Izolacja określonych regionów genomu i identyfikacja powiązanych cząsteczek za pomocą enChIP

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja określonego regionu genomowego z zachowaniem oddziaływań molekularnych w celu identyfikacji cząsteczek oddziałujących z tym regionem genomowym. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na pytania z zakresu funkcji genomu, takich jak transkrypcja i regulacja epigenetyczna. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona bezpośrednią identyfikację cząsteczek oddziałujących z konkretnym regionem genomowym.

Procedurę zademonstruje Toshitsugu Fujita, adiunkt z mojego laboratorium. Postępując zgodnie z protokołem tekstowym, należy zaprojektować interesujące cząsteczki wiążące DNA. Wiąże się to z wygenerowaniem interesującej sekwencji gBlock i wprowadzeniem jej na przykład do retrowirusa w celu produkcji kompleksu guide RNA z trzema FLAG-dCas9.

Alternatywnie można wygenerować trzy białka FLAG-TAL rozpoznające sekwencję docelową. Następnie, zgodnie z protokołem tekstowym, należy zainfekować komórki przygotowanym retrowirusem. Należy potwierdzić ekspresję zmodyfikowanych cząsteczek wiążących DNA i ustanowić linię komórkową.

Następnie należy przeprowadzić sieciowanie komórek za pomocą formaldehydu. Zawiesić 20 milionów transfekowanych komórek w 30 mililitrach standardowej pożywki hodowlanej i dodać 810 mikrolitrów 37% formaldehydu, aby uzyskać stężenie końcowe 1%. Inkubować mieszaninę przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po pięciu minutach przerwać reakcję sieciowania, dodając 3,1 mililitra glicyny o stężeniu 1,25 molarne.

Pozostawić komórki w temperaturze pokojowej na 10 minut przed kontynuowaniem procedury. Następnie wirować probówkę z komórkami przy 300 G przez pięć minut w wirówce chłodzącej. Ostrożnie odlać nadsącz i przemyć osad komórkowy w 30 mililitrach PBS poprzez mieszanie i wirowanie.

Przeprowadź dwa przemycia w roztworze PBS. W razie potrzeby przemyty osad utrwalonych komórek można przechowywać w temperaturze -80 °C. Następnie wyizoluj chromatynę z komórek.

Zawiesić je w 10 mililitrach buforu do lizy i inkubować na lodzie przez 10 minut. Następnie, używając wirówki chłodzącej, zebrać komórki i ostrożnie odlać nadsącz. Teraz zawiesić osad komórkowy w buforze do lizy jądrowej i inkubować na lodzie przez 10 minut.

Co kilka minut podczas inkubacji krótko wymieszaj zawiesinę w wirówce typu vortex. Ponownie odwirowuj komórki. Następnie przemyj osad 10 mililitrami PBS i usuń roztwór płuczący za pomocą kolejnego wirowania.

W ten sposób uzyskuje się frakcję chromatyny, którą w razie potrzeby można szybko zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C. Następnie należy zawiesić osad chromatyny w 800 µL zmodyfikowanego buforu do lizy trzy i przenieść zawiesinę do mniejszej probówki o pojemności 1,5 ml. Teraz należy uruchomić sondę sonikacyjną na poziomie mocy trzy w trybie ciągłym.

Aby pofragmentować chromatynę, wykonuj ręcznie cykle obejmujące 10 sekund sonikacji i 20 sekund chłodzenia na lodzie. Przy każdym 5. lub 6. cyklu wydłuż fazę chłodzenia do dwóch minut, aby zapobiec przegrzaniu próbki. Powtórz ten cykl sonikacji od 10 do 18 razy, dbając o to, aby końcówka sondy nie dotykała dna probówki, co pozwoli uniknąć spienienia próbki.

Po sonikacji należy zebrać próbkę poprzez szybkie wirowanie w warunkach chłodzenia. Następnie przenieść nadkład zawierający pofragmentowaną chromatynę do nowej probówki i odrzucić osad. Sposób oceny stopnia fragmentacji opisano w protokole tekstowym.

