Name: Model urazu kompresyjnego rdzenia kręgowego u noworodków myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: Poznaj metodę kompresyjnego urazu rdzenia kręgowego u noworodków myszy. Ten model pozwala badać mechanizmy plastyczności adaptacyjnej i odbudowy funkcji, dostarczając cennych informacji dla rozwoju terapii urazów rdzenia kręgowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta dotacjami z Regionalnego Urzędu ds. Zdrowia Południowo-Wschodniej Norwegii (JLB, 2014119; JCG, numery projektów 2015045 i 2012065), przez Norweską Radę ds. Badań Naukowych (JCG, numer projektu 23 00 00) i Uniwersytet w Oslo.

Ten eksperymentalny protokół został zatwierdzony przez Krajowy Urząd ds. Badań nad Zwierzętami w Norwegii (Forsøksdyrutvalget, lokalny numer zatwierdzenia eksperymentalnego 12.4591) zgodnie z przepisami Unii Europejskiej dotyczącymi opieki nad zwierzętami (Federacja Europejskiego Stowarzyszenia Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych). Starano się zminimalizować liczbę wykorzystywanych zwierząt i ich cierpienie. W artykule opisano procedurę zastosowaną na pourodzeniowych (P) myszach ICR (Imprinting Control Region) typu dzikiego (Jackson, USA) w dniu 1 (Jackson, USA), ale to samo podejście można również zastosować na późniejszych etapach.
1. Konstruowanie systemu znieczulenia gazowego dla noworodków myszy (Rysunek 1)
<ol>
	<li>Zbuduj maskę na nos z końcówki strzykawki. Podłącz go do 3-drogowego kranu z plastikową rurką (Rysunek 1 - czerwona rurka i Rysunek 2A1).</li>
	<li>Wywierć mały otwór z boku maski na nos i podłącz go do plastikowej rurki, aby usunąć nadmiar gazu z maski. Zakończyć rurkę albo przy pompie próżniowej ustawionej na lekkie podciśnienie, albo w okapie wyciągowym (Rysunek 1 - jasnozielona rurka).</li>
	<li>Wykonać komorę anestezjoterapeutyczną z plastikowej szalki Petriego o wymiarach 150 mm x 25 mm (ryc. 2A2).
	<ol>
		<li>Z jednej strony zrób otwór wystarczająco duży, aby pomieścić głowę myszy i maskę na nos.</li>
		<li>Po przeciwnej stronie wykonaj dwa mniejsze otwory, przez które można włożyć plastikowe rurki do i z maski na nos (Rysunek 1 - odpowiednio czerwona i jasnozielona rurka).</li>
		<li>Zrób trzeci otwór w górnej części pokrywy i przymocuj do niego trzecią plastikową rurkę, która kończy się na pompie próżniowej (Rysunek 1 - ciemnozielona rurka). Celem tej trzeciej rurki jest zapewnienie, że nadmiar gazu, który nie został wychwycony przez wylot z maski na nos, zostanie usunięty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbuduj komorę do spania, robiąc otwór w dnie dowolnego naczynia laboratoryjnego, które jest wystarczająco duże, aby pomieścić mysz i ma gładką i równą krawędź (otwór naczynia musi leżeć równo ze stołem, aby zapobiec wyciekowi gazu). Podłącz otwór w komorze do 3-drogowego kranu z plastikową rurką (Rysunek 1 - brązowa rurka). Umieść komorę spania pod wyciągiem.</li>
	<li>Podłącz 3-kierunkowy kran do rurki wylotowej parownika (Rysunek 1 - żółta rurka i Rysunek 2A3).</li>
	<li>Podłącz wlot parownika do źródła tlenu (Rysunek 1 - niebieska rurka).</li>
</ol>
2. Modyfikacja mini-klipsa do tymczasowego tętniaka Yasargil w celu stworzenia narzędzia do kompresji (Rysunek 2 i Tabela 1)
<ol>
	<li>Przymocuj klips mocno do stojaka za pomocą clamp. Używając lupy lornetkowej do kontroli wizualnej, spiłuj zewnętrzną powierzchnię końcówki każdego ostrza klipsa do końcowej grubości około 150 μm za pomocą kamienia do ostrzenia zamontowanego na wiertle (Rysunek 2B i C).</li>
	<li>Wykonaj korek do klipsa, przecinając krótki odcinek rurki kapilarnej z polietylenu (Tabela 1) pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą mikronoża (Tabela 1) i umieść go na jednym z ostrzy (Rysunek 2A4 oraz Rysunki 2B i C). Zapobiega to całkowitemu zamknięciu klipsa i tworzy ustandaryzowane wymiary kompresji. Gdy klips jest zamknięty, odległość między ostrzami wynosi około 230 μm. Zrób nowy korek dla każdego eksperymentu, ponieważ materiał polietylenowy może się ściskać podczas użytkowania, co zmieni przestrzeń między ostrzami. 
	Uwaga: Napięcie sprężyny klipsa zmniejsza się z czasem, tak że po około 80 ściśnięciach klips nie zamyka się już całkowicie do korka i wymaga wymiany.</li>
</ol>
3. Przygotowanie przed operacją
<ol>
	<li>Umieść mysz w komorze uśpienia (Rysunek 1) i rozpocznij znieczulenie 4% izofluranem (Rysunek 2A5) odparowanym w czystym tlenie, używając parownika (Rysunek 2A3 i Tabela 1).</li>
	<li>Przetestuj odruch wycofania myszy, delikatnie ściskając pajęczynę skóry między palcami cienkimi plastikowymi kleszkami. Rób to ostrożnie, ponieważ nowonarodzone myszy łatwo się zraniły. Zbyt mocne szczypanie powoduje natychmiastowe siniaki. Wykonanie tego testu na początku sedacji wyzwala odruch i zapewnia dobre wskazanie ilości niezbędnej siły.</li>
	<li>Po zniesieniu odruchu wyjmij mysz z komory usypiania i umieść ją w pozycji leżącej na stole operacyjnym z pyskiem włożonym do maski na nos, która zapewnia ciągły dopływ 4% izofluranu zmieszanego z czystym tlenem (ryc. 1). Upewnij się, że wkładka rozgrzewająca jest włączona i ustawiona na 37-38 °C, ponieważ hipotermia podczas operacji może być śmiertelna.</li>
	<li>Aby uzyskać całkowitą analgezję, należy wstrzyknąć podskórnie 50 μl znieczulenia miejscowego Bupiwakainy (2,5 mg/ml, ryc. 2A6) w miejscu operacji (w opisanych tutaj eksperymentach jest to na poziomie klatki piersiowej (T)9-T11). Do wykonania wstrzyknięcia należy użyć strzykawki insulinowej (300 μl, 30 G, Rysunek 2A7 i Tabela 1).</li>
	<li>Zmniejszyć stężenie izofluranu dostarczanego do maski na nos do 1-2%.</li>
</ol>
4. Laminektomia grzbietowa
<ol>
	<li>Wykonaj operację pod kontrolą mikroskopową.</li>
	<li>Po oczyszczeniu obszaru operacyjnego glukonianem chlorheksydyny (Tabela 1 #19) przez co najmniej 30 sekund, wykonaj poprzeczne nacięcie skóry o średnicy 1-2 mm w T9-T11 za pomocą mikronoża (Ryc. 2A8). 
	Uwaga: U nowonarodzonych myszy ICR rostralna część żołądka, widoczna, gdy zawiera mleko, jest skierowana w stronę poziomów kręgów T12-T13 (ryc. 3). Kolejnym punktem orientacyjnym jest rostralna część podskórnego agregatu tkanki tłuszczowej klatki piersiowej, która kończy się około T8-9. Ten punkt orientacyjny jest widoczny dopiero po nacięciu skóry.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy (ryc. 2A9 i A10) poszerzyć otwór skóry w kierunku poprzecznym do 8-9 mm, delikatnie pociągając skórę w kierunku rostralnym i doogonowym (skóra łatwo się rozrywa, tworząc gładką i prostą ranę). Zapewnia to wystarczający dostęp boczny do kręgosłupa.</li>
	<li>Wycofaj krawędzie nacięcia skóry z leżących poniżej struktur, wkładając sterylne kawałki hemostatycznej gąbki żelatynowej (ryc. 2A11 i tabela 1) podskórnie rostralne i doogonowe do nacięcia. Powiększa to otwór i zapobiega cofaniu się skóry i zasłanianiu obszaru podczas zabiegu. Hemostatyczną gąbkę żelatynową nie trzeba przed użyciem moczyć w soli fizjologicznej.</li>
	<li>Aby odsłonić kręgosłup, należy wypreparować mięśnie przykręgosłupowe za pomocą cienkich nożyczek (ryc. 2A12 i tabela 1). Przeciąć przyczepy mięśni do kręgosłupa i odsłonić blaszkę (ryc. 4A). Należy również pamiętać, że na tym etapie wyrostek rdzeniowy jest słabo rozwinięty.</li>
	<li>Zidentyfikuj linię środkową i przetnij poprzecznie między dwiema blaszkami (która na tym etapie jest chrzęstna) cienkimi nożyczkami (ryc. 4B). Ostrożnie umieść jedno ostrze cienkich kleszczyków między blaszką a oponą twardą (ryc. 4C), chwyć blaszkę kleszczami i ostrożnie podnieś ją, aż kawałek oderwie się, pozostawiając oponę twardą nienaruszoną (ryc. 4D). Powtórz to 2-3 razy, aby uzyskać laminektomię o długości 1-2 segmentów.</li>
	<li>Używając cienkich kleszczy jako rongeurów, usuń części stawów międzywyrostkowych obustronnie, aby uzyskać wystarczająco dużo miejsca, aby umieścić klips w kanale kręgowym. Oczyść obszar operacyjny i zatamuj krwawienie małymi kawałkami hemostatycznej gąbki żelatynowej.</li>
</ol>
5. Uraz kompresyjny rdzenia kręgowego
<ol>
	<li>Otwórz zmodyfikowany mini-klips tętniaka w uchwycie zacisku (ryc. 2A13 i ryc. 2B) i umieść ostrza po obu stronach rdzenia kręgowego w przestrzeniach między stawami fasetowymi a rdzeniem. Upewnij się, że ostrza są włożone wystarczająco głęboko, aby wpłynąć na brzuszną część rdzenia kręgowego. Jeśli nie jest to możliwe, usuń więcej połączeń międzywyrostkowych.</li>
	<li>Szybko zwolnij mini-klips, przytrzymując go na miejscu za pomocą uchwytu klipsa, aby zapobiec jego przesuwaniu się. Utrzymuj kompresję przez 15 sekund.</li>
	<li>Szybko otwórz mini-klips i wyjmij go. Aby uzyskać symetryczną kompresję, odwróć orientację mini-klipsa i używając łatwo widocznego śladu pozostawionego przez obrzęk krwotoczny z pierwszego ucisku jako wskazówki, zmień położenie klipsa w odwrotnej orientacji na drugą 15-sekundową kompresję (wcześniejsze eksperymenty wykazały, że generuje to symetryczne deficyty histologiczne i fizjologiczne, podczas gdy pojedyncze uciskinie 1). Opona twarda nie powinna zostać uszkodzona przez kompresję.</li>
	<li>Oczyść obszar i utrzymuj hemostazę za pomocą kawałków hemostatycznej gąbki żelatynowej.</li>
	<li>Usuń kawałki hemostatycznej gąbki żelatynowej, które zostały umieszczone pod krawędziami nacięcia skóry na początku zabiegu i zamknij nacięcie skóry sterylnym szwem 6,0 i uchwytem na igłę (ryc. 2A14 i 15).</li>
	<li>Wstrzyknąć podskórnie 0,75 mg/kg masy ciała buprenorfiny (ryc. 2A16) rozcieńczonej w sterylnym PBS za pomocą strzykawki insulinowej (300 μl, 30 G).</li>
</ol>
6. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Wyjmij mysz z maski na nos i umieść ją w komorze o kontrolowanej temperaturze ustawionej na 30 °C, aż znieczulenie ustąpi, a mysz stanie się czujna (zwykle wystarcza 1-3 godziny).</li>
	<li>Wstrzyknąć diazepam (ryc. 2B17) dootrzewnowo matce (8 g/kg masy ciała). Powoduje to odrętwienie, które zmniejsza ryzyko kanibalizmu podczas pierwszej nocy, kiedy ryzyko to jest najwyższe.</li>
	<li>Umieść obsługiwaną mysz z powrotem w śmieciu.</li>
	<li>Jeśli miot jest duży (>12 młodych), należy usunąć część nieoperowanych młodych, najlepiej większe zwierzęta, jeśli różnią się wielkością, aby zmniejszyć konkurencję o mleko. Opieka matczyna nad operowanymi młodymi jest najlepsza w linii ICR, jeśli wielkość miotu wynosi około 9 młodych.</li>
