Synteza nanocząstek tlenku żelaza sterowana mikrofalami w celu szybkiego wykrywania miażdżycy

Ogólnym celem tego protokołu jest wykorzystanie technologii mikrofalowej do szybkiej syntezy i funkcjonalizacji nanocząstek tlenku żelaza z ugrupowaniem bisfosfonianowym do szybkiego wykrywania miażdżycy za pomocą rezonansu magnetycznego w modelach mysich. Zastosowanie technologii mikrofalowej w syntezie i funkcjonalizacji nanocząstek tlenku żelaza jest wciąż ograniczone. Pokazujemy jednak, w jaki sposób można opracować wysokiej jakości nanocząstki i niezwykle szybkie protokoły.

Główną zaletą tej techniki jest to, że w niezwykle krótkim czasie można wyprodukować wysokiej jakości funkcjonalizowane nanocząstki i wykorzystać je do cewnikowania blaszki miażdżycowej ukierunkowanej na mikrozwapnienia. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj 0,5 grama 3-acetyloacetenianu żelaza, 1,4 mililitra kwasu oleinowego, 0,6 mililitra oleylaminy i 1,19 grama 1,2-heksadodekanodiolu do kolby przystosowanej do kuchenki mikrofalowej. Ostrożnie dodać 10 mililitrów eteru fenylowego w dół ścianki kolby za pomocą pipety miarowej.

Następnie umieść kolbę w reaktorze mikrofalowym i rozpocznij protokół mikrofalowy, ładując dynamiczne badanie do kuchenki mikrofalowej. Po zakończeniu reakcji i ostygnięciu kolby do temperatury pokojowej, przenieść mieszaninę reakcyjną do kolby Erlenmeyera za pomocą szklanej pipety i dodać 10 mililitrów 98-procentowego etanolu. Umieścić kolbę na magnesie neodymowo-niobowo-borowym i po 5 minutach usunąć supernatant szklaną pipetą.

Następnie dodaj 10 mililitrów etanolu do kolby. Sonikować próbkę w temperaturze 40 kiloherców przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu umieść próbkę na magnesie i usuń supernatant.

Rozproszyć nanocząstki pokryte kwasem oleinowym w 30 mililitrach chloroformu i sonikować w temperaturze 40 kiloherców przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po sonikacji przenieś 0,5 mililitra nanocząstek do szklanej kuwety i dodaj 0,5 mililitra chloroformu. Sprawdź rozmiar hydrodynamiczny w zetasizerze zgodnie z instrukcjami producenta.

W tym momencie rozpuść 44,3 miligrama nadmanganianu potasu i 150,4 miligrama chlorku benzoilotrimetyloamoniowego w mieszaninie wody i chloroformu trzy do dwóch. Dodać otrzymany roztwór do 5-mililitrowego Aliquat nanocząstek pokrytych kwasem oleinowym w kolbie przystosowanej do kuchenki mikrofalowej. Uruchom protokół mikrofalowy dla nanocząstek kwasu azelainowego, ustawiając temperaturę na 105 stopni Celsjusza, czas na dziewięć minut, ciśnienie na 250 psi i moc na 300 watów.

Następnie dodać 10 mililitrów buforu fosforanowego o pH 2,9 do kolby. Po powtórzeniu protokołu mikrofalowego i usunięciu supernatantu, dodać 10 mililitrów wody do kolby i przenieść mieszaninę do kolby Erlenmeyera. Najważniejszym etapem jest oczyszczanie z nanocząstek kwasu azelainowego.

Następnie dodaj 5 mililitrów 10-procentowego wodorosiarczanu sodu do kolby Erlenmeyera i sonikuj w 40 kilohercach przez dwie minuty w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po zebraniu cząstek i usunięciu supernatantu, przemyj nanocząstki jeszcze trzykrotnie 1% wodorotlenku sodu. Ponownie zdyspergować cząstki w 5 mililitrach buforu fosforanowego o pH 7,2.

