Name: Kolumna z przepływem kurtyny: optymalizacja wydajności i czułości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Poznaj optymalizację kolumny z przepływem kurtyny w chromatografii HPLC, aby zwiększyć wydajność i czułość analizy śladów w naukach środowiskowych i kryminalistycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jeden z autorów (DK) potwierdza otrzymanie Australijskiej Nagrody Podyplomowej.

Uwaga: Przed użyciem należy zapoznać się z kartami charakterystyki (MSDS) wszystkich materiałów i odczynników (np. MSDS dla metanolu). Należy stosować wszystkie odpowiednie zasady bezpieczeństwa podczas pracy z rozpuszczalnikami i eluentem do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Należy zapewnić odpowiednie zastosowanie zabezpieczeń technicznych w przypadku HPLC, wagi analitycznej i aparatury detekcyjnej oraz używać środków ochrony osobistej (okularów ochronnych, rękawiczek, fartucha laboratoryjnego, długich spodni i obuwia zakrytego).
Uwaga: Niniejszy protokół zawiera instrukcje dotyczące użycia kolumny CF w systemie HPLC sprzężonym z detektorem UV-Vis. Protokół został przygotowany z założeniem, że czytelnik posiada podstawową wiedzę i doświadczenie w zakresie chromatografii.
1. Konfiguracja urządzenia HPLC
Uwaga: Niniejszą sekcję można zmodyfikować w zależności od potrzeb analityka, tj. dobrać rozpuszczalniki, długość fali detektora oraz szybkość przepływu odpowiednie dla analizowanej próbki.
<ol>
	<li>Przygotować aparat HPLC, stosując 100% wody ultraczystej (np., wody Milli-Q) dla linii A oraz 100% metanolu dla linii B jako fazę ruchomą, a następnie przepłukać pompy zgodnie z wymaganiami producenta.</li>
	<li>Ustawić detektor UV-Vis na długość fali 254 nm.</li>
	<li>Wybrać tryb pracy z podziałem przepływu przed wtryskiem lub konfigurację z podwójną pompą. W przypadku trybu z podziałem przepływu przejść do kroku 2, a w przypadku konfiguracji z podwójną pompą przejść do kroku 3.</li>
</ol>
2. Konfiguracja systemu przepływu rozdzielonego
<ol>
	<li>Odłącz linię pompy od zaworu wtryskowego autoksamplera.</li>
	<li>Do linii pompy przymocuj trójnik.</li>
	<li>Do każdego z portów trójnika przymocuj odcinek rurki o średnicy wewnętrznej 0,13 mm i długości 15 cm.</li>
	<li>Podłącz jedną rurkę z trójnika do zaworu wtryskowego autoksamplera.</li>
	<li>Ustaw pompę na 1,0 ml min-1.</li>
	<li>Przed podłączeniem linii pompy do wlotu kolumny CF, dostrój stosunek segmentacji przepływu do 40%:60% (linia środkowa:linia obwodowa) zgodnie z procedurą w kroku 2.7.</li>
	<li>Dostrajanie stosunku wlotu CF w systemie przepływu dzielonego
	<ol>
		<li>Zważ dwa puste naczynia do zbierania za pomocą wagi analitycznej i oznacz jedno naczynie jako „centralne”, a drugie jako „obwodowe” (jedno dla linii prowadzącej z autoksamplera do portu środkowego, a drugie dla linii z trójnika do portu obwodowego).</li>
		<li>Przez 1,0 min zbieraj wypływającą fazę ruchomą z linii prowadzącej z wtryskiwacza (w punkcie, który zostanie podłączony do kolumny) do naczynia, którego masa została zmierzona w punkcie 2.7.1.</li>
		<li>Ponownie zważ naczynie na wadze analitycznej i określ masę zebranej fazy ruchomej.</li>
		<li>Powtórz kroki od 2.7.2 do 2.7.3 dla eluentu wypływającego z linii z trójnika, która ma zostać podłączona do portu obwodowego.</li>
		<li>Wyznacz procentowy udział przepływu (ml min-1) z każdej linii przepływu zgodnie z następującymi równaniami: 
		<img alt="Równania równowagi statycznej: schemat formuły procentowej masy dla portu centralnego i obwodowego." src="/files/ftp_upload/53471/53471eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"></li>
		<li>Dostrój stosunek przepływów do 40%:60% (± 2%) (linia z wtryskiwacza do portu centralnego:linia z trójnika do portu obwodowego). Jeśli procentowy udział przepływu z linii od wtryskiwacza do portu centralnego przekracza 40%, zwiększ spadek ciśnienia poprzez zmniejszenie średnicy wewnętrznej rurki lub zwiększenie jej długości. Jeśli procentowy udział przepływu z linii od wtryskiwacza do portu centralnego jest niższy niż 40%, zwiększ średnicę wewnętrzną rurki lub zmniejsz jej długość.</li>
		<li>Po dostrojeniu stosunków przepływu wyłącz pompę.</li>
		<li>Podłącz linię z wtryskiwacza do portu centralnego wlotu kolumny oraz linię z trójnika do portu obwodowego wlotu kolumny.</li>
		<li>Powoli zwiększaj szybkość przepływu do 1,0 ml min-1 przy 100% linii B.</li>
		<li>Urównoważ kolumnę (śr. wewn. 4,6 mm x długość 100 mm), przepływając 100% metanolu (linia B) jako fazy ruchomej przez kolumnę z prędkością 1,0 ml min-1 przez 10 min. Czas ten należy skalować w zależności od wymiarów innych kolumn, których użytkownik może używać.</li>
		<li>W celu dostrojenia wylotu CF przejdź do Kroku 4: „Dostrajanie przepływu wylotu CF”.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Konfiguracja systemu podwójnej pompy
<ol>
	<li>Podłącz pompę systemu HPLC do injektora, a następnie połącz linię z injektora z centralnym portem wlotowym kolumny.</li>
	<li>Podłącz dodatkową pompę bezpośrednio do peryferyjnego portu wlotowego kolumny. Należy pamiętać, że ta druga pompa omija injektor.</li>