	<li>W celu leczenia bólu buprenorfinę (0,75 mg/kg masy ciała) podaje się podskórnie raz na dobę w pierwszych dniach po operacji, za pomocą strzykawki insulinowej (300 μl, 30 G). Odpowiednia objętość do wstrzyknięcia podskórnego to 30-50 μl. U nowonarodzonych myszy wokalizacja i pobudzenie są dobrymi wskaźnikami bólu.</li>
	<li>Wykonuj codzienne badanie rannych myszy za pomocą arkusza wyników, aby ocenić odżywianie, masę ciała, odwodnienie, ból, gojenie się ran, zatrzymywanie moczu i stan infekcji. Zgodnie z uzyskanym punktem, należy zapewnić specjalną opiekę, taką jak wstrzyknięcia sterylnego roztworu żywieniowego dla dzieci (Tabela 1 #18) w przypadku nieprawidłowego odżywiania. Arkusz wyników określa również kryteria humanitarnego punktu końcowego. Matka, która nie odrzuca rannych szczeniąt, jest najlepszym opiekunem.</li>
	<li>W nietypowym przypadku dysfunkcji pęcherza moczowego należy wykonywać masaż pęcherza dwa razy dziennie, aż do przywrócenia funkcji. Odbywa się to poprzez umieszczenie myszy w pozycji leżącej w jednej ręce i delikatne masowanie dolnej części brzucha w kierunku rostro-ogonowym za pomocą opuszka palca.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule opisano procedury postępowania w przypadku urazu SCC generowanego przez klips u myszy P1. Te same procedury można również wykonać na późniejszych etapach. Urazy kompresyjne przeprowadzono z powodzeniem w P5, P7, P9 i P12 (Züchner i wsp., rękopis w przygotowaniu). Na wszystkich etapach poporodowych znieczulenie ogólne uzyskuje się za pomocą izofluranu odparowanego w czystym tlenie, ale wynik znieczulenia zależy w dużej mierze od wieku. W początkowych próbach P1-P4, przed wprowadzeniem znieczulenia miejscowego do protokołu, trudno było uzyskać głęboką i przedłużoną sedację ze względu na wąskie okno dawka-efekt między niewystarczającą sedacją a przedawkowaniem. Ponadto podniesiono obawy związane z neurotoksycznym działaniem izofluranu u nowonarodzonych zwierząt27-30. Połączenie izofluranu i miejscowo znieczulającego bupiwakainy powoduje głębsze i bardziej stabilne znieczulenie, umożliwiając jednocześnie zmniejszenie dawki izofluranu o współczynnik 2-3. Opisano różne rodzaje znieczulenia u noworodków gryzoni, w tym krioanezjologię31,32, ale jedną z potencjalnych niedogodności krioanestezjologii jest jej działanie neuroprotekcyjne (ocenione przez 33,34), co może skomplikować generowanie skutecznego i powtarzalnego urazu. Uważa się, że znieczulenie oparte na barbituranach ma niższą skuteczność u nowonarodzonych myszy ze względu na niższy poziom albuminy w surowicy i tkanki tłuszczowej niż u dorosłych35,36.
Chociaż jest to dość inwazyjne i traumatyczne, po ustaleniu procedury śmiertelność podczas operacji jest niska. Istnieją jednak krytyczne etapy podczas zabiegu, które wymagają szczególnej uwagi, aby poprawić powrót do zdrowia i przeżycie operowanych myszy. Ważną kwestią jest wybór szczeniąt, które będą miały największe szanse na przeżycie operacji. Gdy miot jest duży, stan odżywienia poszczególnych szczeniąt jest różny. Oprócz nieuniknionego krwawienia, które występuje podczas operacji, operowane szczenięta spędzają godziny z dala od matki i często nie piją mleka przed następnym rankiem. Dlatego korzystne jest wybieranie szczeniąt, które mają już pewną ilość mleka w żołądku. Jest to łatwo widoczne przez skórę brzucha od P0 do P7.
Pierwszej nocy operowane szczenię jest narażone na duże ryzyko kanibalizacji przez matkę. Podczas początkowego rozwoju tego modelu ponad połowa operowanych myszy nie miała już miejsca następnego ranka, z wyraźnymi śladami krwi w klatce. Nekrofagia, kanibalizm i dzieciobójstwo u gryzoni są badane od dziesięcioleci37-40. W tym badaniu kanibalizm był obserwowany tylko raz, ale został uznany za bardziej prawdopodobne wyjaśnienie niż nekrofagia, ponieważ szczenięta, które zostały zwrócone do klatki, były zazwyczaj w tak dobrej kondycji, że śmierć z przyczyn naturalnych w nocy wydawała się nieprawdopodobna. To skłoniło do pomysłu zastosowania odwracalnego środka farmakologicznego, takiego jak Diazepam, w celu zmniejszenia lęku i agresywności u matki (sprawdzone przez 41). Dootrzewnowe wstrzyknięcie diazepamu znacznie poprawiło sytuację, zmniejszając śmiertelność w ciągu pierwszej nocy z ponad 60% do mniej niż 20%.
Zmniejszenie wielkości miotu poprzez ubój i jak najmniejsze naruszanie ściółki po powrocie pooperacyjnym to dodatkowe elementy, które mogą przynieść korzyści operowanym zwierzętom. Jednak pozostawienie z matką tylko operowanych szczeniąt nie jest korzystne. Najlepsza równowaga operowanych/nieoperowanych szczeniąt może się różnić w zależności od linii, ale w przypadku myszy ICR i SCID-ICR pozostawienie 4-5 operowanych szczeniąt (uraz lub pozorowanie) wraz z 3-4 nieoperowanymi młodymi dało najlepsze wyniki.
Ogólnie rzecz biorąc, głównym ograniczeniem tego modelu SCI u noworodków jest to, że rdzeń kręgowy noworodka różni się pod wieloma względami od rdzenia kręgowego dorosłego, a zatem może nie zapewniać wyników eksperymentalnych, które są porównywalne z wynikami uzyskanymi z modeli SCI dla dorosłych. Różnice te obejmują ogólny rozmiar i objętość rdzenia kręgowego, liczbę komórek, niedostateczną reprezentację określonych typów komórek, takich jak oligodendrocyty, niedojrzałe odpowiedzi immunologiczne i niedojrzałe obwody neuronalne. Wnioski płynące z eksperymentów w tym modelu muszą być zatem starannie przemyślane. Z drugiej strony, model ten jest istotny dla stosunkowo mniej zbadanego scenariusza SCI u dzieci. Co więcej, wyraźna słabość w stosunku do modeli SCI u dorosłych jest również potencjalną mocną stroną, ponieważ może pozwolić na wyjaśnienie mechanizmów plastyczności, które, choć w minimalnym stopniu występują w dorosłym rdzeniu kręgowym, mogą stanowić substrat terapeutyczny, jeśli zostaną przywrócone. Można sobie wyobrazić, że przywrócenie stanu noworodkowego, a nawet embrionalnego, może być realizowane poprzez implantację mniej rozwiniętych komórek lub tkanek lub poprzez leczenie odczynnikami, które powodują powstanie dorosłej tkanki o wcześniejszych cechach rozwojowych. Wykorzystanie enzymów do eliminacji sieci okołoneuronalnych jest przykładem tego drugiego podejścia42,43.
Głównym problemem przy ustalaniu modelu zwierzęcego dla SCI jest uzyskanie ustandaryzowanego urazu. Jest to ważny aspekt, który został uwzględniony w wielu modelach SCI, np. przecięcie, hemisekcja, impaktory, ściskanie balonu, zgniatanie kleszczami, ściskanie ciężarem statycznym itp. Jeśli chodzi o urządzenia uderzające, wysiłki w tym kierunku zaowocowały modelami SCI u dorosłych gryzoni, w których można manipulować wieloma parametrami uderzenia, takimi jak prędkość, siła i czas trwania (sprawdzone przez 44). Inne podejście, wymagające mniejszej ilości sprzętu, wykorzystuje modyfikację klipsa do tętniaka Kerra-Lougheeda45,46. Te 2 podejścia są komplementarne, ponieważ impaktor naśladuje uraz spowodowany kontuzją, podczas gdy klips naśladuje uraz kompresyjny z pewnym stopniem współistniejącego niedokrwienia. Ze względu na znaczne ograniczenia rozmiaru i większą podatność nowonarodzonych myszy, wyższą śmiertelność związaną z dłuższymi operacjami, a także koszty opracowania sprzętu na mniejszą skalę, zdecydowano się na opracowanie kompresji generowanej przez klips, a nie kontuzji generowanej przez impaktor. Udało się to osiągnąć poprzez dostosowanie dostępnego na rynku miniklipsa do tętniaka do rozmiaru kręgosłupa nowonarodzonych myszy1. Dodanie korka zapewnia znormalizowaną szerokość kompresji i tak długo, jak napięcie klipsa ściska się do granicy korka, siła ściskania podczas fazy statycznej przy minimalnej szerokości powinna się nieznacznie różnić. To, co nie jest znormalizowane, to prędkość ściskania podczas fazy dynamicznej, ponieważ będzie się ona zmieniać wraz ze zmianami naprężenia klipsa w okresie jego użytkowania. Ponieważ statyczna faza kompresji trwa znacznie dłużej niż faza dynamiczna i niewiele wskazuje na to, że tkanka rdzenia kręgowego wywiera dużą siłę przeciwną przeciwko ostrzom mini-klipsa, jest prawdopodobne, że ciężkość urazu jest najbardziej zależna od fazy statycznej. To jednak pozostaje do przetestowania. Ciężkość urazu może zależeć od wielu czynników, w tym statycznej siły i czasu trwania kompresji, prędkości kompresji i dekompresji, pozycji mini-klipsa oraz liczby uciśnięć wykonanych w tym samym miejscu. W związku z tym kombinatoryczna zmienność tych parametrów może skutkować generowaniem spektrum ciężkości urazów od słabych do ciężkich. Pomimo potencjalnej zmienności, w naszym wcześniej opublikowanym badaniu1 uzyskaliśmy spójne wyniki na poziomie histologicznym, fizjologicznym i behawioralnym, więc niewiele wskazuje na to, że akceptowalna standaryzacja jest trudna do osiągnięcia. Zwracamy uwagę, że w tym badaniu zastosowaliśmy wiele metod walidacji na każdym poziomie, w tym testy behawioralne, takie jak air-stepping, jak pokazano na rysunku 5.
W tym modelu SCI u noworodków uraz oszczędza pewną część aksonów, a tym samym zapewnia sytuację sprzyjającą wywołaniu plastyczności adaptacyjnej poprzez przemodelowanie oszczędzonych połączeń i tworzenie nowych obwodów. Co więcej, ponieważ nowonarodzona mysz dobrze nadaje się do badania wieloma metodami eksperymentalnymi, możliwe jest wykorzystanie tego modelu do badania funkcjonalnego odzyskiwania i plastyczności adaptacyjnej z podejściem integracyjnym, w tym testami behawioralnymi, śledzeniem aksonów wstecznych i następczych, immunohistochemią, elektrofizjologią i wysokoprzepustowym zapisem optycznym1. Jako przykład wykorzystaliśmy to integracyjne podejście, aby zademonstrować ponowne modelowanie sieci na poziomie określonych zstępujących danych wejściowych przy użyciu wysokoprzepustowego obrazowania wapnia w całościowych preparatach ex vivo pnia mózgu i uszkodzonego rdzenia kręgowego1. Można to jeszcze bardziej rozwinąć, wykorzystując narzędzia farmakologii neurooptogenetycznej i optogenetycznej do oceny przebudowy połączeń synaptycznych między określonymi subpopulacjami neuronów rdzeniowych.

