Model urazu kompresyjnego rdzenia kręgowego u noworodków myszy
27 marca 2016
Ten artykuł opisuje metodę generowania powtarzalnego uszkodzenia kompresyjnego rdzenia kręgowego (SCI) u noworodka myszy. Model ten stanowi korzystną platformę do badania mechanizmów plastyczności adaptacyjnej, które leżą u podstaw spontanicznej odbudowy funkcjonalnej.
Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie powtarzalnego urazu uciskowego rdzenia kręgowego u noworodka myszy. Osiąga się to poprzez najpierw głębokie znieczulenie myszy. Następnie wykonanie laminektomii grzbietowej w celu odsłonięcia rdzenia kręgowego.
I w końcu, powodując uraz kompresyjny. Niedawno ustaliliśmy mysi model noworodka pod kątem uszkodzenia rdzenia kręgowego i wykazaliśmy, że nowonarodzone myszy wykazują zadziwiający stopień plastyczności adaptacyjnej. Badanie tego mechanizmu leżącego u podstaw powrotu do zdrowia może dostarczyć ważnych spostrzeżeń, które można wykorzystać w leczeniu urazów rdzenia kręgowego.
W tym filmie pokażemy, jak wykonać uraz uciskowy rdzenia kręgowego u jednodniowej myszy. Ten zabieg chirurgiczny obejmuje znieczulenie, laminektomię i dwa uciski zewnątrzoponowe za pomocą klipsów. Przygotowanie do zabiegu.
Zabieg wykonywany jest pod mikroskopem stereoskopowym. Umieść podkładkę rozgrzewającą pod mikroskopem. Bardzo ważne jest, aby utrzymać szczenię w cieple, aby uniknąć nagłej śmierci podczas operacji.
Połóż koc chirurgiczny lub duży arkusz czystego, miękkiego papieru laboratoryjnego na podkładce rozgrzewającej. W przypadku analgezji przedoperacyjnej przygotuj strzykawkę insulinową o pojemności 0,3 mililitra 30 mm, wypełnioną środkiem znieczulającym miejscowo, Marcaine, rozcieńczoną sterylnym PBS, do końcowego stężenia 2,5 miligrama na mililitr. Do nacinania skóry, usuwania mięśni i laminektomii należy użyć mikronoża, cienkich kleszczy i cienkich nożyczek do irydektomii.
Zwróć uwagę, że tutaj również używamy kleszczy, które zgięliśmy na końcach, aby uformować zęby. Działają one lepiej niż dostępne na rynku kleszcze zębate, ponieważ zęby muszą być bardzo małe. Do ucisku rdzenia kręgowego należy użyć specjalnie zmodyfikowanego Miniclipa do Tętniaka Tymczasowego Yasargil, który opiszemy później.
Niewielka długość plastikowej rurki kapilarnej jest również niezbędna do wykonania korka, aby zapobiec całkowitemu zamknięciu klipsa, oraz aplikatora klipsowego do umieszczenia klipsa. Do szycia użyj uchwytu na igłę i małych nożyczek, aby przeciąć nić. W celu leczenia bólu należy rozcieńczyć lek Temgesic w sterylnym PBS do 0,03 miligrama na mililitr.
Uraz rdzenia kręgowego polega na uciskaniu za pomocą klipsa przy użyciu miniklipsa Yasargil Temporary Aneurysm Miniclip. Przed użyciem klips należy zmodyfikować mechanicznie, przycinając grubość ostrzy do 150 mikrometrów za pomocą kamienia do ostrzenia. Tuż przed zabiegiem odetnij krótki odcinek plastikowej rurki i umieść go na jednym z ostrzy klipsa.
Rurka działa jak korek, aby zapobiec całkowitemu zamknięciu klipsa. Znieczulenie i analgezja. Do znieczulenia gazowego używamy waporyzatora supranowego podłączonego do butli z tlenem.
Izofluran jest środkiem znieczulającym, który jest odparowywany w czystym tlenie. Aby rozprowadzić Isoflurane, mieszaninę tlenu do myszy, należy zbudować maskę na nos dostosowaną do noworodków. Myszy noworodkowe są tak małe, że maskę można wykonać z końcówki strzykawki, która służy jako wlot dla plastikowej rurki podłączonej do wylotu waporyzatora.
Z boku maski wywierć mały otwór, aby podłączyć rurkę ewakuacyjną, która kończy się regulowaną pompą próżniową, jednostką zbierającą lub po prostu okapem wyciągowym. Wykonaj komorę przelewową anestezjologii za pomocą plastikowej szalki Petriego o wymiarach 150 na 25 mililitrów. Z jednej strony zrób otwór wystarczająco duży na głowę myszy.
