Name: Przygotowanie termoczułych powierzchni nanostrukturalnych dla inżynierii tkankowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Poznaj metodę Langmuira-Schaefera do wytwarzania termoczułych powierzchni nanostrukturalnych z kopolimerów blokowych. Ta technika umożliwia kontrolowanie przylegania i odrywania komórek w inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane finansowo przez Projekt Rozwoju Systemów Innowacji Programu Tworzenia Centrów Innowacji dla Zaawansowanych Interdyscyplinarnych Badań "Cell Sheet Tissue Engineering Center (CSTEC)" Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT), Japonia.

1. Synteza polistyrenu-blok-poli(N-izopropylokryloamidu) przez dwuetapową odwracalną addycyjno-fragmentacyjną polimeryzację łańcuchową (RAFT)
<ol>
	<li>Rozpuścić styren (153,6 mmol), kwas 4-cyjano-4-(etylosulfanotiokarbonylo)sulfanylopentanowy (ECT; 0,2 mmol) i 4,4'-Azobis(kwas 4-cyjanalowy) (ACVA; 0,04 mmol) w 40 ml 1,4-dioksanu. Zamrozić roztwór w ciekłym azocie w próżni przez 15-20 minut w celu usunięcia reaktywnych form i stopniowo rozmrażać w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że roztwór jest całkowicie rozmrożony i powtórz ten cykl odgazowywania z zamrażaniem, pompą i rozmrażaniem trzy razy.</li>
	<li>Otrzymać polistyren (PSt) (Mw: 13 500) jako makro RAFT przez polimeryzację w temperaturze 70 °C przez 15 godzin w kąpieli olejowej.</li>
	<li>Wytrącić czynnik PSt makro RAFT za pomocą 800 ml eteru i wysuszyć w próżni.</li>
	<li>Rozpuść monomer IPAAm (4,32 mmol), makro RAFT PSt (0,022 mmol) i ACVA (0,004 mmol) w 4 ml 1,4-dioksanu.</li>
	<li>Usunąć tlen z roztworu w cyklach zamrażania, pompowania i rozmrażania, jak wspomniano w kroku 1.1.</li>
	<li>Po odgazowaniu przeprowadzić polimeryzację w temperaturze 70 °C przez 15 godzin w kąpieli olejowej. Otrzymaj zsyntetyzowaną cząsteczkę St-IPAAm (Mw: 32 800) w taki sam sposób, jak czynnik makro RAFT PSt.</li>
</ol>
2. Przygotowanie silikonowanych hydrofobowych substratów szklanych modyfikowanych
<ol>
	<li>Podłoża szklane (24 mm x 50 mm) należy umyć nadmiarem acetonu i etanolu i poddać sonikacji przez 5 minut w celu usunięcia zanieczyszczeń powierzchniowych.</li>
	<li>Suszyć podłoża w suszarce w temperaturze 65 °C przez 30 minut. Następnie użyj plazmy tlenowej (400 W, 3 min), aby aktywować powierzchnie podłoży w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zanurzyć substraty w toluenie zawierającym 1% heksylotrietoksysilanu na noc w temperaturze pokojowej w celu silanizowania podłoża.</li>
	<li>Umyj silanizowane podłoża w toluenie i zanurz w acetonie na 30 minut w celu usunięcia nieprzereagowanych czynników.</li>
	<li>Wyżarzanie podłoży przez 2 godziny w temperaturze 110 °C w celu dokładnego unieruchomienia powierzchni.</li>
	<li>Pokrój silanizowane podłoża za pomocą noża do szkła o wymiarach 25 mm x 24 mm, aby pasowały do naczyń do kultur komórkowych (rozmiar naczynia: φ35 mm).</li>
</ol>
3. Przygotowanie folii Langmuir i powierzchni przenoszonej folią
<ol>
	<li>Umieść instrument filmowy Langmuir w szafce, aby zapobiec gromadzeniu się kurzu.</li>
	<li>Umyj koryto Langmuir (rozmiar: 580 mm x 145 mm) i bariery wodą destylowaną i etanolem w celu usunięcia zanieczyszczeń.</li>
	<li>Osusz koryto i barierki, wycierając je niestrzępiącym się ręcznikiem. Następnie napełnij koryto około 110 ml wody destylowanej i ustaw bariery po obu stronach koryta. Należy pamiętać, że wodę destylowaną należy dodawać bez rozlewania w następujących krokach od 3.5 do 3.13.</li>
	<li>Podgrzej platynową płytkę Wilhelmy'ego (obwód: 39,24 mm) w celu monitorowania napięcia powierzchniowego za pomocą palnika gazowego, aż płyta zmieni kolor na czerwony, a następnie umyj wodą destylowaną w celu usunięcia zanieczyszczeń. Zawieś płytkę Wilhelmy'ego na drucie przymocowanym do przyrządu do pomiaru ciśnienia powierzchniowego.</li>
	<li>Wyzerować przyrząd do pomiaru ciśnienia powierzchniowego zgodnie z protokołem producenta. Ściskać granicę faz powietrze-woda na korycie przez bariery po obu stronach koryta, aż granica faz osiągnie około 50 cm2 bez żadnych kropli polimeru.</li>
	<li>Odsysaj małe zanieczyszczenia, aż ciśnienie powierzchniowe osiągnie prawie 0 mN/m.</li>
	<li>Zmień położenie barier po obu stronach i dodaj wodę destylowaną, aby skompensować spadek wody destylowanej z kroku 3.6.</li>
	<li>Rozpuścić 5 mg zsyntetyzowanej cząsteczki St-IPAAm w 5 ml roztworu do wywoływania chloroformu. 
	Uwaga: Jako rozpuszczalnik można również stosować dichlorometan lub toluen.</li>
	<li>Delikatnie wrzuć 27 μl St-IPAAm rozpuszczonego w chloroformie na koryto za pomocą mikrostrzykawki lub mikropipety.</li>
	<li>Po odczekaniu 5 minut, aby umożliwić całkowite odparowanie chloroformu, przesuń obie bariery poziomo, aby ścisnąć cząsteczkę St-IPAAm na granicy faz. Utrzymuj stopień ściskania barier na poziomie 0,5 mm/s, aż do osiągnięcia obszaru docelowego 50cm2. 
	Uwaga: Szybki współczynnik kompresji powoduje defekty folii Langmuira.</li>
	<li>Zmierzyć izotermy ciśnienia powierzchniowego (π)-Am za pomocą platynowej płytki Wilhelmy'ego przymocowanej do przyrządu do pomiaru ciśnienia powierzchniowego podczas ściskania zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Po osiągnięciu rozmiaru obszaru docelowego utrzymuj powierzchnię przez 5 minut, aby cząsteczki St-IPAAm mogły się rozluźnić; cząsteczki nie osiągają równowagi natychmiast po ściśnięciu.</li>
	<li>Przenieś folię Langmuira na hydrofobowo zmodyfikowane podłoże szklane za pomocą aparatu transferowego przez 5 minut, aby solidnie zaadsorbować folię. Zamocuj podłoże ze szkła hydrofobowego równolegle na urządzeniu. Podłącz urządzenie do stopnia wyrównującego i poruszaj się prostopadle.</li>
	<li>Podnieść podłoże poziomo za pomocą aparatu transferowego i suszyć przez 1 dzień w eksykatorze.</li>
</ol>
4. Hodowla komórek oraz optymalizacja adhezji i odklejania komórek na powierzchni przenoszonej folii Langmuira
<ol>
	<li>W celu przygotowania zawiesin komórkowych należy wyhodować komórki śródbłonka tętnicy szyjnej bydlęcej (BAEC) do jednej trzeciej konfluencji w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i 95% powietrzu na polistyrenie do hodowli tkankowej (TCPS) za pomocą zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 100 U/ml penicyliny.</li>
	<li>Po osiągnięciu konfluencji należy traktować BAEC 3 ml 0,25% trypsyny-EDTA przez 3 minuty w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i 95% powietrzu.</li>
	<li>Dezaktywować trypsynę-EDTA, dodając 10 ml DMEM zawierającego 10% FBS i zebrać zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Wirować przy sile 120 x g przez 5 minut i odsysać supernatant. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 10 ml DMEM.</li>
	<li>Umieść powierzchnie St-IPAAm w świetle ultrafioletowym na czystej ławce do sterylizacji przez 5 minut.</li>