W ciągu ostatniej dekady, coraz więcej dowodów uzyskanych z różnych modeli urazów rdzenia kręgowego (SCI) pokazało, że sieci rdzeniowe mogą się spontanicznie reorganizować, przyczyniając się do powrotu do sprawności1-9. W konsekwencji plastyczność adaptacyjna stała się ważnym tematem w badaniach nad SCI. Wykazano, że plastyczność obejmuje odrastanie oszczędzonych aksonów, kiełkowanie nowych pobocznych aksonów i tworzenie nowych połączeń synaptycznych. Duża część tej wiedzy została uzyskana z badań behawioralnych lub anatomicznych na dorosłych zwierzętach. Istotnym ograniczeniem badań rdzenia kręgowego u dorosłych jest trudność w wykonaniu wysokoprzepustowej oceny fizjologicznej, która jest łatwiejsza w przypadku preparatów noworodkowych1. Jedną z głównych różnic jest to, że preparaty ex vivo w całości z pnia mózgu i rdzenia kręgowego u dorosłych mają niską żywotność. Innym jest to, że dorosła tkanka rdzenia kręgowego jest bardziej nieprzezroczysta dla światła, ponieważ jest grubsza i mielinowa. Chociaż ostatnie postępy w obrazowaniu in vivo (patrz na przykład 10-12) mogą częściowo przezwyciężyć te problemy, możliwość wykonania wysokoprzepustowego obrazowania na dowolnej żądanej głębokości grzbietowo-brzusznej w wielu miejscach wzdłuż danego preparatu pnia mózgu i rdzenia kręgowego jest obecnie możliwa tylko u noworodków. Niedojrzały stan mielinizacji aksonów w rdzeniu kręgowym noworodka ułatwia wysokoprzepustowy zapis optyczny ex vivo, umożliwiając w ten sposób dynamiczną ocenę funkcjonalnych połączeń synaptycznych13-17. W połączeniu z genetycznie kodowanymi reporterami wapnia oraz narzędziami do stymulacji optogenetycznej i farmakologii, podejścia optyczne mogą przyczynić się do głębszego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw plastyczności adaptacyjnej.
Szacuje się, że od 1 do 10% wszystkich urazów rdzenia kręgowego dotyka niemowląt i dzieciw wieku 18-22 lat. W przeciwieństwie do dorosłego SCI, patogeneza i potencjał spontanicznego powrotu do zdrowia w SCI u dzieci są mniej zbadane. Wykorzystanie modelu SCI u noworodków może zatem dostarczyć więcej informacji na temat SCI u dzieci i przyczynić się do lepszego zrozumienia zaangażowanych mechanizmów patogenetycznych i rekonwalescencji. Co więcej, uważa się, że plastyczność post-SCI wspierająca regenerację funkcjonalną w dorosłym rdzeniu kręgowym obejmuje przynajmniej częściowo te same mechanizmy, które rządzą rozwojem ośrodkowego układu nerwowego, takie jak wzrost aksonów, rozgałęzianie się i tworzenie nowych synaps23-26. W związku z tym zastosowanie modelu SCI u noworodków może dostarczyć ważnych informacji na temat mechanizmów, które działają również w dorosłym rdzeniu kręgowym lub które potencjalnie mogą zostać przywrócone w dorosłym rdzeniu kręgowym (na przykład poprzez wszczepienie komórek lub tkanek płodu lub tkanek zbudowanych de novo z pluripotencjalnych komórek macierzystych) w celu ułatwienia powrotu do zdrowia.
Nowonarodzona mysz stanowi zatem platformę dla integracyjnego, wielometodologicznego podejścia do badania adaptacyjnej plastyczności po urazie rdzenia kręgowego, w której można łatwo zastosować kombinację metod behawioralnych, fizjologicznych, anatomicznych, molekularnych i genetycznych. Ustanowienie ustandaryzowanych modeli urazów noworodków jest ważnym krokiem we wdrażaniu takich badań.

