Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego
2 kwietnia 2016
Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.
Ogólnym celem tej metody obrazowania jest badanie organelli subkomórkowych u kręgowców in vivo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii komórek neuronalnych, takie jak dynamika mitochondriów czy centrosomów w kontekście in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że cały eksperyment można przeprowadzić na nienaruszonym kręgowcu, bez konieczności przeprowadzania jakiegokolwiek zabiegu chirurgicznego.
Metoda ta może dostarczyć wglądu nie tylko w dynamikę subkomórkową w warunkach fizjologicznych, ale może być również zastosowana do badań modeli prac dyplomowych, takich jak choroba Alzheimera. Po wygenerowaniu zarodków z przejściową ekspresją za pomocą mikroiniekcji lub uzyskaniu zarodków ze stabilnych linii transgenicznych, zgodnie z protokołem tekstowym, pod koniec pierwszego dnia należy przeprowadzić badania przesiewowe w kierunku martwych lub niezapłodnionych komórek jajowych. Za pomocą plastikowej pipety transferowej przenieś żywotne zarodki do roztworu Danieau zawierającego 1x PTU, aby zapobiec tworzeniu się pigmentu, i utrzymuj zarodki w roztworze Danieau zawierającym 1x PTU do czasu badania przesiewowego pod kątem ekspresji transgenu.
W dniu eksperymentu obrazowego użyj fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, aby przebadać znieczulone zarodki pod kątem ekspresji transgenu. Następnie przenieś wybrane zarodki na oddzielną szalkę Petriego zawierającą bufor Danieau z 1x PTU i 1x tricainą. Po znieczuleniu zarodków delikatnie wstrzyknąć kilka z nich do niskotopliwej agarozy zawierającej 1x PTU i 1x trikainę, przenosząc jak najmniej płynu, aby uniknąć rozcieńczenia agarozy.
Przenieś zarodki z niewielką ilością agarozy na szalkę Petriego ze szklanym dnem. Następnie, pracując stosunkowo szybko, użyj kleszczy, aby ustawić zarodki w pożądanej orientacji w zależności od struktury, która ma być zobrazowana. Zarodki muszą być odpowiednio zorientowane, na przykład płasko z boku w celu zobrazowania siatkówki lub neuronu Rohon-Beard.
Precyzyjna orientacja zapewni najlepszą jakość obrazowania i zoptymalizuje szybkość nabywania. Po pozostawieniu agarozy do zestalenia się przez co najmniej 15 minut, dodaj bufor Danieau z 1x PTU i 1x trikainą, aby przykryć zarodki. Aby przeprowadzić mikroskopię szerokokątną, po zrównoważeniu naczynia z zamontowanymi rybami w komorze grzewczej w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza, na stoliku mikroskopu szerokokątnego i wybraniu obszaru zainteresowania, otwórz oprogramowanie mikroskopu.
W obszarze Oświetlenie kliknij Ustawienia konfiguracji, aby zdefiniować odpowiednie zestawy filtrów dla interesującej Cię długości fali. W obszarze Camera settings (Ustawienia aparatu) wprowadź czas ekspozycji wymagany do uzyskania odpowiedniego obrazu. Następnie wybierz obiektyw stożkowy zanurzający się w wodzie na dużą odległość roboczą, w zakresie powiększenia od 40x do 100x, który ma największą aperturę numeryczną i jest korygowany chromatycznie.
Kliknij na Na żywo, aby wybrać pole widzenia. W przypadku neuronu R-B obraz transportu mitochondrialnego w aksonie macierzystym, emanującym z ciała komórki lub w altanie obwodowej. Następnie w menu ImageJ kliknij prostokątny przycisk wyboru i zdefiniuj obszar zainteresowania lub ROI.
I kliknij ROI w oknie mikromenedżera. Po wybraniu ROI dla obrazowania kliknij Zatrzymaj i Zapisz, aby zarejestrować morfologię neuronów w kanale YFP. Aby zobrazować transport mitochondrialny, kliknij Multi-D Acquisition.