	<li>Odnalezione komórki należy wysiać na powierzchni St-IPAAm w stężeniu 1,0 x 104 komórki/cm2 zliczone za pomocą hemocytometru jednorazowego użytku i obserwować komórki na powierzchni pod mikroskopem wyposażonym w inkubator w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 95% powietrzem. 
	Uwaga: Wysterylizuj powierzchnie St-IPAAm światłem ultrafioletowym wyposażonym w czystą ławkę.</li>
	<li>Rejestruj obrazy poklatkowe przylegających BAEC przez około 24,5 godziny w temperaturze 37 °C za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym o 10-krotnym powiększeniu. Po adhezji BAEC należy odnotować oderwanie się BAEC od powierzchni St-IPAAm w temperaturze 20 °C przez około 3,5 godziny.</li>
</ol>
5. Produkcja arkuszy komórkowych na powierzchniach przenoszonych folią Langmuir
<ol>
	<li>Hodowle BAEC stosowane w taki sam sposób, jak opisano w sekcji 4.</li>
	<li>Wysiać w sumie 1,0 x 105 komórek/cm2 na powierzchni St-IPAAm i inkubować przez 3 dni w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . Zbiegające się BAEC spontanicznie odłączają się w temperaturze 20 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Bae, Y. H., Kwon, I. C., Pai, C. M., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+release+of+macromolecules+from+electrical+and+chemical+stimuli-responsive+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Makromol.+Chem.%2C+Macromol.+Symp%22%5BJournal%5D)">Controlled release of macromolecules from electrical and chemical stimuli-responsive hydrogels.</a> Makromol. Chem., Macromol. Symp. 70-71 (1), 173-181 (1993).</li>
<li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+control+of+free+energy+and+topography+of+nanostructured+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Reversible control of free energy and topography of nanostructured surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (29), 8904-8905 (2004).</li>
<li>Nykanen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+behavior+and+temperature-responsive+molecular+filters+based+on+self-assembly+of+polystyrene-block-poly%28N-isopropylacrylamide%29-block-polystyrene%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Phase behavior and temperature-responsive molecular filters based on self-assembly of polystyrene-block-poly(N-isopropylacrylamide)-block-polystyrene.</a> Macromolecules. 40 (16), 5827-5834 (2007).</li>
<li>Sun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+switching+between+superhydrophilicity+and+superhydrophobicity%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Reversible switching between superhydrophilicity and superhydrophobicity.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (3), 357-360 (2004).</li>
<li>Shuler, R. L., Zisman, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Study+of+the+behavior+of+Polyoxyethylene+at+the+air-water+interface+by+wave+damping+and+other+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Study of the behavior of Polyoxyethylene at the air-water interface by wave damping and other methods.</a> J. Phys. Chem. 74 (7), 1523-1534 (1970).</li>
<li>Kawaguchi, M., Sauer, B. B., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+monolayer+dynamics+at+the+air%2Fwater+interface+by+surface+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Polymeric monolayer dynamics at the air/water interface by surface light scattering.</a> Macromolecules. 22 (4), 1735-1743 (1989).</li>
<li>Saito, W., Kawaguchi, M., Kato, T., Imae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+solvent+and+temperature+effects+on+interfacial+properties+of+Poly+%28N-isopropylacrylamide%29+films+at+the+air-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Spreading solvent and temperature effects on interfacial properties of Poly (N-isopropylacrylamide) films at the air-water interface.</a> Langmuir. 7463 (11), 5947-5950 (1996).</li>
<li>Jheng, K. T., Hsu, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+effect+of+PMMA+on+its+miscibility+with+PS-b-PEO+at+the+air%2Fwater+interface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+App.+Polym.+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular weight effect of PMMA on its miscibility with PS-b-PEO at the air/water interface.</a> J. App. Polym. Sci. 125 (3), 1986-1992 (2012).</li>
<li>Biesalski, M. A., Knaebel, A., Tu, R., Tirrell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+on+a+polymerized+peptide-amphiphile+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion on a polymerized peptide-amphiphile monolayer.</a> Biomaterials. 27 (8), 1259-1269 (2006).</li>
<li>Da Silva, A. M. P. S. G., Lopes, S. I. C., Brogueira, P., Prazeres, T. J. V., Beija, M., Martinho, J. M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermo-responsiveness+of+poly%28N%2CN-diethylacrylamide%29+polymers+at+the+air-water+interface%3A+The+effect+of+a+hydrophobic+block%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+colloid+interface+sci%22%5BJournal%5D)">Thermo-responsiveness of poly(N,N-diethylacrylamide) polymers at the air-water interface: The effect of a hydrophobic block.</a> Journal of colloid interface sci. 327 (1), 129-137 (2008).</li>
<li>Wang, S. Q., Zhu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+method+to+prepare+smooth+and+homogeneous+polymer+brush+surfaces+of+varied+brush+thickness+and+grafting+density%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Facile method to prepare smooth and homogeneous polymer brush surfaces of varied brush thickness and grafting density.</a> Langmuir. 25 (23), 13448-13455 (2009).</li>
<li>Estillore, N. C., Park, J. Y., Advincula, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langmuir%E2%88%92Schaefer+%28LS%29+macroinitiator+film+control+on+the+grafting+of+a+thermosensitive+polymer+brush+via+surface+initiated-ATRP%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Langmuir−Schaefer (LS) macroinitiator film control on the grafting of a thermosensitive polymer brush via surface initiated-ATRP.</a> Macromolecules. 43 (16), 6588-6598 (2010).</li>
<li>Seo, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanowire+and+mesh+conformations+of+diblock+copolymer+blends+at+the+air%2Fwater+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanowire and mesh conformations of diblock copolymer blends at the air/water interface.</a> Nano Lett. 4 (3), 483-486 (2004).</li>
<li>Lu, Q., Bazuin, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent-assisted+formation+of+nanostrand+networks+from+supramolecular+diblock+copolymer%2Fsurfactant+complexes+at+the+air%2Fwater+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+lett%22%5BJournal%5D)">Solvent-assisted formation of nanostrand networks from supramolecular diblock copolymer/surfactant complexes at the air/water interface.</a> Nano lett. 5 (7), 1309-1314 (2005).</li>
