Name: Budowa modułowych arkuszy hydrożelowych dla mikrowzorzystej architektury komórkowej 3D w skali makro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-11T10:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Poznaj metodę tworzenia modułowych arkuszy hydrożelowych dla trójwymiarowych systemów hodowli komórkowej. Technika ta umożliwia konstrukcję kontrolowanych mikrośrodowisk komórkowych, wspierając postępy w inżynierii tkankowej i badaniach biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez National Leading Research Laboratory Program (Grant NRF-2013R1A2A1A05006378) przez National Research Foundation of Korea, finansowany przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości. Autorzy doceniają również Program Opieki Zdrowotnej KAIST Systems.

1. Przygotowanie form i hydrożeli z mikrowzorami
<ol>
	<li>Wytwarzanie pożądanych wzorów w skali mikro za pomocą fotorezystu SU-8 na powierzchni płytki krzemowej za pomocą standardowej dwuetapowej techniki fotolitografii15,17 do odlewania form PDMS. W pokazanym przykładzie użyto wzoru siatki przypominającego zrazik wątroby (ryc. 1).</li>
	<li>Odważyć PDMS i roztwór utwardzacza w stosunku 1:5 (tj. 12,5 g PDMS i 2,5 g utwardzacza).</li>
	<li>Dokładnie wymieszać 15 g roztworu, odgazować pęcherzyki w komorze próżniowej, a następnie równomiernie rozprowadzić zmieszany roztwór na mikrowzorzystej powierzchni płytki krzemowej w naczyniu do odlewania folii.</li>
	<li>Umieść wafel krzemowy na płycie podgrzewanej w temperaturze 65 °C na 90 minut na płaskiej powierzchni, aby utwardzić PDMS.</li>
	<li>Usuń utwardzony PDMS z naczynia odlewniczego i płytki silikonowej.</li>
	<li>Wytnij krawędzie PDMS i umieść go na szalce Petriego o średnicy 100 mm stroną z mikrowzorem do góry.</li>
	<li>Umyj mikrowzorzyste utwardzone PDMS na szalce Petriego, używając 70% etanolu i wody destylowanej do wstępnej sterylizacji. Następnie suszyć je całkowicie przez 10 minut w piekarniku w temperaturze 65 °C.</li>
	<li>Rozpuścić i wymieszać O/N 3 g sproszkowanego niejonowego środka powierzchniowo czynnego w 100 ml wody destylowanej, tworząc 3% (w/v) roztwór powlekający.</li>
	<li>Umieść mikrowzorzyste formy PDMS w myjce plazmowej i czyść je przez 1 minutę (85 W, 0,73 mbar), aby uzyskać hydrofilową powierzchnię, ułatwiającą dodawanie cieczy wodnych. Następnie pokryj powierzchnię PDMS 100 ml roztworem środka powierzchniowo czynnego przez co najmniej 3 godziny (orO/N) za pomocą laboratoryjnego kołyska.</li>
	<li>Umyj roztwór środka powierzchniowo czynnego z form PDMS i wysusz je całkowicie w piecu w temperaturze 65 °C przez 10 minut. Następnie wysterylizuj każdą formę z mikrowzorem przez wystawienie na działanie promieniowania ultrafioletowego (UV) przez 30 minut.</li>
</ol>
2. Przygotuj zawiesinę komórkową w prekursorze hydrożelu
<ol>
	<li>Aby przygotować prekursor hydrożelu, należy rozpuścić 0,1 g proszku alginianu sodu w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), tworząc 1% (w/v) prekursor alginianu. Aby całkowicie rozpuścić proszek, inkubować i mieszać je O/N.</li>
	<li>Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm podłączony do strzykawki o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Hodowla komórek HepG2 w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną na konwencjonalnej szalce do hodowli tkankowej do zbiegu 70% - 80% w inkubatorze nawilżanym o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umyć komórki raz za pomocą PBS, a następnie trypsynizować je, dodając 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA przez 4 minuty w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Odwirować komórki zebrane z szalki hodowlanej przy 250 x g przez 3 minuty i ponownie zawiesić przy użyciu 1 ml PBS po usunięciu supernatantu.</li>
	<li>Policz liczbę pojedynczych rozproszonych komórek w PBS przy użyciu automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Po odwirowaniu przy 250 x g przez 3 minuty i usunięciu PBS, dodać 1 ml 1% (m/v) roztworu alginianu sodu do pozostałych osadów komórkowych i delikatnie wymieszać za pomocą pipetowania. Ostateczna gęstość wysiewu komórek powinna wynosić 5 x 106 - 107 komórek/ml. Zawiesinę komórkowo-hydrożelową inkubować w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
3. Ładowanie i sieciowanie zawiesiny komórkowej/hydrożelowej
<ol>
	<li>Rozpuścić 1,47 g odwodnionego chlorku wapnia w 100 ml ddH2O, aby otrzymać odczynnik sieciujący (tj. 100 mM CaCl2·2H2O w ddH2O).</li>
