Name: Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Poznaj metody eksplantatów blastocoeli Xenopus laevis do badania wczesnego rozwoju neuronów in vitro i in vivo. Protokoły te pozwalają analizować mechanizmy molekularne i migrację komórek nerwowych w biologii rozwojowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor dziękuje Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef i Anne Hélène Monsoro-Burq za ich pomoc i rady, a także Zakładowi Zwierząt Instytutu Curie. Autor dziękuje Paulowi Johnsonowi za jego pracę redakcyjną nad rękopisem. Prace te były wspierane przez Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) oraz przez granty z "Association pour la Recherche sur le Cancer" (ARC 4972 i ARC 5115; FRC DOC20120605233 i LABEX Memolife) oraz Fundacji Pierre'a Gilles'a de Gennes (FPGG0039).

Eksperymenty są zgodne z krajowymi i europejskimi przepisami dotyczącymi ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych oraz z międzynarodowymi zasadami zastępowania, zmniejszania i udoskonalania.
1. Płaski montaż kijanek Xenopus laevis przedniej cewy nerwowej po całkowitej hybrydyzacji in situ
<ol>
	<li>Pozyskać zarodki X. laevis zgodnie ze standardowymi procedurami4 i postarzyć je do momentu osiągnięcia stadium neuruli 26 i starszych (zgodnie z tabelą rozwojową Nieuwkoopa i Fabera17.</li>
	<li>Napraw kijanki X. laevis, inkubując je w roztworze 4% paraformaldehydu (PFA). Rozdrabniaj i obracaj zarodki w szklanej fiolce o pojemności 2 ml, 1 do 1,5 godziny w RT dla zarodków w stadium od 26 do 38, 2 godziny w RT dla zarodków w późniejszych stadiach. 
	UWAGA: PFA jest toksyczny przez kontakt i podejrzewa się działanie rakotwórcze. Powinien być manipulowany pod maską. 
	UWAGA: Jeden czerw X. laevis jest zwykle umieszczany w szklanej fiolce o pojemności 2 ml, ale można użyć większej szklanej fiolki.</li>
	<li>Umyj zarodki w tej samej fiolce za pomocą 1x PBS z 0,1% Tween (PBT), 3 min w RT, dwa razy. 
	UWAGA: O ile nie określono inaczej, stosowany PBS jest z wapniem i magnezem lub bez nich.</li>
	<li>Odwodnić zarodki w 100% metanolu (MeOH) przez co najmniej 12 godzin w temperaturze pokojowej w tej samej fiolce. Wymień MeOH 100% co najmniej dwa razy pod maską za pomocą plastikowej mikropipety. 
	UWAGA: MeOH zmienia kolor na lekko żółty, gdy rozpuszczą się w nim lipidy. Uwaga: MeOH jest toksyczny przez drogi oddechowe i należy nim manipulować pod maską.</li>
	<li>Ponownie nawodnić zarodki za pomocą tej samej fiolki przez stopniowaną serię kąpieli MeOH: MeOH 75% w PBS, MeOH 50% w PBS, MeOH 25% w PBS, PBS dwukrotnie, każda kąpiel 5-10 minut w RT. Roztwory MeOH są zmieniane pod pokrywą za pomocą plastikowej mikropipety.</li>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety przenieś zarodek do wypreparowania na 60-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną do góry PBT. Za pomocą dwóch cienkich kleszczyków ostrożnie usuń oczy, wkładając jeden cienki kleszcz między oczy a cewę nerwową, na poziomie łodygi wzrokowej. Odłącz oczy od cewy nerwowej. Ostrożnie wprowadź kleszcze poniżej ektodermy pokrywającej cewę nerwową. Ostrożnie oderwij ektodermę, zaczynając od tyłu głowy i wyrzuć ją.</li>
	<li>Wykonać podwójne lub pojedyncze ISH za pomocą sond znakowanych digoksygeniną lub fluoresceiną, jak opisano wcześniej18,19.</li>
	<li>Po transferze ISH zarodki umieszczono na nowej szalce Petriego o średnicy 60 mm, wypełnionej do góry PBT za pomocą plastikowej pipety.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy ostrożnie odłącz cewę nerwową od reszty zarodka. Na tym etapie przednia cewa nerwowa oddziela się od tylnej cewy nerwowej. Ostrożnie odłącz pozostałe części ektodermy leżące nad cewą nerwową, strunę grzbietową, która jest luźno przymocowana poniżej cewy nerwowej, pęcherzyki uszne i pozostałe części mezodermy. Upewnij się, że na tym etapie cewa nerwowa jest pozbawiona jakichkolwiek wyrostków robaczkowych. 
	UWAGA: Aby uniknąć uszkodzenia cewy nerwowej, wszystkie transfery cewy nerwowej/zarodka należy wykonać za pomocą plastikowej pipety transferowej lub, jeśli to konieczne, mikropipety z naciętą końcówką na jej końcu. Średnica końcówki jest dostosowana do wielkości cewy nerwowej.</li>
	<li>Przenieść wypreparowaną rurkę nerwową (patrz uwaga krok 1.9) do probówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej 50% glicerolem rozcieńczonym w PBS. Poczekaj, aż cewy nerwowe opadną na dno roztworu glicerolu, zwykle O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć roztwór 50% glicerolu/PBS za pomocą mikropipety P1000 i dodać do tej samej probówki o pojemności 1,5 ml roztwór 90% glicerolu/PBS za pomocą mikropipety P1000. Poczekaj, aż cewy nerwowe opadną na dno 90% roztworu glicerolu/PBS, zwykle O/N w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: do długotrwałego przechowywania należy stosować 90% glicerol/PBS oraz antybiotyki, aby zapobiec rozwojowi bakterii.</li>
	<li>Przenieś rurki nerwowe na szklaną płytkę lub szkiełko mikroskopowe za pomocą plastikowej pipety transferowej.</li>
	<li>Wypreparuj cewy nerwowe wzdłuż grzbietowej i brzusznej linii środkowej za pomocą igieł wolframowych. Podczas tego etapu cewy nerwowe są utrzymywane w 90% glicerolu/PBS.</li>
	<li>Zamontuj dwie strony cewy nerwowej w 90% glicerolu/PBS za pomocą pierścieni wzmacniających pokrytych szklanym szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe utrwalić lakierem i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Indukcja eksplantatów czapek zwierzęcych za pomocą kulek żywicy anionowymiennej
<ol>
	<li>Przenieść 100 μl kulek żywicy anionowymiennej do probówki o pojemności 2 ml za pomocą mikropipety P1000. Umyj koraliki co najmniej pięć razy z rzędu sterylną wodą destylowaną. Pozwól, aby kulki osiadły na dnie probówki i zastąp sterylną wodę destylowaną za pomocą mikropipety P1000. Nie dotykaj koralików.</li>