	<li>Zwiększaj prędkość przepływu pompy systemu podłączonej do portu centralnego do 0,4 ml min-1 (co odpowiada 40% całkowitego przepływu 1,0 ml min-1) przy zastosowaniu 100% metanolu (linia B).</li>
	<li>Równocześnie z krokiem 3.3 zwiększaj prędkość przepływu pompy peryferyjnej do 0,6 ml min-1 (co odpowiada 60% całkowitego przepływu 1,0 ml min-1) przy zastosowaniu 100% metanolu (linia B).</li>
	<li>Wyrównaj kolumnę (4,6 mm i.d. x 100 mm długości), przepuszczając fazę ruchomą składającą się ze 100% metanolu (linia B) przez kolumnę z prędkością 1,0 ml min-1 przez 10 min. Czas ten należy dostosować do wymiarów innych kolumn, których może używać użytkownik.</li>
	<li>W celu dostrojenia wylotu CF przejdź do kroku 4. „Dostrojenie przepływu wylotu CF”.</li>
</ol>
4. Regulacja przepływu wylotowego CF
<ol>
	<li>Podłącz centralny port wylotowy do detektora UV-Vis, używając 15 cm odcinka rurki o średnicy wewnętrznej 0,13 mm.</li>
	<li>Podłącz 15 cm odcinka rurki o średnicy wewnętrznej 0,13 mm do peryferyjnego portu wylotowego kolumny CF.</li>
	<li>Zważ masę dwóch pustych naczyń zbiorczych na wadze analitycznej i oznakuj jedno naczynie jako „centralne”, a drugie jako „peryferyjne”.</li>
	<li>Przez 1,0 min zbieraj wypływającą z detektora UV-Vis fazę ruchomą (przepływ centralny) do naczynia zbiorczego oznakowanego jako centralne, którego masa została zmierzona w punkcie 4.2.</li>
	<li>Ponownie zważ naczynie zbiorcze zawierające zebrany eluent na wadze analitycznej i określ masę zebranej fazy ruchomej.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.4–4.5 dla eluentu wypływającego z linii z peryferyjnego portu wylotowego.</li>
	<li>Wyznacz procentowy udział przepływu z każdej linii zgodnie z poniższymi równaniami: 
	<img alt="Obliczenia masy portu wylotowego; wzory na procentowy udział portu centralnego i peryferyjnego." src="/files/ftp_upload/53471/53471eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 2"></li>
	<li>Dostosuj stosunek przepływów do 21%:79% (± 2%) (przepływ z wylotu centralnego z UV-Vis : przepływ z wylotu peryferyjnego z linii ). Jeśli procentowy udział przepływu centralnego z UV-Vis przekracza 21%, zwiększ spadek ciśnienia poprzez zmniejszenie średnicy wewnętrznej rurki podłączonej do wylotu detektora UV-Vis lub zwiększenie jej długości. Jeśli procentowy udział przepływu centralnego z UV-Vis jest mniejszy niż 21%, zwiększ średnicę wewnętrzną rurki podłączonej do wylotu detektora UV-Vis lub zmniejsz długość rurki. Po każdej zmianie długości rurki powtórz kroki 4.3–4.7. 
	Uwaga: Kolumna CF w „wirtualnym” trybie o średnicy wewnętrznej 2,1 mm jest gotowa do analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Camenzuli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+parallel+segmented+outlet+flow+columns+for+enhanced+mass+spectral+sensitivity+at+high+chromatographic+flow+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">The use of parallel segmented outlet flow columns for enhanced mass spectral sensitivity at high chromatographic flow rates.</a> Rapid Commun. Mass Sp. 26 (8), 943-949 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+separation+performance+using+a+new+column+technology%3A+Parallel+segmented+outlet+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow.</a> J. Chromatogr. A. 1232 (0), 47-51 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient+elution+chromatography+with+segmented+parallel+flow+column+technology%3A+A+study+on+4.6mm+analytical+scale+columns%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns.</a> J. Chromatogr. A. 1270 (0), 204-211 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+HPLC+separation+performance+using+parallel+segmented+flow+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography.</a> Microchem. J. 111 (0), 3-7 (2013).</li>
<li>Camenzuli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+segmented+outlet+flow+high+performance+liquid+chromatography+with+multiplexed+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection.</a> Anal. Chim. Acta. 803 (0), 154-159 (2013).</li>
<li>Kocic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+through-put+and+highly+sensitive+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+separations+of+essential+amino+acids+using+active+flow+technology+chromatography+columns%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">High through-put and highly sensitive liquid chromatography-tandem mass spectrometry separations of essential amino acids using active flow technology chromatography columns.</a> J. Chromatogr. A. 1305 (0), 102-108 (2013).</li>
<li>Shalliker, R. A., Ritchie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmented+flow+and+curtain+flow+chromatography%3A+Overcoming+the+wall+effect+and+heterogeneous+bed+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures.</a> J. Chromatogr. A. 1335 (0), 122-135 (2014).</li>
<li>Shellie, R., Haddad, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+two-dimensional+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Comprehensive two-dimensional liquid chromatography.</a> Anal. Bioanal. Chem. 386 (3), 405-415 (2006).</li>
