Name: Kwantyfikacja zachowań ryb podczas pływania w odpowiedzi na ostre narażenie na wodną zawartość miedzi przy użyciu wspomaganego komputerowo wideo i cyfrowej analizy obrazu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 21 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji zachowań pływackich jesiotra białego (Acipenser transmontanus) przy narażeniu na miedź. Technika wideo umożliwia obiektywną ocenę toksyczności w ekotoksykologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy pracownikom Oddziału Ekologii, Oddziału Toksykologii i Oddziału Chemii Środowiskowej U.S. Geological Survey, Columbia Environmental Research Center za pomoc techniczną i analityczną. Finansowanie zapewnione częściowo przez Teck American Incorporated na podstawie umowy z Agencją Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych (USEPA) Region 10 ze środków przekazanych przez USEPA US Geological Survey (USGS) za pośrednictwem Departamentu Spraw Wewnętrznych Central Hazmat Fund.

<ol><li>Gerhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquatic+behavioral+ecotoxicology-prospects+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Ecol+Risk+Assess%3A+An+International+Journal%22%5BJournal%5D)">Aquatic behavioral ecotoxicology-prospects and limitations.</a> Hum Ecol Risk Assess: An International Journal. 13 (3), 481-491 (2007).</li>
<li>Beitinger, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+reactions+for+the+assessment+of+stress+in+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Great+Lakes+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral reactions for the assessment of stress in fishes.</a> J Great Lakes Res. 16, 495-528 (1990).</li>
<li>Beitinger, T. L., McCauley, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-animal+and+physiological+processes+for+the+assessment+of+stress+in+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Great+Lakes+Res%22%5BJournal%5D)">Whole-animal and physiological processes for the assessment of stress in fishes.</a> J Great Lakes Res. 16, 542-575 (1990).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Behavioural+Ecotoxicology%22">Behavioural Ecotoxicology</a>. Dell'Omo, G. , J Wiley & Sons. Chichester, UK. (2002).</li>
<li>Little, E. E., Finger, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swimming+behavior+as+an+indicator+of+sublethal+toxicity+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Toxicol+Chem%22%5BJournal%5D)">Swimming behavior as an indicator of sublethal toxicity in fish.</a> Environ Toxicol Chem. 9, 13-19 (1990).</li>
<li>Rand, G. M. Behavior. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRand%2C+GM+%22Fundamentals+of+Aquatic+Toxicology%3A+Methods+and+Applications%22">Fundamentals of Aquatic Toxicology: Methods and Applications</a>. Rand, G. M., Petrocelli, S. R. , Hemisphere Publishing. New York. 221-256 (1985).</li>
<li>Calfee, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+sensitivity+of+white+sturgeon+%28Acipenser+transmontanus%29+and+rainbow+trout+%28Onchorhynchus+mykiss%29+to+copper%2C+cadmium%2C+or+zinc+in+water-only+laboratory+exposures%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Toxicol+Chem%22%5BJournal%5D)">Acute sensitivity of white sturgeon (Acipenser transmontanus) and rainbow trout (Onchorhynchus mykiss) to copper, cadmium, or zinc in water-only laboratory exposures.</a> Environ Toxicol Chem. 33 (10), 2259-2272 (2014).</li>
<li>Little, E. E., Calfee, R. D., Linder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+smelter+slag-contaminated+sediments+from+Upper+Lake+Roosevelt+and+associated+metals+to+early+life+stage+White+Sturgeon+%28Acipenser+transmontanus+Richardson%2C+1836%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Ichthyol%22%5BJournal%5D)">Toxicity of smelter slag-contaminated sediments from Upper Lake Roosevelt and associated metals to early life stage White Sturgeon (Acipenser transmontanus Richardson, 1836).</a> J Appl Ichthyol. , 1-11 (2014).</li>
<li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+sensitivity+of+white+sturgeon+%28Acipenser+transmontanus%29+and+rainbow+trout+%28Onchorhynchus+mykiss%29+to+cadmium%2C+copper%2C+lead+or+zinc+in+water-only+laboratory+exposures%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Toxicol+Chem%22%5BJournal%5D)">Chronic sensitivity of white sturgeon (Acipenser transmontanus) and rainbow trout (Onchorhynchus mykiss) to cadmium, copper, lead or zinc in water-only laboratory exposures.</a> Environ Toxicol Chem. 33 (10), 2246-2258 (2014).</li>
<li>Little, E. E. Behavioral measures of injuries to fish and aquatic organisms: regulatory considerations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLittle%2C+EE+%22Behavioural+Ecotoxicology%22">Behavioural Ecotoxicology</a>. Dell'Omo, G. , J Wiley & Sons. Chichester, UK. 411-431 (2002).</li>
<li>Little, E. E., Brewer, S. K. Neurobehavioral toxicity in fish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLittle%2C+EE+%22Target+Organ+Toxicity+in+Marine+and+Freshwater+Teleosts+New+Perspectives%3A+Toxicology+and+the+Environment.+Volume+2%22">Target Organ Toxicity in Marine and Freshwater Teleosts New Perspectives: Toxicology and the Environment. Volume 2</a>. Schlenk, D., Benson, W. H. , Taylor and Francis. London and New York. 139-174 (2001).</li>
<li>Mount, D. I., Brungs, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+dosing+apparatus+for+fish+toxicological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">A simplified dosing apparatus for fish toxicological studies.</a> Water Res. 1, 21-29 (1967).</li>
<li>Standard guide for performing early life-stage toxicity tests with fishes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Annual.Book+of+ASTM+International+Standards.+Volume+11.06%22">Annual.Book of ASTM International Standards. Volume 11.06</a>. , ASTM International. West Conshohocken, PA. SOURCE: http://www.astm.org/Standards/E1241.htm (2014a) 1241-1305 (2013).</li>
<li>Standard guide for measurement of behavior during fish toxicity tests. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Annual.Book+of+ASTM+Standards.+Volume+11.06%22">Annual.Book of ASTM Standards. Volume 11.06</a>. , ASTM International. West Conshohocken, PA. SOURCE: http://www.astm.org/Standards/E1711.htm (2014b) 1711(2014).</li>
<li>Standard guide for conducting acute toxicity tests on test materials with fishes, macroinvertebrates, and amphibians. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Annual.Book+of+ASTM+Standards.+Volume+11.06%22">Annual.Book of ASTM Standards. Volume 11.06</a>. , ASTM International. West Conshohocken, PA. SOURCE: http://www.astm.org/Standards/E729.htm (2014c) 729-796 (2014).</li>
<li>Brunson,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+bioaccumulation+of+contaminants+from+sediments+from+the+upper+Mississippi+River+using+field-collected+oligochaetes+and+laboratory-exposed+Lumbriculus+variegatus%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Environ+ConTox%22%5BJournal%5D)">Assessing bioaccumulation of contaminants from sediments from the upper Mississippi River using field-collected oligochaetes and laboratory-exposed Lumbriculus variegatus.</a> Arch Environ ConTox. 5, 191-201 (1998).</li>
<li>Brumbaugh, W. G., May, T. W., Besser, J. M., Allert, A. L., Schmitt, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+elemental+concentrations+in+streams+of+the+New+Lead+Belt+in+southeastern+Missouri%2C+2002-05%5BTitle%5D)+AND+%22U.S.+Geological+Survey+Scientific+Investigations+Report+2007-5057%22%5BJournal%5D)">Assessment of elemental concentrations in streams of the New Lead Belt in southeastern Missouri, 2002-05.</a> U.S. Geological Survey Scientific Investigations Report 2007-5057. , (2007).</li>
<li>Kane, A. S., Salierno, J. D., Gipson, G. T., Molteno, T. C. A., Hunter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video-based+movement+analysis+system+to+quantify+behavioral+stress+responses+of+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">A video-based movement analysis system to quantify behavioral stress responses of fish.</a> Water Res. 38, 3993-4001 (2004).</li>
<li>Sprague, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoidance+of+Copper-Zinc+Solutions+by+Young+Salmon+in+the+Laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22JWater+Pollut+Control+Fed%22%5BJournal%5D)">Avoidance of Copper-Zinc Solutions by Young Salmon in the Laboratory.</a> JWater Pollut Control Fed. 36 (8), 990-1004 (1964).</li>
<li>Saunders, R. L., Sprague, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+copper-zinc+mining+pollution+on+a+spawning+migration+of+Atlantic+salmon%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of copper-zinc mining pollution on a spawning migration of Atlantic salmon.</a> Water Res. 1 (6), 419-432 (1967).</li>
<li>Barron, M. G. Environmental contaminants altering behavior. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarron%2C+MG+%22Behavioural+Ecotoxicology%22">Behavioural Ecotoxicology</a>. Dell'Omo, G. , Wiley & Sons. Chichester, UK. 167-186 (2002).</li>
<li>Ellgaard, E. G., Guillot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+the+swimming+behavior+of+bluegill+sunfish%2C+Lepomis+macrochirus+rafinesque%2C+exposed+to+copper%3A+hypoactivity+induced+by+sublethal+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fish+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of the swimming behavior of bluegill sunfish, Lepomis macrochirus rafinesque, exposed to copper: hypoactivity induced by sublethal concentrations.</a> J Fish Biol. 33, 601-608 (1998).</li>
<li>Drummond, R. A., Spoor, W. A., Olson, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+short-term+indicators+of+sublethal+effects+of+copper+on+brook+trout%2C+Salvelinus+fontinalis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fish+Res+Board+Can%22%5BJournal%5D)">Some short-term indicators of sublethal effects of copper on brook trout, Salvelinus fontinalis.</a> J Fish Res Board Can. 30, 698-701 (1973).</li>
<li>Hansen, J. A., Rose, J. D., Jenkins, R. A., Gerow, K. G., Bergman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chinook+salmon+%28Oncorhynchus+tshawytscha%29+and+rainbow+trout+%28Oncorhynchus+mykiss%29+exposed+to+copper%3A+neurophysiological+and+histological+effects+on+the+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Environl+Toxicol+Chem%22%5BJournal%5D)">Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) exposed to copper: neurophysiological and histological effects on the olfactory system.</a> Environl Toxicol Chem. 18, 1979-1991 (1999).</li>
<li>Sandahl, J. F., Baldwin, D. H., Jenkins, J. J., Scholz, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensory+system+at+the+interface+between+urban+stormwater+runoff+and+salmon+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">A sensory system at the interface between urban stormwater runoff and salmon survival.</a> Environ Sci Technol. 41 (8), 2998-3004 (2007).</li>
<li>McIntyre, J. K., Baldwin, D. H., Beauchamp, D. A., Scholz, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-level+copper+exposures+increase+visibility+and+vulnerability+of+juvenile+coho+salmon+to+cutthroat+trout+predators%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol+Appl%22%5BJournal%5D)">Low-level copper exposures increase visibility and vulnerability of juvenile coho salmon to cutthroat trout predators.</a> Ecol Appl. 22 (5), 1460-1471 (2012).</li>
<li>Green, W. W., Mirza, R. S., Wood, C. M., Pyle, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+binding+dynamics+and+olfactory+impairment+in+fathead+minnows+%28Pimephales+promelas%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Copper binding dynamics and olfactory impairment in fathead minnows (Pimephales promelas).</a> Environ Sci Technol. 44 (4), 1431-1437 (2010).</li>
</ol>

