Name: Pobieranie mleka u szczura za pomocą kapilar i oznaczanie zawartości tłuszczu w mleku za pomocą kremokrytu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Naucz się ręcznego pobierania mleka od szczurzyc za pomocą kapilar oraz oznaczania zawartości tłuszczu metodą kremokrytu. Protokół nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być wykonany przez jedną osobę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (RGPIN 238382-2011) oraz Canadian Institutes of Health Research (MOP115076). Heather Paul była wspierana przez stypendium podyplomowe Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii oraz stypendium Alberta Innovates Health Solutions. Megan Hallam była wspierana przez stypendium podyplomowe Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii, stypendium Fredericka Bantinga i Charlesa Besta Canada Graduate Scholarship oraz nagrodę Alberta Children's Hospital Research Institute Training Award w dziedzinie genetyki, rozwoju dziecka i zdrowia.

Ten protokół został zatwierdzony przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Calgary i był zgodny z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych.
1. Oddziel matkę od potomstwa
<ol>
	<li>Odseparuj matkę od jej potomstwa na co najmniej 5 minut przed dojeniem12, 
	UWAGA: Matka może być dojona do 5-6 godzin po oddzieleniu1,6,13, jednak okresy separacji dłuższe niż 4 godziny mogą zmienić skład mleka14. Chociaż wydaje się, że czas separacji nie ma wpływu na objętość odbioru mleka12, zaleca się utrzymanie stałego czasu separacji przez cały czas trwania badania. Skład mleka może ulegać zmianom w okresie laktacji15, dlatego należy dołożyć starań, aby dzień odbioru mleka był spójny. Sugeruje się, że maksymalna produkcja mleka ma miejsce w14-12 dniu laktacji.</li>
	<li>Korzystając z komory grzewczej, upewnij się, że młode są w stanie utrzymać odpowiednią temperaturę ciała bez obecności matki przez cały czas trwania procedury doju. 
	UWAGA: W przedstawionym poniżej badaniu dojenie przeprowadzano w momencie odsadzenia, gdy matki miały około 22 tygodni, a potomstwo 21 dni, dlatego nie stosowano komory grzewczej.</li>
</ol>
2. Ustawienie i przygotowanie
<ol>
	<li>Zbierz wszystkie materiały potrzebne do procedury doju. 
	UWAGA: Wszystkie materiały znajdują się w tabeli materiałów i wyposażenia.</li>
	<li>Umieść poduszkę grzewczą na ławce, na której będzie odbywał się dój i przykryj podkładkę chłonnym podkładem pod ławkę.</li>
	<li>Skonfiguruj system znieczulający. Przed rozpoczęciem upewnij się, że system ma wystarczającą ilość tlenu i izofluranu. Przymocuj do urządzenia maskę znieczulającą, która będzie używana do wstępnej indukcji znieczulenia. Umieść w pobliżu maskę, która będzie używana do utrzymania znieczulenia, jeśli jest inna niż początkowa maska znieczulająca.</li>
	<li>Podłączyć igłę 25 G do strzykawki o pojemności 1 ml w celu wstrzyknięcia oksytocyny z zachowaniem zasad aseptyki.</li>
	<li>Włącz poduszkę grzewczą tak, aby temperatura ciała matki była utrzymywana podczas procedury doju. UWAGA: Monitoruj temperaturę poduszki grzewczej, aby upewnić się, że podkładka nie nagrzewa się zbytnio i nie powoduje oparzeń. Alternatywnie użyj źródła ciepła, takiego jak podgrzewany stół chirurgiczny, który można ustawić na określoną temperaturę. </li>
</ol>
3. Znieczulenie tamy za pomocą izofluranu
<ol>
	<li>Otwórz zbiornik tlenu i zwiększ przepływ do 1 l (1 000 cm3) na minutę. Włącz przepływ izofluranu i ustaw go na 5%. UWAGA: Unikać bezpośredniego wdychania środka znieczulającego i zapobiegać gromadzeniu się oparów środka znieczulającego.</li>
	<li>Znieczulić tamę.</li>
