Przygotowanie termoczułych powierzchni nanostrukturalnych dla inżynierii tkankowej

Ogólnym celem zastosowania metody Langmura-Schaefera z użyciem kopolimerów blokowych jest wytworzenie arkuszy komórkowych w różnych warunkach na powierzchni responsywnej na temperaturę, poprzez kontrolowanie siły adhezji i przyczepności komórek. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biomateriałów, takie jak kwestie materiałów biokompatybilnych, powierzchni do hodowli komórkowych oraz bioseparacji. Główną zaletą tej techniki jest możliwość kontrolowania oddziaływań między powierzchnią responsywną na temperaturę a komórkami oraz optymalizacji warunków modyfikacji w celu odzyskania arkuszy komórkowych.

Choć metoda ta może dostarczyć informacji o oddziaływaniwań między komórką a powierzchnią, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak bioseparacja i biofilm. Aby rozpocząć, rozpuścić styren, ECT i ACVA w 40 mililitrach 1, 4-dioksanu. Zamrozić roztwór w ciekłym azocie pod próżnią przez 15 do 20 minut w celu usunięcia gatunków reaktywnych.

Po stopniowym rozmrożeniu roztworu w temperaturze pokojowej, powtórz ten cykl zamrażania, pompowania, rozmrażania i odgazowywania trzykrotnie. Uzyskaj polistyren jako makroagent RAFT poprzez polimeryzację w temperaturze 70 °C przez 15 godzin w łaźni olejowej. Wytrąc polistyrenowy makroagent RAFT w 800 ml eteru, a następnie wysusz w próżni.

Następnie rozpuść monomer IPAAm, makroinicjator RAFT z polistyrenu oraz ACVA w czterech mililitrach 1, 4-dioksanu. Usuń tlen z roztworu, stosując cykle odgazowywania metodą zamrażania, pompowania i rozmrażania, jak poprzednio. Po odgazowaniu przeprowadź polimeryzację w kąpieli olejowej w temperaturze 70 °C przez 15 godzin.

W końcu otrzymuje się zsyntetyzowaną cząsteczkę St-IPAAm w ten sam sposób, co makro-agent RAFT polistyrenowy. Podłoża szklane należy przemyć nadmiarem acetonu i etanolu, a następnie poddać sonikacji przez pięć minut w celu usunięcia zanieczyszczeń z powierzchni. Podłoża należy wysuszyć w piecu w temperaturze 65 °C przez 30 minut.

Następnie, w temperaturze pokojowej, wykorzystaj plazmę tlenową do aktywacji powierzchni podłoży. Aby przeprowadzić sylanizację podłoży, zanurz je na całą noc w temperaturze pokojowej w toluenie zawierającym 1% hexatrimethoxysilane. Następnie przemyj sylanizowane podłoża toluenem i zanurz w acetonie na 30 minut w celu usunięcia nieprzereagowanych odczynników.

Wyżarzaj podłoża przez dwie godziny w temperaturze 110 °C, aby całkowicie unieruchomić powierzchnię. Na koniec potnij sylanizowane podłoża przecinakem do szkła do wymiarów 25 mm na 24 mm, aby pasowały do naczyń hodowlanych. Umieść urządzenie do filmów Langmuira w szafce, aby zapobiec gromadzeniu się kurzu.

Umyj kuwetę Langmuira wraz z barierami wodą destylowaną i etanolem, aby usunąć zanieczyszczenia. Osusz kuwetę i bariery, przecierając je ręcznikiem bezochłapowym. Następnie napełnij kuwetę około 110 mililitrów wody destylowanej i zamontuj bariery po obu stronach kuwety.

Następnie należy podgrzać platynową płytkę Wilhelmy'ego służącą do monitorowania napięcia powierzchniowego za pomocą palnika gazowego, aż płytka rozżarzy się na czerwono. Następnie płytkę należy wypłukać wodą destylowaną, aby usunąć zanieczyszczenia. Płytkę Wilhelmy'ego zawiesza się na drucie przymocowanym do urządzenia do pomiaru ciśnienia powierzchniowego.

Wyzeruj przyrząd do pomiaru ciśnienia powierzchniowego zgodnie z protokołem producenta. Ściśnij powierzchnię styku powietrze-woda w korycie za pomocą barier po obu stronach, aż powierzchnia osiągnie około 50 centymetrów kwadratowych, nie zawierając żadnych kropel polimeru. Odsysaj wszelkie niewielkie zanieczyszczenia, aż ciśnienie powierzchniowe wyniesie prawie zero milinewtonów na metr.

Ponownie ustaw bariery po obu stronach i dodaj wodę destylowaną, aby zrekompensować jej ubytek. Następnie rozpuść 5 mg zsyntetyzowanej cząsteczki St-IPAAm w 5 mL roztworu wywołującego na bazie chloroformu. Następnie, używając mikrosτρzykawki lub mikropipety, ostrożnie nanieś 27 µL St-IPAAm rozpuszczonego w chloroformie na powierzchnię koryta.

Po odczekaniu pięciu minut w celu całkowitego odparowania chloroformu, przesuń obie bariery poziomo, aby skompresować cząsteczki St-IPAAm na powierzchni. Utrzymuj prędkość kompresji barier na poziomie 0.5 milimetrów na sekundę, aż do osiągnięcia docelowej powierzchni 50 centymetrów kwadratowych. Podczas kompresji mierz izotermy ciśnienia powierzchniowego Pi-A za pomocą platynowej płytki Wilhelmy'ego podłączonej do urządzenia do pomiaru ciśnienia powierzchniowego, zgodnie z protokołem producenta.