Jakiekolwiek użycie nazw handlowych, firm lub produktów służy wyłącznie celom opisowym i nie oznacza poparcia ze strony rządu Stanów Zjednoczonych.

Zmiany w zachowaniu spowodowane narażeniem na zanieczyszczenie są często wykorzystywane jako punkt końcowy dla toksyczności subletalnej, ale mogą być trudne do zmierzenia. Ogólnie rzecz biorąc, reakcje behawioralne są mierzone za pomocą obserwacji wizualnych i ręcznej analizy danych, która wymaga dużo czasu na przetworzenie. Jednak wraz z postępem technologicznym metody ilościowego określania aktywności pływackiej skupiły się na wykorzystaniu wideografii18 i analizy ruchu lub cyfrowego oprogramowania śledzącego, które skraca czas przetwarzania i analizy. Podczas analizy danych przechwyconych w formie wideo, ręczne określanie zmiennych pływania byłoby bardzo czasochłonne, dlatego wykorzystanie nagrań danych wideo i oprogramowania do śledzenia ryb zapewniło bardziej skuteczny i wydajny sposób analizy zachowania pływania jesiotra. Chociaż procedura podkreślała zachowanie ryb podczas pływania, dostosowanie do innych organizmów, takich jak i bezkręgowce wodne, wymagałoby prostych modyfikacji. W zależności od tego, jakie behawioralne punkty końcowe są rozwiązywane, można opracować eksperymentalne projekty i systemy kamer do użytku z niemal każdym dostępnym na rynku pakietem oprogramowania śledzącego.
Metodę demonstruje się przy użyciu rozpuszczonej miedzi, ale ma ona zastosowanie do innych zanieczyszczeń wodnych lub właściwości, takich jak temperatura lub zawartość tlenu. Protokoły opracowane i przedstawione w tym artykule wykorzystywały prostą cyfrową kamerę wideo jako urządzenie rejestrujące. Pliki cyfrowe można łatwo przenieść do komputera i przesłać do oprogramowania do analizy ruchu. Metody są stale modyfikowane i udoskonalane w celu usprawnienia procesu kwantyfikacji. Konieczne jest, aby jakość wideo była w wysokiej rozdzielczości, aby oprogramowanie analityczne mogło zidentyfikować każdą pojedynczą rybę do śledzenia. Każde tło, które nie kontrastuje z rybą, spowoduje problemy podczas próby przetworzenia plików danych. Innym częstym problemem związanym z dwuwymiarowym śledzeniem wideo jest identyfikacja osób, gdy ścieżki pływania się przecinają. Można to skorygować ręcznie, identyfikując każdą rybę podczas przekraczania ścieżki i łącząc odcinki ścieżki w oprogramowaniu. Alternatywnie, całkowita aktywność może być wyznaczona z każdej komory kontrprób jako średnia grupowa. W tym samym polu widzenia można sfilmować kilka oddzielnych komór, z których każda zawiera jedną rybę, aby obliczyć ruchy poszczególnych ryb.
Obecnie przeprowadziliśmy modernizację do korzystania z serii kamer monitorujących nad komorami naświetlania, które są połączone z cyfrowym urządzeniem do nagrywania wideo o wysokiej rozdzielczości (HD-DVR). Jednak użycie dowolnego systemu kamer, który może nagrywać filmy w wysokiej rozdzielczości MPEG-4, będzie działać. HD-DVR można ustawić na nagrywanie o określonej godzinie i zaprogramować na maksymalnie 7 dni. To zautomatyzowane podejście pozwala na przechwytywanie kilku filmów w tym samym czasie, aby zachować spójność, jednocześnie minimalizując zakłócenia zewnętrzne, które mogłyby zagrozić zachowaniu ryb. Rejestratory HD-DVR są podłączone do sieci wewnętrznej, dzięki czemu przesyłanie plików jest stosunkowo proste. Chociaż zautomatyzowany system kamer jest znacznie ulepszoną techniką ilościowego określania zachowań związanych z pływaniem, nadal korzystne jest prowadzenie obserwacji wizualnych, które służą jako dodatkowe informacje pomocnicze do dokumentowania upośledzenia behawioralnego podczas testów toksyczności.
Istnieje długa historia literatury dokumentującej zmienione zachowanie ryb wynikające z ekspozycji na metale, sięgająca wczesnych lat 60.19,20,21. Wykazano, że miedź powoduje zmiany w poziomie aktywności, takie jak hipoaktywność u bluegill22 (Lepomis macrochirus rafinesque) oraz zmiany w aktywności lokomotorycznej i żerowej pstrąga potokowego23 (Salvelinusfontinalis). Przynajmniej niektóre młode ryby polegają na swoim węchu w wykrywaniu i unikaniu drapieżników, a deprywacja chemosensoryczna wywołana miedzią może wpływać na zachowania związane z wykrywaniem alarmowych substancji chemicznych24,25,26. Nabłonek węchowy jest uszkodzony z powodu ekspozycji na miedź, wpływając w ten sposób na mechanizmy czuciowe, co może skutkować dezorientacją, unikaniem zachowań, zmniejszonym karmieniem i wszelkimi innymi zachowaniami, które są kierowane przez węch27. Te zmienione zachowania były zgodne z tym, co zaobserwowano podczas ekspozycji.
Pływanie jesiotra białego miało duży wpływ podczas subletalnej ekspozycji na wodne stężenia miedzi. Wyniki te ilustrują, w jaki sposób wpływa na zachowanie przy subletalnych stężeniach miedzi i mogą być wykorzystane jako wskaźnik stresu toksycznego. Analiza oparta na filmach okazała się skuteczna w ilościowym określaniu zachowań podczas pływania, a także posłużyła jako jakościowa dokumentacja wizualna poważnych skutków dla jesiotra narażonego na działanie miedzi. Oprogramowanie analityczne jest również w stanie określić ilościowo inne różne behawioralne punkty końcowe. Listę znajduje się w Tabeli 1 . System narażenia może być modyfikowany w celu uwzględnienia każdego punktu końcowego w trybie czasu rzeczywistego i może być używany do ilościowego określania różnic w zachowaniu związanym z narażeniem na różne niepokojące zanieczyszczenia.
