnie przenieść kilka z nich pipetą do agarozy o niskiej temperaturze topnienia zawierającej 1x PTU i 1x trikainę, przenosząc jak najmniejszą ilość cieczy, aby uniknąć rozcieńczenia agarozy.Przenieś embriony wraz z niewielką ilością agarozy do szalki Petriego z szklanym dnem. Następnie, pracując stosunkowo szybko, za pomocą pęsety ustaw embriony w pożądanej orientacji, zależnie od struktury przeznaczonej do obrazowania. Embriony muszą być odpowiednio zorientowane, na przykład płasko na boku w przypadku obrazowania siatkówki lub neuronu Rohona-Bearda.Precyzyjne ustawienie zapewni najlepszą jakość obrazowania i zoptymalizuje prędkość akwizycji. Po pozostawieniu agarozy do zastygnięcia przez co najmniej 15 minut, należy dodać bufor Danieau z 1x PTU i 1x tricaine, aby przykryć zarodki. W celu przeprowadzenia mikroskopii szerokopolowej, po wyrównaniu temperatury szalki z zamocowanymi rybami w komorze grzewczej do 28,5 °C, należy umieścić ją na stoliku mikroskopu szerokopolowego i po wyborze obszaru zainteresowania otworzyć oprogramowanie mikroskopu.W sekcji Oświetlenie kliknij Ustawienia konfiguracji, aby zdefiniować odpowiednie zestawy filtrów dla interesującej długości fali. W sekcji Ustawienia kamery wprowadź czas ekspozycji wymagany do uzyskania odpowiedniego obrazu. Następnie wybierz achromatyczny obiektyw imersyjny wodny o dużej odległości roboczej, z powiększeniem od 40x do 100x, który posiada najwyższą aperturę numeryczną.Kliknij Live, aby wybrać pole widzenia. W przypadku neuronu R-B obrazuj transport mitochondriów w aksonie głównym, wychodzącym z ciała komórki, lub w arboryzacji obwodowej. Następnie w menu ImageJ kliknij przycisk zaznaczenia prostokątnego i zdefiniuj obszar zainteresowania, tzw. ROI.Następnie kliknij ROI w oknie programu MicroManager. Po wybraniu ROI do obrazowania, kliknij Stop and Save, aby zarejestrować morfologię neuronów w kanale YFP. Aby obrazować transport mitochondriów, kliknij Multi-D Acquisition.Następnie w oknie o nazwie Multi-dimensional Acquisition należy wybrać liczbę punktów czasowych oraz odstęp między nimi. W oknie Multi-dimensional Acquisition kliknij Channels, a następnie dodaj i zdefiniuj długość fali dla obrazowania oraz czas ekspozycji. Kliknij Save images, aby automatycznie zapisać pliki w określonym folderze wskazanym w ścieżce katalogu.Teraz kliknij Acquire w prawym górnym rogu, aby rozpocząć obrazowanie time-lapse. W przypadku mikroskopii konfokalnej, po umieszczeniu zamontowanych embrionów w komorze grzewczej o temperaturze 28.5 °C na stoliku konfokalnym, otwórz oprogramowanie mikroskopu i kliknij Trans Lamp lub Epi Lamp. Następnie, korzystając z okularów mikroskopu, użyj odpowiednio światła przechodzącego lub fluorescencyjnego, aby zidentyfikować obszar zainteresowania.W oknie ustawień akwizycji (Acquisition) należy zweryfikować, czy obiektyw wybrany do obrazowania jest zgodny z obiektywem wyświetlanym w menu rozwijanym dostępnych obiektywów. Następnie, w oknie sterowania akwizycją obrazu (Image Acquisition Control), należy kliknąć przycisk listy barwników i wybrać odpowiednie fluorofory. Alternatywnie można kliknąć przycisk ścieżki światła i barwników (Light Path and Dyes), aby ręcznie ustawić parametry.W oknie ustawień akwizycji (Acquisition Setting) dostosuj współczynnik powiększenia i proporcje skanowanego obrazu, aby uzyskać rozmiar piksela niezbędny do optymalnego rozdzielenia obrazowanych struktur. Ustaw rozmiar piksela na około połowę teoretycznej rozdzielczości obiektywu, stosując tym samym kryterium próbkowania Nyquista. Aby określić rozmiar piksela pozyskanego obrazu, w oknie sterowania akwizycją obrazu (Image Acquisition Control) kliknij przycisk I.Następnie ustaw prędkość skanowania na najwyższą możliwą. Następnie w oknie Image Acquisition Control kliknij Kalman line averaging i ustaw mnożnik na dwa lub trzy, aby