Name: Szybka metoda przygotowania chromosomów do opadania na powietrzu odpowiednia dla RYB w roślinach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Poznaj szybką metodę przygotowania chromosomów roślinnych do FISH w cytogenetyce. Technika opadania na powietrze zwiększa liczbę użytecznych chromosomów i skraca czas przygotowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdecznie dziękujemy DFG za wsparcie finansowe (HO 1779/21-1), a także Katrin Kumke i Dr. Veit Schubert (IPK, Gatersleben) za porady techniczne.

1. Przygotowanie chromosomów
<ol>
	<li>Kiełkowanie nasion i utrwalanie wierzchołków korzeni
	<ol>
		<li>Wykiełkować 10-20 nasion jęczmienia na dwóch warstwach wilgotnej bibuły filtracyjnej na szalce Petriego w ciemnych warunkach przez 2 dni w temperaturze 22-24 °C. Odciąć energiczne korzenie o długości 1-2 cm od nasion za pomocą żyletki.</li>
		<li>Przygotuj lodowatą wodę, umieszczając szklaną butelkę o pojemności 500 ml zawierającą zimną wodę z kranu w pokruszonej lodowatej wodzie. Napowietrz lodowatą wodę i zanurz końcówki korzeni na 20 godzin, aby zwiększyć częstotliwość komórek metafazy.</li>
		<li>Przenieś korzenie z wody do 50 ml utrwalacza etanolu: kwasu octowego (3:1), aby utrwalić je w temperaturze pokojowej przez 2 dni. Przechowywać korzenie w świeżo przygotowanym etanolu: kwasie octowym (3:1) utrwalającym w temperaturze 4 °C przez okres do roku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mycie i obróbka enzymatyczna
	<ol>
		<li>Umyj 10-20 korzeni 30 ml lodowatej wody z kranu przez 5 minut dwa razy za pomocą szklanej zlewki o pojemności 50 ml. Użyj mikroskopu dwuokularowego. Przenieść korzenie pojedynczo do 30 ml 0,01 M buforu cytrynianu (0,01 M kwas cytrynowy + 0,01 M cytrynian sodu, pH 4,8) za pomocą kleszczy i umyć, potrząsając szklaną zlewką przez 5 minut dwukrotnie. Umieść korzenie na bibule filtracyjnej, aby całkowicie usunąć płyn i odciąć niepożądaną tkankę niemerystematyczną za pomocą żyletki.</li>
		<li>Inkubować do 20 końcówek korzeni w 1 ml mieszaniny enzymów w temperaturze 37 °C przez około 50 minut, aby zmiękczyć tkankę roślinną (Tabela 1) w szkiełku zegarkowym. Mieszanina enzymatyczna zawiera 0,7% celulazy R10, 0,7% celulazy, 1% pektoliazy i 1% cytohelikazy rozcieńczonej w 0,01 M buforze cytrynianowym. Mieszaninę enzymów należy przechowywać w temperaturze -20 °C i użyć ponownie do pięciu razy.</li>
		<li>Usunąć enzym za pomocą pipetowania i dwukrotnie umyć końcówki korzeni na lodzie 5 ml 0,01 M buforu cytrynianowego w celu zastąpienia pozostałego enzymu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Maceracja korzeni
	<ol>
		<li>Umyj końcówki korzeni 1 ml 96% etanolu dwukrotnie dokładnie w tym samym szkiełku zegarka. Zastąp etanol świeżo przygotowanym utrwalaczem (75% kwas octowy : 25% etanol). Użyj 10-15 μl utrwalacza na wierzchołek korzenia.</li>
		<li>Przenieś wierzchołki korzeni wraz z utrwalaczem do probówki o pojemności 2 ml i rozdrobnij merystemy korzeniowe za pomocą igły preparacyjnej lub kleszczy. Dotknij rurki 20 razy, aby ponownie zawiesić komórki i uzyskać zawiesinę komórek. Zawiesinę komórek należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do dwóch miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Upuszczanie zawiesiny komórek
	<ol>
		<li>Umieść 2-3 warstwy nasączonej wodą chusteczki papierowej na płycie grzewczej w temperaturze 50 °C. Zanurz mikroskopijne szkiełka w lodowatej wodzie z kranu w lodówce na 30 minut. I umieść szkiełka na wilgotnej chusteczce papierowej.</li>