Stosowanie behawioralnych punktów końcowych w wodnych badaniach toksykologicznych jest coraz częściej stosowane i powinno być brane pod uwagę przy ocenie skutków zanieczyszczeń, ponieważ adaptacyjne funkcje behawioralne mają kluczowe znaczenie w określaniu szkód środowiskowych9. Wpływ zanieczyszczeń środowiskowych na zachowanie ryb jest często subiektywny i trudny, szczególnie w przypadku subletalnych punktów końcowych przy braku standardowych metod.
Aktywność pływacka, określona ilościowo przy użyciu tych metod, może być rygorystycznie monitorowana, jest nieniszcząca przy minimalnym stresie dla organizmu i może być powtarzana. Zachowanie podczas pływania jest ważnym i spójnym wskaźnikiem toksyczności subletalnej, który powinien zostać włączony do protokołów badań w celu zwiększenia czułości standardowych testów toksyczności5.

Zrozumienie, jak narażenie na zanieczyszczenia może wpływać na zachowanie, jest czasami bardzo trudne i subiektywne. Zachowanie jest zwykle definiowane jako seria jawnych, obserwowalnych działań całego ciała, które działają przez ośrodkowy układ nerwowy i umożliwiają organizmowi przetrwanie, wzrost i rozmnażanie. Zmiany w zachowaniu spowodowane narażeniem na działanie substancji toksycznych są jednymi z najbardziej czułych wskaźników stresu środowiskowego, często od 10 do 100 razy bardziej wrażliwymi w porównaniu zprzeżyciem1. Większość z tych badań dotyczyła aktywności pływackiej, wentylacji i zachowań żywieniowych ryb2,3,4. Aktywność pływacka jest najczęściej stosowanym subletalnym punktem końcowym w określaniu zmiany zachowania w odpowiedzi na zanieczyszczenie w testach toksyczności5. Zmienne pływania obejmują częstotliwość i czas trwania ruchu, prędkość i przebyty dystans, częstotliwość i kąt skrętów, pozycję w słupie wody oraz wzorzec pływania. Aktywność pływacka jest skuteczną miarą zachowania podczas pływania przy ocenie wrażliwości na substancję toksyczną w oparciu o kryteria zaproponowane w rozdziale 9 przez Randa 6 w książce Fundamentals of Aquatic Toxicology.
Ten artykuł przedstawia badanie toksykologiczne jako przykład tego, jak oceniono toksyczność miedzi dla jesiotra białego (Acipenser transmontanus) we wczesnym stadium rozwoju w różnych stadiach wczesnego rozwoju w ekspozycjach tylko na wodę w stosunku do zachowania jesiotra podczas pływania i ilustruje metody ilościowego określania zachowania podczas pływania.
W poprzednich badaniach, niekorzystne reakcje behawioralne były widoczne już od kilku pierwszych dni ostrej i przewlekłej ekspozycji na miedź i stawały się stopniowo coraz bardziej dotkliwe wraz z czasem ekspozycji i stężeniem7,8,9. Skala i czas wystąpienia tych reakcji behawioralnych są prawdopodobnie wystarczające, aby ograniczyć długoterminowe przeżycie, a zatem budzą niepokój, biorąc pod uwagę implikacje dla niepowodzenia rekrutacji10. W celu dokładnej interpretacji znaczenia tej wrażliwości na narażenie na metale opracowano metody i procedury ilościowego określania czasu, przebiegu i zakresu zaburzeń zachowania w odniesieniu do stężeń miedzi.
Protokoły testowe dla funkcji behawioralnych i rozwoju zostały ustalone poprzez analizę próbek wideo jesiotra w komorach ekspozycyjnych. Próbki wideo dostarczyły jakościowej oceny rozwoju i funkcji wśród zabiegów miedziowych w całym okresie ekspozycji. Zachowanie i aktywność w poszukiwaniu schronienia oceniano podczas ekspozycji na wodne stężenia miedzi w celu określenia czasu do efektu i scharakteryzowania czasowej sekwencji upośledzenia, które wpływa na poszukiwanie schronienia, letarg, koordynację pływania, równowagę i oddychanie. Ponadto wykonano nagrania wideo jesiotra, w których pobrano podpróbki z każdej repliki w celu ilościowego udokumentowania spontanicznej aktywności pływackiej. Te punkty końcowe obejmowały pomiary czasu trwania lub czasu spędzonego na poruszaniu się, prędkości pływania i przebytej odległości5,11 przy użyciu dostępnego na rynku pakietu oprogramowania do cyfrowej analizy obrazu. To oprogramowanie definiuje kontur każdego obrazu w polu widzenia i na tej podstawie definiuje środek ciężkości dla każdego obrazu. Oprogramowanie może następnie śledzić położenie każdego środka ciężkości w sekwencji klatka po klatce, aby określić ścieżki ruchu.
To badanie było zgodne ze wszystkimi obowiązującymi sekcjami przepisów Ustawy o Dobrostanie Zwierząt (9 CFR) oraz ze wszystkimi wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi humanitarnego traktowania organizmów testowych podczas hodowli i eksperymentów. Po zakończeniu badania wszystkie ryby zostały poddane eutanazji zgodnie z odpowiednimi wytycznymi, zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt dla U.S. Geological Survey, Columbia Environmental Research Center.

