Izolacja określonych regionów genomu i identyfikacja powiązanych cząsteczek za pomocą enChIP

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie określonego regionu genomowego z zachowaniem interakcji molekularnych w celu identyfikacji cząsteczek oddziałujących z regionem genomu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania w dziedzinach funkcji genomicznych, takich jak transkrypcja i regulacja epigenetyczna. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona bezpośrednią identyfikację cząsteczek oddziałujących z określonym regionem genomu.

Procedurę zademonstruje Toshitsugu Fujita, adiunkt z mojego laboratorium. Postępując zgodnie z protokołem tekstowym, zaprojektuj interesujące Cię cząsteczki wiążące DNA. Pociąga to za sobą wygenerowanie interesującej sekwencji gBlock i wstawienie jej do retrowirusa, na przykład w celu wytworzenia przewodnika RNA skompleksowanego z trzema FLAG-dCas9.

Alternatywnie można wygenerować trzy białka FLAG-TAL rozpoznające sekwencję docelową. Następnie, zgodnie z protokołem tekstowym, zainfekuj komórki przygotowanym retrowirusem. Potwierdź ekspresję zmodyfikowanych cząsteczek wiążących DNA i ustal linię komórkową.

Teraz kontynuuj sieciowanie komórek formaldehydem. Zawiesić 20 milionów transfekowanych komórek w 30 mililitrach zwykłej pożywki hodowlanej i dodać 810 mikrolitrów 37% formaldehydu, aby uzyskać końcowe stężenie 1%Inkubować mieszaninę przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po pięciu minutach zabij reakcję sieciowania, dodając 3,1 mililitra glicyny o sile 1,25 molowej.

Pozostaw komórki w temperaturze pokojowej na 10 minut przed kontynuowaniem. Następnie odwirować probówkę komórkową o sile 300 G przez pięć minut w wirówce z chłodzeniem. Ostrożnie wyrzucić supernatant i umyć osad komórkowy w 30 mililitrach PBS, mieszając i odwirowując.

Wykonaj dwa mycia PBS. W razie potrzeby umyte osady z komórek stałych można przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Kontynuując, zbierz chromatynę z komórek.

Zawieś je w 10 mililitrach buforu do lizy i inkubuj na lodzie przez 10 minut. Następnie, za pomocą wirówki z chłodzeniem, zebrać komórki i ostrożnie wyrzucić supernatant. Teraz zawieś osad komórkowy w buforze do lizy jądrowej i inkubuj go na lodzie przez 10 minut.

Co kilka minut podczas inkubacji krótko wirować mieszaninę. Ponownie zbierz komórki przez odwirowanie. Teraz umyj granulkę 10 mililitrami PBS i usuń roztwór myjący za pomocą kolejnego wirowania.

W ten sposób powstaje frakcja chromatyny, która w razie potrzeby może być błyskawicznie zamrażana i przechowywana w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Kontynuuj, zawieszając osad chromatyny w 800 mikrolitrach zmodyfikowanego buforu do lizy trzy i przenieś zawiesinę do mniejszej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Teraz włącz sondę sonikacyjną na trzecim poziomie mocy z ciągłą pracą.

Aby rozdrobnić chromatynę, ręcznie przełączaj się między 10 sekundami sonikacji a 20 sekundami na lodzie. W każdym 5. lub 6. cyklu wydłużaj fazę lodową do dwóch minut, aby próbka się nie przegrzała. Wykonaj ten cykl sonikacji od 10 do 18 razy, trzymając końcówkę sondy z dala od dna probówki, aby uniknąć spienienia próbki.

Po sonikacji pobrać próbkę za pomocą szybkiego wirowania z chłodzeniem. Następnie przenieść supernatant zawierający rozdrobnioną chromatynę do nowej probówki i wyrzucić osad. Zapoznaj się z protokołem tekstowym, aby dowiedzieć się, jak ocenić fragmentację.

