Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wykorzystanie eksplantów dachu blastocele lub czapy zwierzęcej x laevis do badania mechanizmów molekularnych i procesów komórkowych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego in vitro oraz in vivo. Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach biologii rozwoju i biologii komórek macierzystych dotyczące nabywania losu komórkowego, migracji komórek oraz właściwości autonomicznych i nieautonomicznych komórek nerwowych. Przedstawione techniki stanowią proste, tanie, wszechstronne i wydajne narzędzia do badania fundamentalnych mechanizmów kluczowych zachowań komórek nerwowych.

Analizy te umożliwiają testowanie czynników determinujących losy neuronów w celu przeprogramowania indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych oraz dojrzałą generację linii komórkowych pochodzenia neuronalnego do dalszego przesiewu. Zazwyczaj osoby nowo zapoznające się z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ techniki te wymagają sprawności manualnej. Pomysł na te metody pojawił się u mnie podczas rozważań nad analizą zachowania segregacji komórek.

Aby przygotować preparat w układzie płaskim (flat-mount) przedniej części rurki neuralnej *Xenopus laevis*, należy za pomocą plastikowej pipety transferowej przenieść utrwalony, odwodniony i ponowie nawodniony embrion do 60-milimetrowej szalki Petriego wypełnionej po brzegi roztworem PBT. Następnie należy wsunąć pęsetę o cienkich końcach między oczy a rurkę neuralną na poziomie szypuły nerwu wzrokowego i oddzielić oczy. Następnie ostrożnie wprowadza się pęsetę pod ektodermę pokrywającą rurkę neuralną za głową i delikatnie oddziela ektodermę.

Po przeprowadzeniu odpowiedniego znakowania hybrydyzacyjnego NC2 przenieś embrion do nowej szalki Petriego o pojemności 60 ml wypełnionej PBT i za pomocą precyzyjnej pęsety wstępnie odizoluj przednią część rurki nerwowej od embrionu. Następnie ostrożnie usuń luźno przylegającą notochord z obszaru pod rurką nerwową. W razie potrzeby usuń pęcherzyki słuchowe oraz pozostałe części mezodermy.

Po odcięciu wszystkich wyrostków cewy nerwowej, oddziel przednią część cewy nerwowej od zarodka. Następnie przenieś wyizolowaną cewę nerwową do probówki stożkowej o pojemności 1,5 mililitra wypełnionej 50% glycerol i PBS w celu inkubacji przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po drugiej nocnej inkubacji w 90% glycerol, przenieś cewę nerwową na szkiełko mikroskopowe w niewielkiej ilości glicerolu i za pomocą igieł wolframowych rozetnij cewy nerwowe wzdłuż linii środkowej grzbietowej i brzusznej.

Następnie użyć pierścieni wzmacniających przykrytych szkiełkiem podstawowym, aby zamontować obie strony cewy nerwowej w 90% glicerolu i PBS. Aby przygotować koraliki do indukcji eksplantu czepka zwierzęcego, użyć mikropipety P200, aby przenieść połowę porcji koralików żywicznych traktowanych BSA do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Następnie zastąpić sterylną wodę destylowaną w nowej probówce 200 µl medium zawierającego badaną cząsteczkę eksperymentalną i inkubować przez dwie godziny w temperaturze 4 °C.

Po zakończeniu inkubacji przenieść zarodki w stadium blastuli lub bardzo wczesnej gastruli do buforu PBS z dodatkiem wapnia i magnezu oraz 0,2% BSA. Następnie, pod mikroskopem stereoskopowym, uchwyć błonę żółtkową jedną parą pęset i za pomocą drugiej pary pęset powoli odwarstw błonę od strony wegetatywnej zarodka, uważając, aby nie uszkodzić strony animalnej. Następnie, używając precyzyjnej pęsety, wycięty mały kwadrat z bieguna animalnego każdego zarodka.

Używając końcówki do pipety powleczonej BSA, przenieś kapsuły do poszczególnych dołków płytki wielodołkowej Terasaki w 0,5X modyfikowanym roztworze soli Bartha, umieszczając pigmentowaną stronę zwierzęcia w kontakcie z okrągłym dnem dołka. Używając mikropipety P20, wybierz najciemniejsze różowe kuleczki z probówki z preparatem i umieść jedną kuleczkę na każdej kapsule, używając pęsety do centrowania kuleczek na kapsułach. Po umieszczeniu ostatniej kuleczki, ustaw płytkę na namoczonym wodą papierze i przykryj ją plastikowym pojemnikiem przed inkubacją.

Aby przygotować dysocjowane i rezagregowane eksplanty czapki zwierzęcej, należy wyizolować od 15 do 30 czapek zwierzęcych, zgodnie z wcześniejszą instrukcją. Za pomocą precyzyjnej pęsety należy wyciąć mały kwadrat tkanki z biegunów zwierzęcych. Następnie przenieść czapki zwierzęce do dołka pokrytego agarozą i wypełnionego bezwapniową solą Holtfretera, tak aby ich pigmentowane strony były skierowane ku górze.

Po kilku minutach powinna nastąpić dezagregacja. Za pomocą precyzyjnej pęsety należy oddzielić warstwy pigmentowe od reszty tkanki. Następnie, używając mikropipety P20, należy usunąć pigment.

Gdy większość warstw pigmentowych zostanie usunięta, a komórki będą całkowicie dysocjowane, zakręć płytką, aby skupić komórki w centrum, i za pomocą mikropipety P1000 usuń jak najwięcej medium, uważając, aby nie dotknąć komórek. Następnie dodaj do dołka 1 ml soli fizjologicznej Holtfretera z wapniem. Przenieś dysocjowane czapy zwierzęce do probówki o pojemności 1,5 ml.

Po odwirowaniu komórek, użyj mikropipety P1000, aby ostrożnie usunąć nadsącz i ponownie zawiesić osad w 20 µL soli Holtfretera z wapniem. Pozostaw komórki do ponownej agregacji na okres od trzech do sześciu godzin w temperaturze pokojowej. Następnie powoli dodaj 1 mL 3/4 NAM, aby ostrożnie odczepić eksplantaty od dna probówki, a następnie za pomocą plastikowej pipety transferowej rozdziel eksplantaty do poszczególnych niepowlekanych płytek.

Aby przenieść eksplanty z czepka zwierzęcego na płytki neuronalne Xenopus laevis, najpierw należy pokryć 60-milimetrowe szalki Petriego 3% agarozą i roztworem 3/4 NAM, w którym wykonano małe otwory. Następnie embriony we wczesnym stadium neurulacji należy przenieść do buforu PBS z dodatkiem wapnia i magnezu, uzupełnionego o 0,2% BSA, w celu usunięcia błony witelinowej. Potem należy wypełnić pokrytą agarozą szalkę do sekcji świeżym roztworem 3/4 NAM i przenieść do niej embriony stroną grzbietową do góry.

Następnie przenieś reaggregowany eksplant czapy zwierzęcej na płytkę do sekcji, pozwalając eksplantowi powoli opaść na dno naczynia pod wpływem grawitacji po tym, jak końcówka pipety przebije powierzchnię NAM. Następnie, pod mikroskopem stereoskopowym, użyj zaokrąglonych pęsety, aby przytrzymać embrion w miejscu, wykonując jednocześnie igłą wolframową nacięcie w płytce neuralnej dla eksplantu. Wytnij niewielki fragment reaggregowanego eksplantu czapy zwierzęcej, używając zaokrąglonej pęsety i nożyka do brwi.

Użyj fragmentu tkanki, aby dopasować rozmiar fragmentu eksplantu do przeszczepu. Rysunek przedstawia płasko rozłożone przednie rurki neuronowe X laevis i X tropicalis, przygotowane zgodnie z opisaną metodą w stadiach 30, 32 i 35 po podwójnej hybrydyzacji NC2 w całym preparacie. Jak widać na obrazach, ekspresja genu sonic hedgehog u Xenopus jest wykrywalna w komórkach w kontakcie z kuleczkami nasączonymi pożywką warunkowaną suplementowaną końcowym fragmentem genu sonic hedgehog, natomiast nie jest obecna w komórkach w kontakcie z kuleczkami traktowanymi pożywką kontrolną.

Po dysocjacji i reaggregacji, zgodnie z zaprezentowanym właśnie sposobem, eksplanty zawierające zanterioryzowane komórki czepek zwierzęcy zmieszano z zanterioryzowanymi komórkami czepek zwierzęcy wykazującymi ekspresję Otx2. Jak zaobserwowano, komórki wykazujące ekspresję Otx2 nie oddzieliły się od komórek bez ekspresji Otx2. Oba typy komórek swobodnie wymieszały się w obrębie eksplantu.

W przeciwieństwie do tego, w eksplantach, w których komórki wykazujące ekspresję Otx2 zmieszano z komórkami wykazującymi ekspresję BAR HL-2, Otx2 oraz IRX3, komórki wykazujące ekspresję wielu genów utworzyły spójne płaty, które nie rozprzestrzeniły się równomiernie w obrębie reagregowanego eksplantu. Po przeszczepieniu do przedniej płytki neuralnej embrionów x laevis, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, mieszane eksplanty składające się z komórek koekspresujących BAR HL-2, Otx2 i IRX3 zmieszanych z komórkami wykazującymi ekspresję N-końca sonic hedgehog, wykazywały endogenną ekspresję sonic hedgehog i oddzieliły się od przednich komórek nabłonka neuralnego. Natomiast w przypadku przeszczepienia do płytki neuralnej x laevis mieszanych eksplantów składających się z komórek wykazujących ekspresję Otx2 oraz N-końca sonic hedgehog, przeszczepione komórki nie wykazywały ekspresji sonic hedgehog ani nie oddzieliły się od sąsiednich komórek.

Po opanowaniu techniki, przeszczepianie eksplantu czapki zwierzęcej na embrionalne płytki nerwowe można przeprowadzić w ciągu dwóch do trzech godzin, w zależności od liczby przeszczepianych embrionów. Jest to technika bardzo niezawodna i przynosząca satysfakcjonujące wyniki. Podczas wykonywania tej procedury należy zachować najwyższą ostrożność w celu uniknięcia kontaminacji bakteryjnej i grzybiczej.

Po przeprowadzeniu procedur przeszczepiania można zastosować inne metody, takie jak hybrydyzacja in situ w preparatach całych, aby śledzić losy i zachowanie przeszczepionych komórek. Programy rozwojowe leżące u podstaw organogenezy rurki neuralnej są w dużej mierze konserwatywne, szczególnie u kręgowców. W związku z tym informacje uzyskane na płazach pomogły w pogłębieniu naszej wiedzy na temat procesów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw rozwoju kręgowców.