<table><tbody><tr><td>pentahydrat siarczanu miedzi II</td> Niepokojące <td>zanieczyszczenie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>dozownik strzykawkowy</td><td>Hamilton MicroLab 600 Series</td><td></td><td>do kolby chemicznej</td></tr><tr><td>2 l kolba</td><td></td><td></td><td>miarowa pojemnik do przechowywania roztworu</td></tr><tr><td>podstawowego 24-1,5 l szklane słoiki</td> komora testowa <td></td><td></td> do kamery wideo z <td>jesiotrem 2 dph</td></tr><tr><td></td><td>Sony Handycam Cyfrowe oprogramowanie śledzące HDR-CX550V</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Noldus Ethovision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-17 "monitory</td><td></td><td></td><td></td>z płaskim ekranem</tr><tr><td>24 kamery monitorujące</td><td>Model CL101</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-16-kanałowe cyfrowe urządzenia</td><td></td><td></td><td></td>rejestrujące</tr><tr><td>Miernik tlenu rozpuszczonego</td><td>YSI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Orion 940</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sonda ph</td><td>Orion&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miernik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>amoniaku sonda amoniaku</td><td>agregat</td> chłodniczy <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> Orion <tr><td>pompa</td><td></td><td></td><td></td> recyrkulacyjna wody</tr></tbody></table>

kwantyfikacja zachowań ryb podczas pływania w odpowiedzi na ostre narażenie na wodną zawartość miedzi przy użyciu wspomaganego komputerowo wideo i cyfrowej analizy obrazu

Quantifying Fish Swimming Behavior in Response to Acute Exposure of Aqueous Copper Using Computer Assisted Video and Digital Image Analysis

Reakcje behawioralne organizmów wodnych na zanieczyszczenia środowiska mogą być prekursorami innych efektów, takich jak przetrwanie, wzrost lub rozmnażanie. Jednak odpowiedzi te mogą być subtelne, a pomiar może być trudny. Wykorzystując młodocianego jesiotra białego (Acipenser transmontanus) z ekspozycją na miedź, w artykule zilustrowano techniki stosowane do ilościowego określania reakcji behawioralnych za pomocą wspomaganego komputerowo wideo i cyfrowej analizy obrazu. W poprzednich badaniach zaobserwowano poważne upośledzenie zachowań związanych z pływaniem u jesiotra białego we wczesnym stadium życia, podczas ostrego i przewlekłego narażenia na miedź. Zachowanie jesiotra zostało szybko osłabione i do tego stopnia, że przetrwanie na polu byłoby zagrożone, ponieważ ryby zostałyby zmiecione w dół rzeki lub łatwo schwytane przez drapieżniki. Celem tego badania było zilustrowanie protokołów ilościowego określania aktywności pływackiej podczas serii ostrych ekspozycji na miedź, określenie czasu do efektu we wczesnym stadium rozwoju oraz zrozumienie znaczenia tych reakcji w odniesieniu do przeżywalności tych wrażliwych ryb we wczesnym stadium życia. Biorąc pod uwagę, że śmiertelność znajduje się w kontinuum czasowym, określenie, kiedy miedź po raz pierwszy wpływa na zdolność pływania, pomaga nam zrozumieć implikacje dla wpływu na poziomie populacji. Zastosowane techniki można łatwo dostosować do projektów eksperymentalnych z innymi organizmami i stresorami.

