Pobieranie mleka u szczura za pomocą kapilar i oznaczanie zawartości tłuszczu w mleku za pomocą kremokrytu
16 grudnia 2015
Mleko jest podstawowym źródłem pożywienia dla noworodka. Analiza składników mleka może dostarczyć informacji na temat czynników matczynych, które wpływają na zdrowie potomstwa. Protokół ten opisuje ręczną metodę pobierania próbek mleka od szczura w okresie laktacji, które można następnie wykorzystać do dalszej analizy.
Ogólnym celem tej procedury jest opisanie sposobu ręcznego pobierania mleka od szczura w okresie laktacji w celu przeprowadzenia laboratoryjnej analizy składu mleka. Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie zdrowia matki i dziecka, takie jak to, w jaki sposób dieta matki może wpływać na skład mleka. Główną zaletą tej techniki jest to, że może być wykonana przez jednego badacza bez specjalistycznego sprzętu próżniowego lub ssącego.
No.To rozpocząć, oddziel matkę od jej potomstwa na co najmniej pięć minut przed dojeniem. Następnie zbierz wszystkie materiały, które są wymagane do procedury doju, jak pokazano tutaj. Następnie umieść chłonną podkładkę stołową na podgrzewanym stole operacyjnym lub użyj oddzielnej poduszki grzewczej, aby zapobiec utracie ciepła z koferdamu podczas procedury doju.
Następnie przed zabiegiem należy sprawdzić system znieczulający, aby upewnić się, że system ma wystarczającą ilość tlenu i izofluoru. Następnie przymocuj maskę, która będzie używana do wstępnej indukcji znieczulenia, do urządzenia i ustaw maskę konserwacyjną w pobliżu. Otwórz zbiornik tlenu i ustaw przepływ na jeden litr na minutę.
Następnie włącz przepływ izofluoru i ustaw jego przepływ na 5%Po znieczuleniu przełącz zaporę na maskę konserwacyjną. Potwierdź wystarczający poziom znieczulenia, sprawdzając, czy nie ma odruchu pedałowania. Następnie umieść koferdam w pozycji leżącej na chłonnej podkładce ławkowej.
Zmniejsz przepływ izofluoru do dwóch do 3%Stale monitoruj koferdam przez cały czas trwania zabiegu i w razie potrzeby dostosowuj przepływ izofluoru, aby uniknąć bólu i depresji oddechowej. Następnie użyj sterylnej chusteczki nasączonej alkoholem lub wacika oczyszczającego, aby zdezynfekować fiolkę oksytocyny za pomocą jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 25, pobrać 0,1 mililitra oksytocyny. Następnie wbij igłę w prawy dolny kwadrant brzucha matki z igłą skierowaną w stronę głowy pod kątem od 15 do 30 stopni, na głębokość około 0,5 centymetra.
Odciągnąć tłok, aby zapewnić podciśnienie przed wstrzyknięciem. Jeśli płyn nie zostanie odessany, należy wstrzyknąć oksytocynę i natychmiast wyrzucić igłę i strzykawkę do pojemnika stanowiącego zagrożenie biologiczne. Odczekaj około pięciu do 15 minut, aż oksytocyna pobudzi mleko.
Zawiedziony w tym czasie wybierz tety, z których będzie zbierane mleko. Użyj trymerów, aby delikatnie usunąć sierść wokół wybranych tet, ponieważ futro może powodować trudności w pobieraniu próbek. Następnie umyj tety letnią wodą.
Przygotuj co najmniej dwa miejsca, ponieważ do odbioru mleka może być wymagane więcej niż jedno miejsce. Gdy mleko spuści się, delikatnie ściśnij podstawę Tet, aby ręcznie usunąć mleko. W celu zebrania zbierz kropelki mleka do 50-mikrolitrowej rurki kapilarnej.
Po napełnieniu przelej mleko z rurki kapilarnej do sterylnej probówki do mikrowirówki, dotykając końca probówki, która była używana do pobierania mleka ze smoczka, na bok probówki do mikrowirówki. Następnie użyj igły o rozmiarze 18 dołączonej do strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby wydmuchać mleko, które nie zostało wciągnięte do probówki. Powtórz pobieranie mleka i przenieś je do probówki z mikrowirówką, aż do zebrania wystarczającej ilości mleka.