	<li>Wypłucz wnętrze nawilżacza za pomocą przetwornika ultradźwiękowego przy użyciu 70% etanolu i napełnij je 200 ml odczynnika sieciującego. Nawilżacz ma 110 mm szerokości, 300 mm długości i 170 mm głębokości (tj. 110 mm x 300 mm x 170 mm (szer. x wys. x gł.)).</li>
	<li>Umieść mikrowzorzyste formy PDMS w myjce plazmowej i czyść je przez 1 minutę z mocą 85 W, aby uzyskać hydrofilową powierzchnię.</li>
	<li>Równomiernie załaduj 7,2 μl dobrze wymieszanej zawiesiny komórek/hydrożelu na krawędzi mikrowzoru w formie. W pokazanym przykładzie użyto wzoru siatki przypominającego zrazik wątroby (ryc. 1). Objętość zawieszenia zależy od wzoru topograficznego.</li>
	<li>Aby uzyskać żelowanie zawiesiny komórkowej/hydrożelowej, włącz nawilżacz i sprawdź, czy nawilżacz wytwarza mgłę odczynnika sieciującego. Rozpyl odczynnik sieciujący na prekursor hydrożelu przez 5 minut, pokrywając powierzchnię topograficzną form PDMS w zakresie 5 cm. 
	Uwaga: Odległości dłuższe i krótsze niż 5 cm mogą powodować odpowiednio niepełne i nierównomierne żelowanie. Upewnij się, że nawilżacz ma szybkość rozpylania 250 ml/h, wytwarzając 20 ml mgły odczynnika sieciującego w ciągu 5 minut.</li>
	<li>Po procesie sieciowania wyłącz nawilżacz i napełnij formy PDMS PBS.</li>
</ol>
4. Obsługa pojedynczych modułowych arkuszy hydrożelowych
<ol>
	<li>Odłącz każdy utwardzony arkusz hydrożelu od form z mikrowzorami, delikatnie pipetując PBS wokół arkusza hydrożelu za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl.</li>
	<li>Podnieś każdy pływający arkusz hydrożelu za pomocą końcówki końcówki pipety o pojemności 1 000 μl. Każdy arkusz hydrożelu z siatki przypominającej zrazik wątroby ma wymiary 8 mm x 8,7 mm i grubość 100 - 200 μm.</li>
	<li>Przenieść pojedynczą warstwę arkusza hydrożelu do 1 ml DMEM na płytce 12-dołkowej i hodować komórki in vitro w sposób pływający, używając konstruktu hydrożelowego jako składnika jednostkowego na płytce 12-dołkowej przez tydzień w inkubatorze nawilżanym o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Pożywkę hodowlaną wymieniać co drugi dzień.</li>
</ol>
5. Montaż wielowarstwowych arkuszy hydrożelowych
<ol>
	<li>Powtórz kroki od 1.1 do 1.5, aby uzyskać ramę PDMS o wymiarach 18 mm x 18 mm x 4 mm (szer. x wys. x gł.), która zawiera struktury słupków o wysokości 170 μm na dolnej powierzchni. Użyj 42 g mieszaniny PDMS i utwardzacza, w takich samych proporcjach jak w kroku 1.2. Umieść specjalistyczną formę poliwęglanową na płytce silikonowej do ramy PDMS, aby stworzyć ramę wewnętrzną o wymiarach 8 mm x 9 mm x 2 mm (szer. x wys. x gł.).</li>
	<li>Wysterylizuj ramkę PDMS i nylonowe bibuły filtracyjne o porach 180 μm zanurzone w wodzie destylowanej i pęsetę w autoklawie na 15 minut w temperaturze 121 °C.</li>
	<li>Umieść wysterylizowaną ramkę PDMS na ćwiartce kawałka nylonowej bibuły filtracyjnej (o średnicy 5 cm) na szalce Petriego o średnicy 60 mm.</li>
	<li>Przenieś modułowy arkusz hydrożelu do wnętrza ramy PDMS za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 000 μl. Arkusze hydrożelowe używane do montażu powinny być hodowane przez co najmniej jeden dzień po ich wyprodukowaniu.</li>
	<li>Dopasuj krawędź każdego modułowego arkusza hydrożelu do ramy PDMS za pomocą pustej końcówki do pipety o pojemności 200 μl.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.4 i 5.5, używając modułowych arkuszy hydrożelowych, aby utworzyć stos 4-6 warstw.</li>
	<li>Usuń pożywkę hodowlaną, przepuszczając ją przez struktury filarów w dolnej części ramy PDMS. Następnie dodać 2 μl roztworu alginianu (2% w/v) w rogu wielowarstwowej konstrukcji.</li>
	<li>Rozpyl mgiełkę odczynnika sieciującego przez 30 sekund na konstrukcję wielowarstwową, aby połączyć krawędzie każdej warstwy z krawędziami innej. Użyć 2 ml mgły odczynnika sieciującego (przy szybkości rozpylania 250 ml/h).</li>
	<li>Delikatnie opłucz wielowarstwową konstrukcję za pomocą 400 μl DMEM i zdejmij ramkę PDMS za pomocą pęsety.</li>
	<li>Oderwać wielowarstwowy konstrukt od bibuły filtracyjnej, delikatnie przecierając ją podnośnikiem do komórek po dodaniu 4 ml DMEM.</li>
	<li>Przenieść wielowarstwowy konstrukt na 6-dołkową płytkę zawierającą 3 ml DMEM za pomocą bibuły filtracyjnej i hodować komórki in vitro w sposób pływający, z konstruktem hydrożelowym jako wieloskalowym rusztowaniem komórkowym na płytce 6-dołkowej przez tydzień w inkubatorze nawilżanym o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Pożywkę hodowlaną wymieniać co drugi dzień.</li>
</ol>