	<li>W razie potrzeby przełącz się na maskę konserwacyjną, kładąc koferdam na wznak na chłonnej podkładce ławkowej. Potwierdź znieczulenie brakiem odruchu pedałowania.</li>
	<li>Zmniejsz przepływ izofluranu do 2-3% w celu utrzymania znieczulenia. Stale monitoruj koferdam przez cały czas trwania zabiegu, aby upewnić się, że nie wystąpi depresja oddechu. UWAGA: Po znieczuleniu oczy koferdamu powinny być chronione za pomocą sterylnego smaru do oczu, aby zapobiec wysuszeniu lub zarysowaniu oczu. </li>
</ol>
4. Wstrzyknięcie oksytocyny
<ol>
	<li>Upewnij się, że oksytocyna (20 jednostek USP/ml) nie przekroczyła daty ważności. Zdezynfekować fiolkę z oksytocyną sterylnym wacikiem nasączonym alkoholem/wacikiem nasączonym alkoholem.</li>
	<li>Stosując technikę aseptyczną, pobrać 2 j.m. (0,1 ml) oksytocyny do strzykawki. Użyj nowej igły i strzykawki dla każdej matki, która ma być dojona. 
	UWAGA: Dawki oksytocyny zazwyczaj wahają się od pojedynczych wstrzyknięć od 1 do 5 j.m.1,6,12,16. Alternatywnie można zastosować dawkę 4 j.m./kg masy ciała12. Pojedynczą dawkę 2 j.m. można powtórzyć jeden raz, jeśli wystąpią trudności z dojeniem.</li>
	<li>Oksytocynę należy wstrzykiwać dootrzewnowo. Wbić igłę w prawy dolny kwadrant brzucha z igłą skierowaną w stronę głowy, pod kątem 15-30°, na głębokość około 0,5 cm.</li>
	<li>Odciągnąć tłok, aby zapewnić podciśnienie przed wstrzyknięciem. Jeśli jakikolwiek płyn (krew, mocz, treść jelitowa itp.) zostanie odessany do strzykawki, należy usunąć igłę i spróbować wstrzyknąć nową igłę i strzykawkę. Jeśli płyn nie zostanie odessany, należy wstrzyknąć oksytocynę i natychmiast wyrzucić igłę i strzykawkę do pojemnika stanowiącego zagrożenie biologiczne.</li>
	<li>Odczekaj około 5-15 minut, aż oksytocyna pobudzi wydzielanie mleka.</li>
</ol>
5. Przygotowanie miejsc dojenia
<ol>
	<li>Wybierz miejsca/strzyki, z których będzie zbierane mleko. Mleko można pobrać z dowolnego smoczka12.</li>
	<li>Delikatnie usuń sierść wokół strzyków, które mają być dojone za pomocą trymerów, ponieważ sierść może powodować trudności w pobieraniu próbek z powodu przesiąkania mleka. Bądź delikatny – skóra wokół strzyków jest niezwykle wrażliwa i może być sucha, a co za tym idzie, podatna na zadrapania i rozdarcia.</li>
	<li>Sterylizacja smoczka nie jest konieczna, ale opcjonalnie po usunięciu sierści należy oczyścić smoczek letnią wodą. Przygotuj co najmniej dwa miejsca, ponieważ do odbioru mleka może być wymagane więcej niż jedno miejsce. 
	UWAGA: Jeśli analiza mleka obejmuje profilowanie mikrobiologiczne, obszar strzyka może wymagać sterylizacji jodem5.</li>
</ol>
6. Odbiór mleka
<ol>
	<li>Delikatnie ściśnij podstawę smoczka, ręcznie usuwając mleko do zbioru. 
	UWAGA: Jeśli analiza mleka obejmuje profilowanie mikrobiologiczne, pierwsze kilka kropli mleka należy wyrzucić.</li>
	<li>Zbierz kropelki mleka do rurki kapilarnej, napełniając rurkę kapilarną. Rurki kapilarne, które przyjmują większe objętości (np. 50 μl), ułatwiają ten proces. 
	UWAGA: W przypadku wystąpienia trudności w pobieraniu mleka można podać drugą dawkę oksytocyny. Zaleca się, aby dawka nie przekraczała 4 j.m. ogółem.</li>
	<li>Dozuj mleko z rurki kapilarnej do sterylnej probówki do mikrowirówki, dotykając końca probówki, która była używana do pobierania mleka ze smoczka, do boku probówki mikrowirówki - obserwuj, jak mleko jest wyciągane z rurki kapilarnej za pomocą działania kapilary. 
	UWAGA: "Wydmuchać" mleko, które nie zostało pobrane do probówki, za pomocą igły 18 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Należy stale monitorować koferdam pod kątem objawów bólu lub depresji oddechowej i odpowiednio dostosować przepływ izofluranu.</li>