W przypadku wybranej analizy postaraj się ograniczyć całkowity czas, w którym zapora jest pod narkozą, do mniej niż jednej godziny. Po zakończeniu doju należy odciąć dopływ fluoru i tlenu oraz zdjąć maskę z zapory. Kontynuuj monitorowanie zapory, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać mostek w pozycji leżącej.
Jeśli nie są wymagane dalsze analizy, zmyj mleko w temperaturze minus 80 stopni. Aby przygotować się do pomiaru CCR, załaduj od 15 do 20 mikrolitrów mleka do mikrorurki hematokrytu bezpośrednio z Tet. Następnie uszczelnij koniec rurki szczeliwem glinianym.
Umieść rurkę kapilarną w wirówce hematokrytu z wgłębieniem uszczelki skierowanym na zewnątrz i upewnij się, że wirówka jest zrównoważona. Następnie obracać próbkę w temperaturze 13 700 razy G przez dwie minuty. Gdy próbka zakończy wirowanie, wyjmij probówkę z wirówki.
Obserwuj rozdzielenie próbki na warstwę kremu i warstwę przezroczystą. Zmierz i zapisz całkowitą długość płynu w tubce oraz długość warstwy tłuszczu lub śmietany za pomocą linijki lub suwmiarki. Na podstawie tych informacji można obliczyć CCR zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym w celu określenia, w jaki sposób dieta w okresie ciąży i laktacji wpływa na skład mleka.
Próbki mleka pobrano po odsadzeniu od matek z Worcester, które są karmione albo wysokobiałkowym, wysokobiałkowym, wysokobiałkowym, albo kontrolowaną dietą. Mleko pobrane od matek na diecie o wysokiej zawartości błonnika prebiotycznego miało liczbowo najwyższy hematokryt C, złą koncentrację i wartość energetyczną. Różnice te nie były jednak istotne statystycznie, jeśli chodzi o białko.
Jednak mleko zebrane od matek na diecie wysokobiałkowej miało najwyższe stężenie białka. Chociaż i w tym przypadku różnica ta nie była istotna statystycznie. Po opanowaniu technikę tę można wykonać w czasie krótszym niż godzina od początkowego punktu znieczulenia zapory, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o ciągłym monitorowaniu zapory, aby upewnić się, że nie wystąpi depresja oddechowa podczas znieczulenia po tej procedurze. Inne metody, takie jak spektrometria mas, mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak określenie składu oligosacharydowego mleka. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać ręczne pobieranie mleka od szczura w okresie laktacji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia prostą metodę ręcznego pobierania mleka od laktujących szczurów, umożliwiającą laboratoryjną analizę składu mleka. Protokół został opracowany do wykonania przez jednego badacza bez użycia specjalistycznego sprzętu próżniowego lub ssącego i obejmuje technikę szacowania zawartości tłuszczu w mleku przy użyciu metody krematokrytycznej. Podejścia te ułatwiają badania nad wpływem czynników macierzyńskich na skład mleka i, w konsekwencji, na rozwój potomstwa.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania nad zdrowiem matki i dziecka
- Biochemia żywienia
- Fizjologia zwierząt
Wprowadzenie
- Mleko jest głównym źródłem odżywczym dla noworodków ssaków, zawierając niezbędne składniki odżywcze i związki bioaktywne.
- Modele szczurze są powszechnie wykorzystywane do badania fizjologii matczynej oraz jej wpływu na potomstwo.
- Analiza składu mleka pomaga wyjaśnić powiązania między zdrowiem matki a rozwojem potomstwa.
- Istniejące metody pobierania mleka często wymagają specjalistycznego sprzętu lub udziału wielu osób.
Cel badania
- Opisanie prostej, ręcznej metody pozyskiwania mleka od laktujących szczurów.
- Przedstawienie protokołu, który nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być wykonany przez jednego badacza.
- Zdemonstrowanie zastosowania metody krematokrytu do szacowania zawartości tłuszczu w mleku.
Zastosowane metody
- Oddzielenie matki od potomstwa przed udojem.
- Indukcja i utrzymywanie znieczulenia z użyciem izofluranu i tlenu.
- Podanie oksytocyny w celu stymulacji wydzielania mleka.
- Ręczne wyciśnięcie mleka z sutków i zebranie go do kapilar.
- Przeniesienie mleka do probówek do mikrocentryfugi w celu przechowywania lub analizy.
- Pomiar krematokrytu: wirowanie mleka w kapilarach do hematokrytu w celu oddzielenia śmietanki i obliczenie zawartości tłuszczu.
