Name: Półautomatyczne podejście do przygotowywania koktajli przeciwciał do analizy immunofenotypowej ludzkiej krwi obwodowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Naucz się półautomatycznego przygotowywania koktajli przeciwciał do immunofenotypowania ludzkiej krwi obwodowej. Ta metoda zwiększa dokładność pipetowania i redukuje błędy przygotowania, poprawiając niezawodność wyników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Hannah Puzas za pomoc w projektowaniu i konfiguracji systemu oraz Kevinowi Khovananthowi za porady techniczne. Fundusze na te prace zostały zapewnione przez The Hearst Foundations i Providence Portland Medical Foundation.

<ol><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nat. Rev. Immunol. 12 (3), 191-200 (2012).</li>
<li>Craig, F. E., Foon, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+immunophenotyping+for+hematologic+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms.</a> Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).</li>
<li>Johansson, U., Bloxham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+the+use+of+multicolour+flow+cytometry+in+the+diagnosis+of+haematological+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Guidelines on the use of multicolour flow cytometry in the diagnosis of haematological neoplasms.</a> Br. J. Haematol. 165 (4), 455-488 (2014).</li>
<li>Schnizlein-Bick, C. T., Spritzler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+TruCount+Absolute-Count+Tubes+for+Determining+CD4+and+CD8+Cell+Numbers+in+Human+Immunodeficiency+Virus-Positive+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of TruCount Absolute-Count Tubes for Determining CD4 and CD8 Cell Numbers in Human Immunodeficiency Virus-Positive Adults.</a> Clin. Vaccine Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).</li>
<li>Cossarizza, A., De Biasi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry%2C+immunology%2C+and+HIV+infection%3A+Three+decades+of+strong+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Cytometry, immunology, and HIV infection: Three decades of strong interactions.</a> Cytometry A. 83 (8), 680-691 (2013).</li>
<li>Hensley, T. R., Easter, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+Major+Peripheral+Blood+Leukocyte+Populations+for+Multicenter+Clinical+Trials+Using+a+Whole+Blood+Phenotyping+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay.</a> J. Vis. Exp. (67), e4302(2012).</li>
<li>Streitz, M., Miloud, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+whole+blood+immune+phenotype+monitoring+for+clinical+trials%3A+panels+and+methods+from+the+ONE+study%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant.+Res%22%5BJournal%5D)">Standardization of whole blood immune phenotype monitoring for clinical trials: panels and methods from the ONE study.</a> Transplant. Res. 2 (1), 17(2013).</li>
<li>Hensley-McBain, T., Heit, A., De Rosa, S. C., McElrath, M. J., Andersen-Nissen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+whole+blood+phenotyping+assay+for+enumeration+of+peripheral+blood+leukocyte+populations+in+multicenter+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of a whole blood phenotyping assay for enumeration of peripheral blood leukocyte populations in multicenter clinical trials.</a> J. Immunol. Methods. 411, 23-36 (2014).</li>
<li>Green, C. L., Brown, L., Stewart, J. J., Xu, Y., Litwin, V., Closkey, T. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+validation+of+flow+cytometric+testing+during+drug+development%3A+I+instrumentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: I instrumentation.</a> J. Immunol. Methods. 363 (2), 104-119 (2011).</li>
<li>O'Hara, D. M., Xu, Y., Liang, Z., Reddy, M. P., Wu, D. Y., Litwin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+validation+of+flow+cytometric+testing+during+drug+development%3A+II+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays.</a> J. Immunol. Methods. 363 (2), 120-134 (2011).</li>