	<li>Kontynuuj pobieranie mleka zgodnie z opisem w tym rozdziale, aż do momentu zebrania wystarczającej ilości mleka do wybranej analizy mleka. W celu oznaczenia śmietanokrytu i stężenia białka opisanego poniżej, należy zebrać 0,25 ml mleka. 
	UWAGA: Użyj innego miejsca doju, jeśli upływ mleka spowolni lub wybrane miejsce nie wydala mleka w wystarczającym stopniu. Na jedno zwierzę można zebrać maksymalnie około 2,5 ml mleka17 , czyli do 0,5 ml na strzyk. Autorzy zalecają, aby całkowity czas pod narkozą był ograniczony do około 45-60 minut, czyli 45 minut doju.</li>
	<li>Zbierz mleko do probówki mikrohematokrytu w celu pomiaru kremokrytu z próbek świeżego mleka i uszczelnij koniec probówki uszczelniaczem glinianym. Oznacz rurkę mikrohematokrytu identyfikatorem koweny i przechowuj próbkę mleka w pozycji pionowej.</li>
	<li>Po zakończeniu doju wyłącz przepływ izofluranu i tlenu. Zdejmij maskę z zapory i kontynuuj monitorowanie zapory aż do przebudzenia. Zaleca się, aby w przypadku braku pełnej przytomności, koferdam umieścić na chłonnej podkładce ławkowej w okresie rekonwalescencji, a nie bezpośrednio na ściółce klatki, aby zapobiec zasysaniu ściółki lub drapaniu oczu zapory podczas rekonwalescencji. 
	UWAGA: Nie pozostawiaj zapory bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.</li>
	<li>Jeżeli dalsze analizy nie są wymagane, zamrozić mleko w temperaturze -80 °C. Inni sugerowali, że mleko można przechowywać do 3 godzin w temperaturze 4 °C lub 5 miesięcy w temperaturze -20 °C18.</li>
</ol>
7. Pomiar kremokrytu
<ol>
	<li>Oszacuj zawartość tłuszczu w mleku, obliczając śmietankatokryt mleka (procentowa zawartość śmietany w próbce mleka)19. 
	UWAGA: Pomiary z mlekiem matki wykazały, że do pomiaru kremokrytu można użyć zarówno świeżego, jak i mrożonego mleka, jednak świeże mleko jest bardziej skorelowane (r = 0,92 w porównaniu z r = 0,90) ze stężeniem lipidów11. Stosowanie świeżego lub mrożonego mleka do pomiarów kremokrytu powinno być spójne w całym badaniu, ponieważ rozmrożone mleko wiąże się z niewielkim spadkiem wartości krematokrytu11.</li>
	<li>W przypadku świeżego mleka należy pobrać próbkę mleka ze strzyka do probówki mikrohematokrytu; napełnić co najmniej 3/4 objętości (około 15-20 μl). Alternatywnie, po dokładnym wymieszaniu, pobrać świeże mleko z pobranej próbki do rurki kapilarnej. Uszczelnij koniec uszczelniaczem glinianym.</li>
	<li>Umieść rurkę kapilarną w wirówce hematokrytu, z uszczelnionym końcem skierowanym na zewnątrz, upewniając się, że wirówka jest zrównoważona.</li>
	<li>Rozpocznij wirowanie hematokrytu (120 sekund przy 13 700 x g). 
	UWAGA: Czas wirowania lub prędkość mogą się zmieniać w zależności od używanego modelu wirówki.</li>
	<li>Wyjmij probówkę z wirówki po zakończeniu wirowania i wykonaj pomiary w celu obliczenia krematokrytu. Obserwować rozdzielenie próbki na warstwę kremową i warstwę przezroczystą.</li>
	<li>Zmierz i zapisz całkowitą długość płynu w tubie oraz długość warstwy tłuszczu (kremu) za pomocą suwmiarki lub linijki. 
	UWAGA: Krematokryt jest wyrażony jako procent warstwy śmietany w próbce mleka19, obliczony jako (długość warstwy śmietany/całkowita długość kolumny mleka) x 100 (rysunek 1A). Obliczyć stężenie tłuszczu i wartości energii na podstawie pomiaru krematokrytu w następujący sposób: Stężenie tłuszczu (g/L) = (creamatocrit (%)-0,59)/0,146 (Rysunek 1B)19; Wartość energetyczna (kcal/L) = 290 + (66,8*creamatocrit (%) (Rysunek 1C)19.</li>
</ol>
8. Oznaczanie stężenia białka
<ol>
	<li>Używając albuminy surowicy bydlęcej jako wzorca białka, oznacz całkowite stężenie białka mleka za pomocą standardowego testu białka, takiego jak test białka Lowry'ego6, 
	UWAGA: Rozcieńczenie mleka może być konieczne, aby pomiary białka mleka mieściły się w krzywej wzorcowej testu.</li>
</ol>