Następnie w oknie o nazwie Akwizycja wielowymiarowa wybierz liczbę punktów czasowych oraz interwał między punktami czasowymi. W oknie Multi-dimensional Acquisition (Akwizycja wielowymiarowa) kliknij Channels (Kanały), a następnie dodaj i zdefiniuj długość fali do obrazowania oraz czas ekspozycji. Kliknij Zapisz obrazy, aby automatycznie zapisać pliki w określonym folderze opisanym w trasie katalogu.
Teraz kliknij Zdobądź w prawym górnym rogu, aby rozpocząć obrazowanie poklatkowe. W przypadku mikroskopii konfokalnej, po umieszczeniu zamontowanych zarodków w komorze grzewczej w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza na stoliku konfokalnym, otwórz oprogramowanie mikroskopu i kliknij Lampa Trans lub Lampa Epi. Następnie, za pomocą okularów mikroskopu, użyj odpowiednio światła przechodzącego lub fluorescencyjnego, aby zidentyfikować obszar zainteresowania.
W oknie Ustawienia pozyskiwania sprawdź, czy cel wybrany do obrazowania jest zgodny z celem wyświetlanym w menu rozwijanym dostępnych celów. Następnie w oknie Image Acquisition Control kliknij przycisk listy barwników i wybierz odpowiednie fluorofory. Alternatywnie kliknij przycisk Ścieżka światła i barwniki, aby ręcznie ustawić parametry.
W oknie Acquisition Setting (Ustawienia akwizycji) dostosuj współczynnik powiększenia i proporcje rozmiaru zeskanowanego obrazu, aby uzyskać rozmiar piksela niezbędny do najlepszego rozdzielenia obrazowanych struktur. Ustaw rozmiar piksela na około połowę teoretycznej rozdzielczości obiektywu, postępując w ten sposób zgodnie z kryteriami próbkowania Nyquista. Aby określić rozmiar uzyskanego obrazu w pikselach, w oknie Image Acquisition Control kliknij przycisk I.
Następnie ustaw prędkość skanowania na najwyższą możliwą wartość. Następnie w oknie Image Acquisition Control kliknij uśrednianie linii Kalmana i ustaw współczynnik dwa lub trzy, aby zredukować szum. Aby wybrać tryb skanowania sekwencyjnego do obrazowania fluoroforów z nakładającymi się widmami, kliknij Sekwencyjny i Linia.
Następnie dostosuj moc wyjściową odpowiednich linii laserowych. Aby w sposób ciągły skanować wybrany obszar podczas dostosowywania ustawień detektora dla każdego kanału, kliknij XY Repeat lub Focus x2 lub Focus x4. Następnie dostosuj HV, Gain i Offset dla każdego kanału, aby uzyskać obrazy o najwyższym zakresie dynamicznym wartości szarości.
Teraz naciśnij Control plus H, aby wyświetlić uzyskane obrazy za pomocą tabeli przeglądowej, która identyfikuje nienasycone piksele na niebiesko i przesycone piksele na czerwono, których należy unikać. Ponownie oceń moc wyjściową odpowiednich linii laserowych i ustawienia detektora. Aby zdefiniować górną i dolną granicę głośności, która ma być zobrazowana, w ustawieniach akwizycji kliknij przycisk Zakończ zestaw na górnym limicie, a następnie ustaw ostrość na dolnym limicie i naciśnij Start Set.
Aby sprawdzić rozdzielczość Z obiektywu, w obszarze Image Acquisition Control (Kontrola akwizycji obrazu) kliknij symbol I. Następnie wybierz rozmiar kroku, który jest równy połowie rozdzielczości Z dla danego celu. W oknie podrzędnym TimeScan wprowadź częstotliwość, z jaką powinny być pozyskiwane stosy Z, oraz liczbę przypadków, w których obrazy powinny być pozyskiwane, aby ustawić szereg czasowy odpowiedni dla dynamiki obrazowanej struktury subkomórkowej.