<li>Owens, M. A., Vall, H. G., Hurley, A. A., Wormsley, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+quality+control+of+immunophenotyping+in+clinical+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Validation and quality control of immunophenotyping in clinical flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 33-50 (2000).</li>
<li>Kalina, T., Flores-Montero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).</li>
<li>Calvelli, T., Denny, T. N., Paxton, H., Gelman, R., Kagan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guideline+for+flow+cytometric+immunophenotyping%3A+a+report+from+the+National+Institute+of+Allergy+and+Infectious+Diseases%2C+Division+of+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Guideline for flow cytometric immunophenotyping: a report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS.</a> Cytometry A. 14 (7), 702-715 (1993).</li>
<li>Biancotto, A., McCoy, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+human+immunome%3A+the+complexity+of+comprehensive+leukocyte+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Studying the human immunome: the complexity of comprehensive leukocyte immunophenotyping.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 377, 23-60 (2014).</li>
<li>Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+assurance+for+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quality assurance for polychromatic flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).</li>
<li>Yong, P. F. K., Salzer, U., Grimbacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+costimulation+in+antibody+deficiencies%3A+ICOS+and+common+variable+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The role of costimulation in antibody deficiencies: ICOS and common variable immunodeficiency.</a> Immunol. Rev. 229 (1), 101-113 (2009).</li>
<li>Donnenberg, A. D., Donnenberg, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare-Event+Analysis+in+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lab.+Med%22%5BJournal%5D)">Rare-Event Analysis in Flow Cytometry.</a> Clin. Lab. Med. 27 (3), 627-652 (2007).</li>
<li>Biancotto, A., Fuchs, J. C., Williams, A., Dagur, P. K., McCoy, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+dimensional+flow+cytometry+for+comprehensive+leukocyte+immunophenotyping+%28CLIP%29+in+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">High dimensional flow cytometry for comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP) in translational research.</a> J. Immunol. Methods. 363 (2), 245-261 (2011).</li>
<li>Villanova, F., Di Meglio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Lyoplate+Based+Flow+Cytometry+and+Computational+Analysis+for+Standardized+Immunological+Biomarker+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Integration of Lyoplate Based Flow Cytometry and Computational Analysis for Standardized Immunological Biomarker Discovery.</a> PloS One. 8 (7), e65485(2013).</li>
<li>BD biosciences. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Optimizing+Experiments+Using+BD+Horizon+Brilliant+Polymer+Conjugates%22">Optimizing Experiments Using BD Horizon Brilliant Polymer Conjugates</a>. , (2014).</li>
<li>Malergue, F., van Agthoven, A., Scifo, C., Egan, D., Strous, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+a+Phospho-STAT5+Staining+Procedure+for+Flow+Cytometry+for+Application+in+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Automation of a Phospho-STAT5 Staining Procedure for Flow Cytometry for Application in Drug Discovery.</a> J. Biomol. Screen. 20 (3), 416-421 (2015).</li>
<li>Hasan, M., Beitz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+and+standardized+cytometric+procedures+for+multi-panel+and+multi-parametric+wholeblood+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Semi-automated and standardized cytometric procedures for multi-panel and multi-parametric wholeblood immunophenotyping.</a> Clin. Immunol. 157 (2), 261-276 (2015).</li>
<li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+harmonizing+flow+cytometry+in+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+immunol%22%5BJournal%5D)">A model for harmonizing flow cytometry in clinical trials.</a> Nat. immunol. 11 (11), 975-978 (2010).</li>
</ol>