<ol><li>Izumi, H., Kosaka, N., Shimizu, T., Sekine, K., Ochiya, T., Takase, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+expression+profiles+of+microRNAs+and+mRNAs+in+rat+milk+whey%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Time-dependent expression profiles of microRNAs and mRNAs in rat milk whey.</a> PLoS ONE. 9 (2), e0088843(2014).</li>
<li>Hsieh, C. C., Hernández-Ledesma, B., Fernández-Tomé, S., Weinborn, V., Barile, D., de Moura Bell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milk+Proteins%2C+Peptides%2C+and+Oligosaccharides%3A+Effects+against+the+21st+Century+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22+BioMed+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Milk Proteins, Peptides, and Oligosaccharides: Effects against the 21st Century Disorders.</a> BioMed Res. Int. , (2015).</li>
<li>Rogier, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+mother%3A+Long-term+impact+of+antibodies+in+breast+milk+on+the+gut+microbiota+and+intestinal+immune+system+of+breastfed+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Lessons from mother: Long-term impact of antibodies in breast milk on the gut microbiota and intestinal immune system of breastfed offspring.</a> Gut Microbes. 5 (5), 663-668 (2014).</li>
<li>Keen, C. L., Lönnerdal, B., Clegg, M., Hurley, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+composition+of+rat+milk%3A+trace+elements%2C+minerals%2C+protein%2C+carbohydrate+and+fat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Nutr%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in composition of rat milk: trace elements, minerals, protein, carbohydrate and fat.</a> J. of Nutr. 111 (2), 226-236 (1981).</li>
<li>Cabrera-Rubio, R., Collado, M. C., Laitinen, K., Salminen, S., Isolauri, E., Mira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+milk+microbiome+changes+over+lactation+and+is+shaped+by+maternal+weight+and+mode+of+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">The human milk microbiome changes over lactation and is shaped by maternal weight and mode of delivery.</a> Am. J. Clin. Nutr. 96 (3), 544-551 (2012).</li>
<li>Hallam, M. C., Barile, D., Meyrand, M., German, J. B., Reimer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+high-protein+or+high-prebiotic-fiber+diets+affect+maternal+milk+composition+and+gut+microbiota+in+rat+dams+and+their+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity%22%5BJournal%5D)">Maternal high-protein or high-prebiotic-fiber diets affect maternal milk composition and gut microbiota in rat dams and their offspring.</a> Obesity. 22 (11), 2344-2351 (2014).</li>
<li>Munch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+Profiling+of+microRNA+by+Next-Gen+Deep+Sequencing+Reveals+Known+and+Novel+miRNA+Species+in+the+Lipid+Fraction+of+Human+Breast+Milk%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transcriptome Profiling of microRNA by Next-Gen Deep Sequencing Reveals Known and Novel miRNA Species in the Lipid Fraction of Human Breast Milk.</a> PLoS ONE. 8 (2), e50564(2013).</li>
<li>Li, M., Sloboda, D. M., Vickers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+obesity+and+developmental+programming+of+metabolic+disorders+in+offspring%3A+Evidence+from+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Maternal obesity and developmental programming of metabolic disorders in offspring: Evidence from animal models.</a> Exp Diabetes Res. 2011, (2011).</li>
<li>Ellis, P. J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrifty+metabolic+programming+in+rats+is+induced+by+both+maternal+undernutrition+and+postnatal+leptin+treatment%2C+but+masked+in+the+presence+of+both%3A+implications+for+models+of+developmental+programming%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Thrifty metabolic programming in rats is induced by both maternal undernutrition and postnatal leptin treatment, but masked in the presence of both: implications for models of developmental programming.</a> BMC Genomics. 15, 49(2014).</li>
<li>Gomez-Gallago, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+collect+high+volumes+of+milk+from+mice+%28Mus+musculus%29%5BTitle%5D)+AND+%22An.+Vet.+Murcia%22%5BJournal%5D)">A method to collect high volumes of milk from mice (Mus musculus).</a> An. Vet. Murcia. 29, 55-61 (2013).</li>
<li>Wang, C. D., Chu, P. S., Mellen, B. G., Shenai, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creamatocrit+and+the+nutrient+composition+of+human+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Perinatol%22%5BJournal%5D)">Creamatocrit and the nutrient composition of human milk.</a> J. Perinatol. 19 (5), 343-346 (1999).</li>
<li>Rodgers, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+aspects+of+milk+collection+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim%22%5BJournal%5D)">Practical aspects of milk collection in the rat.</a> Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).</li>
<li>Godbole, V. Y., Grundleger, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+of+rat+milk+from+day+5+to+20+of+lactation+and+milk+intake+of+lean+and+preobese+zucker+pups%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Composition of rat milk from day 5 to 20 of lactation and milk intake of lean and preobese zucker pups.</a> J. Nutr. 111 (3), 480-487 (1981).</li>
<li>Del Prado, M., Delgado, G., Villalpando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+lipid+intake+during+pregnancy+and+lactation+alters+milk+composition+and+production+and+litter+growth+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Maternal lipid intake during pregnancy and lactation alters milk composition and production and litter growth in rats.</a> J. Nutr. 127 (3), 458-462 (1997).</li>
<li>Nicholas, K. R., Hartmann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milk+secretion+in+the+rat%3A+progressive+changes+in+milk+composition+during+lactation+and+weaning+and+the+effect+of+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Physiol.+A.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Milk secretion in the rat: progressive changes in milk composition during lactation and weaning and the effect of diet.</a> Comp. Biochem. Physiol. A. Comp. Physiol. 98 (3-4), 533-542 (1991).</li>
<li>Azara, C. R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+intake+during+lactation+alters+milk+nutrient+composition+and+growth+and+mineral+status+of+rat+pups%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Ethanol intake during lactation alters milk nutrient composition and growth and mineral status of rat pups.</a> Biol. Res. 41 (3), 317-330 (2008).</li>
<li>Keen, C. L., Lönnerdal, B., Sloan, M. V., Hurley, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+milking+procedure+on+rat+milk+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Effects of milking procedure on rat milk composition.</a> Physiol. Behav. 24 (3), 613-615 (1980).</li>
<li>Romeu-Nadal, M., Castellote, A. I., Lòpez-Sabater, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cold+storage+on+vitamins+C+and+E+and+fatty+acids+in+human+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Effect of cold storage on vitamins C and E and fatty acids in human milk.</a> Food Chem. 106 (1), 65-70 (2008).</li>
<li>Lucas, A., Gibbs, J. A., Lyster, R. L., Baum, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creamatocrit%3A+simple+clinical+technique+for+estimating+fat+concentration+and+energy+value+of+human+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Med.+J%22%5BJournal%5D)">Creamatocrit: simple clinical technique for estimating fat concentration and energy value of human milk.</a> Br. Med. J. 1 (6119), 1018-1020 (1978).</li>
<li>Furtado, K., Andrade, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+beneficial+and+adverse+effects+of+inhalable+and+injectable+anaesthetics+in+animal+models%3A+a+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22OA+Anaesthetics%22%5BJournal%5D)">Comparison of the beneficial and adverse effects of inhalable and injectable anaesthetics in animal models: a mini-review.</a> OA Anaesthetics. 1 (2), 20(2013).</li>
<li>Hausman Kedem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+advanced+maternal+age+upon+human+milk+fat+content%5BTitle%5D)+AND+%22Breastfeed.+Med%22%5BJournal%5D)">The effect of advanced maternal age upon human milk fat content.</a> Breastfeed. Med. 8 (1), 116-119 (2013).</li>
<li>Mandel, D., Lubetzky, R., Dollberg, S., Barak, S., Mimouni, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+and+energy+contents+of+expressed+human+breast+milk+in+prolonged+lactation%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Fat and energy contents of expressed human breast milk in prolonged lactation.</a> Pediatrics. 116 (3), e432-e435 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez CCAC.