Ręczne przetwarzanie danych z obserwacji wizualnych wykazało, że odsetek nieprawidłowości wzrastał wraz ze zwiększaniem stężenia miedzi już po 72 hr ekspozycji rozpoczętej w 2. dniu po wykluciu (dph) jesiotrów (Rysunek 2). Próbki wideo udokumentowały ekstremalny wpływ ekspozycji na miedź na zachowanie pływackie jesiotrów (Wideo 2) i pomogły w zdefiniowaniu wynikających z tego zaburzeń behawioralnych. W innym przykładzie jesiotry w 30. dph okazały się wrażliwe na ekspozycję na miedź, przy czym 96-godzinne mediane stężenie letalne (LC50), oparte wyłącznie na śmiertelności, wyniosło 40,3 µg/L. Jednakże, gdy uwzględni się subletalne punkty końcowe zachowania, takie jak utrata równowagi i unieruchomienie, wraz ze śmiertelnością, wrażliwość wzrasta, a szacowane 96-godzinne mediane stężenie efektu (EC50) mieści się w zakresie od 2,4 do 5,0 µg/L. Dokumentacja wideo utrwaliła te efekty subletalne i dodatkowo potwierdziła ludzkie obserwacje nieprawidłowości behawioralnych zarejestrowanych podczas ekspozycji. Zastosowanie oprogramowania do cyfrowego śledzenia znacząco skróciło czas przetwarzania danych podczas analizy aktywności pływackiej. Prędkość pływania ryb, czas spędzony w ruchu oraz przebyta odległość uległy znacznemu zmniejszeniu (Rysunek 3) wraz ze wzrostem stężenia miedzi. Tor pływania również uległ skróceniu wraz ze wzrostem stężenia miedzi (Rysunek 4).
<img alt="Tabela przygotowania testu toksyczności chemicznej; zawiera wzór na rozcieńczenie i ustawienie stężenia docelowego." src="/files/ftp_upload/53477/53477fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Zrzut ekranu szablonu arkusza kalkulacyjnego służącego do wyznaczania stężenia roztworu stokowego do testu.Przygotowanie chemicznych roztworów stokowych do testów toksyczności dla rozcieńczalników zostało określone przy użyciu szablonu arkusza kalkulacyjnego w oparciu o stężenie docelowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat eksperymentu przedstawiający poziomy oczyszczania wody: kontrolny, niski, średni i wysoki w zbiornikach akwakulturowych." src="/files/ftp_upload/53477/53477fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Układ rozcieńcznika i plan eksperymentalny. Różne stadia rozwojowe jesiotra białego poddano działaniu miedzi. Wielkość rozcieńcznika użytego do ekspozycji została dobrana w zależności od rozmiaru ryb. (a) Jesiotry we wczesnym stadium rozwojowym poddano ekspozycji przy użyciu małego układu rozcieńcznika, a (b) jesiotry w starszym stadium rozwojowym przy użyciu dużego układu rozcieńcznika.
<img alt="Efekty toksyczności miedzi u ryb: wykresy słupkowe pokazują spadek czasu trwania, dystansu i prędkości ruchu." src="/files/ftp_upload/53477/53477fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wyniki zachowań pływackich jesiotra białego (Acipenser transmontanus) we wczesnym stadium rozwoju po 72-godzinnej ekspozycji na miedź (rozpoczętej w 30. dniu po wykluciu [dph]). Parametry aktywności pływackiej u jesiotra białego w 30 dph: (a) czas trwania ruchu; (b) prędkość pływania; oraz (c) przebyta odległość uległy zmniejszeniu wraz ze wzrostem stężenia miedzi u ryb eksponowanych przez 96 hr. Gwiazdka oznacza istotną różnicę względem kontroli, słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe.
<img alt="Wpływ toksyczności miedzi na zachowanie; wykres słupkowy; stężenie miedzi vs procent nieprawidłowego zachowania." src="/files/ftp_upload/53477/53477fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Wyniki 96-godzinnej ekspozycji na miedź u białego jesiotra (Acipenser transmontanus) we wczesnym stadium życia (rozpoczętej u ryb 2 dni po wykluciu [dph]). Przeżyły osobniki białego jesiotra w 2 dph wykazujące utratę równowagi i unieruchomienie po 72 h z 96-godzinnej ekspozycji przy rosnącym stężeniu miedzi. Gwiazdka oznacza istotną różnicę w stosunku do grupy kontrolnej, słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe.
<img alt="Ścieżki pływania białego jesiotra, grupa kontrolna i grupa z wysoką dawką Cu, schemat eksperymentalny, analiza behawioralna." src="/files/ftp_upload/53477/53477fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Przykładowe wyniki ścieżek pływania białego jesiotra (Acipenser transmontanus) we wczesnej fazie życia po 96-godzinnej ekspozycji na miedź (rozpoczętej w 30. dniu po wykluciu [dph]). Ścieżki pływania jesiotrów zdigitalizowane za pomocą oprogramowania do śledzenia cyfrowego z (a) powtórzenia kontrolnego (n = 5 ryb) oraz (b) z powtórzenia z wysokim stężeniem (50 µg/L) (n = 3 ryby) po 96-godzinnej ekspozycji. Należy zauważyć, że liczba ścieżek pływania nie odpowiada liczbie ryb znajdujących się w komorze, ponieważ niektóre ryby były nieaktywne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametr mierzalny</td>
			<td>Parametry obserwacyjne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prędkość</td>
			<td>Letarg/Nadaktywność</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dystans pokonany</td>
			<td>Utrata równowagi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czas przebywania w strefie</td>
			<td>Skurcze/drżenia/pozycja odwrócona</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przejście między strefami – liczba przejść organizmu między wybranymi strefami</td>
			<td>Położenie w kolumnie wody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kierowanie do punktu – oblicza odchylenie ścieżki zwierzęcia w kierunku punktu zainteresowania</td>
			<td>Oddychanie (szybkie/wolne)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heading oblicza kurs wybranego punktu ciała</td>
			<td>Barwienie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Różnica kątowa w kierunku poruszania się między dwiema próbkami</td>
			<td>Ukrywanie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prędkość kątowa – obliczana poprzez podzielenie kąta obrotu przez interwał próbkowania</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meander – obliczany poprzez podzielenie kąta skrętu przez przebytą odległość. Stosowany do porównywania skręcania u zwierząt poruszających się z różnymi prędkościami.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czas spędzony w ruchu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stan mobilności – oblicza czas trwania zmian w całym obszarze wykrytym jako zwierzę, nawet jeśli punkt centralny pozostaje bez zmian</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotacja – jeden obrót uznaje się za ukończony, gdy wybrany punkt ciała osiągnie skumulowany kąt obrotu wynoszący 360°Zwroty w przeciwnym kierunku o wartości mniejszej niż wartość progowa są pomijane.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobilność ciągła – oblicza procent mobilności dla całego obszaru wykrytego zwierzęcia, nawet jeśli punkt centralny pozostaje niezmienny.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odległość między obiektami – oblicza odległość między wszystkimi aktorami a wybranymi odbiornikami</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bliskość – oblicza czas, w którym aktor znajduje się lub nie znajduje się w pobliżu odbiornika</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruch względny</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ważony ruch netto – ruch aktora w kierunku (wartość dodatnia) lub od (wartość ujemna) odbiorcy, ważony odległością między nimi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Obciążony ruch oddalający – ruch aktora od odbiorcy, obciążony odległością między nimi.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ważony ruch do – ruch aktora w stronę odbiorcy, ważony odległością między nimi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stan kontrolny próby – okres między dwoma zdarzeniami elementów kontroli próby lub w obrębie jednego elementu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moment zdarzenia sterowania próbą – moment, w którym wewnątrz zdefiniowanego elementu w Sterowaniu próbą (Trial Control) występuje zdarzenie.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Punkty końcowe behawioralne ilościowane za pomocą oprogramowania do śledzenia cyfrowego. Punkty końcowe te mogą być stosowane w odniesieniu do osobników lub grup, a także służyć jako lista do wizualnej oceny zaburzeń behawioralnych podczas ekspozycji.
<img alt="Ryba pływająca w akwarium; obserwacja zachowania i ruchu w środowisku wodnym." src="/files/ftp_upload/53477/53477movie1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Wideo 1"> 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video1.avi">Wideo 1: Wizualna definicja nieprawidłowego zachowania wykazywanego przez dotknięte jesiotura białego. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać)</a> Do dokumentowania nieprawidłowości wykorzystano codzienną listę kontrolną obserwacji. Utrata równowagi oraz unieruchomienie były najczęściej obserwowanymi nieprawidłowościami podczas ekspozycji. Opracowano na podstawie Calfee et al.7
<img alt="Zachowanie organizmu wodnego w szalce Petriego; układ eksperymentalnego badania wodnego; analiza ruchu." src="/files/ftp_upload/53477/53477movie2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Wideo 2"> 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video2.avi">Wideo 2: Dokumentacja wizualna przedstawiająca przykład zachowania pływackiego jesiotra białego. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać)</a> Aktywność pływacka jesiotra białego została znacznie ograniczona pod wpływem rosnącego stężenia miedzi. Jesiotry przedstawione w tym filmie pochodzą z grupy kontrolnej oraz grup poddanych średnio niskiej i wysokiej dawce miedzi po zakończeniu 96-godzinnej ekspozycji w środowisku wodnym. Mimo że jesiotry białe wciąż żyły, ewidentne jest, że ryby w grupach badawczych były w znacznie gorszym stanie niż w grupie kontrolnej. Zmodyfikowano na podstawie Calfee et al.7

Mierzenie wpływu zanieczyszczeń środowiska na zachowanie ryb jest często subiektywne i trudne, szczególnie gdy mamy do czynienia z subletalnymi punktami końcowymi. Opisujemy metody, w tym technologię wideo, do ilościowego określania zachowania pływackiego jesiotra białego (Acipenser transmontanus) we wczesnym stadium życia podczas i po 96-godzinnej ostrej ekspozycji na różne stężenia miedzi.