		<li>Odpipetować 7-10 μl zawiesiny komórek i upuścić ją z odległości 20 cm na schłodzony szkiełko umieszczone na płycie grzejnej. Odpipetować 10 μl mieszaniny kwasu octowego i etanolu w tym samym miejscu, co zawiesina komórek na szkiełku podstawowym i trzymać szkiełko na płycie grzejnej przez dodatkowe 2 minuty. Umieść szkiełko na płycie grzejnej bez mokrej chusteczki i pozostaw do wyschnięcia na 1 minutę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontrola jakości i przechowywanie preparatów
	<ol>
		<li>Sprawdź szkiełka za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym, aby kontrolować jakość rozprzestrzeniania się chromosomów. Preparaty należy stosować tego samego dnia lub przechowywać zanurzając w 96% etanolu w słoiku Coplin w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstępna obróbka szkiełek przed FISH; wszystkie etapy są wykonywane w RT
	<ol>
		<li>Umieść szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 50 ml 2x SSC (20x SSC zawiera 3 M NaCl i 300 mM cytrynian trisodowy) na 5 minut. Za pomocą kleszczy przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego 50 ml 45% kwasu octowego na 3-10 min.</li>
		<li>Przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego 50 ml 2x SSC na 10 min. Przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego 50 ml 4% formaldehydu (w 2x SSC) i zanurz szkiełka na 10 minut w celu utrwalenia chromosomów.</li>
		<li>Usunąć formaldehyd, spłukując szkiełka 3 razy po 4 minuty każde, w słoiku Coplin zawierającym 50 ml 2x SSC. Odwadnianie szkiełek w słoiku Coplin przez 2 minuty w seriach odpowiednio 70%, 90% i 100% etanolu oraz suchych szkiełek w pozycji pionowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)
<ol>
	<li>Dla każdego szkiełka należy przygotować roztwór hybrydyzacyjny o łącznej objętości 20 μl, używając 10 μl dejonizowanego formamidu, 5 μl 4x buforu hybrydyzacyjnego (bufor 200 μl zawiera 80 μl 20x SSC, 8 μl 1 M Tris-HCl pH 8,0, 1,6 μl 0,5 M EDTA, 11,2 μl 10 μg/ μl nasienia łososia i 99,2 μl wody wolnej od DNaz), 3 μl sondy i 2 μl wody wolnej od DNaz.</li>
	<li>Dodać 20 μl roztworu do hybrydyzacji na szkiełko podstawowe i przykryć szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 x 32 mm, a następnie zamknąć szkiełko nakrywkowe cementem gumowym. Denaturyzacja szkiełek za pomocą sond jednocześnie w temperaturze 80 °C przez 2 minuty na płycie grzejnej.</li>
	<li>Przenieść szkiełka do wilgotnej komory i inkubować szkiełka w temperaturze 37 °C O/N, unikając światła. Usuń szkiełka nakrywkowe, spłukując szkiełka w słoiku Coplin z 2x SSC. Umieścić szkiełka w słoiku Coplin o temperaturze 55-60 °C 2x SSC i inkubować przez 20 minut.</li>
	<li>Umieść szkiełka do 2x SSC w słoiku Coplin na 2 minuty w temperaturze RT. Odwodnić szkiełka w słoiku Coplin na 2 minuty w seriach odpowiednio 70%, 90% i 100% etanolu.</li>
	<li>Wysuszyć szkiełka na powietrzu i przeciwbarwić 1 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindoliny (DAPI) w podłożu zapobiegającym blaknięciu, unikając intensywnego światła.</li>
</ol>
3. Analiza mikroskopowa i przechowywanie
<ol>
	<li>Przeanalizuj szkiełka za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. Dobór filtra zależy od fluorochromu użytego do znakowania sondy. W razie potrzeby szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemnych warunkach do roku.</li>
</ol>