Aby przygotować się do immunoprecypitacji, najpierw należy skoniugować przeciwciała z kuleczkami Dynabeads. Niniejsza immunoprecypitacja jest dostosowana do próbek pochodzących z 20 milionów komórek. Do pofragmentowanej chromatyny należy dodać 1/5 objętości zmodyfikowanego buforu do lizy numer trzy z Triton X-100, aby uzyskać końcowe stężenie 1%Triton.

Następnie dodać mieszaninę do kulek magnetycznych sprzężonych z normalną IgG mysią. Inkubować reakcję przez godzinę na rotatorze w warunkach chłodzenia. Następnie oddzielić kulki od roztworu, pozostawiając je na trzy minuty na statywie magnetycznym.

Następnie zebrać nadsącz. Przenieść nadsącz do probówki z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z przeciwciałami anty-FLAG. Reakcję sprzęgania prowadzić przez noc na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia rano przykładamy magnes do probówki na trzy minuty, aby zebrać kuleczki. Następnie odpipetowujemy i odrzucamy nadsącz. Teraz należy wyprać kuleczki.

Zawiesić je w jednym mililitrze buforu niskosolnego i inkubować przez pięć minut na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza. Po inkubacji wyizolować kuleczki za pomocą magnesu i odrzucić nadsącz. Powtórzyć ten etap płukania buforem niskosolnym jeszcze raz.

Stosując tę samą technikę, przeprowadź dwa kolejne płukania za pomocą buforu o wysokim stężeniu soli. Kontynuuj stosowanie tej metody, aby dwukrotnie wypłukać kulki w buforze chlorku litu. Na koniec wypłucz kulki raz za pomocą TBS-IGEPAL CA-630.

Po siedmiu etapach płukania zawiesić kuleczki w 200 µL buforu elucyjnego i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Następnie przyciągnąć kuleczki za pomocą magnesu i zebrać nadsącz do nowej probówki. Powtórzyć ten etap elucji, aby zwiększyć wydajność.

Następnie oczyść około 5% DNA w celu oszacowania wydajności. Rozpocznij od zmieszania głównej części eluatu w reakcji wytrącania. Wytrącanie chromatyny prowadź przez noc w temperaturze -20 °C.

Następnego dnia odwiruj próbkę w wirówce i odlej nadsącz. Przepłucz osad jeden mililitr 70% etanolu i powtórz wirowanie przez 10 minut. Następnie odlej nadsącz i zawieś osad w 40 µL buforu do próbek 2x.

Następnie mieszaj zawiesinę w wirówce vortex przez pełne pięć minut. Potem inkubuj ją w temperaturze 100 °C przez 30 minut, aby zdenaturować białka i odwrócić sieciowanie. Po gotowaniu nanieś 40 µL próbki na żel SDS-PAGE.

Zazwyczaj stosuje się gradient od 4 do 20%. Elektrolizę żelu należy prowadzić do momentu, aż barwnik przemieści się o jeden centymetr poniżej studzienki. Następnie żel należy zabarwić i pociąć na pięć fragmentów o długości około 2 milimetrów.

Rozcieńcz białko z wycinków żelu i wykorzystaj je do analizy spektrometrią mas. Oczyszczanie RNA, a następnie analiza sekwencjonowania, zostały opisane w protokole tekstowym. Łącznie za pomocą metody enChIP można oczyścić do 10% docelowych regionów genomowych.

Przedstawione tutaj są wydajności analiz celujących w region promotora genu IRF-1 w porównaniu z nieswoistym locus Sox2. Innym przykładem jest celowanie w telomery w porównaniu z nieswoistym locus gamma-satelitowym. Metoda enChIP SILAC zidentyfikowała kilka białek związanych z promotorem IRF-1 w sposób swoisty dla interferonu gamma.

Białka wiążące telomery zidentyfikowano również za pomocą metody enChIP w połączeniu ze spektrometrią mas. Następnie zastosowano sekwencjonowanie RNA metodą enChIP, aby zidentyfikować cząsteczki RNA związane z telomerami. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu transkrypcji i regulacji epigenetycznej do zgłębiania tych mechanizmów w różnych układach biologicznych.