	<li>Pozwól kulkom namoczyć O/N w probówce o pojemności 2 ml wypełnionej sterylną wodą destylowaną z albuminą surowicy bydlęcej (BSA) (10 mg / ml) w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dwie godziny przed pobraniem AC umieść połowę kulek w nowej probówce o pojemności 1,5 ml za pomocą mikropipety P1000. Zastąp sterylną wodę destylowaną 500 μl pożywki zawierającej cząsteczkę, która ma być badana pod kątem jej potencjału indukcyjnego lub o której wiadomo, że wywołuje określony los. Zachowaj drugą połowę koralików, ponieważ będą one używane jako kontrola negatywna.</li>
	<li>Inkubować kulki w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 godziny.</li>
	<li>Wykonaj wszystkie kolejne kroki pod mikroskopem stereoskopowym i wykonaj cały transfer prądu przemiennego za pomocą mikropipety.</li>
	<li>Przenieść blastulę lub bardzo wczesne zarodki gastruli do PBS z wapniem i magnezem uzupełnionymi 0,2% BSA za pomocą plastikowej pipety transferowej. 
	UWAGA: Zarodki rozwijające się w temperaturze 12 °C osiągają stadium blastuli i gastruli w ciągu 20 do 24 godzin.</li>
	<li>Usuń błonę witelinową zarodka za pomocą kleszczy, jak opisano wcześniej20. Napraw zarodek jednym kleszczem. Ściśnij błonę witelinową bokiem innych kleszczy. Trzymając błonę, powoli oderwij ją od zarodka. Wykonaj tę procedurę po brzusznej (roślinnej) stronie zarodka. Nie uszkadzaj zwierzęcej strony zarodka.</li>
	<li>Odizoluj małe AC zgodnie z wcześniejszym opisem21. Biegun zwierzęcy to pigmentowana część zarodka. Za pomocą cienkich kleszczy wytnij mały kwadrat tkanki z kija zwierzęcego. Tkanka AC zawiera tylko komórki ektodermalne. Upewnij się, że tkanka ma jednolitą grubość. Jeśli nie, usuń AC z analizy.</li>
	<li>Umieść każdy AC w płytkach wielodołkowych Terasaki w 0,5x zmodyfikowanej soli Barth's Saline (MBS)4. Umieść klimatyzator w studzience pigmentowaną zwierzęcą stroną do dołu, stykając się z okrągłym dnem studzienki. 
	UWAGA: powlekanie pipet 0,1% roztworem BSA zapobiega przywieraniu małych kawałków tkanki adhezyjnej do tworzywa sztucznego.</li>
	<li>Umieść jeden koralik na każdej nasadce za pomocą mikropipety P20. W razie potrzeby użyj kleszczy, aby ostrożnie umieścić koralik na środku nasadki. 
	UWAGA: Po namoczeniu w kondycjonowanym podłożu koraliki są zabarwione na różowo. Wybierz najbardziej kolorowe koraliki.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej (18–22 °C) przez 6 godzin bez przesuwania płytki wielodołkowej Terasaki. Koralik przykleja się do klimatyzacji w mniej niż 2 godziny.</li>
	<li>Umieść płytkę wielodołkową Terasaki na papierach nasączonych wodą. Przykryj talerz plastikowym pojemnikiem. 
	UWAGA: Ta "komora wilgotnościowa" zapobiega przedwczesnemu parowaniu studzienek.</li>
	<li>Hodować AC w 0,5x MBS lub 3/4 NAM (patrz krok 4.1) w komorze wilgotnościowej w temperaturze 15-20 °C, aż zarodki rodzeństwa osiągną właściwy etap, aby przetestować działanie twojego czynnika.</li>
	<li>Napraw klimatyzatory na 1 godzinę w świeżo przygotowanym 4% PFA. Odwodnić AC w 100% MeOH, jak opisano wcześniej (krok 1.4).</li>
</ol>
3. Dysocjacja i reagregacja komórek czapeczki zwierzęcej przed szczepieniem w Xenopuslaevis neurula
<ol>
	<li>Pokryj szalki Petriego (60 mm) lub 12-dołkowe płytki 3% agarozy w sterylnej wodzie lub w PBS bez wapnia i magnezu. Dodaj tyle agarozy, aby przykryć dno szalki Petriego lub studzienki. Podgrzej talerze w temperaturze pokojowej (18-22 °C). Opcjonalnie przechowuj płytki przez kilka dni w temperaturze 4 °C, aby zapobiec odwodnieniu.</li>
	<li>Przygotować sól fizjologiczną Holtfretera bez wapnia (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (A-7888 Sigma pH 7,6)) i sól fizjologiczną Holtfretera (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA pH 7,6)5. UWAGA: roztworu CaCl2 nie można sterylizować w autoklawie.</li>
	<li>Napełnij dobrze pokrytą agarozą do góry solą fizjologiczną Holtfretera bez wapnia.</li>
	<li>Przygotuj zarodki blastuli lub bardzo wczesnej gastruli w celu wyizolowania ich AC, jak opisano wcześniej (kroki od 2.5 do 2.7).</li>
	<li>Odizoluj co najmniej 15 lub do 30, małe AC21. Za pomocą cienkich kleszczy wytnij mały kwadrat tkanki z kija zwierzęcego. Tkanka AC zawiera tylko komórki ektodermalne i dlatego ma jednolitą grubość. Jeśli nie, usuń AC z analizy. 
	UWAGA: Biegun zwierzęcy to pigmentowana część zarodka.</li>
	<li>Przenieś klimatyzatory do pokrytej agarozą studzienki wypełnionej do góry solą fizjologiczną Holtfretera bez wapnia. Umieść klimatyzatory pigmentowaną stroną skierowaną do góry. 
	UWAGA: Proces dysocjacji rozpoczyna się szybko w bezwapniowym roztworze soli fizjologicznej Holtfretera.</li>
	<li>Poczekaj kilka minut, aż komórki zaczną się dysocjować. Obserwuj to poprzez dezagregację tkanek. Za pomocą cienkich kleszczyków oddziel pigmentowaną warstwę od reszty AC i wyrzuć je za pomocą mikropipety P20. Całkowity proces dysocjacji komórek wskazuje na oddzielenie komórek od siebie. 
	UWAGA: W ponownie zagregowanym eksplantacie można pozostawić jedną lub dwie warstwy pigmentu, aby ułatwić wizualizację podczas szczepienia.</li>
	<li>Wyśrodkuj komórki za pomocą okrężnych ruchów płytki. Za pomocą mikropipety P1000 ostrożnie usuń jak najwięcej podłoża. Uważaj, aby nie dotknąć komórek.</li>
	<li>Dodać 1 ml soli fizjologicznej Holtfretera z wapniem do studzienki. Przenieść zdysocjowane ACs do probówki o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Nie można używać probówek o pojemności 2 ml ze względu na ich okrągłe dno.</li>
	<li>Granulować komórki przez odwirowanie, 5 minut przy maksymalnej prędkości 2 000 obr./min dla wirówki stołowej (500 x g). Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą mikropipety P1000.</li>
	<li>Do zdysocjowanych komórek dodać 20 μl soli fizjologicznej Holtfretera z wapniem (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (A-7888 Sigma pH 7,6)5.</li>