<ol><li>Geber, G., Schweizer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+heterochromatin+differentiation+in+Sinapis+alba+%28Cruciferae%29+using+a+simple+air-drying+technique+for+producing+chromosome+spreads%5BTitle%5D)+AND+%22Pl+Syst+Evol%22%5BJournal%5D)">Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads.</a> Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).</li>
<li>Andras, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drop-spreading+technique+to+produce+cytoplasm-free+mitotic+preparations+from+plants+with+small+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes.</a> Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).</li>
<li>Rothfels, K. H., Siminovitch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+air-drying+technique+for+flattening+chromosomes+in+mammalian+cells+grown+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro.</a> Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).</li>
<li>Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+preparation+of+plant+chromosomes+for+high-resolution+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy.</a> Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).</li>
<li>Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+fluorescence+in+situ+hybridization+signal+detection+in+maize+using+directly+labeled+probes+produced+by+high+concentration+DNA+polymerase+nick+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation.</a> Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).</li>
<li>Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy+%27SteamDrop%27+method+for+high+quality+plant+chromosome+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">An easy 'SteamDrop' method for high quality plant chromosome preparation.</a> Mol. Cytogenet. 7, 21(2014).</li>
<li>Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+chromosome+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamics of chromosome spreading.</a> Am J Med Genet. 61 (4), 387-393 (1996).</li>
<li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synteny+between+Brachypodium+distachyon+and+Hordeum+vulgare+as+revealed+by+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH.</a> Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).</li>
<li>Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+painting+using+repetitive+DNA+sequences+as+probes+for+somatic+chromosome+identification+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).</li>
<li>Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+effective+cell+synchronization+in+plant-roots+by+hydroxyurea+and+amiprophos-methyl+or+colchicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine.</a> Genome. 36 (2), 387-390 (1993).</li>
<li>Kim, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+karyotyping+of+sorghum+by+in+situ+hybridization+of+landed+BACs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs.</a> Genome. 45 (2), 402-412 (2002).</li>
<li>Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+physical+mapping+with+barley+BAC+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">FISH physical mapping with barley BAC clones.</a> Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).</li>
<li>Aliyeva-Schnorr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+mapping+with+centromeric+BAC+contigs+shows+that+this+recombination-poor+region+comprises+more+than+half+of+barley+chromosome+3H%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H.</a> Plant J. 84, 385-394 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Eksperyment z preparatyką chromosomów przeprowadzono z wykorzystaniem młodych korzeni zbóż należących do rodziny traw (Poaceae). Wszystkie analizowane gatunki mają 14 stosunkowo długich mitotycznych chromosomów metafazy (11-15 μm) w diploidalnym zestawie genomu i należą do gatunków wielkogenomowych (5,1-7,9 Gbp).
Długość kiełkujących korzeni nie przekraczała 2 cm, aby uzyskać maksymalnie tkankę merystematyczną. Synchronizację dzielących się komórek osiągnięto dzięki 20-godzinnemu leczeniu lodo...