YK, ILG, TLM, WLM, DPH i KSB: Brak sprzecznych interesów finansowych. ANT jest pracownikiem firmy Beckman Coulter, Inc. Publikacja tego artykułu wideo jest sponsorowana przez Beckman Coulter, Inc.

Immunofenotypowanie krwi obwodowej ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wglądu w indywidualne reakcje na immunoterapię. Wyzwanie polega na standaryzacji testów w celu kontrolowania zmienności między eksperymentami1,14. Jednym z głównych źródeł zmienności jest manipulacja próbkami przez człowieka. W związku z tym można sobie wyobrazić, że częściowa lub pełna automatyzacja przetwarzania próbek ułatwi radykalne zmniejszenie zmienności między eksperymentami1,14. W tym protokole informujemy o naszych udanych wysiłkach na rzecz zminimalizowania zmienności testu poprzez wprowadzenie zautomatyzowanego urządzenia do obsługi cieczy wyposażonego w czytnik kodów kreskowych 2D do barwienia próbek w immunofenotypowaniu krwi pełnej.
Pod względem projektowym nasza metoda jest wszechstronna i może monitorować inne podgrupy odpornościowe, dodając dodatkowe "koktajle bazowe" w celu ich zdefiniowania. Takie podzbiory obejmują limfocyty pomocnicze T, limfocyty regulatorowe T, limfocyty B, komórki NK, komórki dendrytyczne i monocyty (manuskrypt w przygotowaniu)18. Dostosowaliśmy zalecane przez konsorcjum panele przeciwciał poprzez wprowadzenie dodatkowych markerów1. Populacje komórek zidentyfikowano za pomocą "koktajlu bazowego" sprzężonego z fluorochromami z minimalną emisją do detektorów fioletu brylantowego 421 (BV421), fikoerytryny (PE) i allofikocyjaniny (APC), ponieważ chcieliśmy zarezerwować te kanały do wykrywania indukowalnych antygenów. Cecha ta nie tylko zapewnia najwyższą czułość monitorowania stanu aktywacji komórek odpornościowych, ale także umożliwia elastyczną akomodację nowych markerów aktywacji, ponieważ te trzy fluorochromy są najczęściej sprzężone z przeciwciałami przeciwko markerom indukowalnym. Dlatego nasza metoda nadaje się nie tylko do przygotowania koktajli do immunofenotypowania krwi pełnej, ale jest również przydatna do barwienia innych próbek, w tym komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i komórek odzyskanych z tkanek zdezagregowanych (np. guza).
Pomyślne wprowadzenie naszej metody wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na etapy przygotowania sprzętu laboratoryjnego oraz programowania i wykonywania metody. Przygotowanie probówek z kodami kreskowymi 2D obejmuje etykietowanie etykietami czytelnymi dla człowieka i przeniesienie przeciwciał do wyznaczonych probówek. Aby zapobiec wprowadzaniu błędów, zalecamy zrobienie tego w dwie osoby. Za każdym razem, gdy zmieniasz arkusze kalkulacyjne, badacze powinni sprawdzić, czy metoda działa poprawnie. Wybór odpowiednich metod pipetowania podczas programowania zapewnia pomyślne przenoszenie cieczy. LLS umożliwia pipetowanie bez wytrącania się zanieczyszczeń z dna probówek z przeciwciałami, do czego używamy końcówek przewodzących P50 lub P200. LLS może nie być dobrym rozwiązaniem dla końcówek P1000, ponieważ LLS jest bardziej wrażliwy na końcówki P1000 i czasami jest fałszywie wyzwalany przez obecność pęcherzyków. Wysokości w definicji sprzętu laboratoryjnego powinny być dostosowane do każdego instrumentu, ponieważ może dojść do nieoptymalnego przenoszenia cieczy, na przykład, jeśli nie ma wystarczającej przestrzeni między krawędzią końcówek a dnem rurek. Jak pokazano na rysunku 12, jeśli "Koktajl bazowy" i/lub "Koktajl aktywacyjny" nie są dobrze zawirowane, może to spowodować nieoptymalne barwienie.
Myśleliśmy o użyciu liofilizowanych odczynników do barwienia komórek jako alternatywnego podejścia do zmniejszenia zmienności związanej z dozowaniem odczynników19. Wiadomo jednak, że polimerowe koniugaty jaskrawych barwników fioletowych oddziałują ze sobą, powodując niespecyficzne sygnały. W związku z tym dodanie więcej niż dwóch koniugatów polimerowych (np. BV421 i BV650 itp.) do liofilizowanych odczynników może powodować niespecyficzną sygnalizację (np . wzrost sygnału tła BV650 w populacji BV421+ )20. Co więcej, odczynniki liofilizowane nie są elastyczne w zakresie włączania nowych barwień. Są one zazwyczaj droższe i wymagają zamówienia zbiorczego. Z tych powodów zdecydowaliśmy się na użycie zautomatyzowanej maszyny do obsługi cieczy wyposażonej w rurki z kodami kreskowymi 2D. Chociaż konfiguracja wymaga czasu i wiąże się z początkową inwestycją w zakup urządzenia, w dłuższej perspektywie takie czynniki zostaną zrekompensowane przez zwiększoną produktywność i odtwarzalność testów. W rzeczywistości kilka grup wcześniej zgłosiło udaną integrację zautomatyzowanego urządzenia do obsługi cieczy z ich przepływem pracy immunofenotypowania lub podobnych zastosowań21,22. Zautomatyzowane rozwiązania do analizy cytometrii przepływowej są również dostępne ze źródeł komercyjnych (FACS SPA III, Automated Cocktail Preparation Workstation i FlowStainer). To dodatkowo wskazuje, że istnieje duże zapotrzebowanie na zautomatyzowane przygotowywanie koktajli do immunofenotypowania.
Po opanowaniu tej techniki przewidujemy, że opracowanie w pełni zautomatyzowanego immunofenotypowania krwi pełnej jeszcze bardziej zmniejszy zmienność między eksperymentami i może sprawić, że immunofenotypowanie krwi pełnej będzie możliwe nawet w wieloośrodkowym badaniu klinicznym23. Zaczęliśmy już korzystać z asystenta mycia lyse, aby zautomatyzować etapy lizy i mycia. Przewidujemy również, że automatyczne oznaczanie objętości przeciwciał w probówkach z kodami kreskowymi 2D i śledzenie dozowania odczynników znacznie poprawi odpowiednio inwentaryzację przeciwciał i kontrolę jakości naszej metody.