<ol><li>Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hydrogels for biomedical applications.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64 (Supplement), 18-23 (2012).</li>
<li>Lan, S., Starly, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+based+3D+hydrogels+as+an+in+vitro+co-culture+model+platform+for+the+toxicity+screening+of+new+chemical+entities%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Appl.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Alginate based 3D hydrogels as an in vitro co-culture model platform for the toxicity screening of new chemical entities.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 256 (1), 62-72 (2011).</li>
<li>Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+in+vitro+bioengineered+tumors+based+on+collagen+I+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels.</a> Biomaterials. 32 (31), 7905-7912 (2011).</li>
<li>Lim, F., Sun, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microencapsulated+islets+as+bioartificial+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas.</a> Science. 210 (4472), 908-910 (1980).</li>
<li>Koh, W. G., Itle, L. J., Pishko, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molding+of+hydrogel+microstructures+to+create+multiphenotype+cell+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molding of hydrogel microstructures to create multiphenotype cell microarrays.</a> Anal. Chem. 75 (21), 5783-5789 (2003).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic+Hydrogel+Capable+of+Cell+Preservation+without+Perfusion+Culture+under+Cell-Based+Assay+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic Hydrogel Capable of Cell Preservation without Perfusion Culture under Cell-Based Assay Conditions.</a> Adv Mater. 22 (28), 3017-3021 (2010).</li>
<li>Um, E., Lee, D. S., Pyo, H. S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+generation+of+hydrogel+beads+and+encapsulation+of+biological+materials+using+a+microfluidic+droplet-merging+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Continuous generation of hydrogel beads and encapsulation of biological materials using a microfluidic droplet-merging channel.</a> Microfluid. Nanofluid. 5 (4), 541-549 (2008).</li>
<li>Lee, D. H., Lee, W., E, U. m, Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbridge+structures+for+uniform+interval+control+of+flowing+droplets+in+microfluidic+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microbridge structures for uniform interval control of flowing droplets in microfluidic networks.</a> Biomicrofluidics. 5 (3), 034117(2011).</li>
<li>Lee, D. H., Bae , C. Y., Han, J. I., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+heterogeneity+in+the+lipid+content+of+single+green+microalgae+in+alginate+hydrogel+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of heterogeneity in the lipid content of single green microalgae in alginate hydrogel microcapsules.</a> Anal. Chem. 85 (18), 8749-8756 (2013).</li>
<li>Yamada, M., Sugaya, S., Naganuma, Y., Seki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+chemically+and+physically+anisotropic+hydrogel+microfibers+for+guided+cell+growth+and+networking%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of chemically and physically anisotropic hydrogel microfibers for guided cell growth and networking.</a> Soft Matter. 8 (11), 3122-3130 (2012).</li>
<li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+formation+of+heterotypic+hepatic+micro-organoids+in+anisotropic+hydrogel+microfibers+for+long-term+preservation+of+liver-specific+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions.</a> Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).</li>
<li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metre-long+cell-laden+microfibres+exhibit+tissue+morphologies+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions.</a> Nat. Mater. 12 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>Lee, W., Son, J., Yoo, S. S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+and+Biocompatible+Fabrication+of+Chemically+Sol%E2%88%92Gel+Transitional+Hydrogel+Free-Standing+Microarchitectures%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Facile and Biocompatible Fabrication of Chemically Sol−Gel Transitional Hydrogel Free-Standing Microarchitectures.</a> 12 (1), 14-18 (2011).</li>
<li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+hydrogel+biopaper+for+patterned+3D+cell+culture+and+modular+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">Cellular hydrogel biopaper for patterned 3D cell culture and modular tissue reconstruction.</a> Adv. Healthcare Mater. 1 (5), 635-639 (2012).</li>
<li>Bae, C. Y., Min, M. K., Kim, H., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+effect+of+the+hydrogel+grid+structure+on+in+vitro+formation+of+homogeneous+MIN6+cell+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Geometric effect of the hydrogel grid structure on in vitro formation of homogeneous MIN6 cell clusters.</a> Lab Chip. 14 (13), 2183-2190 (2014).</li>
<li>Bruzewicz, D. A., McGuigan, A. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+modular+tissue+construct+in+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a modular tissue construct in a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 8 (5), 663-671 (2008).</li>
<li>Choi, S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+photolithography+to+fabricate+multilevel+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Two-step photolithography to fabricate multilevel microchannels.</a> Biomicrofluidics. 4 (4), 046503(2010).</li>
<li>Lee, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+formation+and+collagen-alginate+composite+encapsulation+of+pancreatic+islet+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In situ formation and collagen-alginate composite encapsulation of pancreatic islet spheroids.</a> Biomaterials. 33 (3), 837-845 (2012).</li>
<li>Cabodi, M., Choi, N. W., Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+biomaterial%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A microfluidic biomaterial.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (40), 13788-13789 (2005).</li>
<li>Choi, N. W., Cabodi, M., Held, B., Gleghorn, J. P., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+scaffolds+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Microfluidic scaffolds for tissue engineering.</a> Nat. Mater. 6 (11), 908-915 (2007).</li>
<li>Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+hydrogels+as+synthetic+extracellular+matrix+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials.</a> Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten zapewnia prostą metodę wytwarzania modułowych arkuszy hydrożelowych i składania ich w celu utworzenia rusztowań komórkowych 3D.
Aby w krótkim czasie skonstruować wyraźnie wzorzyste struktury alginianowe, powinniśmy zidentyfikować proces sieciowania, który może stworzyć wystarczająco sztywne struktury, aby utrzymać złożone mikrowzory z formy, a także utrzymać żywotność komórek i metabolizm. Opracowaliśmy proces sieciowania, w tym przejście zol-żel, w celu rozpylenia odczynnika siec...