	<li>Utrzymuj zdysocjowane klimatyzatory przez 3 do 6 godzin w temperaturze MT (18-22 °C). 
	UWAGA: Jest to niezbędny czas na ponowną agregację komórek. Ponowna agregacja jest widoczna, gdy komórki tworzą małą kulkę na dnie probówki.</li>
	<li>Ostrożnie odłączyć eksplant od dna probówki, dodając 1 ml 0,5 MBS lub 1 ml 3/4 NAM (patrz krok 4.1). Przenieś eksplant na niepowlekaną płytkę za pomocą plastikowej pipety transferowej.</li>
	<li>Ułóż eksplantaty za pomocą ich kontrolnego rodzeństwa. Do długotrwałej hodowli należy stosować antybiotyki: kanamycynę (50 μg/ml), ampicylinę (50 μg/ml) i gentamycynę (50 μg/ml).</li>
</ol>
4. Szczepienie eksplantatów czapek zwierzęcych w płytce nerwowej zarodka X. laevis
<ol>
	<li>Przygotować 3/4 NAM (110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca(NO3)2, 1 mM MgSO4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO3, 0,2x PBS, 50 μg/ml gentamycyny). Nie przechowywać dłużej niż 1 tydzień w celu rozbioru i przechowywać w temperaturze 4 °C. Starsze NAM mogą być używane do przygotowania naczyń do sekcji pokrytych agarozą (poniżej).</li>
	<li>Posmaruj szalki Petriego (60 mm) 3% agarozą w 3/4 NAM, w których wykonano małe otwory za pomocą silikonowej formy lub pokrowca rakiety do tenisa stołowego. 
	UWAGA: Agaroza pokrywa dno szalki Petriego. Zostaw trochę miejsca, aby szalka Petriego wypełniła się 3/4 NAM. Alternatywnie wykonaj naczynia preparacyjne z niewysychającej plasteliny. W glinie lekko ściśnij zarodki podczas procedury preparacji. Wykop małe otwory w agarozie za pomocą zaokrąglonych kleszczy To "naczynie preparacyjne" pomaga utrzymać zarodki podczas procedury preparacji.</li>
	<li>Zbierz narzędzia do preparacji: plastikowe pipety transferowe, "nóż do brwi" (wykonany z włosków brwi zatopionych w parafinie na końcu szklanej pipety Pasteura)22, dwa cienkie kleszcze preparacyjne, mikropipetę i końcówki P1000, mikroskop stereoskopowy o powiększeniu 8-40X, jasne źródło światła z światłowodami. Utrzymuj wszystkie narzędzia preparacyjne w czystości; Po każdym eksperymencie spłucz je dwukrotnie wodą destylowaną, raz 100% etanolem i pozostaw do wyschnięcia. Przechowywać z dala od kurzu i, jeśli to konieczne, autoklawować metalowe narzędzia preparacyjne.</li>
	<li>Pozwól zdysocjowanym i ponownie zagregowanym AC (protokół 3) i ich rodzeństwu zarodkom X. laevis rozwijać się, aż osiągną stadium 13 (neurula) zgodnie z tabelą rozwojową Nieuwkoopa i Fabera17. Do przeszczepienia w obrębie płytki nerwowej od stadium 13 do stadium 15 wykorzystuje się zarodki.</li>
	<li>Wykonaj wszystkie kolejne kroki pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety transferowej przenieś zarodki do PBS z wapniem i magnezem uzupełnionymi 0,2% BSA. Usuń błonę witelinową zarodka zgodnie z wcześniejszym opisem20. Napraw zarodek jednym kleszczem. Ściśnij błonę witelinową bokiem innych kleszczy. Trzymając mocno błonę, powoli oderwij ją od zarodka. 
	UWAGA: Wykonaj tę procedurę po brzusznej (roślinnej) stronie zarodka. Nie należy uszkadzać płytki nerwowej zarodków. Jeśli zarodki zostały uszkodzone na etapie usuwania błony witelinowej, przenieś zarodki na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 3/4 NAM za pomocą plastikowej pipety transferowej i odczekaj 15 minut, co jest wystarczającym czasem do zajścia procesu gojenia.</li>
	<li>Napełnij naczynie rozwarstwiające do góry świeżym 3/4 NAM.</li>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety transferowej przenieś zarodki bez błony witelinowej do naczynia sekcyjnego. Umieść zarodki grzbietową stroną do góry w studzienkach. Podczas procesu transferu nie należy dopuścić do tego, aby zarodek wszedł w kontakt z powierzchnią powietrzno-cieczową, ponieważ X. laevis ulega lizie pod wpływem napięcia powierzchniowego.</li>
	<li>Przenieś eksplant AC do szczepienia na płytkę separacyjną za pomocą plastikowej pipety transferowej lub mikropipety P1000. Gdy pipeta znajdzie się w płynie, pozwól eksplantatom powoli opadać pod wpływem grawitacji lub bardzo delikatnie popchnij.</li>
	<li>Utrzymuj zarodki za pomocą zaokrąglonych kleszczy. Za pomocą noża do brwi wykonaj nacięcie w płytce nerwowej, w której zamierzasz przeszczepić kawałek eksplantu. 
	UWAGA: Na etapie 14 przednie zgięcie płytki nerwowej może być wykorzystane jako punkt orientacyjny, oznacza terytorium międzymózgowia (ryc. 4).</li>
	<li>Wytnij mały kawałek nabłonka nerwowego za pomocą zaokrąglonych kleszczy i noża do brwi. Wytnij mały kawałek eksplantatu nożem do brwi. 
	UWAGA: Kawałek eksplantatu powinien mieć mniej więcej ten sam rozmiar i kształt, co obszar ablacji nabłonka nerwowego.</li>
	<li>Umieść kawałek eksplantatu w nacięciu nabłonka nerwowego za pomocą noża do brwi i cienkich kleszczy. Upewnij się, że eksplant szybko przyczepia się do zarodka.</li>
	<li>Alternatywnie umieść kawałek szklanego szkiełka nakrywkowego na przeszczepionym zarodku, aby utrzymać przeszczep na miejscu. Aby to zrobić, pokrój cienkie szklane szkiełko nakrywkowe na bardzo małe kawałki za pomocą grubych kleszczy. Upewnij się, że rozmiar wynosi około 1.5 mm2. Zanurz kawałki na szalce Petriego zawierającej 3/4 NAM lub PBS za pomocą kleszczy. Wybierz kawałek szkła większy niż zarodek, aby go nie uszkodzić. Zarodek będzie nieco spłaszczony.</li>
	<li>Odczekaj co najmniej 30 minut bez ruchu lub tylko delikatnie przesuwaj płytkę preparacyjną. Pozwól zarodkowi dojść do siebie przez 30 minut do 2 godzin i delikatnie usuń szkiełko nakrywkowe, jeśli to konieczne. Ostrożnie odpipetować przeszczepione zarodki do czystego naczynia wypełnionego 3/4 NAM, używając plastikowej pipety transferowej. 
	UWAGA: Przeszczepione zarodki mają tendencję do rozwoju zanieczyszczenia bakteryjnego lub grzybiczego. Do długotrwałej hodowli należy stosować antybiotyki: kanamycynę (50 μg/ml), ampicylinę (50 μg/ml) i gentamycynę (50 μg/ml).</li>
</ol>

