Name: Optyczna kontrola aktywności elektrycznej żywych komórek za pomocą sprzężonych polimerów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Poznaj metodę optycznej kontroli aktywności komórek za pomocą sprzężonych polimerów półprzewodnikowych. Technika ta umożliwia nieinwazyjną stymulację potencjału błonowego bez konieczności transferu genów, stanowiąc alternatywę dla optygenetyki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca była wspierana przez UE poprzez projekt FP7-PEOPLE-212-ITN 316832-OLIMPIA, 
Telethon - Włochy (granty GGP12033 i GGP14022), Fondazione Cariplo (grant ID 2013-0738).

1. Przygotowanie substratów fotoaktywnych
<ol>
	<li>Przygotować roztwór P3HT:PCBM (1:1 w/w) w chlorobenzenie o stężeniu P3HT 20 g/l. Mieszać roztwór za pomocą mieszadła magnetycznego przez co najmniej 4 godziny w temperaturze 60 °C. Należy rozważyć objętość 150 μl roztworu dla każdego przygotowywanego podłoża.</li>
	<li>Szkiełka szklane z powłoką ITO (Rs = 10 Ω/sq, 18x18 mm2, grubość 170 μm) należy oczyścić kolejnymi kąpielami wody dejonizowanej, acetonu i izopropanolu w sonikatorze (10 minut na każdy krok). Wysuszyć szkiełka nakrywkowe pistoletem do azotu. Umieść próbki w myjce plazmowej o mocy 100 W na 10 minut.</li>
	<li>Na oczyszczone podłoża należy nanieść cienką warstwę warstwy aktywnej poprzez powlekanie wirowe.
	<ol>
		<li>Za pomocą diamentowej końcówki przyciąć szkiełko mikroskopowe (grubość ≈ 1 mm) do tych samych wymiarów bocznych podłoży pokrytych ITO. Wyjmij roztwór P3HT:PCBM z płyty grzejnej i pozwól mu ostygnąć do temperatury otoczenia.</li>
		<li>Ustaw dwustopniowy program wirowania: i) 30 sekund przy 800 obr./min; ii) 30 sekund przy 1,600 obr./min. Umieść szkiełko na uchwycie wirówki i uruchom odkurzacz, aby go zamocować. Umieść kroplę acetonu na szkiełku, a następnie na oczyszczonym podłożu, stroną pokrytą ITO do góry. Rozpocznij rotację wirówki, aby pozbyć się nadmiaru acetonu.</li>
		<li>Umieścić 150 μl roztworu P3HT:PCBM na podłożach i ponownie uruchomić urządzenie do powlekania wirowego (użyć tego samego protokołu opisanego w 1.3.2).</li>
		<li>Po zakończeniu pracy wirówki należy usunąć próbkę i ostrożnie oderwać pokryte podłoże od szkiełka podstawowego. Oczyść tylną część podłoża wacikiem do pomieszczeń czystych zamoczonym w acetonie. 
		Uwaga: Podłoża fotoaktywne można przechowywać przez kilka dni w ciemnym pudełku do czasu użycia. Przez dłuższy czas przechowuj je w komorze rękawicowej z gazem obojętnym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie pożywki do hodowli komórkowych i roztworów elektrofizjologicznych
<ol>
	<li>Przygotuj kompletną pożywkę wzrostową (CGM) dla komórek HEK-293: Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) nieinaktywowaną termicznie, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Wysterylizować pożywkę za pomocą systemu filtracji 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór zewnątrzkomórkowy w wodzie ultraczystej (stężenia w mM): 135 NaCl, 5,4 KCl, 5 HEPES, 10 Glukoza, 1,8 CaCl2, 1 MgCl2. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH. Wysterylizować roztwór za pomocą systemu filtracji 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór wewnątrzkomórkowy w wodzie ultraczystej (stężenia w mM): 12 KCl, 125 K-glukonian, 1 MgCl2, 0,1 CaCl2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na2. Zwróć uwagę, że ATP-Na2 jest wrażliwy na ciepło i dodaj go na końcu. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH. Wysterylizować roztwór za pomocą systemu filtracji 0,2 μm, podwielokrotność porcji w probówkach o pojemności 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
3. Posiewanie komórek HEK-293 na aktywnych podłożach
<ol>
	<li>Umieścić podłoże fotoaktywne w szklanej zlewce pokrytej aluminium lub na zamkniętej szalce Petriego i wstawić do piekarnika w temperaturze 120 °C na 2 godziny w celu sterylizacji. Od tego momentu wszystkie operacje należy wykonywać w sterylnych warunkach. Umieść próbki w sterylnym kapturze i pozwól im ostygnąć.</li>
	<li>Pokryj fotoaktywne podłoże warstwą adhezyjną, aby zmniejszyć hydrofobowość powierzchni i promować adhezję komórek.
	<ol>
		<li>Umieść aktywne substraty na szalce Petriego P35 lub płytce wielodołkowej z 6 dołkami. Biorąc pod uwagę hydrofobowość sprzężonej warstwy polimeru, należy wykonać studzienkę z polidimetylosiloksanu (PDMS), aby utrwalić próbkę i ograniczyć roztwory.
		<ol>
			<li>Wymieszaj PDMS i katalizator w proporcji 10:1 ze szklanym prętem, aby uzyskać lepką zawiesinę.</li>
