Przygotowanie termoczułych powierzchni nanostrukturalnych dla inżynierii tkankowej

Ogólnym celem tej metody Langmuira-Schaefera z kopolimerami blokowymi jest wytwarzanie arkuszy komórek w różnych warunkach powierzchni reagującej na temperaturę, poprzez kontrolowanie siły adhezji komórek i przyczepów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomateriałów, takie jak materiały biokompatybilne, powierzchnia hodowli komórkowych i bioseparacja. Główną zaletą tej techniki jest to, że można kontrolować interakcję między powierzchnią reagującą na temperaturę a komórkami, a także zoptymalizować warunki modyfikacji odzyskiwania arkusza komórek.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w interakcję między komórką a powierzchnią, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak bioseparacja i biofilm. Na początek rozpuść styren, ECT i ACVA w 40 mililitrach 1,4-dioksanu. Zamrozić roztwór w ciekłym azocie w próżni przez 15 do 20 minut, aby usunąć reaktywne formy.

Po stopniowym rozmrożeniu roztworu w temperaturze pokojowej powtórz ten cykl zamrażania, pompowania, rozmrażania, odgazowywania trzy razy. Otrzymaj polistyren jako środek makro-RAFT przez polimeryzację w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 15 godzin w kąpieli olejowej. Wytrącić polistyrenowy makro-RAFT 800 mililitrami eteru i wysuszyć w próżni.

Następnie rozpuść monomer IPAAm, polistyrenowy środek makro-RAFT i ACVA w czterech mililitrach 1,4-dioksanu. Usuń tlen z roztworu za pomocą cykli zamrażania, pompowania, rozmrażania jak poprzednio. Po odgazowaniu przeprowadzić polimeryzację w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 15 godzin w kąpieli olejowej.

Na koniec należy otrzymać zsyntetyzowaną cząsteczkę St-IPAAm w taki sam sposób, jak polistyrenowy środek makro-RAFT. Umyj szklane podłoża nadmiarem acetonu i etanolu i poddaj sonifikacji przez pięć minut, aby usunąć zanieczyszczenia powierzchniowe. Podłoża suszyć w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Następnie użyj plazmy tlenowej, aby aktywować powierzchnie podłoży w temperaturze pokojowej. Zanurzyć substraty w toluenie zawierającym 1% heksatrimetoksysilanu na noc w temperaturze pokojowej w celu sylanizacji podłoża. Następnie umyj zylane podłoża w toluenie i zanurz w acetonie na 30 minut w celu usunięcia nieprzereagowanych czynników.

Wyżarzaj podłoża przez dwie godziny w temperaturze 110 stopni Celsjusza, aby dokładnie unieruchomić powierzchnię. Na koniec przyciąć zylizowane podłoża za pomocą noża do szkła na 25 milimetrów na 24 milimetry, aby pasowały do naczyń do kultur komórkowych. Umieść instrument filmowy Langmuir w szafce, aby zapobiec gromadzeniu się kurzu.

Umyj koryto Langmuir w barierach wodą destylowaną i etanolem, aby usunąć zanieczyszczenia. Osusz koryto i barierki, wycierając je niestrzępiącym się ręcznikiem. Następnie napełnij koryto około 110 mililitrami wody destylowanej i ustaw bariery po obu stronach koryta.

Następnie podgrzej platynową płytkę Wilhelmy'ego w celu monitorowania napięcia powierzchniowego za pomocą palnika gazowego, aż płyta zmieni kolor na czerwony. Następnie umyj płytkę wodą destylowaną, aby usunąć zanieczyszczenia. Zawieś płytkę Wilhelmy'ego na drucie przymocowanym do przyrządu do pomiaru ciśnienia powierzchniowego.

Wyzeruj przyrząd do pomiaru ciśnienia powierzchniowego zgodnie z protokołem producenta. Spręż granicę faz powietrze-woda na korycie przez bariery po obu stronach koryta, aż granica osiągnie około 50 centymetrów kwadratowych bez żadnych kropli polimeru. Zasysaj wszelkie drobne zanieczyszczenia, aż ciśnienie powierzchniowe osiągnie prawie zero miliniutonów na metr.

Zmień położenie barier po obu stronach i dodaj wodę destylowaną, aby skompensować spadek wody destylowanej. Następnie rozpuść pięć miligramów zsynestezowanej cząsteczki St-IPAAm w pięciu mililitrach roztworu rozwojowego chloroformu. Następnie delikatnie wrzuć 27 mikrolitrów St-IPAAm rozpuszczonego w chloroformie na koryto za pomocą mikrostrzykawki lub mikropipety.

Po odczekaniu pięciu minut, aby umożliwić całkowite odparowanie chloroformu, przesuń obie bariery poziomo, aby ścisnąć cząsteczkę St-IPAAm na powierzchni. Utrzymuj stopień kompresji barier na poziomie 0,5 milimetra na sekundę, aż do osiągnięcia obszaru docelowego 50 centymetrów kwadratowych. Zmierz ciśnienie powierzchniowe izoterm Pi-A z platynową płytką Wilhelmy'ego przymocowaną do przyrządu do pomiaru ciśnienia powierzchniowego podczas ściskania, zgodnie z protokołem producenta.