Immunofenotypowanie ludzkiej krwi obwodowej określa ilościowe i jakościowe zmiany w podzbiorach komórek odpornościowych1. Zapewnia wgląd w mechanizmy działania i oporności, pomaga w odkrywaniu biomarkerów predykcyjnych i ułatwia opracowywanie immunoterapii skojarzonych. Dlatego walidacja i standaryzacja immunofenotypowania jest obszarem dużego zainteresowania badaczy akademickich, laboratoriów klinicznych i przemysłu.
Chociaż immunofenotypowanie krwi obwodowej metodą cytometrii przepływowej jest obecnie stosowane do klinicznego leczenia nowotworów hematologicznych2,3 i zakażenia ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV)4,5, wiarygodne immunofenotypowanie krwi obwodowej do immunoterapii wymaga szczególnych rozważań w walidacji i standaryzacji, ponieważ wymaga szerszego pokrycia podzbiorów komórek odpornościowych i receptorów aktywujących/hamujących1,6-8. Skuteczne immunofenotypowanie wymaga starannej standaryzacji w celu zminimalizowania zmienności między eksperymentami związanych z konfiguracją instrumentu i procedurą barwienia komórek9,10. Podczas gdy standaryzacja ustawień przyrządów do cytometrii przepływowej jest dobrze ugruntowana, aby rozwiązać pierwszy problem9,11,12, pozostaje niejasne, jak zminimalizować zmienność związaną z barwieniem komórek bez ograniczania zasięgu podzbiorów komórek odpornościowych i ich statusu aktywacji.
Wraz ze wzrostem liczby wykrywanych antygenów, rośnie również możliwość wystąpienia błędów i zmienności z powodu nieoptymalnego dozowania odczynników i zanieczyszczenia krzyżowego. Metody analizy fenoptypowej antykoagulowanej krwi pełnej zostały opracowane pod koniec lat 80-tych XX wieku do stosowania w klinicznych testach laboratoryjnych. Te same metody służą potrzebom laboratorium badawczego w zakresie przygotowania próbek. Co ważne, koktajle przeciwciał stosowane w laboratorium klinicznym są zazwyczaj mniej złożone i dostępne w postaci wstępnie zbalansowanej i wstępnie zmieszanej przez producenta. Wymagane jest tylko jednorazowe przeniesienie wstępnie zmieszanego koktajlu przeciwciał. W warunkach badawczych typowe są koktajle przeciwciał składające się z 10-16 przeciwciał. Każdy koktajl musi zostać zatwierdzony pod względem stabilności przez laboratorium lub przygotowany na świeżo przed każdym badaniem. Przygotowanie wielu koktajli przeciwciał dla próbki może wiązać się z pipetowaniem 50-80 pojedynczych przeciwciał, co jest zadaniem zarówno żmudnym, jak i podatnym na błędy.
Automatyzacja przygotowywania koktajli ma kilka zalet w porównaniu z ręcznym przygotowywaniem koktajli, takich jak mniej błędów, zwiększona dokładność pipetowania, a być może nawet zmniejszone marnotrawstwo odczynników. W tym miejscu informujemy o udanym wprowadzeniu zautomatyzowanego urządzenia do obsługi cieczy wyposażonego w dwuwymiarowy (2D) czytnik kodów kreskowych do procesu barwienia komórek immunofenotypowania w celu zminimalizowania zmienności związanej z przygotowaniem próbki.

