Kolumna z przepływem kurtyny: optymalizacja wydajności i czułości
12 czerwca 2016
Tutaj prezentujemy protokół do działania i optymalizacji kolumny Active Flow Technology (AFT) w trybie Curtain flow (CF) dla zwiększenia wydajności separacji.
Ogólnym celem tej metody jest poprawa wydajności i czułości separacji poprzez optymalizację kurtynowej kolumny przepływowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu nauk o środowisku, kryminalistyki oraz w obszarach wymagających analizy próbek śladowych, gdzie wymagana jest wydajna i bardzo czuła technika separacji. Główną zaletą tej techniki jest to, że zwiększa ona efektywność separacji i czułość analizy w porównaniu z konwencjonalnymi metodami separacji HPLC.
Metoda ta może zapewnić sposób na zwiększenie mocy separacji, a tym samym przyspieszenie wydajności, w sposób ekonomiczny i efektywny czasowo. Kurtynowa kolumna przepływowa jest nową koncepcją dla praktyków HPLC, jednak jej zastosowanie nie jest skomplikowane. Wymaga to po prostu optymalizacji odpowiednich proporcji przepływu.
Najpierw przygotuj butelki ze 100% ultra czystą wodą i 100 metanolem do ruchomych faz A i B instrumentu HPLC. Oczyść pompy zgodnie z wymaganiami producenta. Po oczyszczeniu odłączyć przewód pompy od zaworu wtryskiwacza próbnika automatycznego.
Przymocuj trójnik do odłączonej linii. Do każdego portu trójnika przymocuj rurkę o średnicy wewnętrznej 0,13 milimetra i długości 15 centymetrów. Podłącz jedną rurkę z trójnika do zaworu wtryskiwacza próbnika automatycznego.
Na koniec ustaw pompę na natężenie przepływu jednego mililitra na minutę. Wytaruj dwa puste naczynia zbiorcze i oznacz je jako centralne i obwodowe. Przez 60 sekund należy używać centralnie oznakowanego naczynia do zbierania wychodzącej fazy ruchomej z przewodu wychodzącego z wtryskiwacza.
Ponownie zważyć naczynie centralne i określić masę zebranej fazy ruchomej. Powtórz ten proces, zbierając przepływ przez port obwodowy za pomocą naczynia oznaczonego na obwodzie. Określ procent przepływu lub mililitry na minutę z każdej linii, korzystając ze wskazanych równań.
Port centralny powinien mieć około 40 procent, a port peryferyjny około 60 procent. Jeśli wartości różnią się o więcej niż dwa procent, zmień długość lub średnicę przewodu, aby dostosować współczynnik przepływu. Następnie powtórz kroki zbierania i obliczeń.
Następnie wyłącz przepływ pompy i podłącz przewód wtryskiwacza do centralnego portu wlotu kolumny. Podłącz również linię od trójnika do portu peryferyjnego wlotu kolumny. Powoli zwiększaj natężenie przepływu do jednego mililitra na minutę w 100-procentowej fazie ruchomej B.To zakończ dostrajanie systemu, przepływaj 100 procent metanolu z prędkością jednego mililitra na minutę przez 10 minut, aby zrównoważyć kolumnę.
Aby rozpocząć, użyj rurki do podłączenia centralnego portu wylotowego do detektora UV-Vis. Podłącz ten sam typ i długość rurki do peryferyjnego portu wylotowego kolumny CF. Następnie ustaw pompę na natężenie przepływu jednego mililitra na minutę.
Wytaruj dwa puste naczynia zbiorcze i ponownie oznacz jedno dla zbiórki centralnej, a drugie dla urządzeń peryferyjnych. Przez 60 sekund należy używać centralnie oznakowanego naczynia do zbierania wychodzącej fazy ruchomej z detektora UV-Vis. Ponownie zważyć naczynie zbiorcze w celu określenia masy roztworu, który wydostał się na zewnątrz.