<li>Abia, J. A., Mriziq, K. S., Guiochon, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+heterogeneity+of+some+analytical+columns+used+in+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Radial heterogeneity of some analytical columns used in high-performance liquid chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 1216 (15), 3185-3191 (2009).</li>
<li>Knox, J. H., Laird, G. R., Raven, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+radial+and+axial+dispersion+in+liquid+chromatography+in+relation+to+the+%26%2334%3Binfinite+diameter+effect%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Interaction of radial and axial dispersion in liquid chromatography in relation to the &#34;infinite diameter effect&#34.</a> J. Chromatogr. A. 122 (0), 129-145 (1976).</li>
<li>Miyabe, K., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+column+radial+heterogeneity+from+an+analysis+of+the+characteristics+of+tailing+peaks+in+linear+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Estimation of the column radial heterogeneity from an analysis of the characteristics of tailing peaks in linear chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 830 (1), 29-39 (1999).</li>
<li>Shalliker, R. A., Scott Broyles, B., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+and+radial+diffusion+coefficients+in+a+liquid+chromatography+column+and+bed+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Axial and radial diffusion coefficients in a liquid chromatography column and bed heterogeneity.</a> J. Chromatogr. A. 994 (1-2), 1-12 (2003).</li>
<li>Gritti, F., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+thermal+heterogeneity+of+the+column+on+chromatographic+results%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Effects of the thermal heterogeneity of the column on chromatographic results.</a> J. Chromatogr. A. 1131 (1-2), 151-165 (2006).</li>
<li>Shalliker, R. A., Wong, V., Broyles, B. S., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+bed+compression+in+an+axial+compression+liquid+chromatography+column%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Visualization of bed compression in an axial compression liquid chromatography column.</a> J. Chromatogr. A. 977 (2), 213-223 (2002).</li>
<li>Tallarek, U., Albert, K., Bayer, E., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+transverse+and+axial+apparent+dispersion+coefficients+in+packed+beds%5BTitle%5D)+AND+%22AICHE+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of transverse and axial apparent dispersion coefficients in packed beds.</a> AICHE J. 42 (11), 3041-3054 (1996).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+flow+management+in+preparative+chromatographic+separations%3A+A+preliminary+investigation+into+enhanced+separation+using+a+curtain+flow+inlet+fitting+and+segmented+flow+outlet%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet.</a> J. Sep. Sci. 35 (3), 410-415 (2012).</li>
<li>Shalliker, R. A., Broyles, B. S., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+evidence+of+two+wall+effects+in+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Physical evidence of two wall effects in liquid chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 888 (1-2), 1-12 (2000).</li>
<li>Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+segmented+flow+chromatography+columns%3A+Conventional+analytical+scale+column+formats+presenting+as+a+%27virtual%27+narrow+bore+column%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column.</a> J. Chromatogr. A. 1262 (0), 64-69 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+a+new+concept+chromatography+column%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">The design of a new concept chromatography column.</a> Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).</li>
<li>Foley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+and+Reliability%3A+an+Intercontinental+Study+of+Curtain+Flow+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Thermo+Scientific%22%5BJournal%5D)">Precision and Reliability: an Intercontinental Study of Curtain Flow Chromatography.</a> Thermo Scientific. , (2013).</li>
<li>Pravadali-Cekic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+Approaches+for+the+Analysis+of+Complex+Samples+using+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22University+of+Western+Sydney%22%5BJournal%5D)">Multidimensional Approaches for the Analysis of Complex Samples using HPLC.</a> University of Western Sydney. , PhD thesis (2014).</li>
<li>Soliven, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+performance+of+narrow-bore+HPLC+columns+using+active+flow+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology.</a> Microchem. J. 116 (0), 230-234 (2014).</li>
<li>Foley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curtain+flow+chromatography+%28%27the+infinite+diameter+column%27%29+with+automated+injection+and+high+sample+through-put%3A+The+results+of+an+inter-laboratory+study%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Curtain flow chromatography ('the infinite diameter column') with automated injection and high sample through-put: The results of an inter-laboratory study.</a> Microchem. J. 110 (0), 127-132 (2013).</li>
</ol>