Po osiągnięciu rozmiaru obszaru docelowego utrzymuj powierzchnię przez pięć minut, aby cząsteczki St-IPAAm mogły się rozluźnić. Cząsteczki nie osiągają równowagi natychmiast po ściśnięciu. Następnie przenieś folię Langmuira na hydrofobowo zmodyfikowane szklane podłoże za pomocą aparatu transferowego na pięć minut, aby solidnie wchłonąć folię.

Zamocuj podłoże ze szkła hydrofobowego równolegle na urządzeniu. Podłącz urządzenie do stopnia wyrównującego i poruszaj się prostopadle. Podnieść podłoże poziomo za pomocą aparatu transferowego i suszyć przez jeden dzień w eksykatorze.

Aby przygotować zawiesiny komórkowe, należy wyhodować komórki śródbłonka tętnicy szyjnej bydlęcej lub BAEC do 1/3 konfluencji w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2 i 95% powietrzu, na polistyrenie z hodowli tkankowej z DMEM, zawierającym FBS i penicylinę. Po osiągnięciu konfluencji należy traktować BAEC trzema mililitrami 0,25% trypsyny EDTA przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2 i 95% powietrzu. Dezaktywuj trypsynę EDTA, dodając 10 mililitrów DMEM zawierającego 10% FBS.

I zbierz zawiesinę komórek w 50-mililitrowej stożkowej probówce. Po odwirowaniu w ilości 120 razy g przez pięć minut, odessać supernatent i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach DMEM. Wysiewaj odzyskane komórki na powierzchni St-IPAAm w stężeniu 10 000 komórek na centymetr kwadratowy, zliczonym za pomocą jednorazowego hemocytometru.

Obserwuj komórki na powierzchni pod mikroskopem wyposażonym w inkubator w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 i 95% powietrzem. Następnie wysterylizuj powierzchnie St-IPAAm światłem ultrafioletowym wyposażonym w czystą ławkę. Rejestruj obrazy poklatkowe przylegających BAEC przez około 24,5 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym o 10-krotnym powiększeniu.

Po adhezji BAEC należy odnotować odczepianie się BAEC od powierzchni St-IPAAm w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez około 3,5 godziny. Po optymalizacji adhezji i odrywania komórek na przenoszonej powierzchni folii Langmuira, należy wytworzyć arkusze komórek, najpierw hodując BAEC, tak jak poprzednio. Wysiewaj łącznie 100 000 komórek na centymetr kwadratowy na powierzchniach St-IPAAm.

I inkubować przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2. Zlewane BAEC spontanicznie odłączają się w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Przygotowanie reagującej na temperaturę powierzchni przenoszonej folią Langmuir pokazano tutaj.

Zsyntetyzowany roztwór chloroformu St-IPAAm delikatnie upuściono na granicę faz powietrze-woda. Zastosowano dwie bariery do ściskania cząsteczek St-IPAAm na granicy faz, aż do osiągnięcia obszaru docelowego 50 centymetrów kwadratowych. Ciśnienie powierzchniowe zostało zmierzone podczas ściskania w celu wykrycia wszelkich wad folii Langmuira.

Po ściśnięciu hydrofobowo zmodyfikowane podłoże ze szkła nakrywkowego umieszczono poziomo na granicy faz ze stopniem wyrównywania. Podłoże podniesiono poziomo i suszono przez jeden dzień. Po tym etapie powierzchnie St-IPAAm były gotowe do użycia w eksperymentach z hodowlami komórkowymi.

Reprezentatywne wyniki obrazów topograficznych powierzchni St-IPAAm z mikroskopii sił atomowych przedstawiono tutaj. Nanostruktury zaobserwowano na obu powierzchniach St-IPAAm. Wielkość i kształt nanostruktur były silnie uzależnione od AM i składu St-IPAAm.

Tutaj pokazano makroskopowy obraz odzyskanego arkusza komórek na powierzchni przeniesionej na folię Langmuira za pomocą St-IPAAm 480 i AM 40 nanometrów kwadratowych na cząsteczkę. Komórki osiągnęły konfluencję po trzech dniach hodowli na powierzchniach St-IPAAm 170 i St-IPAAm 480 w temperaturze 37 stopni Celsjusza. A arkusz komórek został szybko odzyskany po obniżeniu temperatury z 37 do 20 stopni Celsjusza.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać, jak projektować skład molekularny polimeru, wytwarzać i przenosić folię Langmuira, kontrolować adhezję i odklejanie komórek oraz odzyskiwać arkusz komórek. Po opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się biomateriałami i inżynierią tkankową do badania interakcji między komórkami i powierzchniami oraz strategii hodowli komórkowych do wykorzystania w medycynie zwyrodnieniowej. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię przeszczepów komórek, ponieważ technika ta ma potencjał do wytwarzania arkuszy komórek różnych typów komórek, dostarczanych od pacjentów.