Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Ogólnym celem tego protokołu jest wykorzystanie eksplantatów x laevis blastocoel roof lub animal cap do testowania mechanizmów molekularnych i procesów komórkowych leżących u podstaw rozwoju neuronów in vitro i in vivo. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozwoju i biologii komórek macierzystych dotyczące nabywania losu, migracji komórek oraz autonomicznych i nieautonomicznych właściwości komórek nerwowych. Przedstawione techniki dostarczają prostych, tanich, wszechstronnych i wydajnych narzędzi do badania podstawowego mechanizmu kluczowych zachowań komórek nerwowych.

Testy te pozwalają na testowanie determinacji losu neuronów w celu przeprogramowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych i dojrzałego generowania wiązań komórkowych pochodzących z neuronów, co potwierdza badania przesiewowe. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ techniki te wymagają zręczności manualnej. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tych metod, kiedy myślałem o analizie zachowania segregacji komórek.

Aby płasko zamontować przednią rurkę nerwową xenopus laevis, użyj plastikowej pipety transferowej, aby przenieść stały, odwodniony i ponownie uwodniony zarodek na 60-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną do góry PBT. Następnie włóż parę cienkich kleszczyków między oczy a cewę nerwową na poziomie łodygi nerwu wzrokowego i odłącz oczy. Następnie ostrożnie wprowadź kleszcze poniżej ektodermy pokrywającej cewę nerwową za głową i ostrożnie oderwij ektodermę.

Po wykonaniu odpowiedniego znakowania hybrydyzacją NC2 przenieś zarodek na nową 60-mililitrową szalkę Petriego wypełnioną PBT i użyj cienkich kleszczyków, aby grubo odizolować przednią cewę nerwową od zarodka. Następnie ostrożnie usuń luźno przymocowaną strunę grzbietową spod cewy nerwowej. W razie potrzeby pęcherzyki uszne i pozostałe części mezodermy.

Po odcięciu wszystkich wyrostków robaczkowych cewy nerwowej należy oddzielić przednią cewę nerwową od zarodka. Następnie przenieś izolowaną rurkę neuronową do stożkowej rurki o pojemności 1,5 mililitra wypełnionej 50% glicerolem i PBS na nocne leczenie w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po drugim nocnym leczeniu 90% glicerolem, przenieś cewę nerwową na szkiełko mikroskopowe w niewielkiej ilości glicerolu i użyj igieł wolframowych do wypreparowania cew nerwowych wzdłuż grzbietowej i brzusznej linii środkowej.

Następnie użyj pierścieni wzmacniających pokrytych szklanym szkiełkiem nakrywkowym, aby zamontować dwie strony rurki neuronowej w 90% glicerolu i PBS. Aby przygotować kulkę do indukcji eksplantatu z nasadki zwierzęcej, użyj mikropipety P200, aby rozdzielić pół porcji kulek żywicznych poddanych działaniu BSA na nową rurkę o pojemności 1,5 mililitra. Następnie zastąp sterylną wodę destylowaną w nowej probówce 200 mikrolitrami pożywki zawierającej badaną cząsteczkę przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji przenieść blastulę lub bardzo wczesne zarodki gastruli do PBS z wapniem i magnezem uzupełnionymi 0,2% BSA. Następnie, pod mikroskopem stereoskopowym, ściśnij błonę witelinową bokiem jednej pary kleszczy i użyj drugiej pary kleszczy, aby powoli oderwać błonę od roślinnej strony zarodka, uważając, aby nie uszkodzić strony zwierzęcej. Następnie za pomocą cienkich kleszczy wytnij mały kwadrat z kija zwierzęcego każdego zarodka.

Używając końcówki do pipety pokrytej BSA, przenieś nakrętki do indywidualnych dołków płytki wielodołkowej Terasaki w 0,5-krotnie zmodyfikowanej soli fizjologicznej Bartha, umieszczając pigmentowaną stronę zwierzęcą w kontakcie z okrągłym dnem studzienki. Za pomocą mikropipety P20 wybierz najciemniejsze różowe kulki z rurki zabiegowej i umieść po jednym koraliku na każdej nasadce, używając kleszczyków, aby wyśrodkować koraliki na nasadkach. Po umieszczeniu ostatniego koralika połóż płytkę na papierach nasączonych wodą i przykryj płytkę plastikowym pojemnikiem przed inkubacją.

Aby przygotować zdysocjowane i ponownie zagregowane eksplantaty kapeluszy zwierzęcych, wyizoluj od 15 do 30 kapeluszy zwierzęcych, jak właśnie pokazano. Za pomocą cienkich kleszczy wyciąć mały kwadrat tkanki z tyczek zwierzęcych. Przenieś kapelusze zwierząt do pokrytego agarozą, dobrze wypełnionego solą fizjologiczną Holtfretera bez wapnia, ich pigmentowanymi bokami skierowanymi do góry.

Po kilku minutach należy zaobserwować dezagregację. Użyj cienkich kleszczyków, aby oddzielić pigmentowane warstwy od reszty tkanki. Następnie użyj mikropipety P20, aby wyrzucić pigment.