Prace te były wspierane przez UWS i ThermoFisher Scientific.

Badanie obejmowało międzylaboratoryjną analizę kolumn chromatograficznych CF w celu sprawdzenia wydajności analitycznej pod względem wydajności i czułości. Kolumna CF została wyposażona w podwójny system pompowania, jak opisano w rozdziale "3". Układ podwójnej pompy w celu osiągnięcia stosunku przepływu 40:60 (środek:obrzeże) na wlocie kolumny CF. Stosunek przepływu 40:60 (środek:obrzeże) został osiągnięty poprzez ustawienie natężenia przepływu każdej pompy na wartość, która odpowiada odpowiednio 40% i 60% całkowitego na...

W ostatnich latach technologia kolumnowa dla wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) znacznie się rozwinęła; szczytowe zdolności znacznie wzrosły, głównie dzięki zastosowaniu mniejszych rozmiarów cząstek i bardziej wydajnych cząstek powłoki rdzenia. Ponieważ separacje są na ogół bardziej wydajne, efektem przepływu jest wzrost czułości, ponieważ piki są teraz ostrzejsze, a tym samym wyższeod 1 do 8.
Niemniej jednak, niejednorodność złoża promieniowego jest nadal czynnikiem ograniczającym wydajność wszystkich kolumn, ale nie jest to nowa historia, ponieważ chromatografowie wiedzą o tym od wielu lat. Łoża słupów są niejednorodne zarówno w kierunku promieniowym9-12, jak i wzdłuż osi słupa10,12-15. Szczególnie efekt ściany jest ważnym czynnikiem przyczyniającym się do utraty wydajności separacji7,16-18. Shalliker i Ritchie7 dokonali niedawno przeglądu aspektów niejednorodności łoża kolumny, dlatego nie ma potrzeby dalszego omawiania tego tematu. Chociaż wystarczy powiedzieć, że różnice w gęstości upakowania łoża kolumny i efekty ścian prowadzą do zniekształcenia czopa substancji rozpuszczonej, tak że pasma wymywają się przez kolumnę w korkach, które przypominają częściowo wypełnione miski na zupę, a nie cienkie, płaskie, stałe krążki7, które są zwykle przedstawiane w podstawowych tekstach nauczania. Gdy przeprowadzono eksperymenty w taki sposób, że można było uwidocznić migrację substancji rozpuszczonej przez złoże, profile korków wewnątrz kolumny były częściowo puste, a sekcja ogonowa pasma jest w dużej mierze elementem ściennym korka próbki. Efekt końcowy jest taki, że potrzeba znacznie więcej płytek, aby oddzielić te "częściowo puste" korki, niż byłoby to wymagane, gdyby tarcze były solidne i płaskie12,14,17. Aby przezwyciężyć problemy związane z poszerzaniem pasma związane z efektami ścian i zmiennością promieniowej gęstości upakowania, zaprojektowano nową formę technologii kolumnowej znaną jako technologia aktywnego przepływu (AFT)7,19. Celem tej konstrukcji było usunięcie efektów ścian poprzez fizyczne oddzielenie elucji rozpuszczalnika wzdłuż obszaru ścianki, od elucji fazy ruchomej w promieniowym obszarze centralnym kolumny19. Istnieją dwa główne typy kolumn AFT; Kolumny z równoległym przepływem segmentowym (PSF) i kolumny z przepływem kurtynowym (CF) 7. Ponieważ protokół ten ma na celu wykorzystanie i optymalizację kolumn CF, kolumny PSF nie będą dalej omawiane.
Przepływ kurtyny (CF)
Formaty kolumn Curtain Flow (CF) wykorzystują końcówki AFT zarówno na wlocie, jak i wylocie kolumny. Końcówki AFT składają się z pierścieniowej frytki umieszczonej wewnątrz złączki wieloportowej. Fryta składa się z trzech części: porowatej promieniowej części środkowej, która jest wyrównana z centralnym portem złączki końcowej, porowatej części zewnętrznej, która jest wyrównana z portem (portami) obwodowym złączki końcowej oraz nieprzepuszczalnego pierścienia, który oddziela dwie porowate części, zapobiegając jakiemukolwiek przepływowi krzyżowemu między promieniowymi obszarami środkowymi i zewnętrznymi fryty19. Rysunek 1 ilustruje konstrukcję fryty AFT, a rysunek 2 ilustruje format kolumny CF. W tym trybie pracy (CF) próbka jest wstrzykiwana do promieniowego centralnego portu złączki wlotowej, podczas gdy dodatkowa faza ruchoma jest wprowadzana przez port obwodowy wlotu, aby "zasłonić" migrację substancji rozpuszczonych przez promieniowy obszar centralny kolumny. W związku z tym próbka wchodzi do złoża w promieniowym centralnym obszarze kolumny, przy czym zewnętrzny obszar kolumny ma fazę ruchomą tylko przez nią przechodzącą. Badania wykazały, że stosunek objętościowego natężenia przepływu wynoszący około 40:60 (centralny:port peryferyjny) dla końcówki wlotowej kolumny o średnicy wewnętrznej (ID) 4,6 mm wynosioptymalne 6,7,16. Wylot AFT kolumny CF umożliwia regulację przepływu centralnego i obwodowego do ich względnej części i może być zmieniany do prawie dowolnego pożądanego stosunku poprzez zarządzanie ciśnieniem. Optymalizacja kolumny CF może znacznie poprawić różne aspekty funkcjonalne technologii kolumn, takie jak wydajność separacji lub czułość wykrywania. W ten sposób ustanawia się kolumnę "bez ścian", o "nieskończonej średnicy" lub "wirtualną"6,10,18,20. Celem kolumn CF jest aktywne zarządzanie migracją próbki przez kolumnę, aby zapobiec przedostawaniu się próbki do obszaru ściany. W ten sposób stężenie substancji rozpuszczonej po wyjściu do detektora jest maksymalizowane, zwiększając czułość około 2,5 razy większą niż w przypadku konwencjonalnego formatu kolumnowego przy zastosowaniu detekcji ultrafioletowej (UV)16, a nawet większą przy zastosowaniu detekcji widma masowego6.