<table><tbody><tr><td>Plastikowa strzykawka (30 lub 50&nbsp; ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa szalka Petriego (150 x 25&nbsp; mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waporyzator Fortec izofluranowy</td><td>Cyprane</td><td></td><td>Używamy i starego urządzenia wycofanego z produkcji, sprawdź link do nowszego urządzenia</td></tr><tr><td>Yasargil tymczasowy tętniak mini-clip</td><td>&AElig; sculap</td><td>FE681K</td><td></td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa drobnootworowa ID 0,58&nbsp; mm, OD 0,96&nbsp; mm</td><td>Smiths Medical</td><td>800/100/200</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran (Forene)</td><td>Abbott GmbH & Co. KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marcain (Bupivacain)</td><td>AstraZeneca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insuline seyringe 0,3&nbsp; ml 30&nbsp; G x 8&nbsp; mm</td><td>VWR</td><td>80086-442</td><td></td></tr><tr><td>Ultra cienki mikronóż 5&nbsp; mm krawędź tnąca</td><td>Fine Science Tools</td><td>10315-12</td><td></td></tr><tr><td>Ekstra cienkie kleszcze Graefe &ndash; 0.5&nbsp; mm Końcówka</td><td>Fine Science Tools</td><td>1153-10</td><td>Naprawdę nie jest to konieczne, często zęby są za duże</td></tr><tr><td>Kleszcze SuperGrip Straight</td><td>Fine Science Tools</td><td>00632-11</td><td>Potrzebne są dwa kleszcze</td></tr><tr><td>Spongostan Special 70 x 50 x 1&nbsp; mm</td> Nożyczki sprężynowe <td>Ferrosan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vannas &ndash; 2&nbsp; mm Ostrza Proste</td><td>narzędzia do nauki o naprawie</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Vario Clip Kleszcze do nakładania</td><td>Aesculap</td><td>FE502T</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 6&ndash; 0 (Ethicon)</td><td>Johnson and Johnson</td><td>J105G</td><td></td></tr><tr><td>Mikroigły</td><td></td> Dithricha <td>11-510-20</td><td></td></tr><tr><td>Temgesic (buprenorfina)</td><td>Schering-Plough</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stesolid (diazepam)</td><td>Actavis</td><td></td><td>Znany również jako Valium</td></tr><tr><td>Pedamix</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klorhexidinsprit (glukonian chlorheksydyny)</td><td>Fresenius Kabi</td><td>D08A C02</td><td></td></tr></tbody></table>