Po przeciwnej stronie wykonaj dwa mniejsze otwory o średnicy plastikowej rurki. Na koniec zrób otwór ewakuacyjny, mniejszy niż inne, na wierzchu naczynia. Odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 250 mikrolitrów i włóż ją do tego ostatniego otworu.
Końcówka pipety pełni funkcję łącznika dla rurki ewakuacyjnej, która jest podłączona do urządzenia próżniowego ustawionego na niewielkie podciśnienie. Używając plasteliny, przymocuj maskę tuż w otworze na głowę myszy. Za pomocą taśmy lub plasteliny przymocuj plastikową rurkę do sufitu komory, upewniając się, że rurki są dobrze umieszczone w odpowiednich otworach.
Umieść komorę na kocu chirurgicznym pod mikroskopem. Cały system jest przedstawiony na tym schemacie. Na wyjściu waporyzatora umieszczony jest trójdrożny kran.
Tutaj droga do komory snu jest wolna, podczas gdy droga do maski jest zablokowana, a mysz można umieścić w komorze uśpienia w celu zainicjowania sedacji. Przekręcenie trójdrogowego kurka w prawo umożliwia przepływ gazu do maski i blokuje drogę do komory usypiania. W tej konfiguracji mysz może zostać przeniesiona do maski.
Wyciek gazu jest usuwany przez podciśnienie z komory przelewowej. Wybierz szczeniaka myszy, który ostatnio pił mleko, o czym świadczy biały kolor widoczny przez skórę. Umieść szczeniaka w komorze snu i wprowadź odparowany izofluran w stężeniu 4%, aby uzyskać szybkie uspokojenie.
Przenieś szczeniaka do maski. Ostrożnie umieść pysk myszy dobrze w masce, aby zapewnić wystarczającą ekspozycję na gaz znieczulający. Przekręć trójdrożny kurek, aby skierować gaz w kierunku maski.
Wstrzyknąć podskórnie 50 mikrolitrów Marcaine w dawce 2,5 miligrama na mililitr w żądanym miejscu operacji. Należy uważać, aby nie wstrzykiwać zbyt głęboko, ponieważ naczynia krwionośne mogą łatwo zostać trafione, a wprowadzenie Marcaine do naczynia jest śmiertelne. Zetrzyj nadmiar Marcaine małym sterylnym kompresem.
Laminektomia grzbietowa. Zmniejsz stężenie izofluranu do jednego do dwóch procent. Po kilku minutach przekłuj skórę mikronożem i wykonaj otwór transferowy o średnicy od ośmiu do dziewięciu milimetrów, delikatnie pociągając za skórę w kierunku rostralnym ogonowym.
Otwór przenoszący jest znacznie wygodniejszy i zapewnia lepszy dostęp boczny do wykonania laminektomii. Wycofaj krawędzie nacięcia skóry z leżącej pod spodem tkanki, wprowadzając kawałki spongistatyny, podskórnie rostralnie i doogonowo do nacięcia. Przetnij mięśnie przedkręgowe cienkimi nożyczkami, aby odsłonić kręgosłup.
Należy zauważyć, że u noworodka wyrostek rdzeniowy nie jest w pełni rozwinięty. Zidentyfikuj linię środkową i przetnij blaszkę poprzecznie cienkimi nożyczkami. Zwróć uwagę, aby nie ciąć zbyt głęboko, ponieważ może to potencjalnie uszkodzić oponę twardą, a nawet rdzeń kręgowy.
Ostrożnie umieść jedno ostrze cienkich kleszczyków między blaszką a oponą twardą. Chwyć blaszkę, zamykając kleszcze i podnieś ją ostrożnie, aż się odczepi, pozostawiając oponę twardą w takcie. Powtórz ten krok dwa do trzech razy, aby uzyskać laminektomię z jednego do dwóch segmentów.
Kontroluj krwawienie za pomocą małych kawałków spongistatyny. Używając cienkich kleszczy jako rongeurów, usuń części stawów międzywyrostkowych obustronnie, aby uzyskać wystarczająco dużo miejsca, aby umieścić zmodyfikowany miniklips tętniaka w kanale kręgowym. Ten krok często powoduje krwawienie, które można opanować za pomocą małych kawałków spongistatyny.
Aby poprawić widoczność, czasami warto spłukać ciepłym sterylnym PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Generowanie urazu kompresyjnego rdzenia kręgowego. Otwórz klips i umieść ostrza po obu stronach rdzenia kręgowego w przestrzeniach między stawami fasetowymi a rdzeniem.