Kolumny CF idealnie nadają się do próbek o niskim stężeniu, ponieważ zwiększa się czułość wykrywania. Co więcej, idealnie nadają się do łączenia z detektorami o ograniczonym natężeniu przepływu, takimi jak spektrometr masowy (MS)6. Na przykład kolumna AFT w formacie średnicy wewnętrznej 4,6 mm może być dostrojona tak, aby dostarczała taką samą objętość rozpuszczalnika do detektora, jak standardowa kolumna o średnicy wewnętrznej 2,1 mm, gdy pracuje z tymi samymi prędkościami liniowymi, dostosowując wyjściowy przepływ centralny do 21%. Podobnie, kolumna AFT może być również dostrojona tak, aby dostarczała takie samo obciążenie objętościowe do detektora, jak kolumna o średnicy wewnętrznej 3,0 mm, dostosowując wyjściowy przepływ centralny do 43%. W rzeczywistości każdy "wirtualny" format kolumny może być wyprodukowany zgodnie z wymogiem analitycznym6,18,22. Zastosowanie tych specjalnie zaprojektowanych łączników końcowych na wlocie i wylocie zapewnia utworzenie prawdziwej kolumny bez ścian.
Istnieją dwa sposoby ustawienia systemu dostarczania rozpuszczalnika do centralnego i peryferyjnego portu wlotu: system dzielonego przepływu6 i system dwóch pomp6,7. Rysunek 3 ilustruje każdą z tych konfiguracji systemu CF.
System dzielonego przepływu
W systemie z dzielonym przepływem (Rysunek 3A) przepływ pompy prowadzący do wtryskiwacza jest dzielony przez wtryskiwacz za pomocą trójnika o zerowej objętości martwej, gdzie jeden strumień przepływu fazy ruchomej jest podłączony do wtryskiwacza, który jest następnie podłączony do centralnego portu końcówki wlotowej kolumny. Drugi strumień przepływu fazy ruchomej omija wtryskiwacz i jest podłączony do portu obwodowego na wlocie kolumny. Podczas rozdzielania przepływu procentowy strumień przepływu jest regulowany na 40:60 (środek:obrzeże) przed podłączeniem przewodów do kolumny, tj. od wtryskiwacza do środka i pompy do obwodu.
System dwóch pomp
Kolumna CF wymaga dwóch strumieni przepływu na końcu wlotu kolumny. W zależności od typu automatycznego podajnika próbek/wtryskiwacza urządzenia HPLC, konfiguracja z dzielonym przepływem może nie być możliwa, a więc CF można uzyskać za pomocą 2 pomp (rysunek 3B21). Każda pompa jest przydzielana i podłączana do portu centralnego lub peryferyjnego, a natężenie przepływu jest ustawione tak, aby reprezentowało 40% przepływu dla portu centralnego i 60% dla portu peryferyjnego. Na przykład, jeśli całkowite natężenie przepływu wynosi 1,0 ml min-1, natężenie przepływu pompy centralnej jest ustawione na 0,4 ml min-1, a pompa obwodowa jest ustawiona na 0,6 ml min-1.
Wybór trybu działania zależy w dużej mierze od oprzyrządowania HPLC i chromatograficznego trybu działania. Na przykład w niektórych automatycznych podajnikach próbek może dojść do zmiany ciśnienia między położeniem obciążenia próbki a pozycją wtrysku próbki, zakłócając stosunek przepływu dzielonego, dlatego w tym przypadku zaleca się konfigurację podwójnej pompy w celu uzyskania optymalnej wydajności CF. Niezależnie od konfiguracji systemu dostarczania rozpuszczalnika wybranego dla wlotu kolumny CF, optymalizacja wylotu CF pozostaje taka sama. Centralny port wylotowy kolumny CF jest podłączony do detektora światła ultrafioletowego (UV-Vis) z najmniejszą możliwą objętością rurki, aby zminimalizować skutki martwej objętości po kolumnie. Ponieważ kolumny CF naśladują kolumny o wąskim otworze, martwa objętość między wylotem kolumny a detektorem jest szkodliwa dla wydajności separacji kolumny CF. Bardzo ważne jest, aby zapewnić jak najmniejszą objętość przewodów między portem centralnym a detektorem UV-Vis, aby zminimalizować skutki martwej objętości, takie jak poszerzenie pasma, utrata wydajności i czułości. W związku z tym zaleca się stosowanie węży o wąskim otworze (średnica wewnętrzna 0,1 mm), aby umożliwić łatwą regulację ciśnienia bez dodawania nieodpowiedniej objętości martwej. Rurki są również podłączone do portu peryferyjnego i kierowane do odpadów. Po wyjściu kolumny CF współczynnik segmentacji można dostosować do dowolnego wskaźnika, który odpowiada celom analityka. Na przykład, gdy używany jest CF o średnicy wewnętrznej 4,6 mm, często wygodnie jest ustawić współczynnik na 43:57 lub 21:79 (środek: peryferium), aby z szacunkiem emulować "wirtualną" kolumnę o średnicy wewnętrznej 3,0 mm lub kolumnę o średnicy wewnętrznej 2,1 mm. W ten sposób wydajność separacji jest łatwo określana na podstawie kryterium. Współczynnik segmentacji mierzy się poprzez ważenie ilości przepływu wychodzącego z detektora, który jest podłączony do portu centralnego, i przepływu wychodzącego z portu peryferyjnego w danym okresie. Następnie można określić procentowy przepływ przez każdy port, a proporcje można regulować, zmieniając długość dołączonego przewodu lub używając rurki o innej średnicy wewnętrznej (id).
Ten protokół wideo szczegółowo opisuje działanie i procedury optymalizacyjne kolumny CF w celu zwiększenia wydajności chromatograficznej.