Kwantyfikacja zachowań ryb podczas pływania w odpowiedzi na ostre narażenie na wodną zawartość miedzi przy użyciu wspomaganego komputerowo wideo i cyfrowej analizy obrazu

Behavioral responses of aquatic organisms to environmental contaminants can be precursors of other effects such as survival, growth, or reproduction.  ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie sposobu ilościowego określania reakcji behawioralnych jesiotra białego w odpowiedzi na pod subletalną ekspozycję na miedź w środowisku wodnym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu ekotoksykologii, takie jak wpływ pod subletalnej ekspozycji na zanieczyszczenia na zachowanie pływackie ryb. Metoda ta może dostarczyć istotnych informacji dla ochrony jesiotra białego.Metodę tę można również z łatwością zastosować do innych gatunków ryb, płazów oraz bezkręgowców. Główną zaletą tej techniki jest wysoka czułość odpowiedzi, która zapewnia wczesną sygnalizację toksyczności i ma istotne znaczenie dla przeżywalności organizmów. Początkowo metoda ta może być wymagająca dla osób nieposiadających doświadczenia w pomiarach behawioralnych.Protokół zaprezentuje moja współautorka Holly Puglis. Najpierw należy przygotować dwa litry wodnego roztworu siarczanu(II) miedzi(II) pięciowodnego o czystości reagentowej. Następnie należy zrównoważyć system rozcieńczania oraz zbiorniki ekspozycyjne.Umieść rurkę ssącą automatycznego dozownika strzykawkowego w kolbie z roztworem zapasowym. Następnie ustaw objętość dozowania automatycznej pompy na 1 ml i włącz rozcieńczalnik. System przygotuje serię pięciu rozcieńczeń 50% oraz próbkę kontrolną.Za pomocą rozdzielacza czterodrożnego roztwory te są dostarczane do czterech powielonych komór ekspozycyjnych. Następnie włącz pompę chłodziarki ustawionej na utrzymywanie kąpieli wodnej w temperaturze 15 °C. Teraz, korzystając z automatycznego timera w rozcieńczalniku, ustaw go na cykl co 30 minut.Poziom wody w zbiornikach jest utrzymywany przez rurę przelewową. Przygotuj komory ekspozycyjne, wykonując w boku otwór o średnicy czterech centymetrów i zakrywając go siatką ze stali nierdzewnej o oczkach 30 micron.Na przykład 89-dniowy jesiotr biały waży około 373 mg, zatem może być badany w kwadratowej komorze o wymiarach 28 cm na 13,5 cm na 25 cm. Na początku, w połowie oraz pod koniec eksperymentu należy pobrać próbki roztworu testowego o objętości 24 ml do analizy chemicznej. W tym celu należy użyć rurek pobierających przymocowanych do plastikowych strzykawek.Zastąp rurkę ssącą filtrem z polietersulfonu o porach 0,45 µm i przepuść przez filtr 4 mL wody testowej. Wodę tę należy zutylizować. Następnie przefiltruj pozostałe 20 mL wody do butelki polietylenowej oczyszczonej kwasem.Zakwasz próbkę 16 M kwasem azotowym do stężenia 1% objętościowo. Takie próbki można przechowywać do trzech miesięcy. Po potwierdzeniu ekspozycji testowych, umieść trzy jesiotry w każdej powtórzonej komorze testowej, tak aby uzyskać około 172 mg ryb na litr objętości komory.Odłów jesiotry za pomocą nieściernej sieci i przenieś je do małego wiadra. W sumie potrzeba 144 ryb, aby zebrać dane z sześciu roztworów testowych. Podczas 96 godzinnej ekspozycji nie karm ryb.Należy prowadzić systematyczne codzienne obserwacje w celu oceny śmiertelności oraz nieprawidłowych zachowań. Najlepszą porą dnia na wykonanie tych czynności jest poranek, a najlepiej, jeśli obserwator nie zna warunków testowych. Utratę równowagi definiuje się jako niezdolność ryb do utrzymania pionowej pozycji w kolumnie wody.Unieruchomienie definiuje się jako niezdolność ryb do poruszania się lub pływania, chyba że zostaną sprowokowane. Należy również odnotować wszelkie inne nieprawidłowości, takie jak letarg, nadaktywność, zwiększenie lub zmniejszenie częstotliwości oddychania, zmiany ubarwienia, drżenia, skurcze, wzdęcia brzucha, położenie w kolumnie wody oraz wszelkie inne nietypowe wzorce pływania. Martwe ryby należy zawsze bezzwłocznie usunąć.Każdego dnia należy również zmierzyć poziom tlenu rozpuszczonego w dwóch próbkach wody za pomocą przenośnego miernika. Po zakończeniu 96-godzinnej ekspozycji należy nagrać filmy do analizy zachowań pływackich. Arenę testową należy umieścić w zbiorniku ekspozycyjnym.Należy upewnić się, że wybrana arena testowa jest wystarczająco duża, aby ryby mogły swobodnie pływać. Bezpośrednio nad każdą areną testową należy ustawić przenośną kamerę wideo na statywie. Następnie z grupy ryb poddanych działaniu preparatu należy losowo wybrać do trzech osobników, które przeżyły.Przenieś trzy osobniki do areny testowej za pomocą małej siatki. Pozostaw ryby w arenie na około 30 minut w celu aklimatyzacji. Podczas aklimatyzacji ryb ustaw ostrość obrazu, zminimalizuj zniekształcenia spowodowane odblaskami od poruszającej się wody oraz zmaksymalizuj kontrast ryb na tle, dostosowując widok tak, aby ryby nie były przysłonięte.Po aklimatyzacji ryby rozpocznij nagrywanie i zbierz dwuminutowy materiał wideo. Po zakończeniu nagrania uśmierć rybę i zutylizuj ją. Po przekonwertowaniu plików wideo do formatu wymaganego przez oprogramowanie do analizy cyfrowej, otwórz program do śledzenia i wybierz nową konfigurację domyślną eksperymentu w opcji utworzenia nowego eksperymentu na ekranie głównym.Wypełnij pola w oknie zapytań i zatwierdź przyciskiem OK. Następnie przejdź do opcji ustawień eksperymentu w sekcji konfiguracji i wybierz plik wideo w źródle wideo. Ustaw liczbę aren na jedną.Ustaw liczbę osobników na arenę na trzy. Następnie w sekcji śledzonych cech wybierz detekcję punktu centralnego i wybierz odpowiednie jednostki. Teraz w ustawieniach wybierz opcję listy prób i kliknij dodaj filmy u góry ekranu.W oknie dialogowym wybierz kolejność alfabetyczną. Kliknij Przeglądaj. Przejdź do folderu, w którym znajdują się pliki wideo, zaznacz odpowiednie pliki i kliknij Otwórz.Po wybraniu plików wideo należy zdefiniować zakres eksperymentu w oprogramowaniu. Najpierw kliknij „add variable” u góry ekranu i wpisz „concentration” w polu etykiety. W polu opisu wpisz „copper concentration in micrograms per liter”.Następnie z listy rozwijanej w polu typ wybierz wartość numerical. Kliknij pole pre-defined values, a następnie z okna dialogowego wybierz opcję define individual values. Wpisz stężenia użyte w eksperymencie, klikając add po wprowadzeniu każdej kolejnej liczby.Następnie odznacz opcję zezwalaj na inne wartości i kliknij OK. Z menu rozwijanego w polu zakres wybierz próbę. W odpowiednich polach wpisz właściwe stężenie dla każdej próby.Kliknij dodaj zmienną na górze ekranu. W polu etykiety wpisz replicate. W polu opisu wpisz numer powtórzenia.Z listy rozwijanej w polu typu wybierz opcję numerical. Następnie kliknij pole pre-defined values i w oknie dialogowym wybierz opcję define individual values. Wprowadź wartości jeden, dwa, trzy i cztery, a następnie odznacz opcję allow other values.Następnie kliknij