			<li>Wlać zawiesinę do 6-dołkowej płytki, dozując ilość wystarczającą do pokrycia połowy każdej studzienki.</li>
			<li>Poczekaj na polimeryzację PDMS w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Wytnij utwardzony PDMS na środku, aby uzyskać kwadratowy kształt o tym samym wymiarze próbki polimeru.</li>
			<li>Wysterylizuj studzienki PDMS przez zanurzenie w 70% mieszaninie etanolu i wody na co najmniej 30 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Jeśli dobrze używasz PDMS, zdrap warstwę fotoaktywną wzdłuż całej granicy studzienki spiczastą pęsetą, aby uniknąć oderwania całej warstwy podczas usuwania PDMS dobrze po hodowli komórek.</li>
		<li>Pokryć całą powierzchnię każdej próbki roztworem fibronektyny (2 mg/l w PBS). Objętość między 500-750 μl na próbkę jest zwykle wystarczająca, jeśli używana jest studzienka PDMS (czysta powierzchnia studzienki: 15x15 mm2). Bez studni PDMS do całkowitego zanurzenia próbki potrzeba około 2 ml roztworu fibronektyny; Zwróć uwagę, aby podłoże nie unosiło się na wodzie podczas dodawania roztworu. Próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę.</li>
		<li>Usunąć roztwór fibronektyny szklaną pipetą i przemyć raz 2 ml PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść komórki HEK-293 na próbkach traktowanych fibronektyną o gęstości 15 000 komórek/cm2 w kompletnym pożywce wzrostowej. Użyj objętości 750-1,000 μl CGM dla każdej próbki, jeśli używana jest studzienka PDMS, w przeciwnym razie konieczne są 2-3 ml CGM. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24–48 godzin.</li>
</ol>
4. Protokół stymulacji optycznej i pomiary elektrofizjologiczne
<ol>
	<li>Umieścić roztwór zewnątrzkomórkowy w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu termalizacji; rozmrozić roztwór wewnątrzkomórkowy, umieścić go w strzykawce o pojemności 1 ml z igłą 34 G i utrzymywać w kontakcie z lodem, aby uniknąć degradacji ATP.</li>
	<li>Weź z inkubatora podłoże pokryte komórkami, ostrożnie usuwając PDMS, jeśli jest obecny. Usunąć pożywkę wzrostową szklaną pipetą i przepłukać próbkę roztworem zewnątrzkomórkowym. Postępuj powoli, aby uniknąć oderwania się komórek.</li>
	<li>Umieścić urządzenie w uchwycie na próbkę stacji elektrofizjologicznej z roztworem zewnątrzkomórkowym i elektrodą referencyjną. Przygotuj świeże szklane mikropipety do patch-clampu za pomocą ściągacza (idealna rezystancja mieści się w zakresie 2-4 MΩ). Napełnij połowę pipety roztworem wewnątrzkomórkowym i zamontuj ją na mikromanipulatorze.</li>
	<li>Poszukaj zdrowej komórki do załatania na urządzeniu. Aby uniknąć niepożądanego wzbudzenia substratu fotoaktywnego, należy użyć oświetlenia w podczerwieni do obrazowania, umieszczając filtr przepustowy o dużej długości fali (na przykład można zastosować przeciętą długość fali λ = 750 nm dla polimerów pochłaniających światło widzialne) przed oświetlaczem mikroskopu.</li>
	<li>Umieść wybraną komórkę i zastosuj żądany protokół stymulacji optycznej, dostarczając światło do próbki przez ścieżkę wzbudzenia fluorescencji mikroskopu (ryc. 1). Szczegółowy opis protokołu patch-clamp można znaleźć w odnośniku 20.
	<ol>
		<li>Umieścić pipetę z plastrem w bliskiej odległości od błony komórkowej za pomocą manipulatora mikrometrycznego. Podczas ustawiania należy zastosować nadciśnienie w pipecie, aby uniknąć przywierania brudu do końcówki. Pipeta powinna znajdować się kilka mikronów nad komórką.</li>
		<li>Rozpocznij opuszczanie pipety w kierunku błony komórkowej, kontrolując opór pipety w oprogramowaniu do kontroli plam. Gdy rezystancja pipety wzrośnie o około 1 MΩ, usuń nadciśnienie z pipety, delikatnie odsysając, aby utworzyć gigaseal między pipetą a błoną komórkową (tj. zmierzona rezystancja powinna wzrosnąć do wartości większych niż 1 GΩ).</li>
		<li>Zastosuj ujemny potencjał do pipety zbliżony do oczekiwanego potencjału spoczynkowego ogniwa (w przypadku ogniwa HEK293 można zastosować potencjał -40 mV), aby ustabilizować uszczelnienie. Kompensuj pojemnościowe stany przejściowe wynikające z pojemności pipety za pomocą odpowiednich poleceń na wzmacniaczu krosowym i/lub oprogramowaniu do sterowania poprawkami.</li>
		<li>Przerwij membranę, aby umożliwić dostęp elektryczny do cytoplazmy komórki, przykładając krótki i intensywny impuls ssący do pipety. Ustaw wzmacniacz krosowy w trybie cęgów prądowych (I = 0, tj. bez prądu wstrzykiwanego do ogniwa), aby śledzić potencjał błony komórkowej. Odczekaj kilka minut, aby sprawdzić, czy potencjał komórki jest stabilny.</li>