<table><tbody><tr><td>Przyrząd</td><td></td><td></td><td></td>HPLC</tr><tr><td>Dodatkowa pompa</td><td></td><td></td><td>Wymagana, jeśli ma być używany system CF z 2 pompami.</td></tr><tr><td>Kolumna HPLC Curtain Flow</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Niezdefiniowana</td><td>Wkrótce zostanie skomercjalizowany</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Rurki HPLC Grade</td></tr><tr><td>PEEK</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Różne długości i średnica wewnętrzna&nbsp;</td></tr><tr><td>Obcinak do rur PEEK</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stoper</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do zbierania eluentów</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Fiolki na próbki 1-2 ml mogą być używane jako naczynia do zbierania eluentu</td></tr><tr><td>Trójnik</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kolumna z przepływem kurtyny: optymalizacja wydajności i czułości

Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Technologia Active Flow (AFT) to forma technologii kolumnowej, która zwiększa wydajność separacji kolumny HPLC poprzez zastosowanie specjalnie specjalnie zbudowanego wieloportowego łącznika końcowego. Kolumny Curtain Flow (CF) należą do zestawu kolumn AFT, w szczególności kolumna CF jest zaprojektowana tak, że próbka jest wstrzykiwana do promieniowego centralnego obszaru złoża, a przepływ kurtynowy fazy ruchomej otaczający wtrysk substancji rozpuszczonej zapobiega promieniowemu rozpraszaniu próbki do ściany. Kolumna funkcjonuje jako kolumna o "nieskończonej średnicy". Celem projektu jest przezwyciężenie niejednorodności promieniowej łoża kolumny, a jednocześnie maksymalizacja obciążenia próbki w promieniowym obszarze centralnym łoża kolumny, co służy zwiększeniu czułości wykrywania. Opisany tutaj protokół przedstawia konfigurację systemu i kolumny CF oraz proces dostrajania zoptymalizowanej "wirtualnej" kolumny o nieskończonej średnicy.

Kolumny AFT opracowano przy użyciu specjalistycznej konstrukcji frity (Rycina 1) w wieloportowych złączkach końcowych kolumny, aby wyeliminować heterogeniczność łoża kolumny i poprawić wydajność rozdziału. Przeprowadzono badanie międzylaboratoryjne dotyczące wydajności rozdziału kolumn chromatograficznych CF (Rycina 2), wykorzystując układ z systemem podwójnych pomp (Rycina 3B), zgodnie z opisem w sekcji 3 niniejszego protokołu23</su...

Tutaj prezentujemy protokół do działania i optymalizacji kolumny Active Flow Technology (AFT) w trybie Curtain flow (CF) dla zwiększenia wydajności separacji.

Kolumna z przepływem kurtyny: optymalizacja wydajności i czułości

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially ...