OK. Teraz z menu rozwijanego w polu zakresu wybierz opcję próby. Wprowadź odpowiednią liczbę powtórzeń dla każdej próby.Kolejnym zadaniem jest przygotowanie przestrzeni areny. Należy rozpocząć od wybrania ustawień areny w zakładce set up i nazwać pierwsze ustawienie jako trial one. Z okna dialogowego należy wybrać opcję grab background image i kliknąć browse.Zlokalizuj plik wideo dla pierwszej próby i kliknij otwórz. Po pojawieniu się filmu kliknij przycisk grab w oknie dialogowym grab background image. Następnie kliknij ikonę białego koła w górnej części ekranu w sekcji arena settings i dostosuj pojawiły się okrąg tak, aby otaczał obszar pływania.Następnie kliknij ikonę skali kalibracyjnej w ustawieniach areny. Używając ruchu kliknij-przytrzymaj-przeciągnij, zaznacz obszar areny. Teraz w polu rzeczywistej odległości w sekcji odległości kalibracyjnej wpisz 10,5.Następnie kliknij OK. W razie potrzeby skoryguj linię kalibracyjną tak, aby obejmowała ona całą średnicę kolistej areny. Kliknij opcję walidacji ustawień areny w oknie ustawień areny i rozwiąż wszelkie problemy z ustawieniami, które nie zostały zwalidowane.Teraz powtórz ten proces, aż wszystkie areny zostaną zdefiniowane dla każdej próby. Następnie ustaw parametry wykrywania ryb. W pierwszej kolejności wybierz ustawienia wykrywania w opcji konfiguracji z paska narzędzi eksploracji eksperymentu po lewej stronie ekranu.Następnie z menu rozwijanego w sekcji method w oknie ustawień detekcji one należy wybrać dynamic subtraction. W tym samym oknie, w sekcji subject identification, należy przypisać kolor wypełnienia dla każdego badanego. Następnie należy wybrać select video i zlokalizować plik wideo dla próby one.W oknie ustawień wykrywania (detection settings) w polu częstotliwości próbkowania (sample rate) w sekcji wideo wpisz wartość 5,9941. W tym samym oknie kliknij ustawienia (settings) dla opcji obrazu referencyjnego (reference image) w sekcji wykrywania (detection). Następnie w oknie dialogowym obrazu referencyjnego kliknij opcję rozpocznij naukę C (start learning C).Gdy obraz w oknie dialogowym obrazu referencyjnego pojawi się bez zwierząt, kliknij „use dynamic reference image” w sekcji ustawień akwizycji (acquisition settings) wewnątrz okna dialogowego, a następnie zamknij to okno. Teraz, z menu rozwijanego dla opcji „subject is” w sekcji wykrywania (detection) w oknie dialogowym ustawień wykrywania 1, wybierz „darker”. Dla kontrastu ciemnego (dark contrast) w sekcji wykrywania ustaw mniejszą wartość na 33, a większą na 153.Następnie kliknij zapisz zmiany w prawym dolnym rogu. Teraz potwierdź, że oprogramowanie prawidłowo śledzi zwierzęta, a nie cienie lub zanieczyszczenia. Kliknij przycisk odtwarzania w oknie sterowania odtwarzaniem i w razie potrzeby dostosuj wartości kontrastu ciemnego.Należy pamiętać o zapisaniu wszystkich wprowadzonych zmian. Oprogramowanie jest teraz skonfigurowane do zbierania danych z filmu, więc kolejnym zadaniem jest śledzenie ryb w każdej próbie. Najpierw wybierz opcję acquisition (pozyskiwanie) w menu setup (konfiguracja) z paska narzędzi experiment explorer po lewej stronie ekranu.Następnie w oknie dialogowym ustawień akwizycji kliknij śledź następną planowaną próbę (track next planned trial) i upewnij się, że w sekcji ustawień w tym samym oknie wyświetlają się poprawne wartości dla próby, wideo oraz areny. Następnie w oknie dialogowym sterowania akwizycją zaznacz opcję wykrywanie określa prędkość (detection determines speed). Kliknij przycisk z zielonym kółkiem w białym kwadracie, aby rozpocząć proces akwizycji.Powtarzaj ten proces, aż wszystkie próby zostaną prześledzone. Teraz można przeanalizować śledzone obiekty, którymi są ryby. Najpierw kliknij profile danych (data profiles) w opcji analizy w pasku narzędzi eksploratora eksperymentu po lewej stronie ekranu.Następnie w pasku narzędzi komponentów w opcji gniazdowania (nesting) wybierz czas (time). W oknie dialogowym czasu, w ustawieniu wyboru przedziału czasowego ścieżki (select track time interval), zmień wartość do (to) na dwie minuty i kliknij OK. Następnie przeciągnij pole gniazdowania (nest box) pomiędzy pole start (start box) a pole result one (result one box) w obszarze profili danych po prawej stronie ekranu.Z paska narzędzi eksploratora eksperymentów po lewej stronie ekranu, w opcji analizy wybierz profil analizy. Następnie na pasku narzędzi zmiennych zależnych, w sekcji dystans i czas, kliknij prędkość. Kliknij dodaj, a następnie w sekcji dystans i czas na pasku narzędzi zmiennych zależnych kliknij pokonany dystans.Następnie kliknij dodaj w oknie dialogowym dystansu przebytego, a w pasku narzędzi zmiennych zależnych, w sekcji zachowania indywidualnego, kliknij ruch. W oknie dialogowym ruchu przejdź do sekcji filtru wartości odstających i ustaw interwał uśredniania na jeden. Następnie, w sekcji progu, ustaw prędkość początkową na dwa przecinek zero zero oraz prędkość końcową na jeden przecinek siedem pięć.W sekcji obliczania statystyk zaznacz oba pola dla ruchomych i nieruchomych. Następnie kliknij dodaj, a w opcjach wyników na pasku narzędzi eksploratora eksperymentów po lewej stronie ekranu kliknij wyjście analizy. Teraz kliknij oblicz.Po obliczeniu zmiennych zależnych kliknij przycisk export w górnej części ekranu. W oknie dialogowym eksportu wyników analizy wybierz folder docelowy, a z rozwijanego menu typów plików wybierz Excel. Następnie kliknij okay.Na koniec kliknij zapisz eksperyment w karcie plik u góry ekranu. Zamknij oprogramowanie do śledzenia cyfrowego. Zaimportuj dane do pliku arkusza kalkulacyjnego i przeanalizuj je za pomocą komercyjnego pakietu oprogramowania do analizy statystycznej.Już po 72 godzinach ekspozycji na różne stężenia miedzi u jesiotrów w drugim dniu po wykluciu zaobserwowano liczne anomalie. Wyraźny wpływ odnotowano w zachowaniu pływackim. Dane wideo pomogły w zdefiniowaniu tego upośledzenia behawioralnego.W dalszych testach wykazano, że jesiotry w 30. dniu po wykluciu są wrażliwe na 96-godzinną ekspozycję na miedź. Prędkość pływania, czas spędzony w ruchu oraz przebyta odległość uległy znacznemu zmniejszeniu wraz ze wzrostem stężeń miedzi. Długość ścieżek pływania również uległa skróceniu wraz ze wzrostem stężeń miedzi.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak kwantyfikować zachowanie w teście toksyczności. Technika ta może zapewnić kierownikom ds. środowiska sposób wykorzystania kryteriów zdefiniowanych behawioralnie do dokumentowania szkód środowiskowych i kierowania procesem rekultywacji. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby zachować spójność w rejestrowaniu obserwacji behawioralnych.Inne zachowania, takie jak żerowanie i agresja, można skwantyfikować, postępując zgodnie z tą procedurą, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące długoterminowego wpływu narażenia na zanieczyszczenia na przeżywalność.