zredukować szum. Aby wybrać tryb skanowania sekwencyjnego do obrazowania fluoroforów o nakładających się widmach, kliknij Sequential and Line.Następnie należy dostosować moc wyjściową odpowiednich linii laserowych. Aby stale skanować wybrany obszar podczas regulacji ustawień detektora dla każdego kanału, należy kliknąć XY Repeat lub Focus x2 lub Focus x4. Następnie należy dostosować wartości HV, Gain oraz Offset dla każdego kanału, aby uzyskać obrazy o najwyższej rozpiętości tonalnej wartości szarości.Następnie naciśnij Control + H, aby zwizualizować pozyskane obrazy za pomocą tabeli wyszukiwania (lookup table), która oznacza niedonasycone piksele kolorem niebieskim, a nadnasycone kolorem czerwonym; obu tym stanom należy zapobiegać. Ponownie oceń moc wyjściową odpowiednich linii laserowych oraz ustawienia detektora. Aby zdefiniować górną i dolną granicę wolumenu do obrazowania, w sekcji Acquisition Setting kliknij przycisk End Set przy górnej granicy, a następnie ustaw ostrość na dolnej granicy i naciśnij Start Set.Aby sprawdzić rozdzielczość Z obiektywu, w oknie Image Acquisition Control kliknij symbol I. Następnie wybierz wielkość kroku stanowiącą połowę rozdzielczości Z dla danego obiektywu. W podoknie TimeScan wprowadź częstotliwość, z jaką mają być pozyskiwane stosy Z (Z-stacks), oraz liczbę powtórzeń akwizycji obrazów, aby skonfigurować serię czasową odpowiednią dla dynamiki obrazowanych struktur subkomórkowych.Kliknij przyciski Depth oraz Time, aby potwierdzić, że zostanie wykonany stos Z (Z-stack) oraz seria czasowa. Na koniec kliknij przycisk XY Zt, aby rozpocząć akwizycję obrazów time-lapse. Po zakończeniu akwizycji obrazów kliknij w interfejsie oprogramowania przycisk Series Done.Obrazy należy zapisać w formacie OIB, aby zarejestrować zarówno same zdjęcia, jak i powiązane z nimi metadane. Na tej rycinie przedstawiono organelle oraz neurony R-B znajdujące się na powierzchni zarodka, obrazowane za pomocą mikroskopii szerokopolowej i konfokalnej. W tym przypadku wykorzystano obrazowanie poklatkowe w mikroskopie szerokopolowym, aby śledzić ruch pojedynczego mitochondrium w peryferyjnym drzewie neuronu R-B.Obrazowanie konfokalne jest znacznie wolniejsze i może prowadzić do niedoszacowania dynamiki określonych zdarzeń wewnątrzkomórkowych. Obrazy komórek siatkówki uzyskane za pomocą mikroskopii szerokopolowej charakteryzują się słabym kontrastem, ponieważ sygnały fluorescencyjne z dużej objętości tkanki przesłaniają szczegóły w płaszczyźnie ogniskowej. W tym przypadku możliwość sekcjonowania optycznego w mikroskopii konfokalnej wyraźnie poprawia kontrast.Wstawki przedstawiają szczegóły obszaru wewnętrznej warstwy jądrowej z oznakowaniem błon komórkowych i mitochondriów. Dzięki zastosowaniu specyficznego dla neuronu sensorycznego drivera Gau-4, mozaikowa ekspresja wynikająca z iniekcji UAS-mito-CFP i UAS MAY-FP umożliwia śledzenie pojedynczych komórek przez wiele dni, co pokazano na przykładzie tego neuronu sensorycznego R-B w drugim i trzecim dniu po zapłodnieniu. Oprócz mitochondriów, fluorescencyjne oznakowanie może objąć inne organella subkomórkowe, takie jak centrosomy.W tym przykładzie dwie kasety UAS na pojedynczym ciągłym konstrukcie sterowały ekspresją YFP skierowanego do centrosomów oraz ceruleany skierowanej do błony w komórkach siatkówki. Wstawki przedstawiają komórkę w fazie M. Cała ta procedura zajmuje kilka dni, licząc od krzyżowania, zbierania jaj, iniekcji i ostatecznie obrazowania w trzecim lub czwartym dniu po zapłodnieniu.Właściwy eksperyment obrazowania na mikroskopie może trwać od kilku minut do całego dnia. Po przeprowadzeniu tej procedury można znakować i obrazować inne organelle, takie jak mikrotubule lub peroksysomy, aby zrozumieć ich dynamikę in vivo. Należy pamiętać, że PTU jest rakotwórcze, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek.