		<li>Zastosuj żądany protokół oświetlenia do komórki i zapisz wpływ na potencjał błonowy. 
		Uwaga: Oświetlenie może być dostarczane do próbki od dołu lub od góry, w zależności od architektury mikroskopu.
		<ol>
			<li>Wybierz długość fali wzbudzenia, która jest dobrze absorbowana przez materiał aktywny; dla mieszanki P3HT:PCBM można zastosować długość fali w zakresie 450-600 nm. Odpowiednie gęstości fotowzbudzenia mieszczą się w zakresie 10-100 mW/mm2, 
			Uwaga: Krótkie impulsy światła (poniżej 10-20 ms) powodują przejściową depolaryzację ogniwa, podczas gdy przy przedłużonym oświetleniu (setki milisekund lub dłuższe impulsy) obserwuje się utrzymującą się hiperpolaryzację, aż do wyłączenia światła.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Alivisatos, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotools+for+Neuroscience+and+Brain+Activity+Mapping%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Nanotools for Neuroscience and Brain Activity Mapping.</a> ACS Nano. 7 (3), 1850-1866 (2013).</li>
<li>Spira, M. E., Hai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-electrode+array+technologies+for+neuroscience+and+cardiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology.</a> Nat. Nanotechnol. 8 (2), 83-94 (2013).</li>
<li>Scanziani, M., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+in+the+age+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).</li>
<li>Bareket-Keren, L., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+interfaces+for+light+directed+neuronal+stimulation%3A+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Nanomed%22%5BJournal%5D)">Novel interfaces for light directed neuronal stimulation: advances and challenges.</a> Int. J. Nanomed. 9 (1), 65-83 (2014).</li>
<li>Antognazza, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+Light+on+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Shedding Light on Living Cells.</a> Adv. Mater. , (2014).</li>
<li>Martino, N., Ghezzi, D., Benfenati, F., Lanzani, G., Antognazza, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+semiconductors+for+artificial+vision%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Organic semiconductors for artificial vision.</a> J. Mater. Chem. B. 1 (31), 3768-3780 (2013).</li>
<li>Antognazza, M. R., Scherf, U., Monti, P., Lanzani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic-based+tristimuli+colorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Organic-based tristimuli colorimeter.</a> Appl. Phys. Lett. 90 (16), 163509(2007).</li>
<li>Liao, C., Zhang, M., Yao, M. Y., Hua, T., Li, L., Yan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+Organic+Electronics+in+Biology%3A+Materials+and+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Flexible Organic Electronics in Biology: Materials and Devices.</a> Adv. Mater. , (2014).</li>
<li>Khodagholy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuroGrid%3A+recording+action+potentials+from+the+surface+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain.</a> Nat. Neurosci. 18 (2), 310-315 (2015).</li>
<li>Campana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrocardiographic+Recording+with+Conformable+Organic+Electrochemical+Transistor+Fabricated+on+Resorbable+Bioscaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Electrocardiographic Recording with Conformable Organic Electrochemical Transistor Fabricated on Resorbable Bioscaffold.</a> Adv. Mater. 26 (23), 3874-3878 (2014).</li>
<li>Bonetti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Lysinated+Thiophene-Based+Semiconductor+as+a+Multifunctional+Neural+Bioorganic+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22+Adv.+Healthc.+Mater%22%5BJournal%5D)">A Lysinated Thiophene-Based Semiconductor as a Multifunctional Neural Bioorganic Interface.</a> Adv. Healthc. Mater. , (2015).</li>
<li>Benfenati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+organic+transistor+structure+for+bidirectional+stimulation+and+recording+of+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">A transparent organic transistor structure for bidirectional stimulation and recording of primary neurons.</a> Nat. Mater. 12 (7), 672-680 (2013).</li>
<li>Rivnay, J., Owens, R. M., Malliaras, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rise+of+Organic+Bioelectronics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Mater%22%5BJournal%5D)">The Rise of Organic Bioelectronics.</a> Chem. Mater. 26 (1), 679-685 (2014).</li>