Ogólnym celem tej metody jest zwiększenie wydajności i czułości rozdziału poprzez optymalizację kolumny z przepływem kurtynowym. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie nauk o środowisku, kryminalistyki oraz w obszarach wymagających analizy śladowych ilości próbek, gdzie niezbędna jest wydajna i wysoce czuła technika rozdziału. Główną zaletą tej techniki jest zwiększenie wydajności rozdziału oraz czułości analizy w porównaniu do konwencjonalnych metod rozdziału HPLC.Ta metoda może zapewnić sposób na zwiększenie rozdzielczości, a tym samym wydajności analiz, w sposób ekonomiczny i czasochłonny. Kolumna z przepływem kurtynowym jest nowym konceptem dla praktyków HPLC, jednak jej zastosowanie nie jest skomplikowane. Wymaga ona jedynie optymalizacji odpowiednich stosunków przepływów.W pierwszej kolejności przygotować butelki zawierające 100% ultra czystej wody oraz 100% metanolu jako fazy ruchome A i B dla urządzenia HPLC. Przepłukać pompy zgodnie z wymaganiami producenta. Po przepłukaniu odłączyć linię pompy od zaworu wtryskowego autosamplera.Do odłączonej linii przymocuj trójnik. Do każdego króćca trójnika podłącz rurkę o średnicy wewnętrznej 0,13 millimeter i długości 15 centimeters. Jedną rurkę z trójnika połącz z zaworem wtryskowym autosamplera.Na koniec ustaw pompę na szybkość przepływu 1 ml/min. Wytaruj dwa puste naczynia zbiorcze i oznacz je jako centralne oraz obwodowe. Przez 60 s zbieraj wypływającą z linii pochodzącej z injektora fazę ruchomą do naczynia oznaczonego jako centralne.Ponownie zważ naczynie centralne i wyznacz masę zebranej fazy ruchomej. Powtórz ten proces, zbierając przepływ z portu peryferyjnego do naczynia opisanego jako peryferyjne. Wyznacz procentowy przepływ lub liczbę mililitrów na minutę z każdej linii, korzystając z podanych równań.Port centralny powinien stanowić około 40%, a port obwodowy około 60%. Jeśli wartości różnią się o więcej niż dwa procent, należy zmienić długość lub średnicę cewki, aby dostosować stosunek przepływów. Następnie należy powtórzyć etapy pobierania i obliczeń.Następnie wyłącz przepływ pompy i podłącz linię wtryskiwacza do centralnego portu wlotowego kolumny. Podłącz również linię z trójnika do portu peryferyjnego wlotu kolumny. Powoli zwiększaj szybkość przepływu do 1 mL/min 100% fazy ruchomej B. Aby zakończyć strojenie systemu, przepuść 100% metanolu z szybkością 1 mL/min przez 10 minut w celu równoważenia kolumny.Na początku należy użyć przewodów, aby połączyć centralny port wylotowy z detektorem UV-Vis. Do peryferyjnego portu wylotowego kolumny CF należy podłączyć przewód tego samego typu i długości. Następnie należy ustawić pompę na szybkość przepływu 1 ml/min.Wytaruj dwa puste naczynia zbiorcze, a następnie oznacz jedno jako naczynie do zbiórki centralnej i drugie do zbiórki peryferyjnej. Przez 60 s zbieraj do naczynia oznaczonego jako centralne wypływającą fazę ruchomą z detektora UV-Vis. Ponownie zważ naczynie zbiorcze, aby określić masę eluowanego roztworu.Powtórz ten proces dla peryferyjnego portu wylotowego i oznakowanego naczynia zbiorczego. Następnie określ procentowy przepływ z każdej linii, analogicznie do wcześniejszego pomiaru przepływu wlotowego. Przepływ w linii UV-Vis powinien wynosić 21 procent, a przepływ peryferyjny na wylocie 79 procent.Jeśli stosunek przepływów odbiega znacząco od normy, należy dostosować rozmiar rurki podłączonej do wylotu detektora UV-Vis, aby zmienić procentowy udział przepływu centralnego. Ważne jest, aby stosunki przepływów centralnego i peryferyjnego na wlocie i wylocie kolumny były zgodne z niniejszym protokołem, co zapewni optymalne działanie kolumny o przepływie kurtynowym. Kolumny z technologią aktywnego przepływu zostały opracowane z wykorzystaniem specjalnej konstrukcji frit w wieloportowych złączkach końcowych kolumny, aby wyeliminować niejednorodność złoża kolumny i poprawić wydajność rozdziału.Mieszaninę testową zawierającą fenetol, butylobenzen i pentylobenzen analizowano przy użyciu konwencjonalnych kolumn o średnicy wewnętrznej 4,6 i 2,1 mm oraz kolumny z przepływem osłonowym (curtain flow) o średnicy wewnętrznej 4,6 mm. Rozdział mieszaniny ilustruje poprawę wydajności w zakresie sprawności i czułości kolumny z przepływem osłonowym w porównaniu z kolumnami standardowymi. Zastosowanie kolumny z przepływem osłonowym zwiększyło sygnał dla butylobenzenu pomimo zmniejszonej objętości piku.Po opanowaniu ta technika może zostać przygotowana w mniej niż pół godziny, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Układ kolumny do przepływu kurtynowego można wykorzystywać wielokrotnie, jednak stosunki przepływów muszą być rutynowo sprawdzane. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby trzymać się jak najbliżej zalecanych stosunków przepływów.Kolumna z przepływem kurtynowym utorowała drogę badaczom w dziedzinie HPLC do przesunięcia granic możliwości kolumn i aparatury UPLC, aby uzyskać szybszą analizę próbek bez pogorszenia wydajności rozdziału. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo zrozumieć znaczenie kolumn z przepływem kurtynowym, ponieważ mogą one zapewnić lepszy rozdział niż konwencjonalne kolumny HPLC.

curtain-flow-column-optimization-of-efficiency-and-sensitivity

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Przedstawiono zautomatyzowaną metodę identyfikacji odpowiednich wypełnień do chromatografii oddziaływań hydrofobowych (HIC) do wykorzystania w procesie oczyszczania białek. Metoda ta wykorzystuje system średniociśnieniowej chromatografii cieczowej obejmujący zautomatyzowane mieszanie buforów, dynamiczny wtrysk próbki z pętli, sekwencyjny wybór kolumn, analizę wielodługościową oraz rozdzielcze zbieranie frakcji eluatu.