Hydrożele są szczególnie obiecującymi biomateriałami i oczekuje się, że będą ważne w podstawowej biologii, testach farmakologicznych i medycynie. 1 Sugeruje się, że biofabrykacja konstruktów komórkowych na bazie hydrożelu ma na celu ograniczenie stosowania eksperymentów na zwierzętach,2,3 zastąpienie tkanek nadających się do przeszczepu,4 i ulepszenie testów komórkowych. 5,6 Materiały wiskoelastyczne (hydro)elastyczne (żele) zawierające wodę pozwalają na zamknięcie dużej liczby komórek i utrzymanie ich w strukturze rusztowania w celu kontrolowania mikrośrodowiska komórkowego 3D. W połączeniu ze wskazówkami technologii mikroprzepływowych lub mikromodelowania, geometria konstrukcji hydrożelowych może być precyzyjnie kontrolowana w skali komórkowej. Do tej pory różne kształty hydrożeli, w tym cząstki,7-9 włókna,10-12 i arkusze,13-15 były używane jako jednostki konstrukcyjne w oddolnych podejściach do wytwarzania architektur wielokomórkowych w skali makro.
Zarówno cząsteczki na bazie hydrożelu, jak i włókna zostały łatwo i szybko wyprodukowane do zastosowań jako środowiska komórkowe w mikroskali, z kontrolą płynności za pomocą urządzeń mikroprzepływowych. Jednakże, jako podstawowe jednostki tkanek inżynieryjnych, skomplikowane byłoby ich przegrupowanie i powiększenie ich objętości jako konstruktów w skali makro. 16 Trudniej jest uzyskać konstrukcje w skali makro niż wyprodukować moduły podstawowe o rozmiarach mikronów. Arkuszowe jednostki konstrukcji na bazie hydrożelu mogą być używane do zwiększania objętości rusztowań za pomocą prostego procesu montażu. W związku z tym ułożone w stos warstwy arkuszy hydrożelowych zapewniają nie tylko zwiększenie objętości, ale także geometryczne rozszerzenie w przestrzeni 3D.
Wcześniej opisaliśmy metodę wytwarzania mikrowzorzystych arkuszy hydrożelowych,13-15 wraz z ich składaniem w wielowarstwowe architektury komórkowe. Technika ta umożliwia złożone mikrowzorce i modułowe projektowanie konstruktów komórkowych poprzez proces układania struktur wielowarstwowych. Poprzez wytwarzanie ułożonych w stos modułowych arkuszy hydrożelowych, które są mikrowzorzyste, można zrealizować system hodowli komórkowych 3D z kontrolowanym mikrośrodowiskiem komórkowym w skali makro. Ten protokół wideo opisuje prostą, ale potężną metodę wytwarzania, którą można wykorzystać do budowy modułowych arkuszy hydrożelowych, opartych na linii komórkowej ludzkiego raka wątroby (HepG2). Pokazujemy tutaj prostą manipulację tymi wzorzystymi modułowymi arkuszami hydrożelowymi i ich montaż w wielowarstwową strukturę.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>000000000001064291</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>Sproszkowany niejonowy środek powierzchniowo czynny&nbsp;</td></tr><tr><td>Sól sodowa kwasu alginowego, niska lepkość</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25266</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Nawilżacz ultradźwiękowy</td><td>MediHeim</td><td>MH-2800</td><td>Zmodyfikowany sprzęt, Maksymalna szybkość rozpylania: 250 ml / godz</td></tr><tr><td>Filtr z siatki nylonowej hydrofilowy, 180 &mu; m</td><td>EMD Millipore</td><td>NY8H04700</td><td></td></tr><tr><td>Forma</td><td></td><td></td> z poliwęglanu <td>Dostosowana forma do produkcji wzoru ramy PDMS</td></tr></tbody></table>