<li>Pires, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+differentiation+by+electrical+stimulation+using+a+cross-linked+PEDOT+substrate%3A+Expanding+the+use+of+biocompatible+conjugated+conductive+polymers+for+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Gen.+Subjects%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell differentiation by electrical stimulation using a cross-linked PEDOT substrate: Expanding the use of biocompatible conjugated conductive polymers for neural tissue engineering.</a> BBA-Gen. Subjects. 1850 (6), 1158-1168 (2015).</li>
<li>Ghezzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+bioorganic+interface+for+neuronal+photoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">A hybrid bioorganic interface for neuronal photoactivation.</a> Nat. Commun. 2 (166), 1-7 (2011).</li>
<li>Ghezzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polymer+optoelectronic+interface+restores+light+sensitivity+in+blind+rat+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Photonics%22%5BJournal%5D)">A polymer optoelectronic interface restores light sensitivity in blind rat retinas.</a> Nat. Photonics. 7 (5), 400-406 (2013).</li>
<li>Benfenati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photostimulation+of+Whole-Cell+Conductance+in+Primary+Rat+Neocortical+Astrocytes+Mediated+by+Organic+Semiconducting+Thin+Films%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthc.+Mater%22%5BJournal%5D)">Photostimulation of Whole-Cell Conductance in Primary Rat Neocortical Astrocytes Mediated by Organic Semiconducting Thin Films.</a> Adv. Healthc. Mater. 3 (3), 392-399 (2014).</li>
<li>Martino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothermal+cellular+stimulation+in+functional+bio-polymer+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Photothermal cellular stimulation in functional bio-polymer interfaces.</a> Sci. Rep. 5 (8911), (2015).</li>
<li>Antognazza, M. R., Ghezzi, D., Musitelli, D., Garbugli, M., Lanzani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+solid-liquid+polymer+photodiode+for+the+bioenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">A hybrid solid-liquid polymer photodiode for the bioenvironment.</a> Appl. Phys. Lett. 94 (24), 243501(2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essentials+of+Neuroscience.+Patch+Clamp+Electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Essentials of Neuroscience. Patch Clamp Electrophysiology.</a> JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).</li>
<li>Scarpa, G., Idzko, A. L., Götz, S., Thalhammer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+Studies+of+Functionalized+Regioregular+Poly%283-hexylthiophene%29+Layers+for+Sensing+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility Studies of Functionalized Regioregular Poly(3-hexylthiophene) Layers for Sensing Applications.</a> Macromol. Biosci. 10 (4), 378-383 (2010).</li>
<li>Bellani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+P3HT%2FOxygen+Charge+Transfer+Complex+Identification+in+Thin+Films+Exposed+to+Direct+Contact+with+Water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Reversible P3HT/Oxygen Charge Transfer Complex Identification in Thin Films Exposed to Direct Contact with Water.</a> J. Phys. Chem. C. 118 (12), 6291-6299 (2014).</li>
<li>Wells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+stimulation+of+neural+tissue+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical stimulation of neural tissue in vivo.</a> Opt. Lett. 30 (5), 504-506 (2005).</li>
<li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nat. Commun. 3 (736), 1-10 (2012).</li>
<li>Duke, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+selective+suppression+of+neural+activity+with+infrared+light%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Transient and selective suppression of neural activity with infrared light.</a> Sci. Rep. 3 (2600), 1-8 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Krytyczne etapy opisanego protokołu stymulacji optycznej komórek in vitro dotyczą głównie wyboru światłoczułego polimeru, parametrów sterylizacji termicznej, intensywności i czasu trwania bodźców świetlnych. Wybrano tutaj cienką folię P3HT:PCBM, ponieważ gwarantuje ona dobrą stabilność czasową i elektrochemiczną. Należy jednak zauważyć, że nie wszystkie polimery wrażliwe na światło mogą oferować analogowe właściwości22 , a dokładniej po oświetleniu. Ponadto w tym przypadku wybrane parametry sterylizac...

