Optyczna kontrola aktywności elektrycznej żywych komórek za pomocą sprzężonych polimerów

Ogólnym celem tej metody jest kontrolowanie potencjału błony komórkowej po stymulacji impulsami światła widzialnego. W procesie fototransdukcji pośredniczy światłoczuły sprzężony polimer. Metoda ta stanowi nowe narzędzie w dziedzinie technologii, ponieważ stanowi cenną alternatywę dla istniejących metod, takich jak optogenetyka i stymulacja termiczna do optycznej kontroli aktywności żywych komórek.

Głównymi zaletami tej techniki są szybka integracja z dowolnym typem elektrofizjologa, potencjalnie wysoka rozdzielczość specjalna i czasowa, zmniejszają inwazyjność. Co więcej, pozwala uniknąć transferu genów, który jest wymagany przez optogenetykę. Nasza metoda została opisana tutaj dla fotostymulacji hodowli komórkowych in vitro.

Ale może to również otworzyć interesujące możliwości dla zastosowań in vivo. Procedurę zademonstrują Caterina Bossio i Susana Vaquero Morata, które zostaną doktorantkami z naszych laboratoriów z wykształceniem odpowiednio w zakresie chemii biologicznej i fizycznej. Na początek przygotuj roztwór światłoczułego sprzężonego polimeru, mieszając P3HT i PCBM w chlorobenzynie w stężeniu względnym jeden do jednego.

Mieszać roztwór z mieszadłem magnetycznym przez co najmniej cztery godziny w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Następnie wyczyść szkiełka pokryte tlenkiem indu cyny za pomocą kolejnych 10-minutowych kąpieli w wodzie dejonizowanej, acetonie i izopropanolu w sonikatorze. Osusz szkiełka nakrywkowe pistoletem do azotu, a następnie potraktuj podłoża za pomocą myjki plazmowej.

Po oczyszczeniu umieść suwak na uchwycie maszyny do powlekania przędzalniczego, stroną pokrytą ITO skierowaną do góry. Następnie dodaj 150 mikrolitrów roztworu PCBM P3HT do szkiełka i powlekaj próbkę. Po zakończeniu powlekania należy usunąć próbkę i użyć wacika do pomieszczeń czystych zamoczonego w acetonie, aby oczyścić tylną część podłoża.

Wysterylizuj podłoża fotoaktywne, umieszczając je w przykrytym pojemniku żaroodpornym i podgrzewając w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie przenieś próbki do sterylnego kaptura i pozwól im ostygnąć. Od tego momentu należy utrzymywać sterylność próbek.

Umieść podłoża fotoaktywne na płytce z sześcioma dołkami. Biorąc pod uwagę hydrofobowość sprzężonej warstwy polimeru, należy wykonać studzienkę polidimetylosiloksanową w celu utrwalenia próbki i ograniczyć roztwory zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie umieść fotoaktywne substraty w dołkach płytki i pokryj całą powierzchnię każdej próbki 500 do 750 mikrolitrami roztworu fibronektyny o proporcjach dwóch miligramów na litr w PBS.

Próbki należy inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę. Po inkubacji użyj szklanej pipety, aby usunąć roztwór fibronektyny, a następnie przemyj podłoża raz dwoma mililitrami PBS. Najpierw dodaj całkowitą objętość 750 do 1,000 mikrolitrów kompletnego podłoża wzrostowego na studzienkę.

Następnie umieść 15 000 komórek AGK293 na centymetr kwadratowy substratu fotoaktywnego w każdej studzience. Następnie inkubuj komórki przez 24 do 48 godzin. Komórki można łatwo hodować na podłożach fotoaktywnych, pod warunkiem, że zostanie osadzona odpowiednia warstwa adhezyjna, taka jak fibronektyna.

Na początek przygotuj zarówno roztwory zewnątrzkomórkowe, jak i wewnątrzkomórkowe, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Wysterylizuj roztwory, przepuszczając je przez filtr 0,2 mikrona. Następnie podgrzej roztwór zewnątrzkomórkowy, umieszczając go w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Napełnij również strzykawkę o pojemności jednego mililitra roztworem wewnątrzkomórkowym i wyposaż ją w igłę o rozmiarze 34. Utrzymuj roztwór wewnątrzkomórkowy w kontakcie z lodem, aby uniknąć degradacji ATP. Następnie weź podłoże pokryte komórkami z inkubatora i ostrożnie dobrze usuń PDMS.