model urazu kompresyjnego rdzenia kręgowego u noworodków myszy

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Uraz rdzenia kręgowego (SCI) zazwyczaj powoduje wyniszczające deficyty neurologiczne, szczególnie poprzez uszkodzenie włókien schodzących z mózgu do rdzenia kręgowego. Główny obszar badań koncentruje się obecnie na mechanizmach plastyczności adaptacyjnej, które leżą u podstaw spontanicznego lub indukowanego powrotu do sprawności funkcjonalnej po SCI. Spontaniczna regeneracja funkcjonalna jest większa we wczesnym okresie życia, co rodzi interesujące pytania o to, jak plastyczność adaptacyjna zmienia się wraz z rozwojem rdzenia kręgowego. Aby ułatwić badanie tej dynamiki, opracowaliśmy model SCI u noworodków myszy. Model ten ma znaczenie dla dziecięcego SCI, który jest zbyt słabo badany. Ponieważ plastyczność neuronalna u osoby dorosłej obejmuje niektóre z tych samych mechanizmów, co plastyczność neuronalna we wczesnym okresie życia1, model ten może potencjalnie mieć pewne znaczenie również dla dorosłego SCI. Tutaj opisujemy całą procedurę generowania powtarzalnego uszkodzenia ucisku rdzenia kręgowego (SCC) u noworodka myszy już w 1. dniu po urodzeniu (P). SCC uzyskuje się poprzez wykonanie laminektomii na danym poziomie kręgosłupa (tutaj opisanym na poziomie klatki piersiowej 9-11), a następnie użycie zmodyfikowanego miniklipsa tętniaka Yasargil w celu szybkiego kompresji i odbarczenia rdzenia kręgowego. Jak opisano wcześniej, uszkodzone noworodki myszy mogą być testowane pod kątem deficytów behawioralnych lub poświęcane do analizy fizjologicznej ex vivo połączeń synaptycznych przy użyciu elektrofizjologicznych i wysokoprzepustowych technik zapisu optycznego1. Wcześniejsze i trwające badania z wykorzystaniem oceny behawioralnej i fizjologicznej wykazały dramatyczne, ostre upośledzenie motoryki kończyn tylnych, po którym następuje całkowite odzyskanie funkcji w ciągu 2 tygodni oraz pierwsze dowody na zmiany w obwodach funkcjonalnych na poziomie zidentyfikowanych zstępujących połączeń synaptycznych1.