quantifying-fish-swimming-behavior-response-to-acute-exposure-aqueous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opracowaliśmy metodę odpowiedzi wizualno-motorycznej (Visual-Motor Response), aby ilościowo określić reakcję motoryczną larw zebrafish w odpowiedzi na przyrosty i spadki natężenia światła. Zbadaliśmy również mutanty wzroku zebrafish, w tym mutanty z brakiem odpowiedzi optokinetycznej (nrc), które uznano za całkowicie niewidome podczas testowania za pomocą innego badania wzroku – odruchu optokinetycznego.

Test behawioralny do pomiaru reaktywności rybek zebrafish na zmiany natężenia światła

Życie większości ryb opiera się na pływaniu. Niniejszy protokół opisuje techniki rejestrowania różnych sposobów pływania dostępnych dla pojedynczych osobników oraz ławic ryb, a także zawiera mierniki związane z fizjologią i zachowaniem podczas pływania.

Ocena wydajności pływania u ryb

W niniejszej pracy opisujemy nowatorski wysokoprzepustowy test chemicznie indukowanego stanu zapalnego, którego celem jest identyfikacja bioaktywnych substancji immunomodulujących. Skutecznie połączyliśmy zautomatyzowaną mikroskopię z autorskimi skryptami oprogramowania, co umożliwia automatyczną kwantyfikację odpowiedzi zapalnej, a także dalsze przetwarzanie, analizę, wydobywanie i przechowywanie danych.

Usprawnianie odkrywania leków: zautomatyzowany wysokotreściowy test stanu zapalnego u rybek danio pręgowanych

Film opisuje unikanie i testowanie metodą thigmotaxis larw danio pręgowanego. Film bada zachowanie larw danio pręgowanego w odpowiedzi na wizualny bodziec awersyjny.

Test unikania danio pręgowanego i thigmotaxsji: wysokoprzepustowa metoda badania zachowania larw w odpowiedzi na awersyjny bodziec wzrokowy

Opisujemy zestaw technik do badania spontanicznego zachowania swobodnie pływających ryb o słabo elektrycznym okresie czasu, poprzez synchroniczny pomiar czasu wyładowania elektrycznego zwierzęcia, pozycji ciała i postawy zarówno dokładnie, jak i niezawodnie w specjalnie zaprojektowanym zbiorniku akwariowym wewnątrz sensorycznej komory izolacyjnej.

Długoterminowe śledzenie behawioralne swobodnie pływających ryb o słabym natężeniu elektryczności

Danio pręgowany to doskonały model do badania funkcji mięśni i chorób. Podczas wczesnej embriogenezy danio pręgowany rozpoczyna regularne skurcze mięśni, powodując rytmiczne zachowanie podczas pływania, które zmienia się, gdy mięsień jest zakłócony. W tym miejscu opisujemy reakcję wywołaną dotykiem i test lokomocji, aby zbadać wydajność pływania jako miarę funkcji mięśni.

Wykorzystanie reakcji wywołanej dotykiem i testów lokomocji do oceny wydajności i funkcji mięśni u danio pręgowanego

W tej pracy opisujemy ostry, przewlekły i wielopokoleniowy test biologiczny, aby zbadać wpływ pojedynczych i połączonych stresorów na turkusową karpię Nothobranchius furzeri. Protokół ten ma na celu badanie cech historii życia (śmiertelność, wzrost, płodność, waga) i krytycznego maksimum termicznego.

Protokół badania ostrej i przewlekłej ekotoksyczności turkusowej Killifish Nothobranchius furzeri

Tutaj prezentujemy protokół do badania aktywności lokomotorycznej larw danio pręgowanego i strzebli grubogłowych oraz reakcji fotomotorycznych (PMR) za pomocą automatycznego oprogramowania śledzącego. Po włączeniu do powszechnych testów biologicznych toksykologicznych, analizy tych zachowań stanowią narzędzie diagnostyczne do badania bioaktywności chemicznej. Protokół ten jest opisany przy użyciu kofeiny, modelowego neurostymulantu.

Eksperymentalny protokół badania profili reakcji behawioralnych u larw ryb: zastosowanie do neurostymulantu kofeiny

Tutaj prezentujemy metody wysokoprzepustowego badania szeregu zachowań meksykańskich ryb jaskiniowych i istotnego barwienia systemu mechanosensorycznego. Metody te wykorzystują wolne oprogramowanie i niestandardowe skrypty, zapewniając praktyczną i opłacalną metodę badania zachowań.

Śledzenie behawioralne i obrazowanie neuromastu meksykańskich ryb jaskiniowych

Zdolny do funkcjonalnego powrotu do zdrowia po urazie rdzenia kręgowego, dorosły danio pręgowany jest głównym modelowym systemem do wyjaśnienia wrodzonych mechanizmów regeneracji neuronów. Tutaj opisujemy testy wytrzymałości pływackiej i zachowania podczas pływania jako funkcjonalne odczyty regeneracji rdzenia kręgowego.

Ocena wytrzymałości pływackiej i zachowań związanych z pływaniem u dorosłych danio pręgowanego

Zadania preferencji społecznych wielokomorowych zostały dostosowane od szczurów do rybek zebra, ułatwiając badania nad zachowaniami społecznymi w organizmach modelowych. Ten protokół waliduje niskobudżetowe zadanie trójkomorowe z otwartym zbiornikiem przy użyciu kamer internetowych i oprogramowania open-source w celu zmierzenia preferencji społecznych rybek zebra, czyniąc je dostępnymi dla badań i nauczania na poziomie licencjackim.

Niedroga alternatywa do badania preferencji społecznych u Danio pręgowanego (Danio rerio) przy użyciu zadania wolnego pływania w trzykomorowym otwartym zbiorniku

Poznaj metodę kwantyfikacji zachowań pływackich jesiotra białego (Acipenser transmontanus) przy narażeniu na miedź. Technika wideo umożliwia obiektywną ocenę toksyczności w ekotoksykologii.

Kwantyfikacja zachowań ryb podczas pływania w odpowiedzi na ostre narażenie na wodną zawartość miedzi przy użyciu wspomaganego komputerowo wideo i cyfrowej analizy obrazu (Wideo) | JoVE Journal

Kwantyfikacja zachowań ryb podczas pływania w odpowiedzi na ostre narażenie na wodną zawartość miedzi przy użyciu wspomaganego komputerowo wideo i cyfrowej analizy obrazu

Przeglądaj więcej filmów