Aby przygotować się do immunoprecypitacji, najpierw skoniuguj przeciwciała przeciwko Dynabeads. Ta immunoprecypitacja jest skalowana do próbek pochodzących z 20 milionów komórek. Dodać 1/5 objętości zmodyfikowanego buforu do lizy trzy z Triton X-100 do rozdrobnionej chromatyny, aby uzyskać końcowe stężenie 1%Triton.

Następnie dodaj mieszaninę do kulek magnetycznych sprzężonych z normalną mysią IgG. Inkubuj reakcję przez godzinę na rotatorze z chłodzeniem. Później przyciągnij koraliki z roztworu przez trzy minuty na stojaku magnetycznym.

Następnie zbierz supernatant. Przenieść supernatant do probówki z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z przeciwciałami anty-FLAG. Przeprowadź tę reakcję koniugacyjną przez noc na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego ranka przyłóż magnes do rurki na trzy minuty, aby zebrać koraliki. Następnie odpipetować supernatant i wyrzucić go. Teraz umyj koraliki.

Zawieś je w jednym mililitrze buforu o niskiej zawartości soli i inkubuj przez pięć minut na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji wyizolować namagnesowanie kulek i odrzucić supernatant. Powtórz ten etap płukania z buforem o niskiej zawartości soli jeszcze raz.

Stosując tę samą technikę, wykonaj jeszcze dwa prania przy użyciu buforu o wysokiej zawartości soli. Kontynuuj stosowanie metody dwukrotnego mycia kulek w buforze chlorku litu. Na koniec umyj koraliki TBS-IGEPAL CA-630 tylko raz.

Po siedmiu etapach płukania zawiesić kulki w 200 mikrolitrach buforu elucyjnego i inkubować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie przyciągnij kulki przez namagnesowanie i zbierz supernatant do nowej probówki. Powtórz ten etap elucji, aby zwiększyć plony.

Następnie oczyść około 5% DNA, aby oszacować wydajność. Rozpocząć od zmieszania większości eluatu z reakcją wytrącania. Wytrącić chromatynę przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Następnego dnia odwirować próbkę i wyrzucić supernatant. Opłucz granulat mililitrem 70% etanolu i powtórz wirowanie przez 10 minut. Następnie odrzucić supernatant i zawiesić osad w 40 mikrolitrach 2x buforu do próbek.

Teraz obracaj zawiesinę przez pełne pięć minut. Następnie inkubuj go w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby dokonać denaturacji i odwrócić sieciowanie. Po zagotowaniu wylej 40 mikrolitrów próbki na żel SDS-PAGE.

Zwykle stosuje się nachylenie od czterech do 20%. Uruchom żel, aż barwnik przesunie się jeden centymetr poniżej studzienki. Następnie poplam żel i pokrój go na pięć kawałków o długości około 2 milimetrów.

Rozcieńczyć białko z kawałków żelu i użyć go do analizy masy. Oczyszczanie RNA, a następnie analiza sekwencjonowania, są objęte protokołem tekstowym. Ogólnie rzecz biorąc, za pomocą enChIP można oczyścić do 10% docelowych regionów genomu.

Przedstawiono wyniki analiz ukierunkowanych na region promotorowy genu IRF-1 w porównaniu z niespecyficznym locus Sox2. Innym przykładem są telomery docelowe w porównaniu z niespecyficznym locus satelity gamma. W ramach projektu enChIP SILAC zidentyfikowano kilka białek związanych z promotorem IRF-1 w sposób specyficzny dla interferonu gamma.

Białka wiążące telomery zidentyfikowano również za pomocą enChIP w połączeniu ze spektrometrią mas. Następnie wykorzystano sekwencjonowanie RNA enChIP do identyfikacji RNA związanych z telomerami. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się transkrypcją i regulacją epigenetyczną do zbadania takich mechanizmów w różnych systemach biologicznych.