<ol><li>Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IIB%2C+Pattern+formation+in+the+developing+central+nervous+system+%28CNS%29+of+the+amphibians+and+birds+%28English%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Koninklijke+Nederlandse+Akademie+van+Wetenschappen%22%5BJournal%5D)">IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English).</a> Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+induction+process%3B+its+morphogenetic+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The neural induction process; its morphogenetic aspects.</a> Int J Dev Biol. 43, 615-623 (1999).</li>
<li>Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Neural induction.</a> Curr Opin Genet Dev. 10, 357-362 (2000).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+development+of+Xenopus+laevis+%3A+a+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).</li>
<li>Hoppler, S., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoppler%2C+S+%22Xenopus+protocols+%3A+post-genomic+approaches%22">Xenopus protocols : post-genomic approaches</a>. Hoppler, S., Vize, P. D. , Humana Press; Springer. New York. (2012).</li>
<li>Franklin Hughes, W., La Velle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+early+tectal+lesions+on+development+in+the+retinal+gonglion+cell+layer+of+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The effects of early tectal lesions on development in the retinal gonglion cell layer of chick embryos.</a> J Comp Neurol. 163, 265-283 (1975).</li>
<li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beads+on+the+run%3A+beads+as+alternative+tools+for+chemotaxis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays.</a> Methods Mol Biol. 769, 449-460 (2011).</li>
<li>Juraver-Geslin, H. A., Gomez-Skarmeta, J. L., Durand, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+barH-like+homeobox-2+gene+barhl2+acts+downstream+of+orthodentricle-2+and+together+with+iroquois-3+in+establishment+of+the+caudal+forebrain+signaling+center+induced+by+Sonic+Hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The conserved barH-like homeobox-2 gene barhl2 acts downstream of orthodentricle-2 and together with iroquois-3 in establishment of the caudal forebrain signaling center induced by Sonic Hedgehog.</a> Dev Biol. 396, 107-120 (2014).</li>
<li>Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+embryonic+Xenopus+cells+to+activin+and+FGF+are+separated+by+multiple+dose+thresholds+and+correspond+to+distinct+axes+of+the+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm.</a> Cell. 71, 731-739 (1992).</li>
<li>Wallingford, J. B., Ewald, A. J., Harland, R. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+during+convergent+extension+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling during convergent extension in Xenopus.</a> Curr Biol. 11, 652-661 (2001).</li>
<li>Kiecker, C., Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+morphogen+gradient+of+Wnt%2Fbeta-catenin+signalling+regulates+anteroposterior+neural+patterning+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22DEVELOPMENT%22%5BJournal%5D)">A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signalling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus.</a> DEVELOPMENT. 128, 4189-4201 (2001).</li>
<li>Wilson, P. A., Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+epidermis+and+inhibition+of+neural+fate+by+Bmp-4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of epidermis and inhibition of neural fate by Bmp-4.</a> Nature. 376, 331-333 (1995).</li>
<li>Afouda, B. A., Hoppler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+explants+as+an+experimental+model+system+for+studying+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cardiovascular+medicine%22%5BJournal%5D)">Xenopus explants as an experimental model system for studying heart development.</a> Trends in cardiovascular medicine. 19, 220-226 (2009).</li>
<li>Afouda, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-like+embryonic+explants+to+study+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-like embryonic explants to study cardiac development.</a> Methods Mol Biol. 917, 515-523 (2012).</li>
<li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Xenopus+laevis+neural+crest+for+in+vitro+explant+culture+or+in+vivo+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Dissection of Xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , (2014).</li>
<li>Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax3+and+Zic1+drive+induction+and+differentiation+of+multipotent%2C+migratory%2C+and+functional+neural+crest+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 5528-5533 (2013).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removing+the+Vitelline+Membrane+from+Xenopus+laevis+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Removing the Vitelline Membrane from Xenopus laevis Embryos.</a> CSH protocols. , (2007).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Cap+Isolation+from+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Animal Cap Isolation from Xenopus laevis.</a> CSH protocols. , (2007).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+dissection+and+micromanipulation+tools%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Embryo dissection and micromanipulation tools.</a> CSH protocols. , (2007).</li>
<li>Wilson, S. W., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Early+Steps+in+the+Development+of+the+Forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Review: Early Steps in the Development of the Forebrain.</a> Developmental Cell. 6, 167-181 (2004).</li>
<li>Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+of+the+neural+plate%3A+new+roles+for+apoptosis+and+for+one+of+its+main+effectors+caspase-3%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3.</a> Genesis. 53, 203-224 (2015).</li>
<li>Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+the+early+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Patterning the early Xenopus embryo.</a> Development. 133, 1205-1217 (2006).</li>
<li>Rubenstein, J. L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+vertebrate+forebrain%3A+the+prosomeric+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model.</a> Science. 266, 578-580 (1994).</li>
<li>Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain+gene+expression+domains+and+the+evolving+prosomeric+model%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model.</a> Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).</li>
<li>Martinez-Ferre, A., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regionalization+of+the+diencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+In+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Molecular regionalization of the diencephalon.</a> Frontiers In Neuroscience. 6, 73-73 (2012).</li>
<li>Scholpp, S., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Building+a+bridal+chamber%3A+development+of+the+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus.</a> Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).</li>
<li>Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xotch%2C+the+Xenopus+homolog+of+Drosophila+notch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch.</a> Science. 249, 1438-1441 (1990).</li>
<li>Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+signals%2C+gradient+formation+and+regional+specificity+in+neural+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction.</a> Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).</li>
<li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction%3A+old+problem%2C+new+findings%2C+yet+more+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural induction: old problem, new findings, yet more questions.</a> Development. 132, 2007-2021 (2005).</li>
<li>Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barhl2+limits+growth+of+the+diencephalic+primordium+through+Caspase3+inhibition+of+beta-catenin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+and+Reaggregation+of+Xenopus+laevis+Animal+Caps%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps.</a> CSH protocols. , (2007).</li>
<li>Harland, R. M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+research%3A+metamorphosed+by+genetics+and+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics.</a> Trends Genet. 27, 507-515 (2011).</li>
<li>Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+logic+of+gene+regulatory+networks+in+early+vertebrate+forebrain+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning.</a> Mech Dev. 130, 95-111 (2013).</li>
<li>Pani, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+deuterostome+origins+of+vertebrate+brain+signalling+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres.</a> Nature. 483, 289-294 (2012).</li>
<li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+bilaterian+central+nervous+systems%3A+a+single+origin%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Evodevo%22%5BJournal%5D)">Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin?</a> Evodevo. 4, 27(2013).</li>
<li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole%3A+from+mechanisms+to+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+models+%26+mechanisms%22%5BJournal%5D)">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Disease models & mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).</li>
<li>Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+gap+from+frog+research+to+human+therapy%3A+a+tale+of+neural+differentiation+in+Xenopus+animal+caps+and+human+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells.</a> Development, growth & differentiation. 50, s47-s55 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rozwój neuronalny jest koordynowany przez złożoną interakcję między programami rozwoju komórkowego a sygnałami z otaczających tkanek (przegląd w3,31,32). W tym miejscu opisujemy zestaw protokołów, które można zastosować w zarodkach X. laevis w celu zbadania zewnętrznych i wewnętrznych czynników zaangażowanych w determinację losu neuronów i morfogenezę neuronów in vitro i in vivo. Protokoły te mogą być stosowane jako takie w przypadku zarodków X. tropicalis , jednak zarodki <...