<table><tbody><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD Biosciences</td><td>Cytometr przepływowy</td><td></td></tr><tr><td>NXp Span-8 Stacja robocza do automatyzacji laboratorium&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A31839</td><td>Stacja robocza do automatyzacji laboratoryjnej&nbsp;</td></tr><tr><td>Wkładka, Tuba, 11 mm, Biały, do probówek do mikrofug 1,5 ml (opakowanie 25 szt.)</td><td>Beckman Coulter</td><td>373696</td><td>Akcesorium do 24-pozycyjnego stojaka na probówki do mikrofugowania.&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw LLS</td><td>Beckman Coulter</td><td>719262</td><td>Przymocuj spód pokładu w stacji roboczej automatyzacji laboratoryjnej, aby umożliwić wykrywanie poziomu cieczy</td></tr><tr><td>24-pozycyjny stojak na probówki</td><td>Beckman Coulter</td><td>373661</td><td>Stojak na probówki do przechowywania probówek do mikrofuge do koktajli przeciwciał lub krwi</td></tr><tr><td>WORKI AUTOKLAWE BIOHAZARD 12 x 24 CALE CZERWONE</td><td>LabMart</td><td>M111416</td><td>Jednorazowe worki autoklawe do stacji</td></tr> <tr><td>roboczej Automatyki LaboratoryjnejVisionMate Szybki czytnik kodów kreskowych 2D</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1850</td><td>Czytnik kodów kreskowych 2D</td></tr><tr><td>8-kanałowy ręczny kapsor / decapper z zakrętką</td><td>Thermo Scientific</td><td>4105MAT</td><td>Do odkręcania i zamykania probówek z kodami kreskowymi 2D&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-335</td><td>Do sporządzania koktajlu lub dostarczania próbki krwi do stacji roboczej automatyzacji laboratoryjnej</td></tr><tr><td>CoolRack XT CFT24</td><td>biocision</td><td>BCS-534</td><td>Do przechowywania probówek.</td></tr><tr><td>1,0 ml Matrix ScrewTop Bursztynowe probówki w stojakach zatrzaskowych</td><td>Thermo Scientific</td><td>3741AMB</td><td>Probówki z kodami kreskowymi 2D do przechowywania przeciwciał sprzężonych z barwnikiem fluorescencyjnym</td></tr><tr><td>Końcówki Biomek Span-8 P1000, przewodzące, wstępnie sterylne z barierą, 1,025 i mikro; l</td><td>Beckman Coulter</td><td>987925</td><td>Wskazówki dotyczące stacji roboczej automatyzacji laboratoryjnej&nbsp;</td></tr><tr><td>Końcówki Biomek Span-8 P50, przewodzące, wstępnie sterylne z barierą, 50 i mikro; l (Opakowanie 10 stojaków)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B01091</td><td>Wskazówki dotyczące stacji roboczej automatyzacji laboratorium&nbsp;</td></tr><tr><td>Końcówki Biomek Span-8 P250, przewodzące, wstępnie sterylne z barierą (opakowanie 10 stojaków)</td>Końcówki <td>do 394627 redlic Beckman do</td><td></td> stacji <td>roboczej automatyki laboratoryjnej&nbsp;</td></tr><tr><td>BD FACS Roztwór lizujący 10x Koncentrat</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td>Liza RBC</td></tr><tr><td>Falcon Probówki z polistyrenu okrągłodennego</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-5</td><td>Probówki na próbki</td></tr><tr><td>Anty-CD45 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>347463</td><td>Panel komórek T efektorowych (podstawa)</td></tr><tr><td>Anty-CD3 Alexa Fluor 700</td><td>eBioscience</td><td>56-0038-42</td><td>Panel efektorowych komórek T (podstawa)</td></tr><tr><td>Anty-CD4 PerCPCy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>341654</td><td>Panel komórek T efektorowych (podstawa)</td></tr><tr><td>Anty-TCRgd BV650</td><td>BD Biosciences</td><td>564156</td><td>Panel komórek T efektorowych (podstawa)</td></tr><tr><td>Anty-TCRab BV786</td><td>BD Biosciences</td><td>563825</td><td>Panel komórek T efektorowych (baza)</td></tr><tr><td>Anty-CD8 APC-H7</td><td>BD Biosciences</td><td>560179</td><td>Panel efektorowych komórek T (podstawa)</td></tr><tr><td>Anty-CCR7 PE-CF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562381</td><td>Panel komórek T efektorowych (podstawa)Panel komórek T</td></tr> <tr><td>anty-CD45RA PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>337167</td><td>Panel komórek T efektorowych (podstawa)</td></tr><tr><td>Anty-HLA-DR BV421</td><td>BD Panel</td><td>562804</td><td>Effectorowych komórek T (aktywacja)</td></tr><tr><td>Anty-CD278 (ICOS) PE</td><td>BD Biosciences</td><td>557802</td><td>Panel komórek T efektora (aktywacja)</td></tr><tr><td>Anty-CD38 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340439</td><td>Panel efektorowych komórek T (aktywacja)</td></tr><tr><td>Anty-CD279(PD1) BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562516</td><td>Panel efektorowych komórek T (aktywacja)</td></tr><tr><td>Anty-CD357(GITR) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5875-42</td><td>Panel efektorowych komórek T (aktywacja)</td></tr><tr><td>Anty-CD137(41BB) APC</td><td>BD Biosciences</td><td>550890</td><td>Panel komórek T efektorowych (aktywacja)</td></tr><tr><td>Anty-CD69 BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562884</td><td>Panel komórek T efektora (aktywacja)</td></tr><tr><td>Anty-CD314(NKG2D) PE</td><td>BD Biosciences</td><td>557940</td><td>Panel efektorowych komórek T (aktywacja)</td></tr><tr><td>Anty-CD134(OX40) Panel komórek T efektora APC</td><td>BioLegend</td><td>350008</td><td>(aktywacja)</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Plastikowe probówki do pobierania krwi z heparyną sodu: Korek konwencjonalny</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-689-6</td><td>Do pobierania krwi</td></tr><tr><td>Albumina, surowica bydlęca, frakcja V, RIA i ELISA Klasa</td><td>EMD Milipore</td><td>126593</td><td>Do buforu do płukania przepływu</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td>Do buforu do płukania przepływu</td></tr><tr><td>Heparyna, sól sodowa</td><td>Affimetrix</td><td>16920</td><td>Do buforu do płukania przepływu</td></tr><tr><td>Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS), 1x, z wapniem, magnezem, bez czerwieni fenolowej</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30588.02</td><td>Do buforu przepływowego</td></tr></tbody></table>