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) jest skutecznym narzędziem do fizycznego mapowania pojedynczych i wysokich kopii sekwencji na poziomie chromosomalnym. Warunkiem wstępnym jest przygotowanie wysokiej jakości rozkładów chromosomowych. Nie ma ogólnego protokołu przygotowania chromosomów, który byłby równie odpowiedni dla komórek zwierzęcych i roślinnych. Przygotowanie chromosomów roślinnych jest szczególnie trudne ze względu na sztywną ścianę komórkową i różną konsystencję cytoplazmy u różnych gatunków. Jedną z korzystnych metod przygotowania chromosomów roślinnych jest tak zwana technika kroplowa, znana również jako technika rozprowadzania kropel i technika suszenia powietrzem 1,2. Metoda ta została po raz pierwszy wprowadzona w 1958 roku przez Rothfelsa i Siminovitcha dla komórek ssaków hodowanych in vitro 3. Później Martin i wsp. 4 oraz Kato i wsp. 5 zaadaptowali tę metodę do roślin.
Niedawno opracowano metodę o nazwie 'SteamDrop', która wykorzystywała parę wodną do przygotowania nienakładających się na siebie chromosomów 6. Chociaż pozytywny wpływ wysokiej wilgotności zaobserwowano już wcześniej 7, "SteamDrop" zapewnia kontrolowany przebieg pracy z wysokiej jakości preparatami chromosomowymi 6. Leczenie parą wodną powoduje rozciąganie chromosomów, prawdopodobnie związane z jakimiś modyfikacjami białek chromosomowych. Jakość uzyskanych rozprzestrzeniania się metafaz jest bardzo wysoka, chociaż utrzymanie wystarczającej liczby kompletnych rozprzestrzeniania się metafaz dla kolejnych eksperymentów FISH wymaga specjalistycznej wiedzy technicznej.
Tutaj prezentujemy protokół przygotowania mitotycznych chromosomów zbóż odpowiednich do wykrywania FISH przez sondy pojedyncze i o wysokiej kopii 5,8. Metoda ta jest ulepszonym wariantem metody upuszczania na sucho opisanej przez Kato 9, wykonywanej przy wilgotności względnej 50%-55% (Rysunek 1). Protokół ten obejmuje zredukowaną liczbę etapów mycia, dzięki czemu jego stosowanie jest łatwe, wydajne i powtarzalne. Korzystając z tego protokołu, uzyskaliśmy wysokiej jakości rozsiewy chromosomowe i wyniki FISH dla Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum i Secale cereale.

<table><tbody><tr><td>Płyta grzejna</td><td>MEDAX GmbH</td><td>12603</td><td></td></tr><tr><td>Celulaza R10</td><td>Duchefa</td><td>C8001</td><td></td></tr><tr><td>Celulaza&nbsp;</td><td>CalBioChem</td><td>219466</td><td></td></tr><tr><td>Pectolyase</td><td>Sigma</td><td>P3026</td><td></td></tr><tr><td>Cytohelikaza</td><td>Sigma</td><td>C8274</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-12-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>C3176</td><td>bezpośredni fluorochrom&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluor488-5-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>C11397</td><td>fluorochrom bezpośredni&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus BX61</td><td>BX61</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Orca ER, Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI)&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>Barwnik fluorescencyjny</td> <td>H-1200</td></tr></tbody></table>

szybka metoda przygotowania chromosomów do opadania na powietrzu odpowiednia dla ryb w roślinach

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Przygotowanie rozkładów chromosomów jest warunkiem wstępnym pomyślnego przeprowadzenia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Przygotowanie wysokiej jakości rozsiewów chromosomów roślinnych jest trudne ze względu na sztywną ścianę komórkową. Jedną z zatwierdzonych metod przygotowania chromosomów roślinnych jest tak zwany preparat kropelkowy, znany również jako technika rozprowadzania kropel lub suszenia powietrzem. W tym miejscu przedstawiamy protokół szybkiego przygotowania mitotycznych rozsiewów chromosomowych odpowiednich do wykrywania FISH sond DNA z pojedynczymi i wysokimi kopiami. Metoda ta jest ulepszonym wariantem metody air-dry drop wykonywanej przy wilgotności względnej 50%-55%. Protokół ten obejmuje zredukowaną liczbę etapów mycia, dzięki czemu jego stosowanie jest łatwe, wydajne i powtarzalne. Oczywistymi korzyściami płynącymi z tego podejścia są dobrze rozprzestrzenione, nieuszkodzone i liczne chromosomy metafazowe, które stanowią doskonały warunek wstępny dla udanej analizy FISH. Korzystając z tego protokołu, uzyskaliśmy wysokiej jakości rozsiewy chromosomów i powtarzalne wyniki FISH dla Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum i Secale cereale.