Uraz kompresyjny rdzenia kręgowego i utrata funkcji
Jak opisano wcześniej, poprzez optymalizację procedur przedoperacyjnych, chirurgicznych i pooperacyjnych można uzyskać powtarzalny model kompresyjnego urazu rdzenia kręgowego (SCI) u noworodka myszy1. Zatyczka z polietylenu umieszczona na jednym ramieniu klipsa (Rysunek 2B i C) zapobiega całkowitemu zamknięciu klipsa i utrzymuje odległość między ramionami na stałym poziomie około 230 µm. Odwrócenie orientacji klipsa pomiędzy dwoma kompresjami skutkuje symetrycznym urazem, co potwierdzają następstwa histologiczne (Rysunek 5A i 1). Bezpośrednio po usunięciu miniklipsa tkanka uciśniętego rdzenia kręgowego ciemnieje z powodu obrzęku i stłuczenia krwotocznego. Obserwacja seryjnych przekrojów uszkodzonego rdzenia kręgowego barwionych eosiną i hematoksyliną już jeden dzień po urazie wykazuje stopniowe pogorszenie stanu tkanki w miarę zbliżania się do centrum zmiany (Rysunek 5A). Obecność jam wewnątrzrdzeniowych lub krwi w miejscu zmiany nie jest zjawiskiem niezwykłym.
Ocena behawioralna, na przykład poprzez śledzenie trajektorii kończyn tylnych w warunkach braku obciążenia kilka godzin po operacji, wykazuje znaczne upośledzenie ruchomości kończyn tylnych u myszy z uszkodzeniem SCC w porównaniu do myszy z grupy kontrolnej (sham), u których wykonano jedynie laminektomię (Rysunek 5B oraz 1). Test ten można powtarzać do momentu, aż mysz będzie w stanie przejść inne testy behawioralne wymagające utrzymania własnej masy ciała1.
Śmiertelność i rekonwalescencja po operacji
Śmiertelność wewnątrzoperacyjna wynika głównie z bezdechu i zatrzymania krążenia spowodowanego wysokim stężeniem izofluranu niezbędnym do uzyskania wystarczającej anestezji. Wprowadzenie miejscowego środka znieczulającego, bupiwakainy, do protokołu chirurgicznego pozwala na obniżenie stężenia izofluranu, a tym samym znacząco zmniejsza wskaźnik śmiertelności. W niedawnej serii eksperymentalnej obejmującej ponad 20 zwierząt śmiertelność wewnątrzoperacyjna wyniosła zero. Z kolei na przeżywalność pooperacyjną wpływa głównie akceptacja zoperowanych myszy przez matkę. Znacznaj poprawa nastąpiła po zmniejszeniu lęku i agresji poprzez podanie pojedynczej dawki diazepamu (i.p. 8 g/kg masy ciała) matce przed powrotem zoperowanych myszy do lęgu1. Akceptację i rekonwalescencję pooperacyjną zoperowanych myszy można monitorować poprzez obecność mleka w żołądku. Żołądek myszy w wieku P1-P7, która wypiła mleko, jest wyraźnie biały i widoczny przez skórę brzucha (Rysunek 3). Porównanie karmienia myszy zoperowanych, grupy kontrolnej (zabieg pozorowany) oraz myszy nieoperowanych jest przydatne do oceny stanu odżywienia zwierząt po urazie. Ocena wzrostu myszy zoperowanych w porównaniu do nieoperowanych pokazuje, że mimo niewielkiego spadku masy ciała w pierwszej dobie pooperacyjnej, krzywa wzrostu myszy zoperowanych szybko ulega następnie normalizacji (Rysunek 6). Nie zaobserwowano śmiertelności związanej z dysfunkcją pęcherza moczowego lub infekcją, nawet u myszy badanych przez okres do 7 tygodni.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Numer na rys. 2</td>
			<td>Nazwa</td>
			<td>Producent/Dostawca</td>
			<td>Nr katalogowy</td>
			<td colspan="3">Link</td>
			<td>Komentarz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Strzykawka plastikowa (30 lub 50 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Szalka Petri z tworzywa sztucznego (150 x 25 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Waporyzator izofluranu Fortec</td>
			<td>Cyprane</td>
			<td></td>
			<td colspan="3">http://www.mssmedical.co.uk/products/new-vaporisers/</td>
			<td>Używamy starego urządzenia wycofanego z produkcji, nowsze modele dostępne pod linkiem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4a</td>
			<td>Tymczasowy mikroklips tętniakowy Yasargil</td>
			<td>Æsculap</td>
			<td>FE681K</td>
			<td colspan="3">http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4b</td>
			<td>Cienka rurka kapilarna polietylenowa, ID 0.58 mm, OD 0.96 mm</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>800/100/200</td>
			<td colspan="3">http://www.smiths-medical.com/industrialproducts/8/39/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>Izofluran (Forene)</td>
			<td>Abbott GmbH &amp; Co. KG</td>
			<td></td>
			<td colspan="3">http://www.life-sciences-europe.com/product/forene-abbott-gmbh-wiesbaden-group-narcotic-germany-west-2001-1858.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>Marcain (Bupivacaina)</td>
			<td>AstraZeneca</td>
			<td></td>
			<td colspan="3">http://www.astrazeneca.co.uk/medicines01/neuroscience/Product/marcaine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Strzykawka insulinowa 0.3 ml 30 G x 8mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80086-442</td>
			<td colspan="3">https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4646138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>Ultramikroskopowy nóż 5 mm ostrze tnące</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10315-12</td>
			<td colspan="3">http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= 
			Kat&amp;suchkatalog=0019900000&amp;reloadmenu=1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>Ekstra precyzyjna pęseta Graefe — końcówka 0.5 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>1153-10</td>
			<td colspan="3">http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= 
			Kat&amp;suchkatalog=0055700000&amp;reloadmenu=1</td>
			<td>Nie jest konieczna, często ząbki są zbyt duże</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>Pęseta SuperGrip prosta</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00632-11</td>
			<td colspan="3">http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= 
			Kat&amp;suchkatalog=0053500000&amp;reloadmenu=1</td>
			<td>Konieczne są dwie pęsety</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm</td>
			<td>Ferrosan</td>
			<td></td>
			<td colspan="3"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>Nożyczki sprężynowe Vannasa — ostrza 2 mm proste</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td colspan="3">http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= 
			Kat&amp;suchkatalog=0012800000&amp;reloadmenu=1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td>Pęseta do nakładania klipsów Vario Clip</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>FE502T</td>
			<td colspan="3">http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14</td>
			<td>Vicryl 6–0 (Ethicon)</td>
			<td>Johnson and Johnson</td>
			<td>J105G</td>
			<td colspan="3"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>Mikroskopowy igłotrzymacz Diethrich</td>
			<td></td>
			<td>11-510-20</td>
			<td colspan="3">http://trimed-ltd.com/Products/Suture-Instruments/Micro-Needle-Holders-With-Tungsten-Carbide-Inserts/Ref-11-29.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16</td>
			<td>Temgesic (buprenorfina)</td>
			<td>Schering-Plough</td>
			<td></td>
			<td colspan="3"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17</td>
			<td>Stesolid (diazepam)</td>
			<td>Actavis</td>
			<td></td>
			<td colspan="3"></td>
			<td>Znany również jako Valium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18</td>
			<td>Pedamix</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td></td>
			<td colspan="3">http://www.helsebiblioteket.no/retningslinjer/pediatri/mage-tarm-lever-ern%C3%A6ring/parenteral-ern%C3%A6ring</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19</td>
			<td>Chlorheksydyna w alkoholu (gluconian chlorheksydyny)</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>D08A C02</td>
			<td colspan="3">http://www.felleskatalogen.no/medisin/klorhexidinsprit-fresenius-kabi-klorhexidinsprit-farget-fresenius-kabi-fresenius-kabi-560639</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Lista narzędzi i sprzętu do wywołania uciskowego urazu rdzenia kręgowego za pomocą klipsa u noworodka myszy.
<img alt="Schemat zestawu do znieczulenia wziewnego: parownik izofluranu, maska na gryzoniu, dygestorium, pompa próżniowa." src="/files/ftp_upload/53498/53498fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat zestawu do znieczulenia. Ten schemat przedstawia zestaw do znieczulenia przeznaczony dla nowonarodzonej myszy, obejmujący komorę uśpieniową do wstępnego znieczulenia oraz maskę nosową do podtrzymania znieczulenia podczas operacji.
<img alt="Przygotowanie chirurgiczne do anastomozy naczyń: klematy, kaniula, pęseta, nożyczki i system łącznika żylnego." src="/files/ftp_upload/53498/53498fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Główne narzędzia i klips kompresyjny. (A) Narzędzia używane podczas procedury. Numery odpowiadają oznaczeniom użytym w Tabeli 1. (B i C) Tymczasowy miniklips tętniaka Yasargila z końcówkami każdego ramienia ręcznie przyciętymi do grubości około 150 µm. Stopper wykonany z kawałka rurki polietylenowej (Tabela 1) jest umieszczony na jednym z ramion, aby zapobiec całkowitemu zamknięciu klipsa. Pasek skali: 2 mm. App: aplikator klipsów (#12 w A); St: stopper. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53498/53498fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Anatomia noworodka gryzonia, badanie mleka w żołądku; schemat z opisanymi strukturami do badań rozwojowych." src="/files/ftp_upload/53498/53498fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Punkt orientacyjny do przedoperacyjnej oceny poziomu kręgosłupa u noworodka myszy ICR. (A) Widok boczny myszy ICR w 1. dobie po urodzeniu (P1) z białym mlekiem w żołądku. Przednia część żołądka odpowiada poziomowi kręgów T12-T13. (B) Mysz ICR P1 pod narkozą w pozycji brzusznej. Mimo że jest trudniejszy do zwizualizowania niż w (A), wypełniony mlekiem żołądek jest rozpoznawalny. Przednia część żołądka wskazuje poziom kręgów T12-T13. Paski skali: 0.5 cm.
<img alt="Schemat procedury chirurgicznej: usunięcie łuku kręgowego z widocznym nacięciem w linii środkowej w sekwencji preparacji anatomicznej." src="/files/ftp_upload/53498/53498fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Laminektomia grzbietowa. (A) Preparacja mięśni przykręgosłupowych. Należy zauważyć, że w tym wieku wyrostek kolczysty jest niedorozwinięty. (B) Poprzeczne przecięcie łuku kręgowego cienkimi nożyczkami. (C) Wprowadzenie jednego ramienia cienkiej pęsety pomiędzy łuk kręgowy a oponę twardą. Punkt wprowadzenia wskazany jest grotem strzałki. (D) Usunięcie łuku kręgowego. Pasek skali: 2 mm.
<img alt="Przekroje histologiczne identyfikujące progresję zmiany, wykresy trajektorii ruchu do analizy funkcji kończyn." src="/files/ftp_upload/53498/53498fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Wyniki histologiczne i behawioralne po urazie uciskowym rdzenia kręgowego w dniu P1. (A) Barwienie eozyną i hematoksyliną w przekrojach rdzenia kręgowego myszy po urazie (1 dzień po urazie) w różnych odległościach od centrum urazu. (B) Reprezentatywne ślady trajektorii kończyn przednich i tylnych obserwowane 6 godzin po urazie lub po laminektomii pozorowanej (grupa kontrolna). Ślady u góry przedstawiają trajektorie widziane z boku zwierzęcia. Ślady na dole przedstawiają trajektorie widziane od strony brzusznej zwierzęcia. Patrz również 1. Pasek skali: 250 µm. DH: róg tylny; L: lewa; R: prawa; SCC: ucisk rdzenia kręgowego; VH: róg przedni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53498/53498fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres masy ciała w okresie postnatalnym; wykres słupkowy porównujący grupy Ctrl i SCC w dniach P1-P9." src="/files/ftp_upload/53498/53498fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Porównawcze krzywe wzrostu. Histogram przedstawiający przyrost masy ciała myszy nieoperowanych oraz myszy z urazem SCC od 1. do 9. dnia postnatalnego.

Ten artykuł opisuje metodę generowania powtarzalnego uszkodzenia kompresyjnego rdzenia kręgowego (SCI) u noworodka myszy. Model ten stanowi korzystną platformę do badania mechanizmów plastyczności adaptacyjnej, które leżą u podstaw spontanicznej odbudowy funkcjonalnej.