Badania nad składnikami mleka matki nasiliły się wraz ze wzrostem zainteresowania badaniami nad rozwojem we wczesnym okresie życia. Jako jedyne źródło pożywienia w okresie noworodkowym, związki bioaktywne zawarte w mleku są niezbędne dla idealnego wzrostu i rozwoju, zwłaszcza w kontekście zdrowia jelit i układu odpornościowego3. Przedstawiona tutaj metoda jest prostą, nieinwazyjną metodą pobierania mleka od szczura w okresie laktacji w ilościach wystarczających do dalszej analizy, takiej jak profilowanie oligo...

Mleko jest jedynym źródłem pożywienia dla nowonarodzonych ssaków, dostarczając energii i składników odżywczych dla wzrostu i rozwoju niemowląt1,2. Podczas gdy mleko składa się głównie z komórek, lipidów i białka1, zawiera również mnóstwo związków bioaktywnych, które modulują wczesny rozwój potomstwa, w tym enzymy, węglowodany, hormony, przeciwciała, czynniki wzrostu, cytokiny, egzosomy, mikropęcherzyki i małe RNA, takie jak mikroRNA1,2. Fundamentalna rola mleka matki w kształtowaniu układu odpornościowego i zdrowia jelit u potomstwa3 w połączeniu z dowodami na to, że niemowlęta karmione piersią są mniej podatne na choroby2 , podkreśla znaczenie identyfikacji składników mleka związanych z procesami chorobowymi we wczesnym okresie życia oraz mechanizmów molekularnych zaangażowanych w ich działanie. Rozwijający się szczur jest popularnym modelem do badania wpływu różnych interwencji żywieniowych, fizjologicznych i chemicznych na rozwój we wczesnym okresie życia4. Analiza mleka szczurów może zatem dostarczyć nowych informacji na temat zdrowia matki i potomstwa.
Obecny postęp naukowy stwarza teraz coraz większe możliwości dogłębnych badań nad wpływem określonych składników mleka na zdrowie i choroby. Na przykład sekwencjonowanie profili bakterii mleka wyjaśniło ich rolę we wczesnej kolonizacji jelit niemowlęcia5, analiza spektrometrii mas oligosacharydów mleka dostarczyła informacji na temat zmian profili oligosacharydów mleka poprzez dietę matki6, a głębokie sekwencjonowanie mikroRNA wydzielanego w kuleleczkach tłuszczu mleka matki podkreśla możliwe role w transkrypcji genów. metabolizm i funkcja immunologiczna7.
Modele szczurów reprezentują jedne z najpopularniejszych organizmów modelowych używanych w badaniach nad matkami8,9. Jedną z zalet jest krótki okres ciąży i laktacji, trwający tylko około 21 dni każdy; W związku z tym całkowity czas od początku ciąży do laktacji stanowi krótki okres czasu, w którym można uzyskać cenne dane. Większy rozmiar szczurów w porównaniu z myszami, w kontekście zbierania mleka, może zapewnić znaczną przewagę pod względem objętości mleka i łatwości pobierania mleka; Na przykład produkcja mleka u myszy wydaje się być zależna od całkowitej masy ciała, przy czym cięższe myszy produkują więcej mleka10.
Tutaj znajduje się ogólny opis ręcznego pobierania mleka od szczurów w okresie laktacji. Protokół ten wymaga minimalnego sprzętu, jest nieinwazyjny, niedrogi i może być używany do zbierania odpowiednich ilości mleka do dalszych analiz. Krótko mówiąc, matka jest znieczulana izofluranem, upływ mleka jest stymulowany przez oksytocynę, a mleko jest zbierane do kapilar poprzez ręczne odciąganie mleka. Wreszcie, ponieważ dwoma głównymi składnikami mleka są tłuszcz i białka, przedstawiono krótki opis szacowania zawartości tłuszczu w mleku za pomocą pomiarów creamatokrytu11 oraz kwantyfikacji całkowitego stężenia białka przy użyciu standardowego testu białkowego.