Możliwość manipulowania aktywnością komórkową z precyzyjną rozdzielczością przestrzenną i czasową stanowi kluczową strategię w badaniach neuronaukowych oraz w leczeniu zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych. 1 Tradycyjne metody opierają się na elektrycznej stymulacji komórek za pomocą elektrod umieszczonych w pobliżu lub w kontakcie z docelowym systemem,2 które mogą mieć różną złożoność (pojedyncza komórka, sieć komórkowa, wycinki mózgu, tkanki mózgowe in vivo). W ciągu ostatniego stulecia zastosowanie elektrod typu patch-clamp, elektrod metalowych i zintegrowanych z podłożem dostarczyło szczegółowego obrazu fizjologii i patofizjologii pojedynczych neuronów oraz mechanizmów funkcjonowania sieci neuronowych. Jednak stymulacja elektryczna cierpi na ważne ograniczenia. Pierwszy z nich jest związany z ogólnie słabą rozdzielczością przestrzenną ze względu na fizyczne wymiary elektrod i ich stałą geometrię, której nie można łatwo dostosować do złożonych zorganizowanych systemów, takich jak tkanki biologiczne. Również problemy związane z impedancją elektrod i przesłuchami między systemami stymulacji i rejestracji mogą pogorszyć końcowy stosunek sygnału do szumu pomiarów. 3 Z drugiej strony wykorzystanie światła do stymulacji może pomóc w przezwyciężeniu wielu ograniczeń podejścia elektrycznego. Przede wszystkim oferuje niespotykaną rozdzielczość przestrzenną (< 1 μm) i czasową (< 1 ms), umożliwiając celowanie w określone typy komórek, a nawet podkompartmenty. Ponadto jest wysoce nieinwazyjny, ponieważ unika jakiegokolwiek fizycznego kontaktu z tkanką będącą przedmiotem zainteresowania i oddziela stymulację od nagrywania. Co więcej, zarówno natężenie światła, jak i długość fali mogą być precyzyjnie regulowane, a tym samym można stosować różne protokoły stymulacji. 3,4
Jednak zdecydowana większość komórek zwierzęcych nie wykazuje żadnej szczególnej wrażliwości na światło. W związku z tym zaproponowano kilka strategii stymulacji optycznej, wykorzystując albo wrażliwe na światło mediatory molekularne w pobliżu lub wewnątrz komórek, albo wykorzystując urządzenie fotoaktywne umieszczone na zewnątrz, w pobliżu komórki. Pierwsza kategoria odnosi się do mechanizmów endogennych, takich jak stymulacja za pomocą światła widzialnego lub podczerwonego (IR), a także stosowanie związków fotoizomeryzowalnych/fotorozszczepialnych lub ekspresja genetyczna światłoczułych siłowników molekularnych (optogenetyka). Ta ostatnia klasa obejmuje techniki stymulacji egzogenicznej uzyskanej przy użyciu nieorganicznych nano/mikrocząstek lub fotoprzewodzących substratów krzemowych. 5 Niemniej wszystkie te systemy mają swoje dobre strony i wady. W szczególności endogenna absorpcja komórek w zakresie widzialnym jest słaba i niepewna, a jednoczesne wytwarzanie reaktywnych form tlenu może być szkodliwe dla komórki. Ogólnie rzecz biorąc, podczerwień jest używana do indukowania lokalnego ogrzewania termicznego z powodu absorpcji wody, ale współczynnik ekstynkcji wody jest niewielki, co wymaga silnego światła podczerwonego (od dziesiątek do setek W/mm2), które jest trudne do dostarczenia przez standardową optykę mikroskopu i może stanowić zagrożenie dla bezpieczeństwa w zastosowaniach in vivo. Z drugiej strony, fotoprzełączalne związki do umieszczania w sadzach mają ograniczone w czasie działanie i często wymagają światła UV, które jest trudne do dostarczenia ze względu na ograniczoną penetrację tkanek. Ponadto cierpią na problemy z dyfuzją aktywowanych związków podczas fotolizy poza oświetlanym obszarem. Wreszcie, narzędzia optogenetyczne pozwoliły naukowcom skupić się na określonych subpopulacjach komórkowych i podkompartmentach i szybko stają się jedną z kluczowych technologii w badaniach neuronaukowych. Jednak wprowadzenie egzogennego segmentu DNA za pośrednictwem wektora wirusowego rodzi ważne kwestie bezpieczeństwa, zwłaszcza w świetle adopcji u ludzi. 5,6 Z tych powodów badania nad nowymi materiałami i urządzeniami zdolnymi do optycznej manipulacji komórkami są niezwykle gorącym tematem.
Ostatnio zaproponowano nowatorskie podejście oparte na wykorzystaniu światłoczułych polimerów sprzężonych, zdolnych do efektywnego przekształcania bodźca optycznego w modulację aktywności elektrycznej komórki. Technika stymulacji komórek za pomocą fotowzbudzenia polimerowego (CSPP) wykorzystuje wiele kluczowych cech typowych dla półprzewodników organicznych: są one z natury wrażliwe na światło w zakresie widzialnym; 7 Są biokompatybilne, miękkie i elastyczne, a ich mechaniczna elastyczność pozwala na bliski kontakt z tkankami zarówno in vitro, jak i in vivo8-10. Poza tym można je łatwo funkcjonalizować, aby lepiej dostosować się do interfejsu z żywymi komórkami i umożliwić określone możliwości wzbudzania, sondowania i wykrywania. 11,12 Ponadto wspierają transport elektroniczny i jonowy, co czyni je idealnymi do połączenia elektroniki i biologii. 13,14 Co ciekawe, mogą pracować w trybie fotowoltaicznym, unikając konieczności stosowania zewnętrznego odchylenia w celu wydajnej stymulacji optycznej ogniw. 15 
Niezawodność techniki CSPP została wcześniej wykazana w kilku systemach, w tym w pierwotnych neuronach,15,16 astrocytach,17 drugorzędowych liniachkomórkowych18 i eksplantowanych tkankach siatkówki. 16 W niniejszej pracy szczegółowo opisano wszystkie etapy niezbędne do wytworzenia światłoczułego interfejsu biopolimerowego19 do stymulacji optycznej systemów in vitro. Jako przypadek badawczy zastosowano prototypową organiczną mieszankę fotowoltaiczną z regularnego regionu poli(3-heksylotiofenu) (rr-P3HT), działającego jako donor elektronów, oraz estru metylowego fenylo-C61-kwasu masłowego (PCBM), działającego jako akceptor elektronów. Jako system biologiczny wykorzystywane są komórki ludzkiej embrionalnej nerki (HEK-293). Podano przykład protokołu fotostymulacji ze względnym zapisem aktywności komórek za pomocą pomiarów elektrofizjologicznych.
Opisana platforma ma jednak ogólne znaczenie i może być łatwo rozszerzona na inne sprzężone polimery (poprzez odpowiednie dostosowanie procesu przygotowania roztworu i parametrów osadzania), różne typy komórek (poprzez właściwą zmianę protokołu hodowli komórek, procedury powlekania i czasu wymaganego do wysiewu i proliferacji komórek) oraz różne protokoły stymulacji (długość fali światła, częstotliwość i czas trwania bodźców, gęstość fotowzbudzenia).