budowa modułowych arkuszy hydrożelowych dla mikrowzorzystej architektury komórkowej 3d w skali makro

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrożele mogą być wzorowane w mikroskali za pomocą technologii mikroprzepływowych lub mikrowzorcowych, aby zapewnić trójwymiarową (3D) geometrię tkanek podobną do in vivo. Powstałe w ten sposób konstrukty komórkowe 3D na bazie hydrożelu zostały wprowadzone jako alternatywa dla eksperymentów na zwierzętach w zaawansowanych badaniach biologicznych, testach farmakologicznych i zastosowaniach związanych z przeszczepami narządów. Chociaż cząsteczki i włókna na bazie hydrożelu można łatwo wytworzyć, trudno jest manipulować nimi w celu rekonstrukcji tkanek. W tym filmie opisujemy metodę wytwarzania mikrowzorzystych arkuszy hydrożelu alginianowego wraz z ich montażem w celu utworzenia systemu hodowli komórkowych 3D w skali makro z kontrolowanym mikrośrodowiskiem komórkowym. Za pomocą mgły środka żelującego wapń można łatwo uzyskać cienkie arkusze hydrożelu o grubości w zakresie 100 - 200 μm i precyzyjnych mikrowzorach. Komórki mogą być następnie hodowane z geometrycznym prowadzeniem arkuszy hydrożelu w warunkach wolnostojących. Co więcej, arkusze hydrożelu można łatwo manipulować za pomocą mikropipety z końcówką z końcówką i można je łączyć w wielowarstwowe struktury, układając je w stosy za pomocą wzorzystej ramy z polidimetylosiloksanu (PDMS). Te modułowe arkusze hydrożelowe, które można wytwarzać w łatwym procesie, mają potencjalne zastosowania w testach leków in vitro i badaniach biologicznych, w tym badaniach funkcjonalnych mikro- i makrostruktury oraz rekonstrukcji tkanek.

Opisaliśmy proces wytwarzania i manipulowania samodzielnymi arkuszami hydrożelu komórkowego. Jak pokazano na Rysunku 1, wykonaliśmy mikrowzorowane formy z PDMS, a zawierający komórki hydrożel naniesiono na hydrofilową powierzchnię tych form i sieciowano przy użyciu nawilżacza do generowania aerozolu czynnika żelującego. Po wyjęciu z form, komórki HepG2 hodowano w samodzielnych arkuszach hydrożelu o różnych wzorach (Rysunek 2). W ten sposób cienkie arkusze...

Opisujemy wytwarzanie arkuszy hydrożelowych z mikrowzorzystymi elementami za pomocą prostego procesu, który może być składany i manipulowany w formie wolnostojącej. Korzystając z tych modułowych arkuszy hydrożelowych, można wygenerować prosty system hodowli komórkowych 3D w skali makro z kontrolowanym mikrośrodowiskiem komórkowym.

