Budowa modułowych arkuszy hydrożelowych dla mikrowzorzystej architektury komórkowej 3D w skali makro

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie prostego wytwarzania, manipulacji i montażu modułowych arkuszy hydrożelowych dla systemu hodowli komórkowych 3D. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkankowej, takie jak to, jak stworzyć więcej funkcjonalnych tkanek inżynieryjnych podobnych do in vivo z hodowanymi mikrośrodowiskami. Główną zaletą tej techniki jest to, że komórkowe konstrukcje hydrożelowe mogą być generowane bez kosztownego przyrostu.

Warunki hodowli komórkowej 3D będą zależeć od każdego modułowego arkusza hydrożelu. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku ulepszonych testów komórkowych i badań biologicznych, ponieważ technika ta może zapewnić różne geometrie i skład mikro- i makrośrodowisk komórkowych 3D. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w testy komórkowe in vitro, można ją również zastosować do innego systemu, takiego jak rusztowanie do przeszczepu z modelem tkankowym 3D.

Zacznij od stworzenia pożądanych wzorów w mikroskali przy użyciu standardowych technik fotolitografii. W przykładzie pokazanym w tym filmie zostanie użyty wzór siatki przypominający zrazik wątroby, taki jak ten pokazany tutaj. Następnie odważyć 2,5 grama PDMS i 2,5 grama roztworu utwardzacza i dokładnie wymieszać ze sobą składniki.

Odgazuj roztwór w komorze próżniowej, a następnie równomiernie rozprowadź zmieszany roztwór na powierzchni mikrowzoru płytki krzemowej w naczyniu do odlewania folii. Następnie utwardź PDMS, umieszczając naczynie na płaskiej powierzchni płyty podgrzewanej w temperaturze 65 stopni Celsjusza na 90 minut. Po utwardzeniu wyjmij PDMS z naczynia odlewniczego i ostrożnie oderwij go od płytki silikonowej.

Odetnij krawędzie PDMS i umieść wzorzystą część na szalce Petriego o średnicy 100 milimetrów, tak aby strona z mikrowzorem była skierowana do góry. Następnie umyj mikrowzorzysty PDMS 70% etanolem, a następnie wodą destylowaną w celu wstępnej sterylizacji. Następnie całkowicie wysusz zestaw przez 10 minut w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza.

Następnie umieść mikrowzorzystą formę PDMS w myjce plazmowej i czyść je przez minutę, aby uzyskać hydrofilową powierzchnię. Ułatwi to ładowanie cieczy wodnych. Następnie pokryj powierzchnię PDMS 100 mililitrami roztworu środka powierzchniowo czynnego wymienionego w Tabeli Materiałów.

Próbki należy inkubować na laboratoryjnym kołysku przez co najmniej trzy godziny. Następnie umyj roztwór środka powierzchniowo czynnego z form PDMS za pomocą sterylnej wody i wysusz je całkowicie w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie wysterylizuj każdą formę z mikrowzorem, wystawiając ją na działanie promieniowania ultrafioletowego przez 30 minut.

Zacznij od hodowli komórek hepg2 przy użyciu standardowych technik. Gdy komórki zlewają się w 70% do 80%, umyj je raz za pomocą PBS. Następnie zbierz komórki, dodając jeden mililet 05% tripsin edta i inkubując je przez cztery minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po odłączeniu zbierz komórki do probówki wirówkowej i granuluj je w masie 250 g przez trzy minuty. Usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić komórki w jednym mililecie PBS. Policz liczbę pojedynczych rozproszonych komórek w PBS przy użyciu automatycznego licznika komórek.

Następnie ponownie opluwać komórki w temperaturze 250 g przez trzy minuty. Usunąć supernatant PBS i dodać do komórek wystarczającą ilość jednoprocentowego roztworu alginianu sodu, tak aby końcowa gęstość wysiewu wynosiła od pięciu do dziesięciu milionów komórek na mililet. Delikatnie wymieszaj roztwór komórkowy za pomocą pipety, a następnie inkubuj zawiesinę hydrożelu komórkowego w inkubatorze z pięcioprocentowym nawilżaniem CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Podczas inkubacji komórek umieść mikrowzorzyste formy PDMS w czyszczalni plazmowej i czyść je przez minutę z mocą 85 watów, aby uzyskać hydrofilową powierzchnię. Wymieszaj zawiesinę hydrożelową komórek, delikatnie pipetując w górę iw dół, a następnie równomiernie załaduj 7,2 mikrolitra zawiesiny na krawędzi mikrowzoru w formie. Następnie żeluj zawiesinę hydrożelu komórkowego, wytwarzając mgłę odczynnika sieciującego z nawilżaczem z szybkością 250 mililitrów na godzinę i rozpylając ją na prekursor hydrożelu przez pięć minut.