<table><tbody><tr><td>rr-P3HT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>698989-5G</td><td></td></tr><tr><td>Podłoża powlekane ITO</td><td>Nano-CS</td><td>IT10300100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>chlorobenzen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319996</td><td></td></tr><tr><td>PCBM</td><td>Nano-C</td><td>Nano-CPCBM-BF</td><td></td></tr><tr><td>aceton&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270725</td><td></td></tr><tr><td>alkohol izopropylowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>563935</td><td></td></tr><tr><td>HEK komórki</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>E-MEM</td><td>LGC STANDARDS SRL</td><td>ATCC-30-2003</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E8008-FBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Standardy LGC srl</td><td>ATCC-30-2020</td><td></td></tr></tbody></table>

optyczna kontrola aktywności elektrycznej żywych komórek za pomocą sprzężonych polimerów

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrydowe interfejsy między organicznymi półprzewodnikami a żywymi tkankami stanowią nowe narzędzie do zastosowań in vitro i in vivo. W szczególności polimery sprzężone wykazują kilka optymalnych właściwości jako substraty dla systemów biologicznych, takich jak dobra biokompatybilność, doskonałe właściwości mechaniczne, tania i łatwa technologia przetwarzania oraz możliwość osadzania na lekkich, cienkich i elastycznych podłożach. Materiały te zostały wykorzystane w interfejsach komórkowych, takich jak sondy neuronowe, tranzystory do wzbudzania i rejestrowania aktywności neuronalnej, bioczujniki i siłowniki do uwalniania leków. Niedawne eksperymenty wykazały również możliwość wykorzystania sprzężonych polimerów do całkowicie optycznej modulacji aktywności elektrycznej komórek. Opisano kilka przypadków badań in vitro, w tym pierwotne sieci neuronowe, astrocyty i drugorzędowe komórki liniowe. Co więcej, wykazano, że fototransdukcja sygnału, w której pośredniczą polimery organiczne, przywraca wrażliwość na światło w zdegenerowanych siatkówkach, co sugeruje, że urządzenia te mogą być w przyszłości stosowane w protezach sztucznej siatkówki. Podsumowując, światłoczułe polimery sprzężone reprezentują nowe podejście do optycznej modulacji aktywności komórkowej.
W tej pracy opisane są wszystkie kroki wymagane do wytworzenia interfejsu biopolimerowego do optycznego wzbudzania żywych komórek. Funkcją aktywnego interfejsu jest przekształcenie bodźca świetlnego w modulację potencjału błony komórkowej. Jako przypadek badawczy, przydatny w badaniach in vitro, cienka warstwa politiofenu jest używana jako funkcjonalna warstwa pochłaniająca światło, a komórki ludzkiej embrionalnej nerki (HEK-293) są wykorzystywane jako biologiczny składnik interfejsu. Podano praktyczne przykłady skutecznej kontroli potencjału błony komórkowej po stymulacji impulsami świetlnymi o różnym czasie trwania. W szczególności wykazano, że zarówno efekt depolaryzujący, jak i hiperpolaryzujący błonę komórkową można osiągnąć w zależności od czasu trwania bodźca świetlnego. Zgłoszony protokół ma ogólne zastosowanie i może być bezpośrednio rozszerzony na inne preparaty biologiczne.