Po osiągnięciu docelowej powierzchni obszaru, utrzymuj ją przez pięć minut, aby umożliwić relaksację cząsteczek St-IPAAm. Cząsteczki nie osiągają stanu równowagi natychmiast po kompresji. Następnie przenieś film Langmuira na hydrofobowo zmodyfikowany podłoże szklane za pomocą aparatu transferowego przez pięć minut, aby zapewnić trwałą absorpcję filmu.

Przymocuj równolegle hydrofobowy podłoże szklane w urządzeniu. Podłącz urządzenie do stołu wyrównawczego i przesuń je prostopadle. Podnieś podłoże poziomo za pomocą aparatu transportowego i susz przez jeden dzień w deskrykatorze.

Aby przygotować zawiesiny komórkowe, hoduj komórki śródbłonka tętnicy szyjnej bydlęcej (BAECs) do osiągnięcia 1/3 konfluencji w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 i 95% powietrza, na polistyrenie do hodowli tkanek w pożywce DMEM zawierającej FBS i penicylinę. Po osiągnięciu odpowiedniej konfluencji potraktuj BAECs trzema mililitrami 0,25% trypsyny EDTA przez trzy minuty w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 i 95% powietrza. Dezaktywuj trypsynę EDTA, dodając 10 mililitrów pożywki DMEM zawierającej 10% FBS.

Następnie zebrać zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Po wirowaniu z prędkością 120 ×g przez pięć minut, odessać nadsącz i resuspendować komórki w 10 ml DMEM. Wysiać odzyskane komórki na powierzchnie St-IPAAm w zagęszczeniu 10 000 komórek na cm², odmierzone za pomocą jednorazowego hemocytometru.

Obserwować komórki na powierzchniach za pomocą mikroskopu wyposażonego w inkubator w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 95% powietrza. Następnie wysterylizować powierzchnie St-IPAAm światłem ultrafioletowym w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Rejestrować obrazy timelapse adherentnych BAECs przez około 24,5 godziny w temperaturze 37 °C za pomocą mikroskopu fazokontrastowego z 10-krotnym powiększeniem.

Po adhezji BAEC rejestruj odrywanie się BAEC od powierzchni St-IPAAm w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez około 3,5 godziny. Po optymalizacji adhezji i odrywania się komórek na powierzchni z przeniesionym filmem Langmuira, wytwórz arkusze komórkowe, najpierw hodując BAEC w sposób opisany wcześniej. Wysiej łącznie 100 000 komórek na centymetr kwadratowy na powierzchniach St-IPAAm.

Następnie inkubować przez trzy dni w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2. Konfluencyjne BAECs oddzieliły się spontanicznie w temperaturze 20 °C. Tutaj przedstawiono przygotowanie powierzchni z przeniesionym filmem Langmuira reagującym na temperaturę.

Zsyntetyzowany roztwór St-IPAAm w chloroformie delikatnie naniesiono na granicę faz powietrze-woda. Do kompresji cząsteczek St-IPAAm na powierzchni wykorzystano dwie bariery, aż do osiągnięcia docelowej powierzchni 50 cm². Podczas kompresji mierzono ciśnienie powierzchniowe, aby wykryć ewentualne defekty w filmie Langmuira.

Po kompresji podłoże w postaci szkiełka podstawowego zmodyfikowanego hydrofobowo umieszczono poziomo na granicy faz za pomocą stolika pozycjonującego. Podłoże podniesiono poziomo i suszono przez jedną dobę. Po tym etapie powierzchnie St-IPAAm były gotowe do użycia w eksperymentach z hodowlami komórkowymi.

Tutaj przedstawiono reprezentatywne wyniki obrazowania topograficznego powierzchni St-IPAAm wykonanego za pomocą mikroskopii sił atomowych. Nanostruktury zaobserwowano na obu powierzchniach St-IPAAm. Rozmiar i kształt nanostruktur były silnie zależne od AM oraz składu St-IPAAm.

Tutaj przedstawiono obraz makroskopowy odzyskanej warstwy komórek na powierzchni z przeniesioną warstwą Langmuira z St-IPAAm 480 i powierzchniową gęstością cząsteczek (AM) wynoszącą 40 nanometrów kwadratowych na cząsteczkę. Komórki osiągnęły konfluencję po trzech dniach hodowli na powierzchniach St-IPAAm 170 i St-IPAAm 480 w temperaturze 37 °C. Warstwa komórek została szybko odzyskana po obniżeniu temperatury z 37 do 20 °C.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak wytwarzać, jak projektować skład molekularny polimeru, wytwarzać i przenosić błonę Langmuira, kontrolować adhezję i odrywanie komórek oraz odzyskiwać arkusze komórkowe. Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny biomateriałów i inżynierii tkankowej do badania oddziaływań między komórkami a powierzchniami oraz strategii hodowli komórkowych do zastosowania w medycynie regeneracyjnej. Znaczenie tej techniki rozciąga się na terapię transplantacją komórek, ponieważ pozwala ona na wytwarzanie arkuszy z różnych typów komórek pobranych od pacjentów.