półautomatyczne podejście do przygotowywania koktajli przeciwciał do analizy immunofenotypowej ludzkiej krwi obwodowej

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Immunofenotypowanie krwi obwodowej za pomocą cytometrii przepływowej określa zmiany w częstotliwości i statusie aktywacji leukocytów obwodowych podczas choroby i leczenia. Ma ona potencjał do przewidywania skuteczności terapeutycznej i identyfikowania nowych celów terapeutycznych. Barwienie krwi pełnej wykorzystuje niemanipulowaną krew, co minimalizuje artefakty, które mogą wystąpić podczas przygotowywania próbki. Jednak barwienie krwi pełnej musi być również wykonane na świeżo pobranej krwi, aby zapewnić integralność próbki. Dodatkowo najlepiej jest przygotować koktajle przeciwciał tego samego dnia, aby uniknąć potencjalnej niestabilności barwników tandemowych i zapobiec interakcji odczynników między barwnikami fioletu brylantowego. Dlatego barwienie krwi pełnej wymaga starannej standaryzacji w celu kontroli zmienności wewnątrz- i międzyeksperymentalnej.
Tutaj informujemy o wdrożeniu automatycznego urządzenia do obsługi płynów wyposażonego w dwuwymiarowy (2D) czytnik kodów kreskowych do standardowego procesu wytwarzania koktajli przeciwciał do cytometrii przepływowej. Przeciwciała przeniesiono do probówek z kodami kreskowymi 2D ułożonych w formacie 96 dołków, a ich zawartość skompilowano w bazie danych. Osoba zajmująca się obsługą płynów może następnie zlokalizować źródłowe fiolki z przeciwciałami, odwołując się do nazw przeciwciał w bazie danych. Nasza metoda wyeliminowała żmudną koordynację pozycjonowania probówek z przeciwciałami. Zapewniło to wszechstronność, umożliwiając użytkownikowi łatwą zmianę dowolnej liczby szczegółów w procesie dozowania przeciwciał, takich jak określone przeciwciało do użycia, objętość i miejsce docelowe, poprzez modyfikację bazy danych bez przepisywania skryptów w metodzie oprogramowania dla każdego testu.
Eksperyment potwierdzający słuszność koncepcji osiągnął wyjątkową precyzję między i wewnątrz testu, zademonstrowaną przez powtórzone przygotowanie testu cytometrii przepływowej z 11 kolorami i 17 przeciwciałami. Metodologie te zwiększyły ogólną przepustowość testów cytometrii przepływowej i ułatwiły codzienne przygotowywanie złożonych koktajli przeciwciał wymaganych do szczegółowej charakterystyki fenotypowej świeżo pobranej antykoagulowanej krwi obwodowej.

Immunofenotypowanie krwi pełnej jest niezbędne do monitorowania ludzkiego układu odpornościowego. Jednak liczba wymaganych odczynników i niestabilność określonych fluorochromów w wstępnie zmieszanych koktajlach wymaga codziennego przygotowywania odczynników. Tutaj pokazujemy, że półautomatyczne przygotowanie koktajlu przeciwciał barwiących pomaga ustalić wiarygodne immunofenotypowanie poprzez zminimalizowanie zmienności w dozowaniu odczynników.