Komórki można łatwo hodować na podłożach P3HT:PCBM, pod warunkiem naniesienia odpowiedniej warstwy adhezyjnej (takiej jak fibronektyna użyta w kroku 3.2 opisanego protokołu). P3HT:PCBM wykazuje piki absorpcji optycznej w zielonej części widma widzialnego; można jednak dobrać inne światłoczułe polimery sprzężone, zależnie od preferowanego zakresu długości fal fotostymulacji (Rycina 2). Biokompatybilność tych podłoży wykazano nie tylko w przypadku linii komórkowych18,2...

Opisano metodę stymulacji aktywności elektrycznej kultur komórkowych in vitro za pomocą światła widzialnego, opartą na użyciu organicznych polimerów półprzewodnikowych.

Optyczna kontrola aktywności elektrycznej żywych komórek za pomocą sprzężonych polimerów

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Ogólnym celem tej metody jest kontrolowanie potencjału błony komórkowej podczas stymulacji impulsami światła widzialnego. Proces fototransdukcji jest pośredniczony przez światłoczuły polimer sprzężony. Metoda ta stanowi nowe narzędzie w dziedzinie technologii, ponieważ reprezentuje cenną alternatywę dla istniejących metod, takich jak optogenetyka i stymulacja termiczna, w zakresie optycznej kontroli aktywności żywych komórek.Głównymi zaletami tej techniki są szybka możliwość integracji z dowolnym rodzajem układu elektrofizjologicznego, potencjalnie wysoka rozdzielczość przestrzenna i czasowa oraz mniejsza inwazyjność. Co więcej, pozwala ona uniknąć transferu genów, który jest wymagany w optogenetyce. Nasza metoda opisana jest tutaj w kontekście fotostymulacji hodowli komórkowych in vitro.Może to jednak otworzyć interesujące możliwości zastosowań in vivo. Procedurę zaprezentują Caterina Bossio oraz Susana Vaquero Morata, pracowniczki postdoktorskie z naszych laboratoriów, odpowiednio z wykształceniem w zakresie biologii i chemii fizycznej. Na początek należy przygotować roztwór światłoczułego polimeru sprzężonego, mieszając P3HT i PCBM w chlorobenzenie w stosunku stężeń jeden do jed

optical-control-living-cells-electrical-activity-conjugated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Tutaj przedstawiono procedurę selektywnej aktywacji białka neuronalnego za pomocą krótkiego impulsu światła poprzez genetyczne kodowanie fotoreaktywnego nienaturalnego aminokwasu do docelowego białka neuronalnego wyrażanego w neuronach w hodowli lub in vivo.

Optyczna kontrola białka neuronalnego za pomocą genetycznie kodowanego nienaturalnego aminokwasu w neuronach

Zaprojektowaliśmy aparat do ciągłej hodowli do użytku z systemami optogenetycznymi do oświetlania kultur mikrobów i regularnego obrazowania komórek w ściekach za pomocą mikroskopu odwróconego. Hodowla, pobieranie próbek, obrazowanie i analiza obrazu są w pełni zautomatyzowane, dzięki czemu dynamiczne reakcje na oświetlenie mogą być mierzone przez kilka dni.

