Kwantyfikacja zachowań ryb podczas pływania w odpowiedzi na ostre narażenie na wodną zawartość miedzi przy użyciu wspomaganego komputerowo wideo i cyfrowej analizy obrazu

Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, w jaki sposób można określić ilościowo reakcje behawioralne jesiotra białego na subletalną ekspozycję na wodną zawartość miedzi. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie ekotoksykologii, takie jak to, w jaki sposób subletalne narażenie na zanieczyszczenia wpływa na zachowanie ryb podczas pływania. Metoda ta może dostarczyć ważnych informacji dla ochrony jesiotra białego.

Można go również łatwo stosować do innych gatunków ryb, i bezkręgowców. Główną zaletą tej techniki jest to, że reakcja jest bardzo czuła, zapewnia wczesne wskazanie toksyczności i ma znaczenie dla przetrwania organizmu. Początkowo ta metoda może być trudna, jeśli dana osoba nie jest zaznajomiona z dokonywaniem pomiarów behawioralnych.

Demonstracją protokołu będzie moja współautorka, Holly Puglis. Najpierw przygotuj dwa litry pięciowodnego pięciosiarczanu miedzi klasy wodnego. Następnie zrównoważ układ rozcieńczalnika i zbiorniki ekspozycyjne.

Umieścić rurkę wlotową z automatycznego dozownika strzykawkowego do kolby z roztworem podstawowym. Następnie ustaw objętość skoku automatycznej pompy na jeden mililitr i włącz rozcieńczalnik. System tworzy 50% serię rozcieńczeń składającą się z pięciu stężeń i kontroli.

Za pomocą czterokierunkowego rozdzielacza roztwory te są dostarczane do czterech replikowanych komór ekspozycyjnych. Następnie włącz pompę agregatu chłodniczego, aby utrzymać łaźnię wodną na poziomie 15 stopni Celsjusza. Teraz, używając automatycznego timera na rozcieńczalniku, ustaw go tak, aby zmieniał się co 30 minut.

Poziom wody w zbiornikach jest utrzymywany przez odpływ rurowy stojaka. Przygotuj komory ekspozycyjne, umieszczając czterocentymetrowy otwór z boku i przykrywając otwór siatką ze stali nierdzewnej o grubości 30 mikronów. Pamiętaj, aby wybrać komory ekspozycyjne, które mieszczą co najmniej jeden litr wody na 10 gramów ryby.

Na przykład 89-dniowy biały jesiotr waży około 373 miligramy, a zatem może być testowany w komorze kwadratowej o wymiarach 28 na 13 na 13 centymetrów i 5 centymetrów na 25 centymetrów. Na początku, w połowie i na końcu eksperymentu zbierz 24-mililitrowe podpróbki roztworu testowego do analizy chemicznej. Używaj słomek do słomek do strzykawek przymocowanych do plastikowych strzykawek.

Zastąp słomkę sipper filtrem polieterosulfonowym o temperaturze zerowej cztery pięć mikronów i dozuj cztery mililitry wody testowej przez filtr. Wyrzuć tę wodę. Następnie przefiltruj pozostałe 20 mililitrów wody do oczyszczonej kwasem butelki z polietylenu.

Zakwasić próbkę 16 molowym kwasem azotowym do 1% objętości. Próbki te mogą być następnie przechowywane przez okres do trzech miesięcy. Po potwierdzeniu ekspozycji testowych należy umieścić trzy jesiotry w każdej powtórzonej komorze testowej na około 172 miligramy ryb na litr komory.

Zbierz jesiotra za pomocą nieściernej siatki i przenieś je do małego wiadra. W sumie do zebrania danych z sześciu roztworów testowych potrzebne są 144 ryby. Podczas 96-godzinnej ekspozycji nie należy karmić ryb.

Należy prowadzić konsekwentne codzienne obserwacje w celu oceny śmiertelności i nieprawidłowego zachowania. Poranek jest najlepszą porą dnia, aby to zrobić, a idealnie byłoby, gdyby obserwator był ślepy na warunki testowe. Utratę równowagi definiuje się jako niezdolność ryb do utrzymania pionowej pozycji w słupie wody.