<table><tbody><tr><td>Equipment - Strzykawki do dojenia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml</td><td>BD-Canada</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Igły 25 G</td><td>BD-Canada</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>18 G</td><td>BD-Canada</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu; l Mikrodozownik Kapilary</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-169D</td><td></td></tr><tr><td>Oksytocyna (20 jednostek USP / ml)</td> <td>Bimeda-MTC</td><td>1OXY015</td><td></td></tr><tr><td>PPC Vet Izofluran wziewny środek znieczulający, 250 ml</td><td>Fresenius Kabi</td><td>M60302</td><td>Używany na zlecenie lekarza weterynarii</td></tr><tr><td>Sterylny podkład nasączony alkoholem</td><td>Dukal</td><td>853</td><td></td></tr><tr><td>Chłonny podkład pod ławkę</td><td>VWR</td><td>82020-845</td><td></td></tr><tr><td>Koc Maxi-Therm Hyper/Hypothermia</td><td>Cincinnati Sub-Zero</td><td>274</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do znieczulenia gryzoni z parownikiem</td><td>Benson Medical Industries Inc.</td><td></td><td>W zależności od indywidualnych potrzeb laboratoryjnych</td></tr><tr><td>Maski dla zwierząt,</td><td>Benson Medical Industries, Inc.</td><td>50100/50102</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Axygen</td><td>MCT-060-C</td><td></td></tr><tr><td>ChroMini Profesjonalny trymer</td><td>Wahl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment - Creamatocrit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>StatSpin SafeCrit Plastikowe rurki do mikrohematokrytu (nieobrobione)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-274-914</td><td></td></tr><tr><td>Critoseal Taca na uszczelniacz rurki kapilarnej</td><td>VWR</td><td>470161-478</td><td></td></tr><tr><td>StatSpin CritSpin Wirówka do mikrohematokrytu</td><td>Beckman Coulter, Inc</td><td>X00-004999-001</td><td></td></tr></tbody></table>

pobieranie mleka u szczura za pomocą kapilar i oznaczanie zawartości tłuszczu w mleku za pomocą kremokrytu

Milk Collection in the Rat Using Capillary Tubes and Estimation of Milk Fat Content by Creamatocrit

Mleko, jako jedyne źródło pożywienia dla nowonarodzonego ssaka, dostarcza niezbędnych składników odżywczych i energii do wzrostu i rozwoju potomstwa. Zawiera również ogromną liczbę związków bioaktywnych, które w znacznym stopniu wpływają na rozwój noworodka. Analiza składników mleka pomoże wyjaśnić kluczowe czynniki, które łączą metabolizm i zdrowie matki ze wzrostem i rozwojem potomstwa. Szczur laboratoryjny jest popularnym organizmem modelowym do badań matek, a mleko szczura może być wykorzystywane do badania wpływu różnych interwencji fizjologicznych, żywieniowych i farmakologicznych matki na składniki mleka, co może następnie wpłynąć na zdrowie potomstwa. W tym artykule opisano prostą metodę ręcznego pobierania mleka od szczura w okresie laktacji, która może być wykonana przez jednego badacza, nie wymaga specjalistycznego sprzętu próżniowego ani ssącego i zapewnia wystarczającą ilość mleka do późniejszej analizy. Przedstawiono również metodę szacowania zawartości tłuszczu w mleku poprzez pomiar procentowej zawartości śmietany w próbce mleka, znaną jako creamatocrit. Metody te mogą być ostatecznie wykorzystane do zwiększenia wglądu w zdrowie matki i dziecka oraz do wyjaśnienia czynników matczynych, które są zaangażowane w prawidłowy wzrost i rozwój potomstwa.

Mleko pobierano w okresie odsadzania zgodnie z opisem od samic Wistar (wiek ok. 22 tygodni, masa ciała od 350 do 400 g), które w trakcie ciąży i laktacji otrzymywały dietę kontrolną (AIN-93G, n = 5), wysokobiałkową (40% kazeiny masowo, n = 5) lub bogatą w błonnik prebiotyczny (21,6% masowo, stosunek oligofruktozy do inuliny 1:1, n = 4). Dawka oksytocyny wynosiła 2 IU. Mleko pobierano za pomocą kapilar, a jedną z nich wirowano w wirówce do hematokrytu w celu oznaczenia krematokrytu (Rysunek 1A), który nas...

Mleko jest podstawowym źródłem pożywienia dla noworodka. Analiza składników mleka może dostarczyć informacji na temat czynników matczynych, które wpływają na zdrowie potomstwa. Protokół ten opisuje ręczną metodę pobierania próbek mleka od szczura w okresie laktacji, które można następnie wykorzystać do dalszej analizy.