Układ nerwowy kręgowców wyłania się z płytki nerwowej jako jednorodna warstwa komórek neuroepitelialnych. Zrozumienie, w jaki sposób programy rozwojowe są indukowane, kodowane i ustanawiane podczas regionalizacji płytki neuronalnej, jest obecnie głównym celem biologii rozwojowej. W porównaniu z innymi systemami, eksperymentalnie podatny zarodek Xenopus jest modelem z wyboru do analizy wczesnych etapów rozwoju neuronalnego1,2. Łatwo jest uzyskać dużą liczbę zarodków, a rozwój zewnętrzny daje dostęp do pierwszych etapów neurulacji3. Dostępnych jest wiele narzędzi do eksperymentalnego manipulowania rozwojem embrionalnym Xenopuslaevis (X. laevis). Mikroiniekcja mRNA lub morfoliny (MO), w tym indukowalnych MO, wraz z narzędziami biochemicznymi i farmakologicznymi, umożliwia kontrolowane wzmocnienie funkcji (GOF) i utratę funkcji (LOF) oraz specyficzną zmianę szlaków sygnałowych4,5. Ektoderma dachowa blastocoel, znajdująca się wokół zwierzęcego bieguna blastuli lub bardzo wczesnego zarodka gastruli, określana jako "Animal Cap" (AC), jest źródłem komórek pluripotencjalnych, które można zaprogramować poprzez manipulację ekspresją genów przed przygotowaniem eksplantatów. W tym manuskrypcie znajdują się szczegółowe protokoły stosowania eksplantatów X. laevis AC do testowania mechanizmów molekularnych in vitro i in vivo oraz procesów komórkowych leżących u podstaw rozwoju neuronalnego.
Przedstawiono technikę, pozwalającą na dokładną obserwację wzorców ekspresji genów w cewie neuronowej kijanki Xenopus, co jest wstępnym krokiem w identyfikacji wskazówek dotyczących determinacji losu. Podczas gdy obserwacja płasko zamontowanych tkanek jest powszechnie stosowana w badaniach nad zarodkami piskląt6, nie została ona właściwie opisana w projekcie Xenopus. Manipulowanie ekspresją genów poprzez wstrzykiwanie syntetycznego mRNA lub MO do blastomerów zarodków w stadium 2 lub 4 komórek umożliwia programowanie eksplantatów AC4. Na przykład hamowanie szlaku białka morfogenetycznego kości (BMP) przez ekspresję czynnika anty-BMP Noggin, nadaje tożsamość neuronalną komórkom AC3. Protokół jest szczegółowo opisany w przypadku przeprowadzania lokalnej i kontrolowanej czasowo ekspozycji eksplantatów prądu przemiennego na sygnały zewnętrzne poprzez bezpośredni kontakt ze kulką żywicy anionowymiennej. Na koniec opisano technikę testowania cech rozwojowych neuronalnych komórek progenitorowych in vivo poprzez przeszczepienie mieszanych eksplantatów przygotowanych z odrębnych zaprogramowanych komórek, zdysocjowanych i ponownie powiązanych.
Zarodek żaby to potężny model do badania wczesnego rozwoju neuronalnego kręgowców. Połączenie manipulacji ekspresją genów z eksplantatami in vitro dostarcza ważnych informacji w badaniu regionalizacji, proliferacji i morfogenezy nabłonka nerwowego7-12. Programowanie eksplantatów prądu przemiennego pozwoliło na opracowanie funkcjonalnego serca ex vivo13,14. Zastosowanie szczepienia eksplantatów15 doprowadziło do zidentyfikowania minimalnego przełącznika transkrypcyjnego indukującego program różnicowania grzebienia nerwowego16. Zona limitans intrathalamica (ZLI) jest centrum sygnalizacyjnym, które wydziela sonicznego jeża (Shh) w celu kontrolowania wzrostu i regionalizacji ogonowego przodomózgowia. Przy ciągłym narażeniu na Shh, komórki neuronabłonkowe koeksprymujące trzy geny czynnika transkrypcyjnego - homeobox-2 podobny do barH (barhl2), orthodenticle-2 (otx2) i iroquois-3 (irx3) - uzyskują dwie cechy przedziału ZLI: zdolność do ekspresji shh i zdolność do segregacji od komórek przedniej płytki nerwowej. Jako układ modelowy przedstawiona zostanie indukcja losu ZLI do komórek neuroepitelialnych8.
Te protokoły mają na celu dostarczenie prostych, tanich i efektywnych narzędzi dla biologów rozwojowych i innych badaczy do zbadania podstawowych mechanizmów kluczowych zachowań komórek nerwowych. Protokoły te są bardzo wszechstronne i umożliwiają badanie szerokiego zakresu zewnętrznych i wewnętrznych wskazówek dotyczących determinacji neuronalnej. Pozwala to na długoterminową analizę in vivo zaangażowania linii neuronalnej, interakcji indukcyjnych i zachowań komórek.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>VWR&</td><td>nbsp; 20909.290</td><td>Toksyczne</td></tr><tr><td>kulki żywicy anionowymiennej</td><td>Biorad</td><td>140- 1231</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>A-7888</td><td>Do hodowli kapu zwierzęcegopH 7,6</td></tr><tr><td>Gentamycyna&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>15751-045&nbsp;</td><td>antybiotyk</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>SIGMA</td><td>A7906</td><td>&nbsp; do przygotowania koralików</td></tr></tbody></table>

podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Zrozumienie programów genetycznych leżących u podstaw rozwoju neuronów jest ważnym celem biologii rozwoju i komórek macierzystych. W blastuli komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne. Komórki te można izolować i programować do generowania różnych tkanek poprzez manipulowanie ekspresją genów lub indukcję przez morfogeny. W manuskrypcie opisano protokoły stosowania eksplantatów dachowych Xenopus laevis blastocoel jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego. Protokoły te umożliwiają badanie nabywania losu, zachowań migracyjnych komórek oraz właściwości autonomicznych i nieautonomicznych komórek. Eksplantaty dachu blastocoelu mogą być hodowane w pożywce wolnej od surowicy i szczepione do zarodków gospodarza. To przeszczepienie do zarodka pozwala na zbadanie długoterminowego zaangażowania w linię rodową, właściwości indukcyjnych i zachowania przeszczepionych komórek in vivo. Testy te można wykorzystać do zbadania mechanizmów molekularnych, procesów komórkowych i sieci regulacyjnych genów leżących u podstaw rozwoju neuronów. W kontekście medycyny regeneracyjnej testy te zapewniają środki do generowania typów komórek pochodzenia neuronalnego in vitro, które można wykorzystać w badaniach przesiewowych leków.

W oparciu o rozważania morfologiczne u różnych gatunków, manipulacje embriologiczne oraz wzorce ekspresji genów regulatorowych, przyjmuje się model koncepcyjny, według którego płytka neuralna jest podzielona na segmenty poprzeczne i podłużne, które definiują siatkę rozwojową generującą odrębne pola histogeniczne. W płytce neuralnej primordia przedmózgowia, śródmózgowia, rzbomózgowia i rdzenia kręgowego są już wszystkie ustanowione wzdłuż osi przednio-tylnej (AP) podczas gastrulacji (przeg...

W embrionach Xenopus, komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne i mogą być zaprogramowane do generowania różnych tkanek. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowania eksplantatów dachowych z blastocoelu jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego.