Unieruchomienie definiuje się jako niezdolność ryb do poruszania się lub pływania, chyba że są szturchane. Rejestruj również wszelkie inne nieprawidłowości, takie jak letarg, nadpobudliwość, wzrost lub spadek oddychania, zmiany koloru, drżenie, skurcze, wzdęcia brzucha, pozycja w słupie wody i wszelkie inne nietypowe wzorce pływania. Martwe ryby należy zawsze natychmiast usuwać.

Każdego dnia mierz również poziom tlenu rozpuszczonego za pomocą ręcznego miernika z dwóch próbek wody. Pod koniec 96-godzinnej ekspozycji nagraj filmy do analizy zachowania podczas pływania. Umieść arenę testową w zbiorniku ekspozycyjnym.

Pamiętaj, aby wybrać arenę testową, która jest wystarczająco duża, aby ryby mogły swobodnie pływać. Bezpośrednio nad każdą areną testową ustaw ręczną kamerę wideo na statywie. Teraz z potraktowanych ryb losowo wybierz do trzech ocalałych.

Przenieś trzy na arenę testową za pomocą małej siatki. Pozwól rybie zaaklimatyzować się na arenie przez około 30 minut. Podczas gdy ryby się aklimatyzują, skoncentruj obraz, zminimalizuj odblaski spowodowane poruszającą się wodą i zmaksymalizuj kontrast ryby z tłem, dostosowując widok, aby ryba nie była zasłonięta.

Gdy ryby się zaaklimatyzują, rozpocznij nagrywanie i zbierz dwie minuty danych wideo. Po nagraniu filmu poddaj rybę eutanazji i wyrzuć. Po przekonwertowaniu plików wideo do formatu wymaganego przez oprogramowanie do analizy cyfrowej, otwórz oprogramowanie śledzące i wybierz nowy domyślny eksperyment w opcji utwórz nowy eksperyment na ekranie głównym.

Wypełnij monity i naciśnij OK. Następnie przejdź do opcji ustawień eksperymentu w sekcji konfiguracja i wybierz z pliku wideo w sekcji źródło wideo. Ustaw liczbę aren na jedną.

Ustaw liczbę obiektów na arenę na trzy. Następnie wybierz wykrywanie punktu środkowego w obszarze śledzone obiekty i wybierz żądane jednostki. Teraz w obszarze konfiguracji wybierz opcję listy prób i kliknij dodaj filmy u góry ekranu.

Wybierz kolejność alfabetyczną w oknie dialogowym. Kliknij przycisk Przeglądaj. Przejdź do folderu, w którym znajdują się filmy, zaznacz odpowiednie pliki i kliknij przycisk Otwórz.

Teraz, gdy pliki wideo są już wybrane, przystąp do definiowania zakresu eksperymentu w oprogramowaniu. Najpierw kliknij dodaj zmienną u góry ekranu i wprowadź stężenie w polu etykiety. Wprowadź stężenie miedzi w mikrogramach na litr w polu opisu.

Następnie wybierz numeryczny z listy rozwijanej dla typu. Kliknij pole wstępnie zdefiniowanych wartości i wybierz opcję definiowania poszczególnych wartości w oknie dialogowym. Wprowadź stężenia użyte w eksperymencie, klikając dodaj między każdym dodawaniem liczb.

Następnie odznacz opcję zezwalaj na inne wartości i kliknij OK. Wybierz wersję próbną z menu rozwijanego w polu zakresu. W odpowiednich polach należy wpisać odpowiednie stężenie dla każdej próby.

Kliknij przycisk Dodaj zmienną u góry ekranu. Wprowadź replikację w polu etykiety. Wprowadź numer repliki w polu opisu.

Wybierz numeryczny z listy rozwijanej dla typu. Następnie kliknij pole wstępnie zdefiniowanych wartości i wybierz opcję definiowania poszczególnych wartości z okna dialogowego. Wprowadź jeden, dwa, trzy i cztery i odznacz opcję zezwalaj na inne wartości.