Projekt i wdrożenie zautomatyzowanego systemu oświetlenia, hodowli i pobierania próbek do zastosowań optogenetycznych drobnoustrojów

Przedstawiono protokół analizy żeli utworzonych z optoelektronicznego sprzężonego polimeru poli(3-heksyliofen-2,5-diylu) (P3HT) przy użyciu rozpraszania neutronów pod małym i ultramałym kątem zarówno w obecności jak i bez oświetlenia.

Monitorowanie wpływu oświetlenia na strukturę sprzężonych żeli polimerowych z wykorzystaniem rozpraszania neutronów

Tutaj prezentujemy protokół do analizy transferu informacji oscylacyjnych między komórkami za pomocą kontroli optogenetycznej i monitorowania ekspresji genów na żywo. Podejście to stanowi unikalną platformę do testowania funkcjonalnego znaczenia programów dynamicznej ekspresji genów w systemach wielokomórkowych.

Metoda optogenetyczna do kontroli i analizy wzorców ekspresji genów w interakcjach międzykomórkowych

Tutaj opisujemy optyczne pozyskiwanie i charakterystykę potencjałów czynnościowych z indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych za pomocą szybkiego modułowego systemu fotometrycznego.

Pomiar potencjału czynnościowego optycznego pojedynczej komórki w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Niezawodna kontrola komórek ssaków reagujących na światło wymaga standaryzacji metod optogenetycznych. Aby osiągnąć ten cel, badanie to nakreśla linię budowy obwodów genowych, inżynierii komórkowej, obsługi sprzętu optogenetycznego i testów weryfikacyjnych w celu standaryzacji badania ekspresji genów indukowanej światłem przy użyciu optogenetycznego obwodu genowego o ujemnym sprzężeniu zwrotnym jako studium przypadku.

Niezawodna inżynieria i kontrola stabilnych optogenetycznych obwodów genowych w komórkach ssaków

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia zautomatyzowane wytwarzanie mikrowzorów, które standaryzują kształt komórki, do badania struktur cytoszkieletu w komórkach ssaków. Ta przyjazna dla użytkownika technika może być skonfigurowana z dostępnymi na rynku systemami obrazowania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu niedostępnego dla standardowych laboratoriów biologii komórki.

Kontrola geometrii komórki za pomocą mikromodelowania wspomaganego laserem w podczerwieni

Tutaj prezentujemy metodę wytwarzania systemu optycznego ze światłowodami do dostarczania światła i matrycą elektrod do rejestracji neuronowej. Eksperymenty in vivo na transgenicznych myszach z ekspresją rodopsyny-2 pokazują wykonalność systemu do jednoczesnej stymulacji optogenetycznej i zapisu elektrofizjologicznego.

Matryca optrodowa do jednoczesnej modulacji optogenetycznej i elektrycznego zapisu neuronowego

Ten protokół obejmuje transfekcję czujników cAMP i bPAC-nLuc, białka optogenetycznego, w celu dokładnego śledzenia jego dystrybucji komórkowej i odpowiedzi na stymulację światłem. Innowacyjne podejście polegające na stworzeniu mapy odpowiedzi cAMP przy użyciu systemu skanowania punktowego ma potencjał do przyspieszenia badań nad białkami optogenetycznymi w różnych dziedzinach.

Mapowanie dystrybucji komórkowej białka optogenetycznego za pomocą siatki stymulacji świetlnej

Ten protokół opisuje zastosowanie zaprojektowanej domeny przełącznika allosterycznego aktywowanego niebieskim światłem (LightR) do odwracalnej czasoprzestrzennej kontroli aktywności białek. Wykorzystując kinazę tyrozynową Src jako model, badanie to oferuje skomplikowany protokół do opracowania i scharakteryzowania regulowanego światłem Src (LightR-Src). Pokazuje to wszechstronność tego podejścia w różnych klasach enzymów.

Czasoprzestrzenna kontrola aktywności białek poprzez optogenetyczną regulację allosteryczną

Użycie światła do kontrolowania komórek i tkanek serca umożliwia bezkontaktową stymulację, zachowując w ten sposób naturalny stan i funkcję komórek, co czyni ją wartościowym podejściem zarówno do badań podstawowych, jak i zastosowań terapeutycznych.

Mikrofizjologiczny system serca do badania propagacjiCa2+ za pomocą niegenetycznej stymulacji optycznej

Poznaj metodę optycznej kontroli aktywności komórek za pomocą sprzężonych polimerów półprzewodnikowych. Technika ta umożliwia nieinwazyjną stymulację potencjału błonowego bez konieczności transferu genów, stanowiąc alternatywę dla optygenetyki.

Optyczna kontrola aktywności elektrycznej żywych komórek za pomocą sprzężonych polimerów

Przeglądaj więcej filmów