Półautomatyczne podejście do przygotowywania koktajli przeciwciał do analizy immunofenotypowej ludzkiej krwi obwodowej

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Ogólnym celem tego półautomatycznego protokołu przygotowania koktajlu przeciwciał barwiących jest ustanowienie niezawodnej metody immunofenotypowania w celu zminimalizowania zmienności dozowania odczynników. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych problemów w dziedzinie immunomonitoringu, takich jak: sposób kontrolowania zmienności wewnątrz- i międzyeksperymentalnej po dozowaniu odczynników. Główną zaletą tej techniki jest to, że automatyzacja przygotowywania koktajli zwiększa dokładność pipetowania, jednocześnie zmniejszając błędy związane z ręcznym przygotowywaniem koktajli. Procedurę zademonstruje Iliana Gonzalez, technik z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem procedury należy nakleić etykiety czytelne dla człowieka na probówkach z kodami kreskowymi 2D. Następnie przenieś całą zawartość każdej fiolki z przeciwciałem do odpowiednich probówek z kodami kreskowymi 2D, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Po przeniesieniu przeciwciał użyj czytnika kodów kreskowych 2D, aby odczytać probówki. Następnie utwórz arkusz kalkulacyjny zawierający nazwy przeciwciał i odczyty kodów kreskowych, a następnie zapisz arkusz kalkulacyjny jako plik z wartościami oddzielonymi przecinkami. Teraz uruchom czytnik kodów kreskowych 2D, a następnie automatyczną obsługę cieczy. Aby zalać strzykawki automatycznego urządzenia do obsługi cieczy, w obszarze Instrument wybierz opcję Home All Axes (Położenie początkowe wszystkich osi).Upewnij się, że żadna ze strzykawek nie zawiera widocznych pęcherzyków powietrza. Po zalaniu strzykawek otwórz metody przygotowania koktajlu bazowego i koktajlu aktywacyjnego w oprogramowaniu do automatycznego obchodzenia się z płynami. Następnie umieść probówki z mikrofugami w małych probówkach do mikrofugi na koktajl bazowy i koktajl aktywacyjny, w zależności od liczby koktajli bazowych i aktywacyjnych, które należy wykonać. Użyj schematu konfiguracji przyrządu jako odniesienia do umieszczania stojaków na probówki na pokładzie. Umieść zbiornik buforowy w odpowiedniej sekcji pokładu i użyj ośmiokanałowego odkręcacza z nakrętką, aby odkręcić probówki z kodami kreskowymi 2D zawierające przeciwciała. Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego, umieść każdą nakrętkę na tacce na nakrętki podczas wyjmowania, aby utrzymać nakrętki w odpowiedniej kolejności. Następnie umieść końcówki filtra P50 LLS, końcówki filtra P200 LLS, końcówki P1000 i stojak na probówki Matrix 1 ml na pokładzie w odpowiednich pozycjach. Kliknij ikonę start, aby uruchomić metodę. Gdy pojawi się wyskakujące okienko, upewnij się, że wszystkie elementy na pokładzie są zgodne ze schematem konfiguracji instrumentu dla tej metody. Jeśli wszystko jest na swoim miejscu, kliknij przycisk OK. Zautomatyzowana maszyna do obsługi cieczy przeniesie bufor ze zbiornika do probówek do mikrofuge. Stojak na probówki Matrix 1 ml zostanie przeniesiony do czytnika kodów kreskowych 2D, a kody kreskowe zostaną odczytane. Po odczytaniu wszystkich kodów kreskowych kliknij OK w wyskakującym okienku, aby rozpocząć transfer przeciwciał. Po zakończeniu transferu użyj ośmiokanałowego decappera z nakrętką, aby ponownie zamknąć probówki z kodami kreskowymi 2D i przywróć probówki do 4

a-semi-automated-approach-to-preparing-antibody-cocktails-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film opisuje technikę testu immunologicznego wykorzystującą fluorescencyjne kulki magnetyczne lub mikrosfery w połączeniu z różnymi antygenami do jednoczesnego wykrywania różnych izotypów przeciwciał w próbce surowicy. Test jest pomocny w zrozumieniu serokonwersji podczas infekcji lub po szczepieniu.