Powtórz ten proces z peryferyjnym portem wylotowym i oznaczonym naczyniem zbiorczym. Teraz określ procentowy przepływ z każdej linii, jak wykonano wcześniej z przepływem wlotowym. Linia UV-Vis powinna wynosić 21 procent, a przepływ na zewnątrz powinien wynosić 79 procent.
Jeśli współczynnik przepływu znacznie się różni, dostosuj rozmiar rurki podłączonej do wyjścia detektora UV-Vis, aby zmienić procent przepływu centralnego. Ważne jest, aby proporcje przepływu między centralą a obwodem na wlocie i wylocie kolumny były zgodne z tym protokołem, aby zapewnić optymalną wydajność kolumny przepływowej kurtyny. Kolumny z technologią aktywnego przepływu zostały opracowane przy użyciu specjalistycznej konstrukcji frytki w wieloportowych łącznikach końcowych kolumny, aby przezwyciężyć niejednorodność łoża kolumny i poprawić wydajność separacji.
Mieszaninę testową zawierającą fenetol, butylobenzen i pentylobenzen analizowano na konwencjonalnych kolumnach o średnicy wewnętrznej 4,6 i 2,1 milimetra oraz kolumnie przepływowej kurtyny o średnicy wewnętrznej 4,6 milimetra. Oddzielenie mieszanki ilustruje poprawę wydajności pod względem wydajności i czułości kurtynowej kolumny przepływowej w porównaniu ze standardowymi kolumnami. Zastosowanie kurtynowej kolumny przepływowej zwiększyło sygnał dla butylobenzenu pomimo zmniejszonej objętości szczytowej.
Po opanowaniu tej techniki można ją skonfigurować w mniej niż pół godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Konfiguracja kolumny przepływowej kurtyny może być wielokrotnie używana, ale proporcje przepływu muszą być rutynowo sprawdzane. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby być jak najbardziej zbliżonym do zalecanych proporcji przepływu.
Kurtynowa kolumna przepływowa utorowała drogę naukowcom zajmującym się HPLC do przesuwania granic kolumn i instrumentów UPLC w celu uzyskania szybszej analizy próbek bez uszczerbku dla wydajności separacji. Po obejrzeniu tego filmu należy zrozumieć znaczenie kurtynowych kolumn przepływowych, ponieważ mogą one zapewnić lepszą separację niż konwencjonalne kolumny HPLC.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół optymalizacji kolumn z technologią aktywnego przepływu (Active Flow Technology, AFT) w trybie przepływu zasłonowego (Curtain flow, CF). Metoda ta ma na celu poprawę wydajności rozdzielania, szczególnie w dziedzinach wymagających wysokiej czułości i efektywności.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nauki o środowisku
- Kryminalistyka
- Analiza śladowych próbek
Wprowadzenie
- Konwencjonalne metody HPLC mogą charakteryzować się niską wydajnością i czułością.
- Kolumna z przepływem kurtynowym stanowi nowatorskie podejście w technice HPLC.
- Optymalizacja stosunków przepływów jest niezbędna dla efektywnego zastosowania tej metody.
- Technika ta jest ekonomiczna i oszczędna pod względem czasu.
Cel badania
- W celu poprawy wydajności rozdzielania i czułości.
- W celu zapewnienia niezawodnej metody analizy śladowej.
- W celu zwiększenia szybkości i wydajności rozdzielania.
Zastosowane metody
- Optymalizacja stosunków przepływów w kolumnach z przepływem kurtynowym.
- Porównanie z konwencjonalnymi metodami HPLC.
- Zastosowanie w różnych dziedzinach nauki.
- Opracowanie protokołu w celu praktycznej implementacji.
Główne wyniki
- Zwiększona efektywność rozdzielania.
- Poprawiona czułość analizy.
- Skuteczne zastosowanie w naukach o środowisku i kryminalistyce.
- Wykazana łatwość obsługi dla praktyków.
Wnioski
- Kolumna z przepływem kurtynowym stanowi znaczący postęp w technice HPLC.
- Zoptymalizowane stosunki przepływów są kluczowe dla maksymalizacji wydajności.