Następnie usuń pożywkę wzrostową szklaną pipetą i powoli przepłucz próbkę roztworem zewnątrzkomórkowym, aby uniknąć oderwania komórek. Dodać trzy mililitry roztworu zewnątrzkomórkowego do każdej studzienki, a następnie przenieść płytkę do uchwytu na próbkę stacji elektrofizjologicznej. Po umieszczeniu na miejscu umieść elektrodę odniesienia w studzince, która ma być testowana.

Następnie przygotuj świeżą szklaną mikropipetę do patch clampu za pomocą ściągacza do mikropipet. Napełnij połowę pipety roztworem wewnątrzkomórkowym. Za pomocą mikromanipulatora umieść pipetę z plastrem w bliskiej odległości od wybranej błony komórkowej.

Podczas ustawiania należy przyłożyć zbyt duży nacisk na pipetę, aby uniknąć przywierania brudu do końcówki. Gdy pipeta znajduje się kilka mikronów nad celą, zacznij opuszczać pipetę w kierunku błony komórkowej, jednocześnie sprawdzając opór pipety w oprogramowaniu do kontroli plastrów. Gdy rezystancja pipety wzrośnie o około jeden megaom, usuń nadciśnienie i delikatnie zasysaj, aby utworzyć gigaseal między pipetą a błoną komórkową.

Następnie nałóż ujemny potencjał ujemny 40 miliwoltów na pipetę, aby ustabilizować uszczelnienie. Kompensuj pojemnościową przejściowość wynikającą z pojemności pipety za pomocą odpowiednich poleceń na wzmacniaczu krosowym i/lub oprogramowaniu do sterowania poprawkami. Zastosuj krótki i intensywny impuls ssący do pipety, aby przerwać błonę i umożliwić dostęp elektryczny do cytoplazmy komórki.

Następnie ustaw wzmacniacz krosowy w tryb cęgów prądowych, aby żaden prąd nie był wstrzykiwany do ogniwa. W bieżącym trybie cęgowym śledź potencjał błony komórkowej i poczekaj kilka minut, aż się ustabilizuje. Po ustabilizowaniu się, zastosuj żądany protokół oświetlenia do komórki, oświetlając fotoaktywną błonę pod komórką światłem w zakresie od 450 do 600 nanometrów.

Rejestruj wpływ światła na potencjał błony. Krótkie impulsy światła trwające około 10 do 20 milisekund powodują przejściową depolaryzację komórki, podczas gdy przy długotrwałym oświetleniu rzędu setek milisekund obserwuje się hiperbolizację aż do wyłączenia światła. Stymulacja optyczna komórek, w której pośredniczą substraty fotoaktywne, może powodować różne efekty na błonę komórkową, w zależności od czasu trwania bodźca świetlnego.

Po szybkim skoku, takim jak ten pokazany tutaj, następuje przejściowa depolaryzacja rzędu dziesiątek milisekund. W przypadku krótkich impulsów światła, gdy światło jest wyłączone, obserwuje się odwrotne zachowanie. Sygnały te przypisuje się zmianom w pojemności membrany spowodowanym miejscowym nagrzewaniem po absorpcji światła.

W przypadku przedłużonego oświetlenia początkowa depolaryzacja zamienia się w hiperpolaryzację komórki. Zjawisko to ma ponownie podłoże termiczne, ale w tym przypadku jest związane ze zmianą potencjału równowagi membrany spowodowaną zmianą przewodnictwa kanału jonowego wywołaną wzrostem temperatury. Należy zauważyć, że technika ta jest dość elastyczna i może być dostosowana do szczególnych potrzeb konkretnego eksperymentu, na przykład poprzez zmianę polimeru fototoksycznego, procesu wytwarzania lub protokołu oświetlenia.

Jednak przed zmianą protokołu należy najpierw zweryfikować ważne właściwości aktywnego polimeru, takie jak jego biokompatybilność, przydatność do procesu sterylizacji, stabilność elektrochemiczna i czasowa. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zrealizować hybrydowy interfejs między polimerami łącznymi a żywymi komórkami i jak go używać do optycznej kontroli aktywności komórek. Wierzymy, że technika ta ma również szansę stać się uzupełniającym narzędziem w neurobiologii do badań in vitro, a także otworzyć nową perspektywę zastosowań in vivo.

Aby jednak udoskonalić protokół, konieczny jest silny i wspólny wysiłek naukowców zajmujących się materiałami i neurobiologów, fizyków i lekarzy.