Następnie kliknij OK. Teraz wybierz opcję wersji próbnej z menu rozwijanego w polu zakresu. Wprowadź odpowiedni numer repliki dla każdej próby.

Kolejnym zadaniem jest ustawienie przestrzeni areny. Zacznij od wybrania ustawień areny w zakładce ustawień i nazwij pierwsze ustawienie jako próbne. W oknie dialogowym wybierz opcję chwyć obraz tła i kliknij przeglądaj.

Znajdź plik wideo dla pierwszej wersji próbnej i kliknij przycisk Otwórz. Po wyświetleniu filmu kliknij przycisk chwyć w oknie dialogowym chwyć obraz tła. Następnie kliknij ikonę białego koła u góry ekranu w ustawieniach areny i manipuluj okręgiem, który wydaje się otaczać obszar pływania.

Następnie kliknij ikonę skali kalibracji w ustawieniach areny. Użyj ruchu kliknij-przytrzymaj-przeciągnij, aby wybrać miejsce na arenie. Teraz pod polem odległości świata rzeczywistego w odległości kalibracji wprowadź 10 punktów pięć.

Następnie kliknij OK. W razie potrzeby wyreguluj linię kalibracji tak, aby obejmowała całą średnicę okrągłej areny. Kliknij opcję Sprawdź poprawność ustawień areny w polu ustawień areny i rozwiąż wszelkie problemy z ustawieniami, które nie zostały zweryfikowane.

Teraz powtarzaj ten proces, aż wszystkie areny zostaną zdefiniowane dla każdej próby. Następnie ustaw parametry wykrywania ryb. Najpierw wybierz ustawienia wykrywania w opcji konfiguracji na pasku narzędzi eksplorowania eksperymentu po lewej stronie ekranu.

Następnie wybierz dynamiczne odejmowanie z menu rozwijanego w obszarze metoda w jednym oknie dialogowym ustawień wykrywania. Wybierz także kolor wypełnienia dla każdego tematu w obszarze Identyfikacja tematu w oknie dialogowym. Następnie wybierz wideo i zlokalizuj wideo dla pierwszej wersji próbnej.

W jednym oknie dialogowym ustawień wykrywania wypełnij pole częstotliwości próbkowania pod wideo z pięcioma punktami dziewięć dziewięć cztery jeden. W tym samym polu kliknij ustawienia opcji obrazu referencyjnego w obszarze wykrywanie. Następnie kliknij opcję rozpocznij naukę języka C w oknie dialogowym obrazu referencyjnego.

Gdy obraz w oknie dialogowym obrazu referencyjnego pojawi się bez zwierząt, kliknij opcję Użyj dynamicznego obrazu referencyjnego w obszarze Ustawienia pobierania w oknie dialogowym i zamknij to okno dialogowe. Teraz wybierz ciemniejszy z menu rozwijanego dla tematu jest w trakcie wykrywania w jednym oknie dialogowym ustawień wykrywania. W przypadku wykrywanego ciemnego kontrastu ustaw mniejszą liczbę na 33, a większą liczbę na 153.

Następnie kliknij Zapisz zmiany w prawym dolnym rogu. Teraz upewnij się, że to oprogramowanie z powodzeniem śledzi zwierzęta, a nie cienie lub szczątki. Kliknij przycisk odtwarzania w oknie dialogowym sterowania odtwarzaniem i w razie potrzeby dostosuj liczby dla ciemnego kontrastu.

Pamiętaj, aby zapisać wszelkie wprowadzone poprawki. Oprogramowanie jest teraz ustawione na zbieranie danych z wideo, więc następnym zadaniem jest śledzenie ryb w każdej próbie. Najpierw wybierz akwizycję w opcji konfiguracji na pasku narzędzi eksploratora eksperymentów po lewej stronie ekranu.

Następnie kliknij opcję Śledź następną zaplanowaną próbę w oknie dialogowym ustawień przejęcia i upewnij się, że w ustawieniach w oknie dialogowym ustawień pozyskiwania są wyświetlane poprawne ustawienia próby, wideo i areny. Następnie zaznacz opcję wykrywania określa prędkość w oknie dialogowym kontroli akwizycji. Kliknij przycisk z zielonym kółkiem otoczonym białym kwadratem, aby rozpocząć proces pozyskiwania.