<li>Nagano, S., Matsushita, Y., Ohnuma, Y., Shinma, S., Seki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+highly+ordered+dot+array+of+surface+micelles+of+a+block+copolymer+via+liquid+crystal-hybridized+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of a highly ordered dot array of surface micelles of a block copolymer via liquid crystal-hybridized self-assembly.</a> Langmuir. 22 (12), 5233-5236 (2006).</li>
<li>Perepichka, I. I., Borozenko, K., Badia, A., Bazuin, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-induced+order+transition+in+nanodot-forming+diblock%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Pressure-induced order transition in nanodot-forming diblock.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (493), 19702-19705 (2011).</li>
<li>Wang, X. L., Ma, X. Y., Zang, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+behavior+of+polystyrene-b-poly%28acrylicacid%29+at+the+air-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Aggregation behavior of polystyrene-b-poly(acrylicacid) at the air-water interface.</a> Soft Matter. 9 (2), 443-453 (2013).</li>
<li>Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Today%22%5BJournal%5D)">Cell sheet engineering.</a> Mater. Today. 7 (5), 42-47 (2004).</li>
<li>Rollason, G., Daviest, J. E., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+report+on+cell+culture+on+a+thermally+reversible+copolymer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Preliminary report on cell culture on a thermally reversible copolymer.</a> Biomaterials. 14 (2), 153-155 (1993).</li>
<li>Park, Y. S., Ito, Y., Imanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeation+control+through+porous+membranes+immobilized+with+thermosensitive+polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Permeation control through porous membranes immobilized with thermosensitive polymer.</a> Langmuir. 14 (4), 910-914 (1998).</li>
<li>Kwon, O. H., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+cell+sheet+recovery+by+co-grafting+of+PEG+with+PIPAAm+onto+porous+cell+culture+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Accelerated cell sheet recovery by co-grafting of PEG with PIPAAm onto porous cell culture membranes.</a> Biomaterials. 24 (7), 1223-1232 (2003).</li>
<li>Kikuchi, A., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructured+designs+of+biomedical+materials%3A+applications+of+cell+sheet+engineering+to+functional+regenerative+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Nanostructured designs of biomedical materials: applications of cell sheet engineering to functional regenerative tissues and organs.</a> J. Control. Release. 101 (1-3), 69-84 (2005).</li>
<li>Fukumori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+ultra-thin+temperature-responsive+polymer+layer+and+its+polymer+thickness+dependency+on+cell+attachment%2Fdetachment+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+biosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of ultra-thin temperature-responsive polymer layer and its polymer thickness dependency on cell attachment/detachment properties.</a> Macromol. biosci. 10 (10), 1117-1129 (2010).</li>
<li>Takahashi, H., Nakayama, M., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+chain+length+and+graft+density+of+thermoresponsive+polymer+brushes+for+optimizing+cell+sheet+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled chain length and graft density of thermoresponsive polymer brushes for optimizing cell sheet harvest.</a> Biomacromolecules. 11 (8), 1991-1999 (2010).</li>
<li>Nakayama, M., Yamada, N., Kumashiro, Y., Kanazawa, H., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoresponsive+poly%28N-isopropylacrylamide%29-based+block+copolymer+coating+for+optimizing+cell+sheet+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide)-based block copolymer coating for optimizing cell sheet fabrication.</a> Macromol. Biosci. 12 (6), 751-760 (2012).</li>
<li>Sakuma, M., et al. Control of cell adhesion and detachment on Langmuir-Schaefer surface composed of dodecyl-terminated thermo-responsive polymers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakuma%2C+M+%22J.+Biomater.+Sci.%2C+Polym.+Ed%22">J. Biomater. Sci., Polym. Ed</a>. 25 (5), 431-443 (2014).</li>
<li>Sakuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoresponsive+nanostructured+surfaces+generated+by+the+Langmuir-Schaefer+method+are+suitable+for+cell+sheet+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Thermoresponsive nanostructured surfaces generated by the Langmuir-Schaefer method are suitable for cell sheet fabrication.</a> Biomacromolecules. 15 (11), 4160-4167 (2014).</li>
<li>Moad, G., Chong, Y. K., Postma, A., Rizzardo, E., Thang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+RAFT+polymerization%3A+the+synthesis+of+polymers+with+defined+end-groups%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Advances in RAFT polymerization: the synthesis of polymers with defined end-groups.</a> Polymer. 46 (19), 8458-8468 (2005).</li>
<li>Nishida, K., et al. Corneal Reconstruction with Tissue-Engineered Cell Sheets Composed of Autologous Oral Mucosal Epithelium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNishida%2C+K+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. 351 (12), 1187-1196 (2004).</li>
<li>Ohki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+esophageal+stricture+after+endoscopic+submucosal+dissection+using+tissue-engineered+cell+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Prevention of esophageal stricture after endoscopic submucosal dissection using tissue-engineered cell sheets.</a> Gastroenterology. 143 (3), 582-588 (2012).</li>
<li>Sawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineered+myoblast+sheets+improved+cardiac+function+sufficiently+to+discontinue+LVAS+in+a+patient+with+DCM%3A+report+of+a+case%5BTitle%5D)+AND+%22Surg.+Today%22%5BJournal%5D)">Tissue engineered myoblast sheets improved cardiac function sufficiently to discontinue LVAS in a patient with DCM: report of a case.</a> Surg. Today. 42 (2), 181-184 (2012).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy w równym stopniu przyczynili się do powstania manuskryptu i zatwierdzili ostateczną wersję. Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Powierzchnię reagującą na temperaturę wykonano metodą Langmuira-Schaefera, a następnie zoptymalizowano jej właściwości pod kątem adhezji/odczepiania komórek oraz odzyskiwania arkuszy komórkowych. Podczas stosowania tej metody do wytwarzania powierzchni kluczowe są kilka etapów. Skład molekularny cząsteczek St-IPAAm ma istotny wpływ na strukturę i stabilność powierzchni, a co za tym idzie, na adhezję i odczepianie komórek. W szczególności cząsteczki St-IPAAm powinny charakteryzować się wąskim rozkładem masy cząsteczkowej....