Upewnij się, że ostrza są włożone wystarczająco głęboko, aby objąć brzuszną część rdzenia kręgowego. Szybko zamknij klips, trzymając aplikator na miejscu, aby uniknąć zsunięcia się klipsa do tyłu. Po 15 sekundach szybko zwolnij klips.
Oczyść ranę za pomocą spongistatyny. Aby uzyskać symetryczną kompresję, odwróć ostrza i wykonaj drugą kompresję przez 15 sekund w przeciwnej orientacji. Szycie. Usuń kawałki spongistatyny, które zostały umieszczone pod skórą na początku zabiegu i zamknij skórę szwami 6,0.
Wstrzyknąć 0,05 mililitra, Temgesic, w ilości 0,03 miligrama na mililitr podskórnie za pomocą strzykawki insulinowej o rozmiarze 30 i umieścić szczenię w środowisku o kontrolowanej temperaturze 30 stopni Celsjusza na kilka godzin. Aby zmniejszyć agresywne zachowanie matki w stosunku do operowanego szczeniaka w ciągu pierwszej nocy po operacji, należy przygotować roztwór Diazepamu, rozcieńczony w czystym PBS, do 0,1 miligrama na mililitr do wstrzyknięcia dootrzewnowego w ilości ośmiu gramów na kilogram. Wyniki.
Jak pokazuje ten wykres, sześć godzin po ucisku rdzenia kręgowego, na niższych poziomach klatki piersiowej, tylne kończyny rannych myszy są sparaliżowane, podczas gdy kończyny przednie nie. W przypadku pozorowanych zwierząt kontrolnych, które przeszły jedynie laminektomię, zarówno kończyny tylne, jak i przednie są bardzo ruchome. Na odcinku rdzenia kręgowego na widok urazu widoczne są resztki krwi.
Ponadto tkanka jest półprzezroczysta, co sugeruje utratę tkanki, co często prowadzi do powstania ubytku kilka dni później. Konkluzja. Po tym filmie powinieneś dobrze zrozumieć, jak wygenerować uraz kompresyjny rdzenia kręgowego u noworodka myszy. Zaletą korzystania z myszy noworodkowych jest to, że możemy użyć określonych metod w celu rozwiązania problemu plastyczności adaptacyjnej, której nie można zastosować u dorosłych myszy.
Ponadto model stanowi platformę do testowania podejść terapeutycznych, takich jak przeszczep komórek macierzystych.
Przegląd
W niniejszym artykule opisano metodę generowania powtarzalnego urazu uciskowego rdzenia kręgowego (SCI) u noworodków myszy. Model ten jest korzystny do badania mechanizmów plastyczności adaptacyjnej, które leżą u podstaw spontanicznej regeneracji funkcjonalnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Neurobiologia
- Modele urazów
Wprowadzenie
- Urazy rdzenia kręgowego mogą prowadzić do znacznych upośledzeń funkcjonalnych.
- Myszy noworodkowe wykazują niezwykłą zdolność do regeneracji.
- Zrozumienie plastyczności adaptacyjnej jest kluczowe dla opracowania metod leczenia.
- Model ten umożliwia prowadzenie kontrolowanych eksperymentów nad SCI.
Cel badania
- Ustanowienie powtarzalnego modelu urazu uciskowego rdzenia kręgowego.
- Zbadanie mechanizmów regeneracji u noworodków myszy.
- Dostarczenie informacji przydatnych w opracowaniu potencjalnych metod terapeutycznych.
Zastosowane metody
- Głęboka narkoza noworodków myszy.
- Laminektomia grzbietowa w celu odsłonięcia rdzenia kręgowego.
- Uraz kompresyjny z zastosowaniem zmodyfikowanego mikroklipsa do tętniaków Yasargil.
- Pooperacyjna analgezja w celu opanowania bólu.
Główne wyniki
- Model skutecznie indukuje uraz polegający na ucisku rdzenia kręgowego.
- Noworodki myszy wykazują znaczną plastyczność adaptacyjną po urazie.
- Zdobyta wiedza może pomóc w opracowaniu przyszłych metod leczenia urazów rdzenia kręgowego.
- Szczegółowy protokół chirurgiczny zapewnia powtarzalność modelu.
Wnioski
- Model ten jest cennym narzędziem do badania urazów rdzenia kręgowego.