Preparaty mikroskopowe z rozprzestrzenionymi chromosomami w metafazie mitotycznej przygotowano metodą szybkiego suszenia powietrznego metodą kroplowania, opisaną powyżej (Suppl. Figure 1). Analizę FISH przeprowadzono z wykorzystaniem zarówno sekwencji powtarzalnych, jak i pojedynczych kopii. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z zestawem filtrów umożliwiających wzbudzenie odpowiednich fluoroforów, a następnie zarejestrowano je za pomocą monochromatycznej kamery CCD o wysokiej czułoś...

Opisano protokół przygotowania wysokiej jakości rozsiewów mitotycznych chromosomów roślinnych metodą szybkiego upuszczania na sucho, odpowiednią do wykrywania FISH pojedynczych i wysokokopijnych sond DNA.

Szybka metoda przygotowania chromosomów do opadania na powietrzu odpowiednia dla RYB w roślinach

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Ogólnym celem tej metody jest przygotowanie chromosomów roślinnych odpowiednich do techniki hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH) z wykorzystaniem sond DNA pojedynczych i wielokrotnych kopii. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w zakresie cytogenetyki i badań genomu, takich jak wykrywanie rearanżacji chromosomowych, ustalanie kolejności markerów genetycznych na chromosomach oraz analiza porównawcza między różnymi gatunkami. Główną zaletą tej procedury jest to, że przygotowanie preparatów rozdzielonych chromosomów staje się szybkie, łatwe i wydajne. zawiesinę komórkową można przechowywać w temperaturze -20°C do dwóch miesięcy i wykorzystywać do preparatyki chromosomów w razie potrzeby. Koncepcja tej metody pojawiła się, gdy zaobserwowaliśmy znaczący wzrost jakości oraz liczby odpowiednich chromosomów w próbkach ludzkich. Namocz i kiełkuj 10–20 nasion jęczmienia na dwóch warstwach wilgotnego papieru filtracyjnego w czarce Petriego w ciemności przez dwa dni w temperaturze 22–24°C. Po dwóch dniach odetnij od nasion za pomocą żyletki silne korzenie o długości od 1 do 2 cm.Następnie przygotuj lodowatą wodę, umieszczając szklaną butelkę o pojemności 500 ml zawierającą zimną wodę z kranu w wodzie z kruszonym lodem. Napowietrz lodowatą wodę i zanurz w niej wierzchołki korzeni na 20 godzin, aby zwiększyć częstotliwość występowania komórek w metafazie. Przenieś korzenie z wody do 50 ml utrwalacza z octanu etylu, aby utrwalić je w temperaturze pokojowej przez dwa dni po utrwalaniu.Umyć od 10 do 20 korzeni 30 mililitrami lodowatej wody z kranu w 50-mililitrowej probówce przez pięć minut, powtarzając czynność dwukrotnie. Przenieść korzenie pojedynczo do 30 mililitrów buforu cytrynianowego, używając pęsety. Umyć korzenie, wstrząsając probówką przez pięć minut, powtarzając czynność dwukrotnie.Następnie umieść korzenie na papierze filtracyjnym, aby pod mikroskopem całkowicie usunąć ciecz. Odetnij niepożądaną tkankę niemerystematyczną za pomocą żyletki. Najbardziej krytycznym krokiem tej procedury jest ustalenie odpowiedniego czasu trawienia, który może różnić się w zależności od gatunku.Następnie do 20 wierzchołków korzeni inkubuje się w jednym mililitrze mieszaniny enzymów w temperaturze 37°C przez około 50 minut. Aby zmiękczyć tkankę roślinną w szkiełku zegarkowym pod mikroskopem, należy usunąć enzym za pomocą pipety i przemyć wierzchołki korzeni na lodzie pięcioma mililitrami 0,01 M buforu cytrynianowego w celu usunięcia pozostałości enzymu. Następnie w tym samym szkiełku zegarkowym należy ostrożnie dwukrotnie przemyć wierzchołki korzeni jednym mililitrem 96% etanolu.Następnie zastąp etanol 10 do 15 µL świeżo przygotowanego utrwalacza na każdy wierzchołek korzenia. Przenieś wierzchołki korzeni wraz z utrwalaczem do probówki o pojemności 2 ml i rozdrobnij łodygi korzeniowe za pomocą igły sekcyjnej lub pęsety. Opukaj probówkę 20 razy, aby resuspendować komórki i uzyskać zawiesinę komórkową.Następnie umieść dwie lub trzy warstwy nasączonego wodą ręcznika papierowego na płycie grzewczej ustawionej na 50 °C. Zanurz szkiełka mikroskopowe w lodowatej wodzie z kranu w lodówce na 30 minut. Następnie połóż szkiełka na wilgotnym ręczniku papierowym, pobierz pipetą od 7 do 10 µL zawiesiny komórkowej i nanieś ją z odległości 20 cm na schłodzone szkiełko znajdujące się na płycie grzewczej.Następnie nanieś 10 µL mieszaniny kwasu octowego i etanolu w to samo miejsce, w którym znajduje się zawiesina komórek na szkiełku, i pozostaw szkiełko na płycie grzewczej. Po dwóch minutach przenieś szkiełko na płytę grzewczą bez mokrej chusteczki i pozostaw do wyschnięcia przez kolejną minutę. Sprawdź preparaty za pomocą mikroskopu fazowego, aby skontrolować jakość rozprzestrzenienia chromosomów.Preparaty na szkiełkach należy wykorzystać tego samego dnia lub przechowywać poprzez zanurzenie w 96%Ethanol w naczyniu Coplina w temperaturze minus 20 degrees Celsius w celu wstępnego przygotowania szkiełek przed hybrydyzacją fluorescencyjną in situ (FISH). Za pomocą pęsety umieścić szkiełka w naczyniu Coplina zawierającym 50 milliliters 2X SSC na pięć minut. Następnie przenieść szkiełka do naczynia Coplina zawierającego 50 milliliters 45%acetic acid na okres od trzech do 10 minut.Następnie przenieś preparaty do naczynia Coplin zawierającego 50 mililitrów 2X SSC na 10 minut. Następnie przenieś preparaty do naczynia Coplin zawierającego 50 mililitrów 4% formaldehydu i zanurz je na 10 minut w celu utrwalenia chromosomów. Usuń formaldehyd, płucząc preparaty trzykrotnie po cztery minuty każdy w naczyniu Coplin zawierającym 50 mililitrów 2X SSC.Następnie odwodnij preparaty przez dwie minuty w serii etanolu 70%, 90% i 100%, a następnie wysusz je w pozycji pionowej. Dla każdego preparatu przygotuj 20 µL roztworu hybrydyzacyjnego, używając 10 µL zdejonizowanej formamidu, 5 µL buforu do hybrydyzacji 4X, 3 µL sondy oraz 2 µL wody wolnej od nukleaz (DNase-free water). Nanieś 20 µL roztworu hybrydyzacyjnego na każdy preparat i przykryj go szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 by 32 mm.Po zaklejeniu szkiełek nakrywczych cementem gumowym, przeprowadź denaturację szkiełek z sondami jednocześnie w temperaturze 80 °C przez dwie minuty na płycie grzewczej, a następnie przenieś szkiełka do wilgotnej komory i inkubuj je przez noc w temperaturze 37 °C. Unikając światła, usuń szkiełka nakrywcze, płucząc preparaty w naczyniu do płukania w roztworze 2X SSC. Następnie umieść szkiełka w naczyniu zawierającym 2X SSC w temperaturze od 55 do 60 °C i inkubuj przez 20 minut.Następnie umieść preparaty w dwóch XSSC w naczyniu Coplan przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Odwodnij preparaty w naczyniu Coplan przez dwie minuty w serii 70%, 90% i 100% etanolu. Wysusz preparaty na powietrzu i przeprowadź przeciwbarwienie dappy w medium montażowym Antifa, unikając intensywnego światła.Przeanalizuj preparaty za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. Wybór filtra zależy od fluorochromu użytego do znakowania sondy, jeśli jest to konieczne. Przechowuj preparaty w temperaturze czterech stopni Celsius w ciemności do jednego roku.Przedstawiono preparaty rozprzestrzeńców metafazy mitotycznej przygotowane metodą szybkiego suszenia powietrznego kropel z chromosomami. Analizę FISH przeprowadzono z wykorzystaniem sekwencji powtarzalnych oraz pojedynczych kopii. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z zestawem filtrów umożliwiającym wzbudzanie odpowiednich fluoroforów, a następnie zarejestrowano je za pomocą monochromatycznej kamery CCD o wysokiej czułości.Eksperyment FISH przeprowadzony na chromosomach w metafazie mitotycznej hoard i vulgari przy użyciu sondy jednokopiowej oraz pięciu S-R-D-N-A ujawnił wyraźne sygnały wysokiej jakości. Hybrydyzacja mikrosatelitu CT CTT 10 na chromosomach hordy i BULBUS zaowocowała specyficznym i wyraźnym wzorcem. Eksperyment FISH przeprowadzony na chromosomach w metafazie mitotycznej sala serial przy użyciu dwóch sond PSC 119 przyniósł specyficzne sygnały wysokiej jakości.Oczywistymi zaletami tego podejścia są dobrze rozprzestrzenione, nieuszkodzone i liczne chromosomy w metafazie, które stanowią idealny warunek wstępny dla udanej analizy FISH. Po opanowaniu techniki procedura ta może zostać wykonana w mniej niż dwie godziny, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotować wysokiej jakości preparaty chromosomów w metafazie mitotycznej do badań FISH i karyotypowania. Formaldehyd może być niezwykle niebezpieczny, dlatego podczas wykonywania tych procedur zawsze należy używać wyciągów i dygestoriów.