imaging-subcellular-structures-in-the-living-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych kształtujących wczesny embrion jest możliwość obrazowania komórek w wysokiej rozdzielczości. Opisujemy tutaj technikę znakowania pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek w całych embrionach ryby danio pręgowanej za pomocą białka GFP skierowanego do błony komórkowej.

Znakowanie i obrazowanie komórek w rdzeniu przedłużonym rybki danio

Opisano obrazowanie rozwoju naczyń mózgowych u larw danio pręgowanego. Dostępne są również techniki ułatwiające obrazowanie 3D i modyfikujące rozwój naczyń mózgowych za pomocą zabiegów chemicznych.

Obrazowanie i rekonstrukcja 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego

Opisany tutaj jest protokół półautomatycznego obrazowania specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego.

Półautomatyczne obrazowanie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego

Opisana tutaj metoda pozwala na analizę poklatkową rozwoju narządów w zarodkach danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, zdolnego do wykonywania sekcji optycznych i prostych strategii dostosowania w celu skorygowania dryfu ogniskowego i płaskiego.

Analiza rozwoju nerek danio pręgowanego z obrazowaniem poklatkowym przy użyciu mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w sekcję optyczną

Mitoza jest niezbędna dla każdego żywego organizmu, a defekty często prowadzą do raka i zaburzeń rozwojowych. Korzystając z tego protokołu obrazowania i danio pręgowanego jako systemu modelowego, naukowcy mogą wizualizować mitozę w żywym organizmie kręgowców i mnogość defektów, które powstają, gdy procesy mitotyczne są wadliwe.

Obserwacja podziału i dynamiki mitotycznej w żywym zarodku danio pręgowanego

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Ten protokół demonstruje sekwencyjną immunofluorescencję i immunohistochemię na kriosekcjach z wczesnych stadiów zarodków danio pręgowanego, umożliwiając precyzyjne analizy kolokalizacji w określonych populacjach komórek.

Sekwencyjna immunofluorescencja i immunohistochemia na kriowyciętych zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Opisano strategię przygotowania próbki do obrazowania wczesnych zarodków danio pręgowanego w nienaruszonym kosmówce za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Analizuje różne orientacje, jakie zarodki nabywają w kosmówce na 70% etapie epibolii i pąków, a także szczegółowo opisuje strategie obrazowania w celu uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej w całym zarodku przy użyciu systemu arkuszy świetlnych.

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

Poznaj metodę obrazowania mitochondriów i centrosomów w żywych zarodkach Danio rerio. Technika umożliwia badanie dynamiki organelli in vivo bez interwencji chirurgicznej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów