Szybka metoda przygotowania chromosomów do opadania na powietrzu odpowiednia dla RYB w roślinach

Ogólnym celem tej metody jest przygotowanie chromosomów roślinnych odpowiednich do fluorescencji w technice hybrydyzacji C 2 przy użyciu sond DNA o pojedynczej i wysokiej kopii. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach cytogenetycznych i genomowych, takie jak wykrywanie rearanżacji chromosomów, porządkowanie markerów genetycznych na chromosomach i analiza porównawcza między różnymi gatunkami. Główną zaletą tej procedury jest to, że przygotowanie rozkładów chromosomowych staje się szybkie, łatwe i wydajne.

Zawiesina komórkowa może być przechowywana w temperaturze minus 20 stopni do dwóch miesięcy i w razie potrzeby wykorzystana do przygotowania chromosomów. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zaobserwowaliśmy, że jakość i liczba odpowiednich chromosomów dramatycznie wzrosła w ciągu ludzkich dni Kiełkuj od 10 do 20 nasion jęczmienia na dwóch warstwach wilgotnej bibuły filtracyjnej na szalce Petriego w ciemnych warunkach przez dwa dni w temperaturze od 22 do 24 stopni Celsjusza po dwóch dniach. Odetnij energiczne korzenie o długości od jednego do dwóch centymetrów od nasion za pomocą żyletki.

Następnie przygotuj lodowatą wodę, umieszczając 500-mililitrową szklaną butelkę zawierającą zimną wodę z kranu w pokruszonej lodowatej wodzie. Napowietrz lodowatą wodę i zanurz końcówki korzeni na 20 godzin, aby zwiększyć częstotliwość komórek metafazy. Przenieś korzenie z wody do 50 mililitrów utrwalacza etanolu kwasu octowego, aby utrwalić je w temperaturze pokojowej przez dwa dni po utrwaleniu.

Umyj od 10 do 20 korzeni 30 mililitrami lodowatej wody z kranu w 50-mililitrowym szklanym głośniku przez pięć minut dwa razy. Przenieś korzenie jeden po drugim do 30 mililitrów buforu cytrynianowego za pomocą kleszczy. Umyj korzenie, dwukrotnie potrząsając szklanym głośnikiem przez pięć minut.

Następnie umieść korzenie na bibule filtracyjnej, aby całkowicie usunąć płyn pod mikroskopem. Odetnij niepożądaną tkankę niemerystematyczną za pomocą żyletki. Najważniejszym etapem tej procedury jest określenie właściwego czasu trawienia, który może się różnić w zależności od gatunku.

Tutaj do 20 końcówek korzeni inkubuje się w jednym mililitrze mieszaniny enzymów w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 50 minut. Aby zmiękczyć tkankę roślinną w szkiełku zegarkowym pod mikroskopem, usuń enzym przez pipetowanie i umyj końcówki korzeni na lodzie pięcioma mililitrami 0,01 molowego buforu cytrynianu w celu zastąpienia pozostałego enzymu. Kontynuuj mycie końcówek korzeni jednym mililitrem 96% etanolu dwa razy ostrożnie w tym samym szkiełku zegarka.

Następnie zastąp etanol 10 do 15 mikrolitrami świeżo przygotowanego utrwalacza na wierzchołek korzenia. Przenieś końcówki korzeni wraz z utrwalaczem do dwumililitrowej probówki i rozdrobnij łodygi korzeni za pomocą igły preparacyjnej lub kleszczy. Postukaj w probówkę 20 razy, aby ponownie zawiesić komórki i uzyskać zawiesinę komórek.

Następnie ułóż dwie lub trzy warstwy bibuły nasączonej wodą na płycie grzejnej w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Zanurz mikroskopijne szkiełka w lodowatym, zimnej wodzie z kranu w lodówce na 30 minut. Następnie umieść szkiełka na wilgotnej bibułce, odpipetuj od siedmiu do 10 mikrolitrów zawiesiny komórek i upuść ją z odległości 20 centymetrów na schłodzony szkiełko umieszczone na płycie grzejnej.

Następnie nałóż 10 mikrolitrów mieszaniny etanolu kwasu octowego w to samo miejsce, co zawiesina komórek na szkiełku i trzymaj szkiełko na płycie grzejnej. Po dwóch minutach umieść szkiełko na płycie grzejnej bez mokrej chusteczki i pozostaw do wyschnięcia na dodatkową minutę. Sprawdź szkiełka za pomocą mikroskopu kontrastowego twarzy, aby kontrolować jakość rozprzestrzeniania się chromosomów.

Używaj szkiełka tego samego dnia lub przechowuj je, zanurzając w 96% etanolu w słoiku z kopeliną w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aby wstępnie przygotować szkiełka przed rybami. Umieść szkiełka w słoiku zawierającym 50 mililitrów dwóch XSSC na pięć minut za pomocą kleszczy. Przenieś szkiełka do słoika coplan zawierającego 50 mililitrów 45% kwasu octowego na trzy do 10 minut.

Następnie przenieś szkiełka do słoika coplan zawierającego 50 mililitrów dwóch XSSC na 10 minut. Następnie przenieś szkiełka do słoika z kopiną zawierającego 50 mililitrów 4% formaldehydu i zanurz szkiełka na 10 minut, aby utrwalić chromosomy. Usuń formaldehyd, płucząc szkiełka trzy razy przez cztery minuty każde w słoiku z kopiną zawierającym 50 mililitrów dwóch XSSC.

Następnie odwadniaj szkiełka przez dwie minuty w serii 70%90% i 100% etanolu i wysusz szkiełka w pozycji pionowej. Dla każdego szkiełka przygotuj roztwór hybrydyzacyjny o objętości 20 mikrolitrów, używając 10 mikrolitrów dejonizowanej formy amidu, pięciu mikrolitrów czterech hybrydyzacyjnych X, trzech mikrolitrów sondy i dwóch mikrolitrów wolnej wody D ns. Dodać 20 mikrolitrów roztworu hybrydyzacyjnego na szkiełko podstawowe i przykryć szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 na 32 milimetry.

Po uszczelnieniu szkiełek nakrywkowych cementem gumowym, szkiełka denaturacyjne za pomocą sond jednocześnie w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie minuty na płycie grzejnej, przenieść szkiełka do wilgotnej komory i inkubować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Unikając światła, usuń szkiełka nakrywkowe, przepłukując szkiełka w słoiku sprzęgającym z dwoma XSSC. Następnie umieść szkiełka w słoiku coplan zawierającym od 55 do 60 stopni Celsjusza, dwóch XSSC i inkubuj przez 20 minut.

Następnie umieść szkiełka w dwóch XSSC w słoiku coplan na dwie minuty w temperaturze pokojowej. Pewny. Odwodnić szkiełka w słoiku coplan przez dwie minuty w serii 70%90% i 100% etanolu. Powietrze. Osusz szkiełka i przeciwplamij dappy w podłożu montażowym Antifa, unikając intensywnego światła.

Przeanalizuj szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego epi. Wybór filtra zależy od fluorochromu użytego do oznakowania sondy, jeśli to konieczne. Przechowuj szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemnych warunkach do roku.

Przedstawiono tutaj mitotyczne rozprzestrzenianie się metafazy przygotowane metodą przygotowania chromosomów do szybkiego opadania na suche powietrze. Analizę ryb przeprowadzono zarówno przy użyciu powtarzalnych, jak i pojedynczych kopii. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z zestawem filtrów umożliwiających wzbudzenie odpowiednich czwórek fluorowych i uchwycono za pomocą monochromatycznej kamery CCD o wysokiej czułości.

Eksperyment na rybach na mitotycznych chromosomach metafazowych skarbu i vulgari przy użyciu pojedynczej kopii sondy i pięciu S-R-D-N-A ujawnił wyraźne i wysokiej jakości sygnały. Hybrydyzacja mikrosatelity CT CTT 10 na chromosomach hordy i BULBUS dała specyficzny i wyraźny wzór. Eksperyment na rybach na mitotycznych chromosomach metafazy sala szeregowej przy użyciu sondy PSC 119 two zaowocował specyficznymi sygnałami o wysokiej jakości.

Oczywistymi korzyściami płynącymi z tego podejścia są dobrze rozłożone, nieuszkodzone i liczne chromosomy metafazowe, które stanowią doskonały warunek wstępny dla udanej analizy ryb. Po opanowaniu tę procedurę można wykonać w mniej niż dwie godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować wysokiej jakości mitotyczne zdjęcie z chromosomów meta twarzy dla ryb IDE i byłych, wysokość może być bardzo niebezpieczna, zawsze używaj wykresów i kaptura filmowego podczas wykonywania tych procedur.