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wykorzystanie eksplantów dachu blastocele lub czapy zwierzęcej x laevis do badania mechanizmów molekularnych i procesów komórkowych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego in vitro oraz in vivo. Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach biologii rozwoju i biologii komórek macierzystych dotyczące nabywania losu komórkowego, migracji komórek oraz właściwości autonomicznych i nieautonomicznych komórek nerwowych. Przedstawione techniki stanowią proste, tanie, wszechstronne i wydajne narzędzia do badania fundamentalnych mechanizmów kluczowych zachowań komórek nerwowych.Analizy te umożliwiają testowanie czynników determinujących losy neuronów w celu przeprogramowania indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych oraz dojrzałą generację linii komórkowych pochodzenia neuronalnego do dalszego przesiewu. Zazwyczaj osoby nowo zapoznające się z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ techniki te wymagają sprawności manualnej. Pomysł na te metody pojawił się u mnie podczas rozważań nad analizą zachowania segregacji komórek.Aby przygotować preparat w układzie płaskim (flat-mount) przedniej części rurki neuralnej *Xenopus laevis*, należy za pomocą plastikowej pipety transferowej przenieść utrwalony, odwodniony i ponowie nawodniony embrion do 60-milimetrowej szalki Petriego wypełnionej po brzegi roztworem PBT. Następnie należy wsunąć pęsetę o cienkich końcach między oczy a rurkę neuralną na poziomie szypuły nerwu wzrokowego i oddzielić oczy. Następnie ostrożnie wprowadza się pęsetę pod ektodermę pokrywającą rurkę neuralną za głową i delikatnie oddziela ektodermę.Po przeprowadzeniu odpowiedniego znakowania hybrydyzacyjnego NC2 przenieś embrion do nowej szalki Petriego o pojemności 60 ml wypełnionej PBT i za pomocą precyzyjnej pęsety wstępnie odizoluj przednią część rurki nerwowej od embrionu. Następnie ostrożnie usuń luźno przylegającą notochord z obszaru pod rurką nerwową. W razie potrzeby usuń pęcherzyki słuchowe oraz pozostałe części mezodermy.Po odcięciu wszystkich wyrostków cewy nerwowej, oddziel przednią część cewy nerwowej od zarodka. Następnie przenieś wyizolowaną cewę nerwową do probówki stożkowej o pojemności 1,5 mililitra wypełnionej 50% glycerol i PBS w celu inkubacji przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po drugiej nocnej inkubacji w 90% glycerol, przenieś cewę nerwową na szkiełko mikroskopowe w niewielkiej ilości glicerolu i za pomocą igieł wolframowych rozetnij cewy nerwowe wzdłuż linii środkowej grzbietowej i brzusznej.Następnie użyć pierścieni wzmacniających przykrytych szkiełkiem podstawowym, aby zamontować obie strony cewy nerwowej w 90% glicerolu i PBS. Aby przygotować koraliki do indukcji eksplantu czepka zwierzęcego, użyć mikropipety P200, aby przenieść połowę porcji koralików żywicznych traktowanych BSA do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Następnie zastąpić sterylną wodę destylowaną w nowej probówce 200 µl medium zawierającego badaną cząsteczkę eksperymentalną i inkubować przez dwie godziny w temperaturze 4 °C.Po zakończeniu inkubacji przenieść zarodki w stadium blastuli lub bardzo wczesnej gastruli do buforu PBS z dodatkiem wapnia i magnezu oraz 0,2% BSA. Następnie, pod mikroskopem stereoskopowym, uchwyć błonę żółtkową jedną parą pęset i za pomocą drugiej pary pęset powoli odwarstw błonę od strony wegetatywnej zarodka, uważając, aby nie uszkodzić strony animalnej. Następnie, używając precyzyjnej pęsety, wycięty mały kwadrat z bieguna animalnego każdego zarodka.Używając końcówki do pipety powleczonej BSA, przenieś kapsuły do poszczególnych dołków płytki wielodołkowej Terasaki w 0,5X modyfikowanym roztworze soli Bartha, umieszczając pigmentowaną stronę zwierzęcia w kontakcie z okrągłym dnem dołka. Używając mikropipety P20, wybierz najciemniejsze różowe kuleczki z probówki z preparatem i umieść jedną kuleczkę na każdej kapsule, używając pęsety do centrowania kuleczek na kapsułach. Po umieszczeniu ostatniej kuleczki, ustaw płytkę na namoczonym wodą papierze i przykryj ją plastikowym pojemnikiem przed inkubacją.Aby przygotować dysocjowane i rezagregowane eksplanty czapki zwierzęcej, należy wyizolować od 15 do 30 czapek zwierzęcych, zgodnie z wcześniejszą instrukcją. Za pomocą precyzyjnej pęsety należy wyciąć mały kwadrat tkanki z biegunów zwierzęcych. Następnie przenieść czapki zwierzęce do dołka pokrytego agarozą i wypełnionego bezwapniową solą Holtfretera, tak aby ich pigmentowane strony były skierowane ku górze.Po kilku minutach powinna nastąpić dezagregacja. Za pomocą precyzyjnej pęsety należy oddzielić warstwy pigmentowe od reszty tkanki. Następnie, używając mikropipety P20, należy usunąć pigment.Gdy większość warstw pigmentowych zostanie usunięta, a komórki będą całkowicie dysocjowane, zakręć płytką, aby skupić komórki w centrum, i za pomocą mikropipety P1000 usuń jak najwięcej medium, uważając, aby nie dotknąć komórek. Następnie dodaj do dołka 1 ml soli fizjologicznej Holtfretera z wapniem. Przenieś dysocjowane czapy zwierzęce do probówki o pojemności 1,5 ml.Po odwirowaniu komórek, użyj mikropipety P1000, aby ostrożnie usunąć nadsącz i ponownie zawiesić osad w 20 µL soli Holtfretera z wapniem. Pozostaw komórki do ponownej agregacji na okres od trzech do sześciu godzin w temperaturze pokojowej. Następnie powoli dodaj 1 mL 3/4 NAM, aby ostrożnie odczepić eksplantaty od dna probówki, a następnie za pomocą plastikowej pipety transferowej rozdziel eksplantaty do poszczególnych niepowlekanych płytek.Aby przenieść eksplanty z czepka zwierzęcego na płytki neuronalne Xenopus laevis, najpierw należy pokryć 60-milimetrowe szalki Petriego 3% agarozą i roztworem 3/4 NAM, w którym wykonano małe otwory. Następnie embriony we wczesnym stadium neurulacji należy przenieść do buforu PBS z dodatkiem wapnia i magnezu, uzupełnionego o 0,2% BSA, w celu usunięcia błony witelinowej. Potem należy wypełnić pokrytą agarozą szalkę do sekcji świeżym roztworem 3/4 NAM i przenieść do niej embriony stroną grzbietową do góry.Następnie przenieś reaggregowany eksplant czapy zwierzęcej na płytkę do sekcji, pozwalając eksplantowi powoli opaść na dno naczynia pod wpływem grawitacji po tym, jak końcówka pipety przebije powierzchnię NAM. Następnie, pod mikroskopem stereoskopowym, użyj zaokrąglonych pęsety, aby przytrzymać embrion w miejscu, wykonując jednocześnie igłą wolframową nacięcie w płytce neuralnej dla eksplantu. Wytnij niewielki fragment reaggregowanego eksplantu czapy zwierzęcej, używając zaokrąglonej pęsety i nożyka do brwi.Użyj fragmentu tkanki, aby dopasować rozmiar fragmentu eksplantu do przeszczepu. Rysunek przedstawia płasko rozłożone przednie rurki neuronowe X laevis i X tropicalis, przygotowane zgodnie z opisaną metodą w stadiach 30, 32 i 35 po podwójnej hybrydyzacji NC2 w całym preparacie. Jak widać na obrazach, ekspresja genu sonic hedgehog u Xenopus jest wykrywalna w komórkach w kontakcie z kuleczkami nasączonymi pożywką warunkowaną suplementowaną końcowym fragmentem genu sonic hedgehog, natomiast nie jest obecna w komórkach w kontakcie z kuleczkami traktowanymi pożywką kontrolną.Po dysocjacji i reaggregacji, zgodnie z zaprezentowanym właśnie sposobem, eksplanty zawierające zanterioryzowane komórki czepek zwierzęcy zmieszano z zanterioryzowanymi komórkami czepek zwierzęcy wykazującymi ekspresję Otx2. Jak zaobserwowano, komórki wykazujące ekspresję Otx2 nie oddzieliły się od komórek bez ekspresji Otx2. Oba typy komórek swobodnie wymieszały się w obrębie eksplantu.W przeciwieństwie do tego, w eksplantach, w których komórki wykazujące ekspresję Otx2 zmieszano z komórkami wykazującymi ekspresję BAR HL-2, Otx2 oraz IRX3, komórki wykazujące ekspresję wielu genów utworzyły spójne płaty, które nie rozprzestrzeniły się równomiernie w obrębie reagregowanego eksplantu. Po przeszczepieniu do przedniej płytki neuralnej embrionów x laevis, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, mieszane eksplanty składające się z komórek koekspresujących BAR HL-2, Otx2 i IRX3 zmieszanych z komórkami wykazującymi ekspresję N-końca sonic hedgehog, wykazywały endogenną ekspresję sonic hedgehog i oddzieliły się od przednich komórek nabłonka neuralnego. Natomiast w przypadku przeszczepienia do płytki neuralnej x laevis mieszanych eksplantów składających się z komórek wykazujących ekspresję Otx2 oraz N-końca sonic hedgehog, przeszczepione komórki nie wykazywały ekspresji sonic hedgehog ani nie oddzieliły się od sąsiednich komórek.Po opanowaniu techniki, przeszczepianie eksplantu czapki zwierzęcej na embrionalne płytki nerwowe można przeprowadzić w ciągu dwóch do trzech godzin, w zależności od liczby przeszczepianych embrionów. Jest to technika bardzo niezawodna i przynosząca satysfakcjonujące wyniki. Podczas wykonywania tej procedury należy zachować najwyższą ostrożność w celu uniknięcia kontaminacji bakteryjnej i grzybiczej.Po przeprowadzeniu procedur przeszczepiania można zastosować inne metody, takie jak hybrydyzacja in situ w preparatach całych, aby śledzić losy i zachowanie przeszczepionych komórek. Programy rozwojowe leżące u podstaw organogenezy rurki neuralnej są w dużej mierze konserwatywne, szczególnie u kręgowców. W związku z tym informacje uzyskane na płazach pomogły w pogłębieniu naszej wiedzy na temat procesów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw rozwoju kręgowców.