Powierzchnie nanostrukturalne ostatnio przyciągnęły znaczną uwagę ze względu na ich różne potencjalne zastosowania, w tym wzory, hodowle komórkowe, czyszczenie i zmianę powierzchni. Na przykład powierzchnie superhydrofobowe inspirowane nanostrukturą liścia lotosu i inne wrażliwe powierzchnie są w stanie reagować na bodźce zewnętrzne1-4.
Folia Langmuira jest jedną z najczęściej badanych powłok polimerowych. Film Langmuira powstaje przez upuszczenie cząsteczek amfifilowych na granicę faz powietrze-woda5-8. Folia może być następnie przenoszona na powierzchnię ciała stałego za pomocą adsorpcji fizycznej lub chemicznej, a konformacja molekularna na powierzchni ciała stałego może być kontrolowana za pomocą metod transferu pionowego i poziomego9-12. Gęstość folii Langmuira można precyzyjnie regulować poprzez ściskanie granicy faz powietrze-woda. Ostatnio metoda ta okazała się również skuteczna w wytwarzaniu nanoskalowych struktur wysp morskich przy użyciu amfifilowych kopolimerów blokowych. Zakłada się, że nanostruktury składają się z rdzenia z segmentów hydrofobowych i otoczki z segmentów hydrofilowych13-17. Ponadto liczba nanostruktur na powierzchni jest regulowana poprzez kontrolowanie powierzchni przypadającej na cząsteczkę (Am) kopolimeru blokowego na granicy faz.
Skupiliśmy się na oryginalnym, unikalnym podejściu do inżynierii tkankowej bez rusztowań, inżynierii arkuszy komórkowych, wykorzystując powierzchnię hodowli reagującą na temperaturę. Opracowana technologia została zastosowana w terapiach regeneracyjnych dla różnych narządów18. Powierzchnię hodowli reagującą na temperaturę wyprodukowano poprzez szczepienie poli(N-izopropyloakrylamidu) (PIPAAm), cząsteczki reagującej na temperaturę, na powierzchni19-27. PIPAAm i jego kopolimery wykazują niższą temperaturę roztworu krytycznego (LCST) w środowisku wodnym w temperaturach bliskich 32 °C. Powierzchnia hodowli wykazywała również reagującą na temperaturę zmianę hydrofobowości i hydrofilowości. W temperaturze 37 °C powierzchnia przeszczepiona za pomocą PIPAAm stawała się hydrofobowa, a komórki łatwo przyczepiały się i namnażały na powierzchni, podobnie jak na konwencjonalnym polistyrenie do hodowli tkankowych. Gdy temperatura została obniżona do 20 °C, powierzchnia stała się hydrofilowa, a komórki spontanicznie oderwały się od powierzchni. W związku z tym wyhodowane zlewające się komórki na powierzchni można zebrać jako nienaruszony arkusz poprzez zmianę temperatury. Te właściwości adhezji i odrywania komórek zostały również wykazane przez powierzchnię wytworzoną przez powłokę z folii Langmuira do demonstracji laboratoryjnej26, 27. Wyprodukowano folię Langmuira z kopolimerów blokowych składających się z polistyrenu (P(St)) i PIPAAm (St-IPAAm). Folia Langmuira o określonej średnicy Am może być przenoszona poziomo na hydrofobowo modyfikowane podłoże szklane. Ponadto oceniono adhezję komórek na przygotowanej powierzchni i odklejanie się od niej w odpowiedzi na temperaturę.
Tutaj opisujemy protokoły wytwarzania nanostrukturalnej folii Langmuira złożonej z termoczułych amfifilowych kopolimerów blokowych na szklanym podłożu. Nasza metoda może zapewnić skuteczną technikę wytwarzania nanofilmów organicznych w różnych dziedzinach nauki o powierzchni i może ułatwić skuteczniejszą kontrolę adhezji komórek do powierzchni i spontaniczne odrywanie się od niej.