Model urazu kompresyjnego rdzenia kręgowego u noworodków myszy

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykonanie powtarzalnego urazu kompresyjnego rdzenia kręgowego u noworodka myszy. Osiąga się to poprzez najpierw wprowadzenie myszy w stan głębokiej narkozy, a następnie wykonanie laminektomii grzbietowej w celu odsłonięcia rdzenia kręgowego.I na koniec poprzez wywołanie urazu kompresyjnego. Opracowaliśmy niedawno noworodkowy model urazu rdzenia kręgowego u myszy i wykazaliśmy, że noworodki myszy wykazują zdumiewający stopień plastyczności adaptacyjnej. Badanie mechanizmu leżącego u podstaw regeneracji może dostarczyć istotnych informacji, które mogłyby zostać wykorzystane w leczeniu urazów rdzenia kręgowego.W tym filmie zademonstrujemy, jak przeprowadzić kompresyjny uraz rdzenia kręgowego u jednodniowej myszy. Ta procedura chirurgiczna obejmuje znieczulenie, laminektomię oraz dwie kompresje nadtwardówkowe za pomocą klipsów. Przygotowanie do operacji.Operację przeprowadza się pod mikroskopem stereoskopowym. Pod mikroskopem należy umieścić podkładkę grzewczą. Jest to kluczowe, aby utrzymać szczenię w cieple i zapobiec jego nagłej śmierci podczas zabiegu.Na podkładce grzewczej należy rozłożyć koc chirurgiczny lub duży arkusz czystego, miękkiego papieru laboratoryjnego. Do analgezji przedoperacyjnej należy przygotować strzykawkę insulinową (0,3 ml, igła 30 G) wypełnioną znieczuleniem miejscowym Marcaine rozcieńczonym w sterylnym PBS do stężenia końcowego 2,5 mg/ml. Do wykonania nacięcia skóry, usunięcia mięśni oraz laminektomii należy użyć mikronoża, pęsety precyzyjnej oraz precyzyjnych nożyczek do irydektomii.Należy zauważyć, że używamy tutaj również pęsety, której końcówki zagięliśmy tak, aby utworzyły ząbki. Sprawdzają się one lepiej niż dostępne w handlu pęsety ząbkowane, ponieważ ząbki muszą być bardzo małe. Do kompresji rdzenia kręgowego należy użyć specjalnie zmodyfikowanego klipsa tymczasowego do tętniaków Yasargil (Yasargil Temporary Aneurysm Miniclip), który zostanie opisany w dalszej części.Niezbędny jest również krótki odcinek plastikowej rurki kapilarnej do wykonania zatyczki zapobiegającej całkowitemu zamknięciu klipsa oraz aplikator do zakładania klipsa. Do szycia należy użyć uchwytu do igieł i małych nożyczek do odcinania nici. W celu leczenia bólu należy rozcieńczyć Temgesic w sterylnym PBS do stężenia 0,03 mg/ml.Uraz rdzenia kręgowego jest wywoływany poprzez kompresję za pomocą klipsa, wykorzystując do tego tymczasowy miniklips tętniaka Yasargil. Przed użyciem klips musi zostać zmodyfikowany mechanicznie poprzez zeszlifowanie grubości ramion do 150 micrometers przy użyciu kamienia ostrzącego. Bezpośrednio przed operacją należy odciąć krótki odcinek plastikowej rurki i nałożyć go na jedno z ramion klipsa.Przewód pełni funkcję korka, zapobiegając całkowitemu zamknięciu klipsa. Znieczulenie i analgezja. W przypadku znieczulenia gazowego stosujemy waporyzator suprane podłączony do butli z tlenem.Izofluran jest środkiem znieczulającym, który jest waporyzowany w czystym tlenie. Aby podać mieszaninę izofluranu i tlenu myszy, należy przygotować maskę nosową dostosowaną do noworodków. Myszy noworodkowe są tak małe, że maskę można wykonać z końcówki strzykawki, która służy jako wlot dla plastikowej rurki połączonej z wylotem waporyzatora.Z boku maski wywierć mały otwór, aby podłączyć rurkę ewakuacyjną, która kończy się albo w regulowanej pompie próżniowej z jednostką zbierającą, albo po prostu w dygestorium. Wykonaj komorę przelewową do anestezji, używając plastikowej szalki Petriego o wymiarach 150 by 25 mililitrów. Z jednej strony wykonaj otwór wystarczająco duży, aby zmieściła się w nim głowa myszy.Po przeciwnej stronie wykonaj dwa mniejsze otwory o średnicy rurki plastikowej. Na koniec, na górnej części naczynia, wykonaj otwór ewakuacyjny, mniejszy od pozostałych. Odetnij końcówkę końcówki do pipety 250 µL i wprowadź ją do tego ostatniego otworu.Końcówka pipety służy jako łącznik dla rurki ewakuacyjnej, która jest podłączona do urządzenia próżniowego ustawionego na niewielkie podciśnienie. Za pomocą plasteliny przymocuj maskę tuż wewnątrz otworu na głowę myszy. Używając taśmy lub plasteliny, przymocuj plastikowe rurki do sufitu komory, upewniając się, że rurki są prawidłowo umieszczone w odpowiednich otworach.Umieść komorę na podkładce chirurgicznej pod mikroskopem. Cały system został przedstawiony na tym schemacie. Trójdrożny kran odcinający jest umieszczony na wylocie parownika.W tym ustawieniu droga do komory snu jest otwarta, natomiast droga do maski jest zablokowana, co pozwala na umieszczenie myszy w komorze snu w celu rozpoczęcia sedacji. Przekręcenie trójdrożnego kurka w prawo umożliwia przepływ gazu do maski i blokuje drogę do komory snu. W tej konfiguracji mysz może zostać przeniesiona do maski.Wyciek gazu jest usuwany za pomocą próżni z komory przelewowej. Wybierz szczenię myszy, które niedawno piło mleko, co potwierdza biały kolor widoczny przez skórę. Umieść szczenię w komorze do usypiania i wprowadź odparowany Isoflurane w stężeniu 4%, aby uzyskać szybką sedację.Przenieś szczenię do maski. Ostrożnie umieść pysk myszy głęboko w masce, aby zapewnić odpowiednią ekspozycję na gaz anestetyczny. Przekręć kurek trójdrożny, aby skierować przepływ gazu do maski.Wstrzyknąć podskórnie 50 µL Marcaine w stężeniu 2,5 mg/mL w miejscu planowanej operacji. Należy zachować ostrożność, aby nie wstrzyknąć preparatu zbyt głęboko, ponieważ można łatwo uszkodzić naczynia krwionośne, a wprowadzenie Marcaine do naczynia jest letalne. Nadmiar Marcaine należy wytrzeć małym, sterylnym kompresem.Laminektomia grzbietowa. Obniż stężenie izofluranu do poziomu od 1% do 2%. Po kilku minutach nakłuj skórę mikronóżem i wykonaj nacięcie poprzeczne o długości od 8 do 9 mm, delikatnie odciągając skórę w kierunku rostralno-kaudalnym.Otwór przejściowy jest znacznie wygodniejszy i zapewnia lepszy dostęp boczny do wykonania laminektomii. Odsunąć brzegi nacięcia skóry od leżącej poniżej tkanki, wsuwając kawałki gąbki hemostatycznej podskórnie, rostralnie i kaudalnie względem nacięcia. Przeciąć mięśnie przedkręgowe cienkimi nożyczkami, aby odsłonić kręgosłup.Należy pamiętać, że u noworodka wyrostki kolczyste nie są w pełni rozwinięte. Wyznacz linię środkową i przetnij blaszkę łuku kręgowego w poprzek za pomocą cienkich nożyczek. Należy uważać, aby nie przeciąć tkanek zbyt głęboko, ponieważ może to potencjalnie uszkodzić oponę twardą, a nawet rdzeń kręgowy.Ostrożnie umieść jedno ramię cienkiej pęsety pomiędzy blaszką łukową a oponą twardą. Chwyć blaszkę łukową, zamykając pęsetę, i ostrożnie ją podnieś, aż zostanie oddzielona, pozostawiając oponę twardą nienaruszoną. Powtórz ten krok dwa do trzech razy, aby przeprowadzić laminektomię obejmującą od jednego do dwóch segmentów.Krwawienie należy opanować za pomocą małych kawałków gąbki hemostatycznej. Używając cienkich pęset jako kleszczyków kostnych, usuwa się fragmenty stawów międzywyrostkowych obustronnie, aby uzyskać wystarczającą przestrzeń do umieszczenia zmodyfikowanego miniklipa tętniaka w kanale kręgowym. Krok ten często powoduje krwawienie, które można opanować za pomocą małych kawałków gąbki hemostatycznej.Aby poprawić widoczność, czasami korzystne jest przepłukanie ciepłym, sterylnym PBS w temperaturze 37°C. Powodowanie urazu kompresyjnego rdzenia kręgowego. Otwórz zacisk i umieść ramiona po obu stronach rdzenia kręgowego w przestrzeniach między stawami międzywyrostkowymi a rdzeniem.Należy upewnić się, że ramiona klipsa są włożone wystarczająco głęboko, aby objąć brzuszną część rdzenia kręgowego. Szybko zamknąć klips, utrzymując aplikator w miejscu, aby zapobiec przesunięciu się klipsa do tyłu. Po 15 sekundach szybko zwolnić klips.Oczyść ranę za pomocą spongistatyny. Aby uzyskać symetryczną kompresję, odwróć ostrza i przeprowadź drugą kompresję przez 15 sekund w przeciwnym kierunku. Szycie. Usuń kawałki spongistatyny, które zostały umieszczone pod skórą na początku operacji, i zamknij skórę szwami 6.0.Wstrzyknąć podskórnie 0,05 ml Temgesic w stężeniu 0,03 mg/ml, używając strzykawki insulinowej o rozmiarze 30 G, a następnie umieścić szczenię w środowisku o kontrolowanej temperaturze 30 °C na kilka godzin. Aby ograniczyć agresywne zachowania matki wobec zoperowanego szczenięcia w pierwszą noc po zabiegu, przygotować roztwór Diazepamu rozcieńczony w czystym PBS do stężenia 0,1 mg/ml do wstrzyknięcia domięśniowo w dawce 8 g/kg. Wyniki.Jak pokazano na tym wykresie, sześć godzin po kompresji rdzenia kręgowego, na niższych poziomach odcinka piersiowego, kończyny tylne poszkodowanych myszy są sparaliżowane, podczas gdy kończyny przednie nie są. W przypadku zwierząt z grupy kontrolnej (sham), u których wykonano jedynie laminektomię, zarówno kończyny tylne, jak i przednie wykazują wysoką mobilność. Przekrój rdzenia kręgowego pokazuje pozostałości krwi w miejscu urazu.Dodatkowo tkanka jest półprzezroczysta, co sugeruje jej utratę, co często prowadzi do powstania ubytku kilka dni później. Podsumowanie. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wywołać uraz kompresyjny rdzenia kręgowego u noworodka myszy. Zaletą wykorzystania myszy noworodkowych jest możliwość zastosowania specyficznych metod badania plastyczności adaptacyjnej, których nie można stosować u myszy dorosłych.Ponadto model ten stanowi platformę do testowania podejść terapeutycznych, takich jak transplantacja komórek macierzystych.