Kliknij przyciski Głębokość i Czas, aby potwierdzić, że zostanie pobrany stos Z i szeregi czasowe. Na koniec kliknij przycisk XY Zt, aby rozpocząć pobieranie zdjęć poklatkowych. Po pobraniu obrazu, w interfejsie oprogramowania, kliknij Seria Gotowe.
I zapisz obrazy w formacie OIB, aby nagrać obrazy i powiązane metadane. Ten rysunek przedstawia organelle i neurony R-B zlokalizowane na powierzchni zarodka za pomocą szerokich pól i mikroskopii konfokalnej. W tym przypadku obrazowanie poklatkowe pod mikroskopem szerokokątnym wykorzystano do śledzenia ruchu pojedynczego mitochondria w obwodowej altanie neuronu R-B.
Obrazowanie konfokalne jest znacznie wolniejsze i może prowadzić do niedoszacowania dynamiki określonych zdarzeń subkomórkowych. Obrazy komórek siatkówki uzyskane za pomocą mikroskopii szerokokątnej mają słaby kontrast, ponieważ sygnały fluorescencyjne z dużej objętości tkanki zasłaniają szczegóły w płaszczyźnie ogniskowej. W tym przypadku zdolność mikroskopii konfokalnej do cięcia optycznego zauważalnie poprawia kontrast.
Wstawki pokazują szczegóły obszaru wewnętrznej warstwy jądrowej, z oznaczeniem błon komórkowych i mitochondriów. Napędzana przez specyficzny czynnik Gau-4 neuronu czuciowego, mozaikowa ekspresja z wstrzyknięć UAS-mito-CFP i UAS MAY-FP pozwala na śledzenie pojedynczych komórek przez kilka dni, jak widać w tym neuronie czuciowym R-B po dwóch i trzech dniach od zapłodnienia. Oprócz mitochondriów inne organelle subkomórkowe, takie jak centrosomy, mogą być znakowane fluorescencyjnie.
W tym przykładzie dwie kasety UAS na jednym ciągłym konstrukcie sterowały ekspresją YFP ukierunkowanego na centrosom i ukierunkowanego na błonę ceruleanu w komórkach siatkówki. Wstawki pokazują komórkę w fazie M. Cała ta procedura wymaga kilku dni od krycia, pobrania komórek jajowych, zastrzyków, a następnie obrazowania w trzy lub cztery dni po zapłodnieniu.
Sam eksperyment obrazowania pod mikroskopem może trwać od kilku minut do całego dnia. Po tej procedurze inne organelle, takie jak mikrotubule lub peroksysomy, mogą być znakowane i obrazowane w celu zrozumienia ich dynamiki in vivo. Nie zapominaj, że PTU jest rakotwórczy i podczas wykonywania tego zabiegu należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono metodę obrazowania organelli subkomórkowych, a konkretnie centrosomów i mitochondriów, w żywych embrionach danio pręgowanego. Technika ta pozwala badaczom na analizę dynamiki organelli in vivo, co dostarcza cennych informacji na temat warunków fizjologicznych oraz stanów chorobowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Zrozumienie dynamiki organelli jest kluczowe dla poznania funkcji komórkowych.
- Badanie tej dynamiki in vivo oferuje przewagi nad metodami tradycyjnymi.
- Zarodki ryb danio ostrobemburskich służą jako model w badaniach nad kręgowcami.
- Metodę tę można zastosować w różnych modelach chorób, w tym w chorobie Alzheimera.
Cel badania
- Aby badać dynamikę mitochondriów i centrosomów w żywych organizmach.
- Aby zapewnić nieinwazyjną metodę badania struktur podkomórkowych.
- Aby pogłębić zrozumienie zachowania organelli w warunkach fizjologicznych.
Zastosowane metody
- Genetyczne znakowanie centrosomów i mitochondriów.
- Mikroskopia szerokopolowa i konfokalna do obrazowania.
- Mikroiniekcja w celu uzyskania embrionów z przejściową ekspresją.
- Stosowanie roztworu Danieau z dodatkiem PTU w celu utrzymania żywotności embrionów.
Główne wyniki
- Skuteczne obrazowanie dynamiki organelli w żywych embrionach danio-ostreoseokreślania.