stem-cell-like-xenopus-embryonic-explants-to-study-early-neural

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Obrazowanie tkanki zarodkowej w czasie rzeczywistym przez długie okresy stanowi duże wyzwanie. Przedstawiamy tutaj metodę monitorowania zmian komórkowych i podkomórkowych w rdzeniu kręgowym kurczaka przez dłuższy czas z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Technikę tę można zaadaptować do innych obszarów układu nerwowego oraz rozwijającego się zarodka.

Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium

Kontrola ekspansji somatycznych komórek macierzystych jest głównym czynnikiem utrudniającym ich badanie oraz zastosowanie w terapii. W niniejszym opracowaniu opisujemy system czasowej kontroli ekspansji neuronalnych komórek macierzystych podczas rozwoju oraz w wieku dorosłym, który może zostać wykorzystany do zwiększenia liczby neuronów generowanych w mózgu myszy.

Ekspansja embrionalnych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego poprzez elektroporację in utero lub stereotaksycyjne wstrzyknięcie wirusowe

Hodowla eksplantów neuronalnych z wypreparowanych embrionów Xenopus laevis wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek fuzyjnych umożliwia obrazowanie dynamiki cytoszkieletu stożka wzrostu.

Kultury eksplantów neuronalnych z Xenopus laevis

Los pojedynczej komórki embrionalnej może być determinowany przez cząsteczki dziedziczne i/lub sygnały pochodzące od sąsiednich komórek. Wykorzystując mapy losów embrionu Xenopus w stadium podziałów, można zidentyfikować pojedyncze blastomery w celu ich izolowanej hodowli, aby ocenić wpływ cząsteczek dziedzicznych w stosunku do oddziaływań międzykomórkowych.

Eksplanty blastomerów do badania determinacji losów komórek podczas rozwoju embrionalnego

Ten protokół opisuje ulepszoną procedurę eksplantacji, która obejmuje elektroporację ex utero, sekcję i hodowlę całych półkul mózgowych od embrionalnej myszy. Preparat ułatwia badania farmakologiczne i testy funkcji genów we wczesnym okresie rozwoju kory mózgowej.

Ex utero Elektroporacja i eksplantaty całej półkuli: prosta metoda eksperymentalna do badań nad wczesnym rozwojem kory mózgowej

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić preparację premigracyjnego grzebienia nerwowego czaszki (NC) od Xenopus laevis neurulas. Te eksplantaty można posiewać na fibronektynie i hodować in vitro lub przeszczepiać z powrotem do zarodków gospodarza. Technika ta pozwala na badanie mechanizmów przejścia, migracji i różnicowania nabłonka NC do mezenchymy.

Rozwarstwienie grzebienia nerwowego Xenopus laevis do hodowli eksplantatów in vitro lub przeszczepu in vivo

Zarodek Xenopus laevis nadal jest wyjątkowo przydatny w badaniach nad wczesnym rozwojem, ze względu na jego duży rozmiar i łatwość manipulacji.   Przewidziano uproszczony protokół hybrydyzacji całego montażu in situ, który można wykorzystać do identyfikacji określonych narządów w tym modelowym systemie.

Zrozumienie wczesnej organogenezy przy użyciu uproszczonego protokołu hybrydyzacji in situ u Xenopus

Ten artykuł przedstawia wygodną i szybką metodę wizualizacji różnych populacji komórek nerwowych w ośrodkowym układzie nerwowym zarodków Xenopus za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego na skrawkach.

Ocena pierwotnej neurogenezy w zarodkach Xenopus za pomocą barwienia immunologicznego

Prezentujemy dwuczęściowy protokół, który łączy fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ, pozwalając eksperymentatorowi skorelować wzorce aktywności wapnia z profilami ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki.

Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis

Eksplantaty blastodermy danio pręgowanego są generowane przez izolowanie komórek embrionalnych od endogennych centrów sygnalizacyjnych we wczesnym zarodku, tworząc stosunkowo naiwne klastry komórek, które łatwo manipulować i hodować ex vivo. Ten artykuł zawiera instrukcje dotyczące tworzenia takich eksplantatów i demonstruje ich użyteczność, pytając o role sygnalizacji węzłowej podczas gastrulacji.

Wytwarzanie naiwnych eksplantatów blastodermy z zarodków danio pręgowanego

Poznaj metody eksplantatów blastocoeli Xenopus laevis do badania wczesnego rozwoju neuronów in vitro i in vivo. Protokoły te pozwalają analizować mechanizmy molekularne i migrację komórek nerwowych w biologii rozwojowej.

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo (Wideo) | JoVE Journal

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Przeglądaj więcej filmów