<table><tbody><tr><td>N-izopropylokryloamid</td><td>Kohjin</td><td></td><td>Brak numeru katalogowego</td></tr><tr><td>Azobis(kwas 4-cyjanolerynowy)</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>016-19332</td><td></td></tr><tr><td>Styren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4972</td><td></td></tr><tr><td>1,3,5-trioksan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T81108</td><td></td></tr><tr><td>1,4-dioksan</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>045-24491</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Nakarai</td><td>11482-15</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycyna</td><td>GIBCO BRL</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina</td><td>GIBCO BRL</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Japan Bioserum</td><td>JBS-11501</td><td></td></tr><tr><td>Bank Zasobów Naukowych o Zdrowiu</td><td>BAECs</td><td>JCRB0099</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe</td><td>Matsunami Przemysł szklarski</td><td>C024501</td><td></td></tr><tr><td>AFM NanoScope V</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1H NMR INOVA 400</td><td>Varian, Palo Alto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATR/FT-IR NICOLET 6700</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GPC HLC-8320GPC</td><td>Tosoh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000</td><td>Koryta deponacyjne Tosoh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Langmuir-Blodgett&nbsp;</td><td>KSV Instruments</td><td>KN 2002</td><td>KSV NIWA Midium przez</td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE TE2000-U</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie termoczułych powierzchni nanostrukturalnych dla inżynierii tkankowej