a-fast-air-dry-dropping-chromosome-preparation-method-suitable-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wśród trzech rodzajów komarów, mianowicie Anopheles, Aedes oraz Culex, techniki fizycznego mapowania genomu opracowano jedynie dla Anopheles, którego przedstawiciele posiadają czytelne chromosomy politeniczne. W przypadku rodzajów Aedes i Culex mapowanie cytogenetyczne pozostaje jednak wyzwaniem ze względu na niską jakość chromosomów politenicznych. Przedstawiamy tutaj uniwersalny protokół otrzymywania wysokiej jakości preparatów chromosomów mitotycznych oraz zoptymalizowany protokół FISH dla...

Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ na chromosomach mitotycznych komarów

Ten artykuł opisuje ekstrakcję DNA z klipsa do ogona danio pręgowanego. Protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę analizy genotypów danio pręgowanego.

Ekstrakcja DNA z klipsa ogonowego: metoda stosowana w genotypowaniu danio pręgowanego

Materiał tutaj opisuje metodę opracowaną w celu zachowania trójwymiarowej struktury chromatyny komórek rozrodczych jąder. Zostało to nazwane metodą slajdów trójwymiarowych (3D). Metoda ta poprawia czułość wykrywania struktur subjądrowych i ma zastosowanie do immunofluorescencji, fluorescencji DNA i fluorescencji RNA hybrydyzacji in situ (FISH).