- Zrozumienie mechanizmów regeneracji może prowadzić do opracowania lepszych terapii.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych podstawowych pracach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Ten model ucisku rdzenia kręgowego u noworodkowych myszy umożliwia badanie mechanizmów plastyczności adaptacyjnej w procesie regeneracji po urazie w wczesnej fazie życia, oferując system istotny z punktu widzenia patologii do weryfikacji hipotez terapeutycznych. Poprzez rejestrację dynamiki spontanicznego powrotu funkcji, model ten wspiera walidację celów oraz przesiew fenotypowy w przedklinicznych programach neurobiologicznych. Jego przydatność w badaniach nad dziecięcymi urazami rdzenia kręgowego oraz potencjalna ciągłość translacyjna w odniesieniu do wskazań u dorosłych usprawniają podejmowanie decyzji na poziomie portfela w procesie odkrywania neuroterapiutyków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących mechanizmów plastyczności adaptacyjnej w urazach rdzenia kręgowego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia biologicznie relewantny system do walidacji funkcjonalnej celów terapeutycznych poprzez odczyty behawioralne i elektrofizjologiczne.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie szlaków plastyczności we wczesnych etapach życia z potencjalnymi celami terapeutycznymi.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Pozwala na wygenerowanie standaryzowanego, powtarzalnego modelu urazu, odpowiedniego do przesiewu związków oraz testowania interwencji terapeutycznych.
- Wyniki ilościowe: Umożliwia pomiar zmiennych zależnych, w tym ruchomości kończyn tylnych, łączności synaptycznej oraz aktywności elektrofizjologicznej.
- Skalowalność: Wspiera wysokoprzepustowe rejestrowanie optyczne oraz analizy fizjologiczne ex vivo w celu dalszego rozwoju procedur analitycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Model pediatycznego urazu rdzenia kręgowego z dowodami ostrego upośledzenia kończyn tylnych i powrotu do sprawności funkcjonalnej w ciągu dwóch tygodni.
- Ciągłość translacyjna: Wykorzystuje wspólne mechanizmy plastyczności rdzenia kręgowego noworodków i dorosłych w celu uzyskania wglądu w procesy zachodzące w różnych grupach wiekowych.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Umożliwia ocenę kandydatów terapeutycznych z wykorzystaniem powrotu do sprawności funkcjonalnej i ponownego tworzenia połączeń synaptycznych jako biomarkerów prognostycznych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum odkryć, od walidacji celu po przedkliniczne testy skuteczności, w szczególności w odniesieniu do podejść neuroprotekcyjnych i neurorestauracyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących plastyczności adaptacyjnej i mechanizmów regeneracji funkcjonalnej po kompresji rdzenia kręgowego.
- Przesiewanie: Umożliwia opracowanie testów do oceny związków chemicznych z wykorzystaniem mierzalnych punktów końcowych behawioralnych i fizjologicznych.
- Analityka: Generuje pomiary zmiennych zależnych, takich jak sygnały elektrofizjologiczne i optyczny zapis połączeń synaptycznych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia dotyczące plastyczności we wczesnych etapach życia z urazami rdzenia kręgowego u dorosłych poprzez konserwatywne mechanizmy biologiczne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do iteracyjnego testowania interwencji terapeutycznych na etapach odkrywania i przedklinicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność w odniesieniu do celu poprzez wyjaśnienie mechanizmów spontanicznego powrotu do zdrowia i plastyczności adaptacyjnej.
- Wartość operacyjna: Dostarcza powtarzalny model chirurgiczny ze zstandaryzowanymi parametrami kompresji i opieką pooperacyjną.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie wczesnych sygnałów skuteczności w modelu urazu o wysokiej plastyczności.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację neuroterapeutyków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o funkcjonalny powrót do zdrowia oraz biomarkery naprawy synaptycznej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z noworodkami myszy, mikrochirurgii oraz technik rejestracji elektrofizjologicznej.
- Zależne od specjalistycznego instrumentarium, w tym mikroskopu stereoskopowego, aplikatora miniklipów do tętniaków oraz systemów rekonwalescencji z kontrolą temperatury.
- Wymaga standaryzacji działań zespołów chirurgicznych w celu zapewnienia spójności wykonywanej laminektomii i wywoływania urazu uciskowego.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy przenoszeniu wyników z kontekstu rdzenia kręgowego noworodków na dorosłe zwierzęta lub ludzi.
- Ograniczenia praktyczne obejmują specyficzność modelu dla wczesnych etapów postnatalnych oraz potencjalną zmienność stopnia ciężkości urazu wynikającą z rozmieszczenia klipsa.