Aby sprawdzić rozmiar hydrodynamiczny i potencjał zeta, przenieś 0,7 mililitra nanocząstek kwasu azelainowego do jednorazowej, złożonej komórki kapilarnej i umieść ją w zetasizerze w celu analizy. Dodać 12 miligramów EDC i 15 miligramów sulfo-NHS do probówki wirówkowej z 2 mililitrowym Alikatem nanocząstek kwasu azelainowego. Mieszaj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 35 minut.

Po umieszczeniu magnesu pod rurką wirówkową w celu destabilizacji nanocząstek, należy odessać supernatant i przemyć cząstki 1,5 mililitra 1 milimolowego buforu hepes. Następnie dodaj 5 miligramów neridronianu i mieszaj mieszaninę przez dwie godziny. Oddziel nanocząstki za pomocą magnesu i przemyj 1 milimolowym buforem hepes.

Na koniec zdyspergować nanocząstki neridronianu w 2 mililitrach 1 milimolowego buforu hepes. Aby sprawdzić wielkość hydrodynamiczną i potencjał zeta, dodaj 0,7 mililitra nanocząstek neridronianu do jednorazowej złożonej komórki kapilarnej i umieść ją w zetsizerze w celu analizy. Wszystkie nanocząstki charakteryzowały się małymi rozmiarami hydrodynamicznymi w bardzo wąskim rozkładzie wielkości.

Cząstki wykazują doskonałą krystaliczność, jak pokazano na obrazach TEM. Dodatkowo, te same wyniki dla wielkości i rozkładu hydrodynamicznego uzyskano po czterech powtórzeniach syntezy, demonstrując jeden z najważniejszych aspektów podejścia mikrofalowego, jego odtwarzalność. Właściwości wiązania jonów wapnia przez bisfosfoniany obecne w nanocząstkach neridronianu sprawdzono za pomocą relaksometrii i wykazano, że czas relaksacji T2 rośnie liniowo wraz z ilością jonów wapnia i czasem inkubacji w wyniku tworzenia klastrów nanocząstek, podczas gdy nanocząstki bez jonu wapnia pozostają stabilne.

Eksperymenty MRI in vivo przeprowadzono na 48-tygodniowych myszach z nokautem apoe i po godzinie od wstrzyknięcia sygnał z blaszki był hipointensywny w porównaniu z obrazami podstawowymi. Ponadto stosunek płytki nazębnej do mięśni był znacząco różny między obrazami podstawowymi i godzinę po wstrzyknięciu. Sygnał w wątrobie monitorowano również po wstrzyknięciu nanocząstek neridronianu, które po 20 minutach zostały całkowicie usunięte z krążenia, co potwierdziło selektywną akumulację tych nanocząstek w kierunku blaszki miażdżycowej.

Przeprowadzono obrazowanie ex vivo i histologię, a obrazowanie aorty, z nanocząstkami i bez nich, wykazało różnice w intensywności sygnału zgodnie z eksperymentami in vivo. Po opanowaniu, technologia mikrofalowa pozwala na charakterystykę syntezy i wykrywanie płytki nazębnej w łącznym czasie 3 godzin, jeśli zostanie prawidłowo wykonana. Kolejną zaletą tej metody jest to, że przy niewielkiej modyfikacji można wykonać inne techniki obrazowania, takie jak termografia, w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak kwantyfikacja miażdżycy.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się obrazowaniem układu sercowo-naczyniowego do zbadania wczesnej diagnostyki miażdżycy za pomocą konfiguracji eksperymentalnej, którą można łatwo dostosować do potrzeb klinicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać hydrofilowe nanocząstki tlenku żelaza za pomocą kuchenki mikrofalowej i ich zastosowanie w obrazowaniu układu krążenia. Nie zapominaj, że praca z kuchenkami mikrofalowymi może być niebezpieczna w zależności od używanej kuchenki, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak kontrola ciśnienia w spłuczce.