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Termoresponsywne powierzchnie immobilizowane poli(N-izopropylakrylamidem) (PIPAAm) do kontroli adhezji i odklejania komórek zostały wytworzone metodą Langmuira-Schaefera. Amfifilowe kopolimery blokowe złożone z polistyrenu i PIPAAm (St-IPAAms) zsyntetyzowano metodą odwracalnej polimeryzacji rodnikowej z przeniesieniem łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego (RAFT). Roztwór chloroformu cząsteczek St-IPAAm delikatnie wrzucono do aparatu Langmuir-trough, a obie bariery aparatu przesunięto poziomo, aby ścisnąć film i regulować jego gęstość. Następnie folia St-IPAAm Langmuir została przeniesiona poziomo na hydrofobowo modyfikowane szklane podłoże za pomocą urządzenia mocowanego powierzchniowo. Obrazy z mikroskopii sił atomowych wyraźnie ujawniły nanoskalowe struktury wysp morskich na powierzchni. Siła, szybkość i jakość adhezji i odklejania komórek na przygotowanej powierzchni były modulowane przez zmiany temperatury w dolnym krytycznym zakresie temperatur roztworu cząsteczek PIPAAm. Ponadto udało się odzyskać dwuwymiarową strukturę komórkową (arkusz komórek) na zoptymalizowanych powierzchniach. Te unikalne powierzchnie PIPAAm mogą być przydatne do kontrolowania siły adhezji i odklejania komórek.