Budowa modułowych arkuszy hydrożelowych dla mikrowzorzystej architektury komórkowej 3D w skali makro

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie prostego wytwarzania, manipulowania i składania modułowych arkuszy hydrożelowych dla trójwymiarowego systemu hodowli komórkowej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkankowej, takie jak sposób tworzenia bardziej zbliżonych do warunków in vivo funkcjonalnych tkanek inżynieryjnych z hodowanymi mikrośrodowiskami. Główną zaletą tej techniki jest możliwość generowania komórkowych konstruktów hydrożelowych bez ponoszenia wysokich kosztów dodatkowych.Warunki trójwymiarowej (3D) hodowli komórkowej będą zależały od każdej z modułowych arkuszy hydrożelowych. Znaczenie tej techniki wykracza poza usprawnienie testów komórkowych i badań biologicznych, ponieważ pozwala ona na uzyskanie różnych geometrii oraz składów trójwymiarowych mikro- i makrośrodowisk komórkowych. Chociaż metoda ta może dostarczyć cennych informacji w testach komórkowych in vitro, może zostać ona również zastosowana w innych systemach, takich jak przeszczepialne rusztowania w modelach tkanek 3D.Rozpocznij od wytworzenia pożądanych wzorów w mikroskali, stosując standardowe techniki fotolitografii. Przykład pokazany w tym filmie wykorzystuje wzór siatki przypominający zrąb wątrobowy, taki jak ten przedstawiony tutaj. Następnie odważ 2,5 g PDMS oraz 2,5 g roztworu czynnika sieciującego i dokładnie wymieszaj oba składniki.Odgazuj roztwór w komorze próżniowej, a następnie równomiernie rozprowadź zmieszany roztwór na powierzchni mikrowzorów wafla krzemowego w formie do odlewania z folii. Następnie utwardź PDMS, umieszczając formę na płaskiej powierzchni płyty grzewczej rozgrzanej do 65°C na 90 minut. Po utwardzeniu wyjmij PDMS z formy i ostrożnie odklej go od wafla krzemowego.Odetnij krawędzie PDMS i umieść obszar z wzorem na szalce Petriego o średnicy 100 mm w taki sposób, aby strona z mikrowzorem była skierowana do góry. Następnie, w celu wstępnej sterylizacji, przemyj PDMS z mikrowzorem 70% etanolem, a następnie wodą destylowaną. Po tym wszystkim całkowicie wysusz układ przez 10 minut w piekarniku w temperaturze 65 °C.Następnie umieść formę z mikrowzorowanego PDMS w urządzeniu do czyszczenia plazmowego i poddaj ją czyszczeniu przez jedną minutę w celu uzyskania powierzchni hydrofilowej. Ułatwi to wprowadzanie cieczy wodnych. Następnie pokryj powierzchnię PDMS 100 mililitrami roztworu surfaktantu wymienionego w Tabeli materiałów.Inkubować próbki na kołysarce laboratoryjnej przez co najmniej trzy godziny. Następnie wypłukać roztwór surfaktantu z form PDMS za pomocą sterylnej wody i całkowicie je wysuszyć w piekarniku w temperaturze 65 °C przez 10 minut. Następnie wysterylizować każdą formę z mikrowzorcem, poddając ją promieniowaniu ultrafioletowemu przez 30 minut.Rozpocznij od hodowli komórek hepg2 z zastosowaniem standardowych technik. Gdy komórki osiągną 70% do 80% konfluencji, wypłucz je raz za pomocą PBS. Następnie zbierz komórki, dodając 1 mL 0,5% trypsyny EDTA i inkubując je przez cztery minuty w temperaturze 37 °C.Po ododerwaniu zebrać komórki do probówki wirówkowej i odwirować je z prędkością 250 g przez trzy minuty. Usunąć nadsącz, a następnie zawiesić komórki w 1 ml PBS. Policzyć liczbę pojedynczych, rozproszonych komórek w PBS za pomocą automatycznego licznika komórek.Następnie ponownie zcentryfuguj komórki przy 250 g przez trzy minuty. Usuń nadsącz PBS i dodaj do komórek odpowiednią ilość jednego procentowego roztworu alginianu sodu, aby końcowa gęstość wysiewu wynosiła od pięciu do dziesięciu milionów komórek na mililitr. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową za pomocą pipety, a następnie inkubuj zawiesinę hydrożelu komórkowego w inkubatorze z 5% CO2 i odpowiednią wilgotnością w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Podczas inkubacji komórek należy umieścić mikrowzorowane formy PDMS w oczyszczaczu plazmowym i oczyszczać je przez jedną minutę przy mocy 85 W w celu wytworzenia powierzchni hydrofilowej. Wymieszaj zawiesinę hydrożelu z komórkami, delikatnie pipetując ją w górę i w dół, a następnie miarowo nanieś 7,2 µL zawiesiny na krawędź mikrowzoru w formie. Następnie przeprowadź żelowanie zawiesiny hydrożelu z komórkami, wytwarzając mgiełkę z odczynnika sieciującego za pomocą nawilżacza z przepływem 250 mL/h i rozpylając ją na prekursor hydrożelu przez pięć minut.Należy upewnić się, że procedura ta obejmuje powierzchnię topograficzną formy z PDMS w zakresie pięciu centymetrów. Po zakończeniu procesu sieciowania należy wyłączyć nawilżacz i wypełnić formę z PDMS roztworem PBS. Za pomocą pipety 200 µL należy delikatnie nanieść PBS wokół krawędzi utwardzonych arkuszy hydrożelu, aby oddzielić od siebie poszczególne hydrożele.Następnie, używając odciętego końcówki do pipety 1 000 µL, należy podnieść każdy pływający arkusz hydrożelu. Przenieść każdy arkusz hydrożelu do osobnych dołków płytki 12-dołkowej zawierającej 1 mL uprzednio ogrzanej pożywki DMEM, tak aby pływały one na powierzchni medium. Hodować komórki w ten sposób przez jeden tydzień, wymieniając pożywkę kulturę co drugi dzień.Następnie należy przygotować ramkę z PDMS, która posiada struktury filarkowe o wysokości 170 µm na dolnej powierzchni, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Podczas procesu wytwarzania należy umieścić specjalistyczną formę z poliwęglanu na waflu krzemowym dla ramki z PDMS, aby stworzyć wewnętrzną ramkę o szerokości 8 mm, wysokości 9 mm i głębokości 2 mm. Po sterylizacji ramkę z PDMS należy umieścić na jednej czwartej arkusza nylonowego papieru filtrującego umieszczonego w szalce Petriego o średnicy 60 mm.Wyjmij arkusze hydrożelu z inkubatora i przenieś pierwszy z modułowych arkuszy hydrożelu do wnętrza ramki z PDMS, używając ściętej końcówki do pipety o pojemności 1 000 µL. Wyrównaj krawędź modułowego arkusza hydrożelu z ramką z PDMS, używając pustej końcówki do pipety o pojemności 200 µL. Powtarzaj ten proces z kolejnymi arkuszami hydrożelu, aż do uzyskania stosu od czterech do sześciu warstw.Następnie usuń pożywkę hodowlaną, przepływając ją przez struktury filarowe u podstawy ramki z PDMS. Potem dodaj 2 µL dwuprocentowego roztworu alginianu w jednym narożniku wielowarstwowej konstrukcji. Używając nawilżacza, rozpyl mgiełkę odczynnika sieciującego z prędkością 250 mL/h na wielowarstwową konstrukcję przez 30 sekund, aby połączyć ze sobą krawędzie poszczególnych warstw.Następnie należy delikatnie przepłukać wielowarstwową konstrukcję 400 µL DMEM i usunąć ramkę z PDMS za pomocą pęsety. Następnie dodaje się kolejne 4 mL DMEM. Konstrukcję wielowarstwową oddziela się od papieru filtrującego, delikatnie przecierając ją podnośnikiem do komórek (cell lifter), a następnie za pomocą papieru filtrującego przenosi ją do płytki 6-dołkowej zawierającej 3 mL DMEM.Hoduj komórki w sposób zawiesinowy z konstruktem hydrożelowym pełniącym funkcję wielkoskalowego rusztowania komórkowego w płytce sześciodołkowej przez co najmniej jeden tydzień. Wymieniaj pożywkę hodowlaną co drugi dzień. Przedstawiono tutaj wynik montażu warstwa po warstwie mikrowzorowanych arkuszy hydrożelowych przypominających zraz wątrobowy, w których komórki raka wątroby człowieka fluorescencyjne na zielono oraz fibroblasty NIH-3T3 fluorescencyjne na czerwono były hodowane wspólnie w kokulturze na połączonej siatce.Stosując zaprezentowaną tutaj technikę można stworzyć wiele wariantów wzorów, w tym filary sześciokątne, cienkie siatki, całe macierze oraz liczne mikrowłókna przypominające mikrogrzebienie w formie cienkiej konstrukcji hydrożelowej o grubości rzędu 100 do 200 mikrometrów. Struktury te zapewniają bogate środowisko hodowli 3D dla wielu różnych typów komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak tworzyć komórkowe arkusze hydrożelowe do projektowania systemów hodowli 3D naśladujących warunki in vivo metodą oddolną.