- Wgląd w zachowanie mitochondriów i centrosomów in vivo.
- Potencjalne zastosowania w badaniu modeli chorób.
- Prezentacja nieinwazyjnego podejścia do obrazowania subkomórkowego.
Wnioski
- Ta metoda stanowi cenny instrument do badania dynamiki organelli.
- Otwiera ona nowe możliwości badawcze w zakresie biologii komórek neuronalnych oraz mechanizmów chorobowych.
- Technikę tę można dostosować do różnych kontekstów eksperymentalnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie organelli subkomórkowych w żywych embrionach kręgowców umożliwia bezpośrednią obserwację dynamicznych procesów komórkowych istotnych dla walidacji celów terapeutycznych i ograniczania ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Model rybki zebrafish zapewnia nienaruszony, optycznie dostępny system do badania zachowania organelli w warunkach fizjologicznych, co zwiększa pewność prognostyczną w zakresie modulacji szlaków sygnałowych. Podejście to zmniejsza zależność od inwazyjnych modeli ssaczych i przyspiesza testowanie hipotez w biologii komórki neuronalnej oraz w systemach związanych z chorobami.
Strategiczne Zastosowania w Badań i Rozwoju Biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację dynamiki mitochondriów i centrosomów in vivo.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośrednią obserwację zachowania organelli w kontekście neuronalnym.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wyboru celu poprzez powiązanie dynamiki subkomórkowej z fenotypami komórkowymi w systemie kręgowców.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe, możliwe do zobrazowania odczyty subkomórkowe w celu standaryzacji testów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia powtarzalne przygotowanie znakowanych embrionów dla spójnych cykli obrazowania.
- Skalowalność: Ułatwia ponowne wykorzystanie platformy dla wielu docelowych organelli przy użyciu wspólnej infrastruktury genetycznej i obrazowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy obrazowanie organelli na etapie odkryć z walidacją przedkliniczną w modelach chorób, takich jak choroba Alzheimera.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia wkład poszczególnych struktur subkomórkowych w dysfunkcję komórkową związaną z chorobą.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez ujawnienie dynamicznych odpowiedzi organelli na perturbacje genetyczne lub farmakologiczne.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, dostarczając danych o rozdzielczości subkomórkowej, które wspierają etapy walidacji celu i identyfikacji związków wiodących, szczególnie w programach koncentrujących się na neuronauce.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez bezpośrednią wizualizację dynamiki organelli w żywych neuronach.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowane, gotowe do analizy systemy embrionalne z fluorescencyjnie znakowanymi organellami do zastosowań w badaniach przesiewowych związków chemicznych.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar transportu mitochondriów i pozycjonowania centrosomów jako funkcjonalnych parametrów odczytu.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość badań przedklinicznych poprzez modelowanie dynamiki podkomórkowej w systemach kręgowców istotnych dla badanych jednostek chorobowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania, którą można dostosować do wielu organelli i typów komórek za pomocą systemu Gal4-UAS.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w funkcji subkomórkowej.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie embrionów oraz protokoły obrazowania w celu zapewnienia powtarzalnej oceny dynamiki subkomórkowej.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka związanych z celami poprzez nieinwazyjne obrazowanie kręgowców.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez powiązanie zachowania organelli z wynikiem fenotypowym w kontekście chorobowym.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli rybek zebrafish, mikroiniekcji oraz generowaniu linii transgenicznych.
- Zależne od systemów mikroskopii fluorescencyjnej z odpowiednimi obiektywami i komorami kontroli środowiskowej.
- Konieczna jest standaryzacja etapów rozwoju embrionów, znieczulenia oraz procedur montowania próbek między zespołami.
- Wymaga uwzględnienia modyfikacji dla różnych celów subkomórkowych i promotorów specyficznych dla danego typu komórek.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak fototoksyczność i interferencja pigmentu, które są niwelowane poprzez zastosowanie PTU oraz praktyki obrazowania przy niskim natężeniu światła.