Kopolimery blokowe składające się z polistyrenu i poli(N-izopropylakryloamidu) (St-IPAAms) o określonych masach cząsteczkowych zostały zsyntetyzowane metodą polimeryzacji rodnikowej RAFT. ECT został przygotowany jako czynnik przeniesienia łańcucha zgodnie z opisem Moad et al.28. Zsyntetyzowano dwie cząsteczki St-IPAAm o różnych długościach łańcuchów PIPAAm, a otrzymane polimery blokowe scharakteryzowano za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego...

Nanoskalowane powierzchnie wysp morskich złożone z termoczułych kopolimerów blokowych zostały wytworzone metodą Langmuira-Schaefera do kontrolowania spontanicznej adhezji i odklejania komórek. Uwidoczniono zarówno przygotowanie powierzchni, jak i adhezję i odklejanie się komórek na powierzchni.

Przygotowanie termoczułych powierzchni nanostrukturalnych dla inżynierii tkankowej

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Ogólnym celem zastosowania metody Langmura-Schaefera z użyciem kopolimerów blokowych jest wytworzenie arkuszy komórkowych w różnych warunkach na powierzchni responsywnej na temperaturę, poprzez kontrolowanie siły adhezji i przyczepności komórek. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biomateriałów, takie jak kwestie materiałów biokompatybilnych, powierzchni do hodowli komórkowych oraz bioseparacji. Główną zaletą tej techniki jest możliwość kontrolowania oddziaływań między powierzchnią responsywną na temperaturę a komórkami oraz optymalizacji warunków modyfikacji w celu odzyskania arkuszy komórkowych.Choć metoda ta może dostarczyć informacji o oddziaływaniwań między komórką a powierzchnią, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak bioseparacja i biofilm. Aby rozpocząć, rozpuścić styren, ECT i ACVA w 40 mililitrach 1, 4-dioksanu. Zamrozić roztwór w ciekłym azocie pod próżnią przez 15 do 20 minut w celu usunięcia gatunków reaktywnych.Po stopniowym rozmrożeniu roztworu w temperaturze pokojowej, powtórz ten cykl zamrażania, pompowania, rozmrażania i odgazowywania trzykrotnie. Uzyskaj polistyren jako makroagent RAFT poprzez polimery

preparation-thermoresponsive-nanostructured-surfaces-for-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W tym protokole demonstrujemy wytwarzanie biomimetycznych substratów do hodowli komórek serca wykonanych z dwóch różnych materiałów polimerowych za pomocą litografii kapilarnej.  Opisane metody zapewniają skalowalną, opłacalną technikę inżynierii struktury i funkcji makroskopowych tkanek serca do zastosowań in vitro i in vivo.

Litografia sił kapilarnych w inżynierii tkankowej serca

Aby stworzyć wysoce zorganizowane struktury złożonej tkanki, należy złożyć wiele typów materiałów i komórek w zintegrowany kompozyt.  Ten kombinatoryczny projekt obejmuje warstwowe arkusze komórek specyficzne dla narządów z dwoma odrębnymi materiałami pochodzenia biologicznego, zawierającymi silną włóknistą podstawę macierzy oraz komórki śródbłonka w celu usprawnienia tworzenia nowych naczyń.

Inżynieria tkankowa: budowa wielokomórkowego rusztowania 3D do dostarczania warstwowych arkuszy komórkowych

Opisano metodę otrzymywania nanowłókien i złożonych nanostruktur z pojedynczych lub wielu białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta wykorzystuje interakcje białko-powierzchnia do tworzenia wolnostojących materiałów na bazie białek o przestrajalnym składzie i architekturze do wykorzystania w różnych zastosowaniach inżynierii tkankowej i biotechnologii.