Multianalitowy test immunobealikowy: Technika testu immunologicznego oparta na przepływie do jednoczesnego wykrywania wielu podtypów przeciwciał w próbce ludzkiej surowicy

Ten film demonstruje użycie testu ELISpot do oceny funkcji komórek B wydzielających przeciwciała, ASC. Przeciwciała wydzielane przez ASC oddziałują z fragmentami przeciwciał poliklonalnych związanymi z błoną, które są wykrywane przez przeciwciała IgG lub IgM sprzężone z enzymem. Kolorowa plamka wytworzona w każdym dołku wskazuje na obecność specyficznego izotypu przeciwciała, który koreluje z aktywnością wydzielniczą limfocytów B.

Ocena funkcjonalna limfocytów B wydzielających przeciwciała za pomocą testu ELISpot

Ten film demonstruje technikę opartą na cytometrii przepływowej wykorzystującą dwa fluorochromy do identyfikacji limfocytów T CD4+ i CD8+, limfocytów T γδ, limfocytów B, komórek NK i monocytów w ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Po inkubacji komórek z przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem przeciwko markerom powierzchniowym, podzbiory komórek są identyfikowane przy użyciu optymalnej strategii bramkowania cytometrycznego przepływu.

Test cytometrii przepływowej w celu identyfikacji podzbiorów komórek odpornościowych w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej

Tutaj opisujemy protokół izolacji podzbiorów prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej.  Wystarczająca ilość i jakość kwasów nukleinowych może zostać wyekstrahowana z komórek i wykorzystana w kolejnych testach z wykorzystaniem DNA lub RNA.

Izolacja podzbiorów prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej

Ludzka krew obwodowa jest powszechnie używana do oceny humoralnej odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisano metody izolowania ludzkich limfocytów B z krwi obwodowej, różnicowania ludzkich komórek B w limfocyty B wydzielające przeciwciała (Ab) (ASC) w hodowli oraz liczenia całkowitych IgM- i IgG-ASC za pomocą testu ELISpot.

Izolacja, różnicowanie i kwantyfikacja ludzkich limfocytów B wydzielających przeciwciała z krwi: ELISpot jako funkcjonalny odczyt odporności humoralnej

Opisana jest prosta, ale skuteczna metoda, która wykorzystuje magnetyczne nanocząstki do wykrywania i wzbogacania komórek B reagujących na antygen do analizy funkcjonalnej i fenotypowej.

Wykrywanie i wzbogacanie rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu w celu analizy fenotypu i funkcji

Opisujemy metodę produkcji ludzkich przeciwciał specyficznych dla interesującego nas antygenu, zaczynając od rzadkich limfocytów B krążących w ludzkiej krwi. Wytwarzanie tych naturalnych przeciwciał jest wydajne i szybkie, a uzyskane przeciwciała mogą rozróżniać wysoce spokrewnione antygeny.

Wytwarzanie dyskryminujących ludzkich przeciwciał monoklonalnych z rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu B krążących we krwi

Tutaj opisujemy proteomiczne podejście pojedynczej komórki do oceny immunologicznych zmian fenotypowych i funkcjonalnych (indukcja cytokin wewnątrzkomórkowych) w próbkach krwi pełnej z obwodu, analizowanych za pomocą cytometrii masowej.

Jednokomórkowa analiza immunofenotypu i produkcji cytokin w obwodowej krwi pełnej za pomocą cytometrii masowej

Tutaj opisujemy protokoły analizy i wizualizacji struktury i budowy całego repertuaru przeciwciał. Wiąże się to z pozyskiwaniem ogromnych sekwencji RNA przeciwciał za pomocą sekwencjonowania nowej generacji.

Identyfikacja repertuaru przeciwciał mysich i ludzkich za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Metoda BSelex do identyfikacji i odzyskiwania pojedynczych przeciwciał specyficznych dla antygenu z komórek jednojądrzastych ludzkiej krwi obwodowej łączy cytometrię przepływową z PCR pojedynczych komórek i klonowaniem.

Metoda przesiewowa pojedynczych komórek w celu selekcji i odzyskiwania przeciwciał o pożądanej swoistości ze wzbogaconych populacji komórek B ludzkiej pamięci

Naucz się półautomatycznego przygotowywania koktajli przeciwciał do immunofenotypowania ludzkiej krwi obwodowej. Ta metoda zwiększa dokładność pipetowania i redukuje błędy przygotowania, poprawiając niezawodność wyników.

Półautomatyczne podejście do przygotowywania koktajli przeciwciał do analizy immunofenotypowej ludzkiej krwi obwodowej

Przeglądaj więcej filmów