construction-modular-hydrogel-sheets-for-micropatterned-macro-scaled

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano proste techniki szybkiego wytwarzania mikrofabrykowanych systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem cyfrowego urządzenia z mikrolustrami do litografii z dynamiczną projekcją maski na standardowych podłożach do hodowli komórkowej. Systemy hodowlane te mogą lepiej odzwierciedlać naturalną architekturę biologiczną, a opisane techniki można dostosować do licznych zastosowań.

Wytwarzanie mikrowzorowanych hydrożeli dla systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem fotolitografii z dynamiczną projekcją maski

Bioprinter został użyty do stworzenia wzorzystych hydrożeli na bazie formy ofiarnej.  Formę poloksamerową zasypano drugim hydrożelem, a następnie wymywano, pozostawiając puste przestrzenie, które wypełniono trzecim hydrożelem. Metoda ta wykorzystuje szybką elucję i dobrą drukowność poloksamera do generowania złożonych architektur z biopolimerów.

Drukowanie termoczułych form odwróconych do tworzenia wzorzystych dwuskładnikowych hydrożeli do hodowli komórkowych 3D

Ten artykuł przedstawia proste podejście do dostarczania nieciągłych gradientowych naprężeń statycznych na koncentrycznym hydrożelu wypełnionym komórkami w celu regulacji wyrównania komórek w inżynierii tkankowej.

Gradient Strain Chip do stymulowania zachowań komórkowych w hydrożelu z komórkami

Opisujemy sekwencyjny proces tworzenia za pośrednictwem światła i późniejszego biochemicznego wzorcowania syntetycznych matryc hydrożelowych do zastosowań w trójwymiarowych hodowlach komórkowych. Przedstawiono budowę i modyfikację hydrożeli za pomocą cytokompatybilnej chemii photoclick. Ponadto przedstawiono łatwe techniki ilościowego określania i obserwacji wzorców oraz określania żywotności komórek w tych hydrożelach.

Tworzenie i modelowanie hydrożeli za pośrednictwem światła do zastosowań w hodowlach komórkowych

Ten raport opisuje prostą, łatwą do wykonania technikę, wykorzystującą próżnię niskociśnieniową, do wypełniania kanałów mikroprzepływowych komórkami i substratami do badań biologicznych.

Wszechstronna metoda modelowania białek i komórek

Różne metody manipulowania trójwymiarową architekturą w hydrożelach na bazie białek są tutaj oceniane pod kątem właściwości materiałów. Sieci makroporowate są funkcjonalizowane peptydem adhezyjnym, a ich wykonalność w hodowli komórkowej jest oceniana przy użyciu dwóch różnych modelowych linii komórkowych.

Łatwa manipulacja architekturą w hydrożelach na bazie białek do zastosowań w hodowlach komórkowych

Przedstawiamy procedurę kontrolowania początkowego kształtu klastra komórkowego w trójwymiarowej matrycy zewnątrzkomórkowej w celu uzyskania powtarzalnego formowania wzoru. Sześcienne urządzenie zawierające dwa różne hydrożele jest wykorzystywane do uzyskania wielokierunkowego obrazowania w celu tworzenia wzoru tkankowego.

Wstępna kontrola klastrów komórkowych 3D w hybrydowym urządzeniu do tworzenia sześcianów żelowych w celu tworzenia powtarzalnych wzorów

Opisujemy ulepszenia standardowej metody pomiaru sił trakcyjnych komórek, opartej na drukowaniu mikrokontaktowym z pojedynczym krokiem subtraktywnego tworzenia wzorów układów punktowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na miękkich hydrożelach. Metoda ta pozwala na prostsze i bardziej spójne wytwarzanie wzorów wyspowych, niezbędnych do kontrolowania kształtu klastrów komórek.

Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

Mikrożelowe pręty z komplementarnymi grupami reaktywnymi są produkowane za pomocą mikrofluidyki z możliwością łączenia się w roztworze wodnym. Anizometryczne mikrożele zacinają się i łączą w stabilne konstrukcje z większymi porami w porównaniu z systemami sferycznymi. Mikrożele modyfikowane za pomocą GRGDS-PC tworzą makroporowate konstrukcje 3D, które można wykorzystać do hodowli komórkowych.

Połączone makroporowate rusztowania 3D z prętów mikrożelowych

Praca ta opisuje protokół dla swobodnego osadzonego druku 3D komórek macierzystych nerwowych wewnątrz samonaprawiającego, wyżarniającego się układu cząstek i matrycy zewnątrzkomórkowej. Protokół umożliwia programowalne wzorcowanie połączonych konstrukcjonów tkanek nerwowych ludzkich z wysoką dokładnością.

Wsparcie dla mikrożel-macierzy zewnętrznej dla wbudowanego drukowania 3D ludzkich konstrukcji nerwowych

Poznaj metodę tworzenia modułowych arkuszy hydrożelowych dla trójwymiarowych systemów hodowli komórkowej. Technika ta umożliwia konstrukcję kontrolowanych mikrośrodowisk komórkowych, wspierając postępy w inżynierii tkankowej i badaniach biologicznych.

Budowa modułowych arkuszy hydrożelowych dla mikrowzorzystej architektury komórkowej 3D w skali makro

Przeglądaj więcej filmów