Nanowłókna i nanostruktury białkowe ECM zaprojektowane przy użyciu montażu inicjowanego powierzchniowo

Przedstawiamy technikę wytwarzania mikrokieszeni w membranach elektroprzędzonych, w których można badać zachowanie komórek. W szczególności opisujemy połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu produkcji urządzeń z biomateriału rogówki PLGA (poli(laktyd-ko-glikolid)) wyposażonych w mikrocechy.

Połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu wytworzenia membran wyposażonych we wnęki do regeneracji rogówki

Substraty do hodowli komórkowych funkcjonalizowane mikroskalowymi wzorcami biologicznych ligandów mają ogromną użyteczność w dziedzinie inżynierii tkankowej. W tym miejscu demonstrujemy wszechstronną i zautomatyzowaną produkcję substratów do kultur tkankowych za pomocą wielu, mikrowzorcowych szczotek z poli(glikolu etylenowego) prezentujących ortogonalną chemię, która umożliwia przestrzennie precyzyjną i specyficzną dla miejsca immobilizację ligandów biologicznych.

Wytwarzanie złożonych substratów kulturowych przy użyciu zrobotyzowanego drukowania mikrokontaktowego (R-μCP) i sekwencyjnej substytucji nukleofilowej

Przygotowano rusztowanie do wstrzykiwań inżynierii tkankowej składające się z mikrocząsteczek poli(N-izopropylacrylamidu)-siarczanu chondroityny (PNIPAAm-g-CS)-zawierającego poli(N-izopropylacrylamid). W tym badaniu analizowana jest siła adhezji, właściwości pęcznienia i biokompatybilność in vitro. Opracowane tutaj techniki charakterystyki mogą mieć zastosowanie do innych systemów termożelowania.

Synteza termożelujących kompozytów siarczanowych poli(N-izopropylacyloamidu)-grafto-chondroityny z mikrocząstkami alginianowymi dla inżynierii tkankowej

Opisane są protokoły wytwarzania degradowalnych termoresponsywnych hydrożeli opartych na sieciowaniu hydrazonów polimerowych oligomerów na skalę masową, mikroskalową i nanoskalę, przy czym ta ostatnia służy do przygotowania zarówno nanocząstek żelowych, jak i nanowłókien.

Wytwarzanie degradowalnych termoczułych hydrożeli w różnych skalach długości za pomocą wytłaczania reaktywnego, mikrofluidyki, samoorganizacji i elektroprzędzenia

Ten protokół opisuje metodologię biodruku przy użyciu zautomatyzowanego zrobotyzowanego systemu deponowania, który łączy wytrawione wskazówki topograficzne z precyzyjnym osadzaniem biotuszu z hydrożelu na komórce. Wydrukowane komórki są dostarczane bezpośrednio do wytrawionych elementów i są w stanie je wyczuć i zorientować się w sytuacji.

Zautomatyzowana zrobotyzowana technika dozowania do prowadzenia powierzchni i biodruku komórek

Przedstawiono protokół wytwarzania dużego obszaru nanowzorzystego podłoża z małych form o nanowzorze do badania nanotopograficznej modulacji zachowania komórek.

Ekspandowanie nanowzorzystych substratów przy użyciu techniki ściegu do nanotopograficznej modulacji zachowania komórek

Opisano metodę uzyskiwania nierównych nanowzorów na bazie dendrymerów, które pozwalają na nanoskalową kontrolę lokalnej gęstości powierzchni kwasu arginina-glicyna-asparaginowa (RGD) i zastosowano ją do badania adhezji komórek i różnicowania chondrogennego.

Nierówne nanowzorce na bazie dendrymerów do lokalnej kontroli adhezji powierzchni: metoda kierowania różnicowaniem chondrogennym

Obecny protokół opisuje narzędzia do obsługi mikroelektrod wewnętrznych z krzemu podczas zabiegów modyfikacji powierzchni poprzez osadzanie gazu i reakcje roztworu wodnego. Szczegółowo wyjaśniono montaż komponentów używanych do obsługi urządzeń podczas całej procedury.

Narzędzia do obróbki powierzchniowej krzemowych płaskich mikroelektrod wewnątrzkorowych

Poznaj metodę Langmuira-Schaefera do wytwarzania termoczułych powierzchni nanostrukturalnych z kopolimerów blokowych. Ta technika umożliwia kontrolowanie przylegania i odrywania komórek w inżynierii tkankowej.

Przygotowanie termoczułych powierzchni nanostrukturalnych dla inżynierii tkankowej

Przeglądaj więcej filmów