- Metoda ta pozwala rozwiązać główne problemy w analizie śladowych ilości próbek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Technologia kolumn Curtain Flow (CF) odpowiada na potrzebę zwiększenia wydajności rozdzielania i czułości w zastosowaniach analizy śladowej, szczególnie tam, gdzie krytyczne znaczenie mają ilość nakładanej próbki i granice detekcji. Dzięki optymalizacji stosunków przepływów w celu stworzenia wirtualnej kolumny o „nieskończonej średnicy”, metoda ta redukuje dyspersję radialną i poprawia rozdzielczość pików bez obniżania przepustowości. Wspiera to pewność prognostyczną w procesach wczesnego odkrywania leków, które wymagają niezawodnej charakterystyki związków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia analizę złożonych mieszanin poprzez poprawę rozdzielczości związków eluujących blisko siebie, co wspiera identyfikację docelową w badaniach przesiewowych na wczesnym etapie.
- Wartość operacyjna: Zwiększa czułość w odniesieniu do analitów o niskim stężeniu, umożliwiając wykrywanie słabych sygnałów w złożonych matrycach biologicznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia ilościowe i powtarzalne wyniki rozdziału, które są niezbędne do standaryzacji testów i potwierdzania trafień.
- Wartość operacyjna: Dostrojenie stosunku przepływów zapewnia spójne wyniki w kolejnych seriach, co wspiera powtarzalność testów i skalowalność w warunkach średniej przepustowości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez zapewnienie czystej separacji metabolitów lub produktów degradacji w próbkach przedklinicznych.
- Wartość operacyjna: Możliwość ponownego wykorzystania konfiguracji kolumny wraz z rutynową weryfikacją stosunku przepływów zapewnia długoterminową ciągłość metody na poszczególnych etapach badań odkrywczych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od wstępnej oceny trafień (hits) po optymalizację wiodących związków (leads), gdzie wiarygodne dane dotyczące rozdziału służą do potwierdzenia struktury oraz oceny czystości.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez rozdzielanie współeluujących interferentów, które mogłyby maskować sygnały zaangażowania celu.
- Przesiewanie: Zapewnia wysokoczułe, ilościowe odczyty, które umożliwiają dokładne porównywanie bibliotek związków.
- Analityka: Generuje wskaźniki wydajności i czułości zależne od stosunku przepływu, używane do oceny jakości rozdziału i przydatności metody.
- Badania translacyjne: Ułatwia ciągłość przejścia od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, zapewniając spójne zachowanie chromatograficzne podczas śledzenia biomarkerów lub metabolitów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Platforma kolumn CF została zaprojektowana do wielokrotnego użytku, przy czym optymalizacja przepływu stanowi znormalizowaną, przenośną procedurę stosowaną w różnych zespołach i projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna dzięki poprawie rozdzielczości i czułości, co ogranicza liczbę wyników fałszywie ujemnych w analizie śladowej.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja poprzez protokoły stosunku przepływu zapewnia powtarzalność i skraca czas opracowywania metody.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji typu go/no-go dzięki dostarczaniu czystszych danych na wcześniejszym etapie procesu, co zmniejsza ryzyko niepowodzeń w późnych fazach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki wiarygodnym danym analitycznym, które stanowią podstawę do dalszego rozwoju związku.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie konfiguracji systemów HPLC oraz dynamiki przepływu.
- Wymaga zastosowania precyzyjnych przewodów i złączy w celu osiągnięcia i utrzymania określonych proporcji przepływu (np. 40:60 na wlocie, 21:79 na wylocie).
- Wymaga standaryzacji procedur dostrajania pomiędzy zespołami w celu zapewnienia spójnej wydajności kolumn.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji podczas przenoszenia metody na kolumny o innej chemii lub inne typy detektorów.
- Ograniczenie praktyczne: wydajność zależy od ścisłego przestrzegania tolerancji proporcji przepływu; odchylenia >2% wymagają ponownej optymalizacji.