Gdy większość pigmentowanych warstw zostanie usunięta, a komórki zostaną całkowicie zdysocjowane, zakręć płytką, aby wyśrodkować komórki i użyj mikropipety P1000, aby usunąć jak najwięcej pożywki, uważając, aby nie dotknąć komórek. Następnie dodaj do studzienki jeden mililitr soli fizjologicznej Holtfretera z wapniem. Przenieś zdysocjowane nakrętki zwierzęce do 1,5-mililitrowej probówki.

Po odwirowaniu komórek za pomocą mikropipety P1000 ostrożnie usuń supernatant i ponownie zawiesić osad w 20 mikrolitrach soli fizjologicznej Holtfretera z wapniem. Pozwól komórkom na ponowną agregację przez trzy do sześciu godzin w temperaturze pokojowej. Następnie powoli dodaj jeden mililitr 3/4 NAM, aby ostrożnie oderwać eksplantaty od dna probówki i użyj plastikowej pipety transferowej, aby rozprowadzić eksplantaty na pojedyncze niepowlekane płytki.

Aby wysadzić eksplantaty kapelusza zwierzęcego na płytki nerwowe xenopus laevis, najpierw pokryj 60-milimetrowe szalki Petriego 3% agarozą i 3/4 NANAM, w których wykonano małe otwory. Następnie przenieś wczesne zarodki nerwów do PBS z wapniem i magnezem uzupełnionymi 0,2% BSA w celu usunięcia błony witeliny. Następnie napełnij naczynie separacyjne pokryte agarozą świeżym 3/4 NAM i przenieś zarodki do naczynia rozwarstwiającego grzbietem do góry.

Teraz przenieś ponownie zagregowany eksplant z nakrętką zwierzęcą na płytkę rozwarstwiającą, pozwalając eksplantatowi powoli zanurzyć się w naczyniu pod wpływem grawitacji, gdy końcówka pipety naruszy powierzchnię NAM. Następnie pod mikroskopem stereoskopowym użyj zaokrąglonych kleszczy, aby utrzymać zarodek na miejscu, używając igły wolframowej, aby wykonać nacięcie na płytce nerwowej dla eksplantu. Wytnij mały kawałek eksplantatu z ponownie zagregowanej czapki zwierzęcej za pomocą zaokrąglonych kleszczy i noża do brwi.

Użyj fragmentu tkanki, aby określić rozmiar kawałka eksplantatu do przeszczepu. Ten rysunek przedstawia X laevis i X tropicalis przednie cewy nerwowe zamontowane płasko, jak właśnie wykazano w etapach 30, 32 i 35 po podwójnej hybrydyzacji NC2 całego mocowania. Jak zaobserwowano na tych obrazach, ekspresja xenopus sonic hedgehog jest wykrywana w komórkach mających kontakt z koralikami nasączonymi kondycjonowanym podłożem uzupełnionym końcowym końcem genu sonic hedgehog, ale nie w komórkach mających kontakt z koralikami potraktowanymi pożywką kontrolną.

Po dysocjacji i ponownej agregacji, jak właśnie pokazano, te eksplantaty z przednio ukierunkowanymi komórkami czapu zwierzęcego zmieszano z przednio umieszczonymi komórkami czapeczki zwierzęcej eksprymującymi Otx2. Jak zaobserwowano, te komórki eksprymujące Otx2 nie oddzieliły się od komórek nieeksprymujących Otx2. Oba typy komórek mieszały się swobodnie w całym eksplantacie.

W przeciwieństwie do tego, w eksplantatach, w których komórki eksprymujące Otx2 zmieszano z komórkami eksprymującymi BAR HL-2, Otx2 i IRX3, komórki eksprymujące wielogenowe tworzyły spójne plamy, które nie rozprzestrzeniały się równomiernie w obrębie ponownie zagregowanego eksplantu. Po wszczepieniu do przedniej płytki nerwowej zarodków x laevis, jak właśnie pokazano, mieszane eksplantaty złożone z komórek koeksprymujących BAR HL-2, Otx2 i IRX3 zmieszane z komórkami eksprymującymi N-koniec sonic hedgehog wykazywały indogenną ekspresję sonic hedgehog i oddzielały się od przednich komórek nabłonka nerwowego. Podczas gdy, gdy mieszane eksplantaty złożone z komórek eksprymujących Otx2 i N-koniec sonicznego jeża zostały wszczepione w płytkę nerwową x laevis, starte komórki ani nie wyrażały jeża sonicznego, ani nie oddzielały się od swoich sąsiadów.

Po opanowaniu, szczepienie eksplantatu kapelusza zwierzęcego na embrionalnych płytkach nerwowych można wykonać w ciągu dwóch do trzech godzin, w zależności od liczby przeszczepionych zarodków. Jest to bardzo solidna i bardzo satysfakcjonująca technika. Podczas próby wykonania tej procedury należy zachować szczególną ostrożność w przypadku zanieczyszczenia bakteryjnego i grzybiczego.

Po procedurach szczepienia można wykonać inne metody, takie jak hybrydyzacja całego mocowania in situ, aby śledzić losy i zachowania przeszczepionych komórek. Programy rozwojowe leżące u podstaw organogenozy cewy nerwowej są w dużej mierze konserwatywne, zwłaszcza u kręgowców. W ten sposób informacje uzyskane u pogłębiły naszą wiedzę na temat procesów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw rozwoju kręgowców.