Zautomatyzowany dobór kolumny do hydrofobowej chromatografii oddzielania w celu oczyszczania białek

Opisujemy metodę poddawania przylegających komórek naprężeniom ścinającym w przepływie laminarnym w sterylnym obwodzie przepływu ciągłego. Poprzez przezroczystą komorę można badać adhezję i morfologię komórek, a z obwodu można pobierać próbki do analizy metabolitów oraz zbierać komórki po ekspozycji na siły ścinające do dalszych eksperymentów lub hodowli.

Komora przepływowa z równoległymi płytkami i obwód przepływu ciągłego do oceny komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężenia ścinającego w przepływie laminarnym

Tutaj prezentujemy protokół działania i dostrajania kolumn chromatografii przepływowej z równoległymi segmentami, aby umożliwić detekcję multipleksowaną.

Dostrajanie kolumny przepływu z równoległymi segmentami i włączanie detekcji multipleksowej

Przedstawiono protokół użycia wysokosprawnych kolumn do chromatografii cieczowej z przepływem reakcji dla metod wykorzystujących derywatyzację po kolumnie (PCD).

Derywatyzacja po kolumnie przy użyciu wysokosprawnych kolumn do chromatografii cieczowej z przepływem reakcji

Limity termiczne mogą przewidywać środowisko, które organizmy tolerują, co jest cenną informacją w obliczu gwałtownych zmian klimatycznych. Opisano tutaj wysokoprzepustowe protokoły do oceny krytycznych minimów termicznych i czasu wykańczania ciepła u owadów. Oba protokoły maksymalizują przepustowość i minimalizują koszt testów.

Wysokoprzepustowe testy krytycznych limitów termicznych u owadów

Tutaj prezentujemy protokół dla zoptymalizowanej procedury pakowania kolumn kapilarnych FlashPack. Zastosowanie zoptymalizowanego protokołu do powszechnej konfiguracji bomby ciśnieniowej 100 bar pozwala na 10-krotnie szybsze pakowanie i produkcję długich, ultra wysokowydajnych kolumn kapilarnych.

Prosta, wewnętrzna, ultra-wydajna produkcja kolumn kapilarnych dzięki podejściu FlashPack

Tutaj prezentujemy metodę analizy zakresu, która optymalizuje punkty próbkowania generowane przez ortogonalny projekt eksperymentalny, aby zapewnić, że świeża żywność może być przechowywana w wentylowanym pudełku przez długi czas, regulując wzorzec przepływu powietrza.

Projektowanie i strategie optymalizacji wysokowydajnej skrzynki wentylowanej

Tutaj prezentujemy adaptacyjną metodę symulowanego wyżarzania (ASAM) w celu optymalizacji przybliżonego modelu powierzchni odpowiedzi kwadratowej (QRSM) odpowiadającego systemowi zarządzania ciepłem akumulatora pokrytego pyłem zawieszonym i wypełnienia spadków temperatury poprzez dostosowanie kombinacji prędkości przepływu powietrza na wlotach systemu.

Optymalizacja systemu zarządzania ciepłem na bazie powietrza dla zapylonych akumulatorów litowo-jonowych pokrytych cząstkami stałymi

Kinezyny charakteryzują się zależnym od nukleotydów oddziaływaniem z mikrotubulami: cyklem obrotu ATP sprzężonym z cyklem interakcji mikrotubul. W tym miejscu opisujemy protokoły analizy kinetyki poszczególnych przejść nukleotydowych w cyklu obrotu ATP kinezyny przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie nukleotydów i fluorescencji zatrzymanego przepływu.

Zastosowanie fluorescencji o zatrzymanym przepływie i znakowanych nukleotydów do analizy cyklu obrotu ATP kinezyn

Właściwości powierzchni nanocząstki są ważne dla jej interakcji z otaczającym ją ośrodkiem. Dlatego modyfikacja powierzchni nanorurek węglowych może mieć kluczowe znaczenie dla ich transportu i zatrzymywania przez porowate media. W tym przypadku eksperymenty kolumnowe na skalę laboratoryjną są wykorzystywane do zrozumienia możliwego transportu i zatrzymywania tych nanocząstek.

Transport modyfikowanych powierzchniowo nanorurek węglowych przez kolumnę glebową

Poznaj optymalizację kolumny z przepływem kurtyny w chromatografii HPLC, aby zwiększyć wydajność i czułość analizy śladów w naukach środowiskowych i kryminalistycznych.

Kolumna z przepływem kurtyny: optymalizacja wydajności i czułości

Przeglądaj więcej filmów