Upewnij się, że ta procedura obejmuje powierzchnię topograficzną formy PDMS w zakresie pięciu centymetrów. Po procesie sieciowania wyłącz nawilżacz i napełnij formę PDMS PBS. Za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów delikatnie dozuj PBS wokół krawędzi utwardzonych arkuszy hydrożelu, aby oderwać każdy z hydrożeli.

Następnie podnieś każdy pływający arkusz hydrożelu za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów. Przenieść każdy arkusz hydrożelu do indywidualnych dołków 12-dołkowej płytki zawierającej jeden milileter wstępnie podgrzanego DMEM, tak aby unosiły się na powierzchni pożywki. Hoduj komórki w ten sposób przez tydzień, wymieniając pożywkę co drugi dzień.

Następnie utwórz ramę PDMS, która zawiera struktury słupków o wysokości 170 mikronów na dolnej powierzchni, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Podczas produkcji umieść specjalistyczną formę poliwęglanową na płytce krzemowej dla ramy PDMS, aby stworzyć wewnętrzną ramę o szerokości ośmiu milimetrów, wysokości dziewięciu milimetrów i głębokości dwóch milimetrów. Po wysterylizowaniu umieść ramkę PDMS na jednej czwartej kawałka nylonowej bibuły filtracyjnej umieszczonej na 60-milimetrowej szalce Petriego.

Wyjmij arkusze hydrożelu z inkubatora i przenieś pierwszy z modułowych arkuszy hydrożelu do wnętrza ramy PDMS za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów. Dopasuj krawędź modułowego arkusza hydrożelu do ramy PDMS za pomocą pustej końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Powtórz ten proces z dodatkowymi arkuszami hydrożelu, aż do uzyskania stosu od czterech do sześciu warstw.

Następnie usuń pożywkę hodowlaną, przepuszczając ją przez struktury filarów w dolnej części ramy PDMS. Następnie dodaj dwa mikrolitry dwuprocentowego roztworu alginianu w jednym rogu wielowarstwowej konstrukcji. Za pomocą nawilżacza rozpyl mgiełkę odczynnika sieciującego z szybkością 250 mililitrów na godzinę na wielowarstwową konstrukcję przez trzydzieści sekund, aby połączyć ze sobą krawędzie każdej warstwy.

Następnie delikatnie przepłucz wielowarstwową konstrukcję 400 mikrolitrami DMEM i usuń ramkę PDMS za pomocą pęsety. Następnie dodaj dodatkowe cztery mililitry DMEM. Odłącz wielowarstwową konstrukcję od bibuły filtracyjnej, delikatnie przecierając ją podnośnikiem komórek, a następnie użyj bibuły filtracyjnej, aby przenieść ją na sześciodołkową płytkę zawierającą trzy mililitry DMEM.

Hodować komórki w sposób pływający za pomocą hydrożelowego konstruktu jako wieloskalowego rusztowania komórkowego na płytce sześciodołkowej przez co najmniej tydzień. Wymieniaj pożywkę co drugi dzień. Pokazano tutaj wynik składania warstwa po warstwie mikrowarstwowych arkuszy hydrożelu przypominających zraziki wątroby, gdzie ludzkie komórki raka wątroby fluoryzujące na zielono i fibroblasty NIH-3T3 fluoryzujące na czerwono hodowano razem w wspólnej hodowli na połączonej siatce.

Za pomocą przedstawionej tutaj techniki można stworzyć wiele wariantów wzorów, w tym sześciokątne filary, cienkie siatki, całe układy i wiele mikrowłókien przypominających mikrogrzebień w postaci cienkiej hydrożelowej konstrukcji rzędu 100 do 200 mikrometrów. Struktury te zapewniają bogate środowisko hodowli 3D dla wielu różnych typów komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć arkusze hydrożelu komórkowego do inżynierii systemów hodowli 3D podobnych do vivo od podstaw.