Pobieranie mleka u szczura za pomocą kapilar i oznaczanie zawartości tłuszczu w mleku za pomocą kremokrytu

Milk, as the sole source of nutrition for the newborn mammal, provides the necessary nutrients and energy for offspring growth and development. It also ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opisanie sposobu ręcznego pobierania mleka od laktującej szczurzycy w celu przeprowadzenia laboratoryjnej analizy składu mleka. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu zdrowia matki i dziecka, na przykład w kwestii tego, jak dieta matki może wpływać na skład mleka. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jej wykonania przez jednego badacza bez użycia specjalistycznego sprzętu próżniowego lub ssącego.Nie. Aby rozpocząć, należy oddzielić matkę od potomstwa na co najmniej pięć minut przed udojem. Następnie należy zebrać wszystkie materiały wymagane do procedury udoju, zgodnie z prezentacją. Następnie należy położyć chłonny podkład na podgrzewanym stole chirurgicznym lub użyć oddzielnego podkładu grzewczego, aby zapobiec utracie ciepła przez matkę podczas procedury udoju.Następnie sprawdź system anestezjologiczny, aby upewnić się, że przed zabiegiem w systemie znajduje się wystarczająca ilość tlenu i izofluranu. Następnie podłącz do urządzenia maskę, która będzie służyć do wstępnej indukcji znieczulenia, a maskę do podtrzymania anestezji ustaw w pobliżu. Otwórz butlę z tlenem i ustaw przepływ na 1 l/min.Następnie włącz przepływ izofluranu i ustaw go na poziomie 5%. Po znieczuleniu zwierzęcia przenieś je na maskę podtrzymującą. Potwierdź odpowiedni poziom znieczulenia, sprawdzając brak odruchu cofania łapy. Następnie ułóż zwierzę w pozycji grzbietnej na chłonnym podkładzie laboratoryjnym.Zmniejsz przepływ izofluranu do poziomu od 2 do 3%. Przez cały czas trwania procedury stale monitoruj samicę i w razie potrzeby reguluj przepływ izofluranu, aby uniknąć bólu i depresji oddechowej. Następnie za pomocą sterylnej chusteczki nasączonej alkoholem lub wkładki oczyszczającej zdezynfekuj fiolkę z oksytocyną; używając strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 25 G, pobierz 0,1 ml oksytocyny. Następnie wprowadź igłę w prawy dolny kwadrant brzucha samicy, kierując igłę w stronę głowy pod kątem od 15 do 30 stopni, na głębokość około 0,5 cm.Odciągnij tłok, aby zapewnić podciśnienie przed wstrzyknięciem. Jeśli płyn nie zostanie zassany, wstrzyknij oksytocynę, a następnie niezwłocznie wyrzuć igłę i strzykawkę do pojemnika na odpady biologiczne. Odczekaj około 5–15 minut, aż oksytocyna pobudzi wydzielanie mleka.W czasie zrzutu mleka wybierz sutki, z których będzie pobierane mleko. Użyj trymera, aby delikatnie usunąć sierść wokół wybranych sutek, ponieważ może ona utrudniać pobieranie próbek. Następnie oczyść sutki letnią wodą.Przygotuj co najmniej dwa miejsca, ponieważ do pobrania mleka może być wymaganych więcej niż jedno. Po spłynięciu mleka delikatnie uciśnij podstawę cycki, aby ręcznie usunąć mleko. W celu pobrania treści, zbierz krople mleka do kapilary o pojemności 50 µl.Po całkowitym napełnieniu, przenieś mleko z kapilary do sterylnej probówki do mikrocentryfugi, dotykając końcówką kapilary (tą, która służyła do pobierania mleka z łydki) ścianki probówki. Następnie, używając igły o rozmiarze 18 G zamocowanej do strzykawki o pojemności 1 ml, wydmuchaj pozostałe w kapilarze mleko. Powtarzaj proces pobierania i przenoszenia mleka do probówki do mikrocentryfugi, aż do zgromadzenia odpowiedniej ilości materiału.W przypadku wybranej analizy należy dążyć do tego, aby całkowity czas przebywania samicy pod wpływem środka znieczulającego nie przekraczał jednej godziny. Po zakończeniu udoju należy wyłączyć dopływ izofluranu i tlenu, a następnie zdjąć maskę z samicy. Należy kontynuować monitorowanie samicy aż do momentu odzyskania przez nią wystarczającej świadomości, aby była w stanie utrzymać pozycję leżącą na brzuchu.Jeśli nie są wymagane dalsze analizy, zamrozić mleko w temperaturze -80 °C. Aby przygotować próbkę do pomiaru CCR, nalać od 15 do 20 µL mleka do mikrokprotuby hematokrytycznej bezpośrednio z Tet. Następnie uszczelnić koniec probówki uszczelniaczem glinianym.Umieść kapilarę w wirówce do oznaczania hematokrytu, kierując wgłębienie uszczelki na zewnątrz, i upewnij się, że wirówka jest wyważona. Następnie wiruj próbkę z prędkością 13 700 ×g przez dwie minuty. Po zakończeniu wirowania wyjmij kapilarę z wirówki.Obserwuj rozdzielenie próbki na warstwę śmietankową i warstwę klarowną. Za pomocą linijki lub suwmiarki zmierz i zapisz całkowitą wysokość cieczy w probówce oraz wysokość warstwy tłuszczu lub śmietanki. Wykorzystaj te informacje do obliczenia CCR zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym, aby określić, w jaki sposób dieta podczas ciąży i laktacji wpływa na skład mleka.Próbki mleka pobrano podczas odsadzania od macic rasy Worcester karmionych dietą wysokobiałkową, dietą z wysoką zawartością błonnika prebiotycznego lub dietą kontrolną. Mleko pobrane od macic na diecie z wysoką zawartością błonnika prebiotycznego wykazywało numerycznie najwyższy hematokryt C, stężenie tłuszczów oraz wartość energetyczną. Różnice te nie były jednak istotne statystycznie w odniesieniu do białka.Jednakże mleko pobrane od samic otrzymujących dietę wysokobiałkową charakteryzowało się najwyższym stężeniem białka. Ponownie jednak różnica ta nie była istotna statystycznie. Po opanowaniu techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zająć mniej niż godzinę od momentu znieczulenia samicy.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ciągłym monitorowaniu samicy, aby upewnić się, że po zakończeniu zabiegu i w trakcie znieczulenia nie wystąpi depresja oddechowa. Do odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak określenie składu oligosacharydów mleka, można wykorzystać inne metody, np. spektrometrię mas. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić manualny pobór mleka od laktującej szczurzycy.