a-neonatal-mouse-spinal-cord-compression-injury-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Źródło: Elzat, E. Y. Y.,  i wsp., Ustalanie modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego u myszy w oparciu o technikę minimalnie inwazyjną. J. Vis. Exp. (2022). Ten film przedstawia metodę wywoływania kontuzji rdzenia kręgowego na poziomie T9 w modelu mysim przy użyciu platformy współosiowej urazu rdzenia kręgowego. Na rdzeń kręgowy na poziomie T9 upuszczany jest ciężar, który tworzy stłuczenie, które natychmiast powoduje przebarwienie i obrzęk tkanek.

Wywoływanie stłuczenia rdzenia kręgowego w modelu mysim za pomocą platformy koncentrycznej po urazie rdzenia kręgowego

Źródło: Lakshman, N., et al. Test neurosfery do oceny endogennej aktywacji nerwowych komórek macierzystych w mysim modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego. J. Vis. Exp. (2018). Ten film pokazuje aktywację i migrację nerwowych komórek macierzystych (NSC) w mysim modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego. Aby odsłonić rdzeń kręgowy, z znieczulonej myszy usuwa się kręg z klatki piersiowej kręgosłupa. Następnie za pomocą wygiętej igły tworzy się powierzchowny uraz w istocie białej rdzenia...

 Model minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego do badania aktywacji i migracji nerwowych komórek macierzystych

Źródło: Kumar, S., et. al. Mysi model odleżyn po urazie rdzenia kręgowego. J. Vis. Exp. (2019)Ten film pokazuje szczegółową indukcję uszkodzenia rdzenia kręgowego u myszy. Znieczulona mysz jest preparowana w celu odsłonięcia kręgów T9-T10, a ich wyrostki kolczyste są usuwane. Odsłonięty rdzeń kręgowy jest następnie przecięty w celu zadania urazu. Obszar chirurgiczny jest następnie zamykany, a mysz może dojść do siebie.

Generowanie modelu myszy z urazem rdzenia kręgowego

Uraz rdzenia kręgowego to traumatyczny stan, który powoduje ciężką zachorowalność i wysoką śmiertelność. W niniejszej pracy szczegółowo opisano model kontuzji rdzenia kręgowego u myszy, po którym następuje przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych.

Przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych w eksperymentalnym modelu kontuzyjnym uszkodzenia rdzenia kręgowego

Modele urazów rdzenia kręgowego powinny być wysoce powtarzalne. Pokazujemy, że skalibrowany model ucisku rdzenia kręgowego za pomocą kleszczy jest łatwą w użyciu metodą chirurgiczną do generowania powtarzalnych urazów mysiego rdzenia kręgowego.

Skalibrowany model ucisku rdzenia kręgowego

Wprowadzamy model uszkodzenia rdzenia kręgowego oparty na przemieszczeniu tkanki, który może powodować stałe uszkodzenie rdzenia kręgowego u dorosłych myszy.

Model kontuzyjnego uszkodzenia rdzenia kręgowego oparty na przemieszczeniu tkanek u myszy

Ten protokół opisuje, jak stworzyć precyzyjną laminektomię do indukcji stabilnego uszkodzenia rdzenia kręgowego typu transsection w modelu mysim, z minimalnymi szkodami ubocznymi dla badań nad uszkodzeniem rdzenia kręgowego.

Indukcja całkowitego uszkodzenia rdzenia kręgowego typu transsection u myszy

Minimalnie inwazyjne techniki i proste urządzenie laboratoryjne poprawiają odtwarzalność modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego, zmniejszając uszkodzenia operacyjne u zwierząt doświadczalnych i umożliwiając utrzymanie anatomicznej morfologii. Metoda ta jest opłacalna, ponieważ wiarygodne wyniki i powtarzalna procedura ułatwiają badanie mechanizmów naprawy choroby.

Ustalenie modelu urazu rdzenia kręgowego stłuczenia u myszy w oparciu o technikę minimalnie inwazyjną

Obecny protokół symulujący zespół centralnego rdzenia kręgowego (CCS) u myszy poprawił powtarzalność i zminimalizował uszkodzenia operacyjne zwierząt doświadczalnych, unikając nadmiernego naruszania struktury anatomicznej. Strategia zawarta w tym badaniu jest korzystna, ponieważ pozwala na badanie mechanizmów urazów poprzez uzyskanie spójnych wyników.

Opracowanie modelu zespołu rdzenia kręgowego u myszy C57BL/6J

Prezentujemy tutaj nowatorskie zautomatyzowane urządzenie do leczenia urazów rdzenia kręgowego dla myszy, które może dokładnie tworzyć modele urazów rdzenia kręgowego w różnym stopniu.

Zautomatyzowany impaktor do modelu kontuzyjnego uszkodzenia rdzenia kręgowego u myszy

Poznaj metodę kompresyjnego urazu rdzenia kręgowego u noworodków myszy. Ten model pozwala badać mechanizmy plastyczności adaptacyjnej i odbudowy funkcji, dostarczając cennych informacji dla rozwoju terapii urazów rdzenia kręgowego.

Model urazu kompresyjnego rdzenia kręgowego u noworodków myszy

Przeglądaj więcej filmów