Metoda przygotowania szkiełek w celu zachowania trójwymiarowej architektury chromatyny komórek rozrodczych jąder

Malowanie chromosomów jest użyteczną metodą do badania organizacji jądra komórkowego i ewolucji kariotypu. W tym miejscu demonstrujemy podejście do izolowania i amplifikacji określonych regionów zainteresowania z pojedynczych chromosomów politenowych, które są następnie wykorzystywane do dwu- i trójwymiarowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Malowanie chromosomów 2D i 3D u komarów malarii

Danio pręgowany był ostatnio używany jako system modelowy in vivo do badania czasu replikacji DNA podczas rozwoju. Poniżej znajdują się szczegółowe protokoły wykorzystania zarodków danio pręgowanego do profilowania czasu replikacji. Protokół ten można łatwo dostosować do badania czasu replikacji u mutantów, poszczególnych typów komórek, modeli chorób i innych gatunków.

Profilowanie czasu replikacji DNA przy użyciu danio pręgowanego jako systemu modelowego in vivo

Opracowaliśmy nową metodę współekspresji wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach, aby przezwyciężyć trudności konwencjonalnych metod. Wykorzystuje wykorzystanie plazmidu o pojedynczej ekspresji, który zawiera wiele funkcjonalnie niezależnych kaset z ekspresją białek, aby osiągnąć koekspresję białka.

Efektywna koekspresja wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach

Tutaj przedstawiono protokół do produkcji i hodowli ryb elektrycznych z nokautem genomu CRISPR/Cas9. Szczegółowo przedstawiono wymagane wymagania z zakresu biologii molekularnej, hodowli i hodowli zarówno dla żywiciela, jak i mormyryda, a także techniki iniekcji w celu wytworzenia larw indelu F0 indukowanych przez Cas9.

Wyciszanie iskry: edycja genomu CRISPR/Cas9 u ryb o słabym natężeniu elektrycznym

Rozprzestrzenianie się powierzchni jądrowej jest niezbędnym narzędziem do badania zdarzeń chromosomowych podczas mejozy. Tutaj demonstrujemy metodę przygotowania i wizualizacji chromosomów mejotycznych podczas profazy I ze spermatocytów danio pręgowanego.

Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów danio pręgowanego

Ten artykuł opisuje protokół szybkiego i efektywnego czasoprzestrzennego monitorowania normalnej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego.

Szybkie i skuteczne czasoprzestrzenne monitorowanie prawidłowej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego

Technologie CRISPR-Cas zrewolucjonizowały dziedzinę edycji genomu. Jednak znalezienie i wyizolowanie pożądanej edycji linii zarodkowej pozostaje głównym wąskim gardłem. Dlatego protokół ten opisuje solidną metodę szybkiego badania przesiewowego nasienia danio pręgowanego wstrzykniętego za pomocą F0 CRISPR pod kątem edycji linii zarodkowej przy użyciu standardowych technik PCR, trawienia restrykcyjnego i elektroforezy żelowej.

Badania przesiewowe plemników w celu szybkiej izolacji zmian linii zarodkowej u danio pręgowanego

Ten protokół opisuje zmodyfikowaną procedurę szybkiego izolowania czystych oocytów etapu I u danio pręgowanego pozbawionego komórek ziarnistych, zapewniając tym samym wygodną metodę do badań specyficznych dla oocytów.

Szybka izolacja oocytów I stopnia u danio pręgowanego pozbawionego komórek ziarnistych

Poznaj szybką metodę przygotowania chromosomów roślinnych do FISH w cytogenetyce. Technika opadania na powietrze zwiększa liczbę użytecznych chromosomów i skraca czas przygotowania.

Szybka metoda przygotowania chromosomów do opadania na powietrzu odpowiednia dla RYB w roślinach

Przeglądaj więcej filmów