Główne wyniki
- Metoda manualnego pobierania pozwala na uzyskanie wystarczającej ilości mleka do dalszych analiz i może zostać przeprowadzona w czasie krótszym niż godzina.
- Próbki mleka od samic na różnych dietach (wysokobiałkowej, z wysoką zawartością błonnika prebiotycznego, kontrolnej) wykazały różnice w krematokrycie, stężeniu tłuszczu i zawartości białka, choć różnice te nie były statystycznie istotne.
- Protokół umożliwia bezpieczne zarządzanie znieczuleniem i minimalizuje stres zwierzęcia przy odpowiednim monitorowaniu.
- Metoda ta jest dostosowana do dalszych analiz, takich jak spektrometria mas w celu profilowania oligosacharydów.
Wnioski
- Ta ręczna technika pobierania mleka jest wydajna, powtarzalna i dostępna dla większości laboratoriów.
- Umożliwia ona szczegółowe badania nad tym, w jaki sposób dieta i fizjologia matki wpływają na skład mleka oraz zdrowie potomstwa.
- Podejście to wspiera szereg dalszych analiz biochemicznych, służących pogłębianiu badań nad zdrowiem matki i dziecka.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodna kwantyfikacja zawartości tłuszczu w mleku w przedklinicznych modelach szczurzych umożliwia badania mechanistyczne nad wpływem żywienia matek oraz interwencji metabolicznych na rozwój potomstwa. Ręczne pobieranie do kapilar oraz analiza krematokrytyczna zapewniają zestandaryzowany, skalowalny schemat postępowania w celu oceny powiązań metabolicznych między matką a potomstwem w badaniach translacyjnych. Podejście to wspiera wczesne etapy odkryć i walidację celów dla programów zdrowotnych matki i dziecka w procesach rozwoju bioprzemysłowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących diety i metabolizmu matki w kontrolowanych modelach przedklinicznych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów interwencji u matek poprzez powiązanie składu mleka z efektami u potomstwa.
- Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka, zapewniając ilościowe odczyty zawartości tłuszczu w mleku.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe pomiary zawartości tłuszczu w celu standaryzacji analizy.
- Pozwala na przygotowanie zwalidowanych próbek mleka do dalszych analiz biochemicznych i omicznych.
- Umożliwia skalowalny screening interwencji żywieniowych lub farmakologicznych w modelach macierzyńskich.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia zestawienie przedklinicznych danych o składzie mleka z translacyjnymi biomarkerami zdrowia matki i noworodka.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po przedkliniczną walidację strategii interwencji u matek.
- Umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniach nad metabolizmem matki i potomstwa.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w etap wczesnego odkrywania i kontinuum przedkliniczne, wspierając testowanie hipotez, walidację celów oraz badania translacyjne w zakresie zdrowia matki i dziecka.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe wyniki krematokrytu wyjaśniają wpływ interwencji matczynych na skład mleka.
- Przesiewanie: Standaryzowany pobór i analiza umożliwiają powtarzalne porównania pomiędzy grupami eksperymentalnymi.
- Analityka: Zapewnia bezpośrednie, ilościowe pomiary zawartości tłuszczu do analizy statystycznej i podejmowania decyzji.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie wyników przedklinicznych do klinicznych punktów końcowych zdrowia matki i dziecka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przepływ pracy jest dostosowany do różnorodnych badań nad interwencjami matczynymi oraz do dalszych platform analitycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w badaniach metabolicznych matki i potomstwa oraz w walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia pracę pojedynczemu badaczowi, standaryzację i powtarzalność bez konieczności użycia specjalistycznego sprzętu.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji go/no-go skorygowanych o ryzyko w programach interwencji macierzyńskich.
- Wpływ na portfolio: Zapewnia wielorazową, skalowalną platformę do priorytetyzacji zasobów w obszarze zdrowia matki i dziecka.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza z zakresu obsługi gryzoni, znieczulania oraz pobierania próbek.
- Niezbędny jest dostęp do podstawowej infrastruktury laboratoryjnej, w tym do wirówki oraz narzędzi do pomiarów kapilarnych.
- Standaryzacja znieczulenia oraz czasu pobierania próbek jest kluczowa dla powtarzalności wyników.
- Metoda jest możliwa do zaadaptowania do różnych modeli interwencji macierzyńskich i jest zgodna z późniejszymi analizami biochemicznymi.
- Przez cały czas trwania procedury niezbędne jest uważne monitorowanie dobrostanu zwierząt oraz głębokości znieczulenia.