milk-collection-rat-using-capillary-tubes-estimation-milk-fat-content

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pobieranie mleka z modeli zwierzęcych ułatwia różne ścieżki badań: zrozumienie odporności biernej, identyfikację patogenów odpowiedzialnych za transgeniczne przenoszenie i, dzięki wykorzystaniu transgenicznych myszy, nawet komercyjną produkcję białek znajdujących się w ludzkim mleku matki. Tutaj ilustrujemy prostą metodę zbierania mleka u myszy i jeleni muntjac Reevesa.

Metody zbierania mleka dla myszy i jelenia Muntjac Reevesa

Hodowla całego zarodka ssaków (WEC) jest szeroko stosowana w teratologii i biologii rozwojowej. Natychmiast odwirowana surowica szczura jest powszechnie dostarczana jako pożywka zarówno dla myszy, jak i szczurów WEC. W tym filmie pokazujemy nasz standardowy protokół przygotowania wysokiej jakości surowicy szczurzej odpowiedniej dla WEC u ssaków.

Przygotowanie surowicy szczurzej odpowiedniej do hodowli całych zarodków ssaków

Opisujemy opartą na HPLC metodę oznaczania kwasu N-acetyloneuraminowego i kwasu N-glikolilenuraminowego w wątrobie i mleku myszy.

Oznaczanie kwasów sjalowych w próbkach wątroby i mleka myszy typu dzikiego i myszy z nokautem CMAH.

Ten artykuł opisuje metodę przeszczepiania komórek nabłonka sutka szczura dawcy do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami u zwierząt biorców. Metoda ta może być stosowana do badania wpływu gospodarza i/lub dawcy na rozwój nabłonka sutka i eliminuje potrzebę wstępnego oczyszczania, zwiększając w ten sposób przydatność tej techniki.

Przeszczep komórek nabłonkowych sutka szczura do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami

Ten artykuł opisuje i demonstruje podawanie szczepionek donosowych oraz pobieranie mleka od królików w okresie laktacji (Oryctolagus cuniculus) jako sposób oceny odporności błony śluzowej w translacyjnie odpowiednim modelu immunizacji matki.

Immunizacja donosowa i pobieranie mleka w badaniach immunizacji matek u białych królików nowozelandzkich (Oryctolagus cuniculus)

Obecny protokół opisuje prostą i efektywną metodę pobierania krwi z żyły podobojczykowej u szczurów. Umożliwia szybkie, terminowe i łatwe do zidentyfikowania pobieranie próbek bez znieczulenia oraz pozwala uzyskać wysokiej jakości krew dzięki powtarzalnemu pobieraniu próbek.

Powtarzające się pobieranie próbek krwi z żyły podobojczykowej przytomnego szczura

Protokół pokazuje powtarzające się pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi od szczurów z padaczką, wykonywane równolegle z ciągłym monitorowaniem wideo-elektroencefalogramu (EEG). Są one niezbędne do zbadania możliwych powiązań między zmianami w różnych cząsteczkach płynów ustrojowych a aktywnością napadową.

Pobieranie próbek płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi z żyły ogonowej bocznej u szczurów podczas zapisów EEG

Tutaj prezentujemy kombinację skutecznych metod ograniczania szczurów i nakłuwania żył podobojczykowych, które umożliwiają szybkie, bezpieczne i wielokrotne pobieranie krwi u szczurów bez znieczulenia.

Pobieranie próbek krwi z żyły podobojczykowej u przytomnych szczurów

Ten artykuł opisuje, jak złożyć urządzenie, które może być używane do zbierania mleka od myszy laboratoryjnych. To urządzenie jest niedrogie, przenośne i umożliwia pobranie 0,1–0,5 ml mleka przez jedną przeszkoloną osobę. Dołączony jest również szczegółowy protokół doju.

Skuteczna jednoosobowa technika pobierania próbek mleka od myszy laboratoryjnych

Protokół ten został zaprojektowany tak, aby przyspieszyć i umożliwić skuteczną izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od mleka matki o wysokiej czystości.

Szybka izolacja pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z ludzkiego mleka matki

Naucz się ręcznego pobierania mleka od szczurzyc za pomocą kapilar oraz oznaczania zawartości tłuszczu metodą kremokrytu. Protokół nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być wykonany przez jedną osobę.

Pobieranie mleka u szczura za pomocą kapilar i oznaczanie zawartości tłuszczu w mleku za pomocą kremokrytu

Przeglądaj więcej filmów