Powtarzaj ten proces, dopóki wszystkie próby nie będą śledzone. Teraz śledzone obiekty będące rybami mogą być analizowane. Najpierw kliknij profile danych w opcji analizy na pasku narzędzi eksploratora eksperymentów po lewej stronie ekranu.

Następnie wybierz czas w opcji zagnieżdżania na pasku narzędzi komponentów. W obszarze wybierz ustawienie interwału czasu śledzenia w oknie dialogowym czasu ustaw wartość do na dwie minuty i kliknij przycisk OK. Następnie przeciągnij pole zagnieżdżenia między pole początkowe a pole wynikowe o jedno pole w obszarze profilów danych po prawej stronie ekranu.

Na pasku narzędzi eksploratora eksperymentów po lewej stronie ekranu spójrz na opcję analizy i kliknij profil analizy. Następnie na pasku narzędzi zmiennych zależnych pod nagłówkiem odległości i czasu kliknij prędkość. Kliknij przycisk Dodaj, a następnie pod nagłówkiem Odległość i czas na pasku narzędzi Zmienne zależne kliknij przycisk Przeniesiono odległość.

Następnie kliknij przycisk Dodaj w oknie dialogowym przesunięta odległość, a następnie pod nagłówkiem Indywidualne zachowanie na pasku narzędzi zmiennych zależnych kliknij przycisk Ruch. W oknie dialogowym ruchu spójrz pod nagłówek filtru wartości odstających i dostosuj interwał uśredniania do jednego. Następnie, pod nagłówkiem progu, ustaw prędkość początkową na dwa punkty zerowe i dostosuj prędkość zatrzymania do jednego punktu siedem pięć.

Pod obliczeniem statystyk dla nagłówka zaznacz oba pola dotyczące ruchu i nieporuszania się. Następnie kliknij przycisk dodaj, a następnie w obszarze opcji wyników na pasku narzędzi eksploratora eksperymentów po lewej stronie ekranu kliknij pozycję Dane wyjściowe analizy. Teraz kliknij oblicz.

Po obliczeniu zmiennych zależnych kliknij przycisk eksportuj u góry ekranu. Wybierz folder docelowy w oknie dialogowym eksportu danych wyjściowych analizy, a następnie wybierz pozycję Excel z menu rozwijanego typu pliku. Następnie kliknij OK.

Na koniec kliknij Zapisz eksperyment na karcie plik u góry ekranu. Zamknij cyfrowe oprogramowanie śledzące. Zaimportuj dane do pliku arkusza kalkulacyjnego i przeanalizuj je za pomocą komercyjnego pakietu oprogramowania do analizy statystycznej.

Już po 72 godzinach ekspozycji na różne stężenia miedzi, dwa dni po wykluciu jesiotra wykazywał wiele obserwowalnych nieprawidłowości. Miało to oczywisty wpływ na zachowanie podczas pływania. Dane wideo pomogły w zdefiniowaniu tego zaburzenia behawioralnego.

W dalszych testach jesiotr po 30 dniach od wylęgu okazał się wrażliwy na 96-godzinną ekspozycję na miedź. Prędkość pływania, czas spędzony na poruszaniu się i przebyty dystans znacznie zmniejszyły się wraz ze wzrostem stężenia miedzi. Wraz ze wzrostem stężenia miedzi zmniejszały się również ścieżki pływackie.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo zachowanie w teście toksyczności. Technika ta może zapewnić menedżerom środowiskowym środki do stosowania kryteriów zdefiniowanych behawioralnie do dokumentowania szkód w środowisku i kierowania odbudową. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o konsekwencji w zapisywaniu obserwacji behawioralnych.

Inne zachowania, takie jak żerowanie i agresja, można określić ilościowo, postępując zgodnie z tą procedurą, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące długoterminowego wpływu narażenia na zanieczyszczenia na przeżycie.