Mysi model do neowaskularyzacji naczyniówkowej indukowanej laserem
27 grudnia 2015
Tutaj prezentujemy protokół neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem myszy (CNV), eksperymentalny model, który odtwarza naczyniowe cechy neowaskularnego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD). Po opanowaniu może niezawodnie i skutecznie indukować CNV jako system modelowy do testowania różnych środków eksperymentalnych.
Ogólnym celem tej procedury jest odtworzenie cech charakterystycznych neowaskularnego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem lub MD w łatwym do zbadania modelu zwierzęcym. Metoda ta może być stosowana do badania różnych aspektów badań nad neowaskularnym A MD, w tym tego, jak zmiany genetyczne lub leczenie farmakologiczne mogą wpływać na chorobę lub jak choroba może objawiać się przy różnych metodach obrazowania. Główną zaletą tej techniki jest to, że po opanowaniu jest łatwa do odtworzenia, co pozwala na szybkie i sprawne przeprowadzanie eksperymentów.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ brakuje im doskonałej zręczności i koordynacji, aby odnieść sukces, które poprawiają się wraz z praktyką. Aby przygotować pozycję stacji laserowej, lasera i lampy szczelinowej, do której można łatwo uzyskać dostęp, włącz laser i ustaw go na zadane parametry. Tutaj używane jest ustawienie 75 mikrometrów, rozmiar plamki, moc 100 miliwatów i czas trwania 100 milisekund.
Następnie umieść znieczulenie, chusteczki do podgrzewania tkanek dla zwierząt i krople do oczu w łatwym zasięgu operatora lasera. Po znieczuleniu pierwszej myszy umieść ją na podgrzewaczu dla zwierząt na około trzy do pięciu minut. Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby zapewnić całkowite znieczulenie.
Następnie za pomocą zwijanej chusteczki higienicznej, aby zapobiec aspiracji płynu do nosa. Umieść 30 mikrolitrową kroplę chlorowodorku tetrakainy w każdym oku. Poczekaj dwie minuty, aż roztwór zacznie działać.
Następnie nałóż jedną kroplę miejscowego środka tropikalnego na każde oko, aby rozszerzyć źrenice. I poczekaj dwie minuty, aż rozwiązanie zacznie działać. Teraz szybko umieść mysz na stoliku myszy, a następnie ustaw scenę na podbródku lampy szczelinowej.
Włącz lampę szczelinową i ustaw ją na najniższą jasność światła. Oceń rozszerzenie źrenic myszy. Jeśli źrenica nie osiągnęła 2,5 do trzech milimetrów rozwarcia.
Włóż mysz z powrotem do podgrzewacza dla zwierząt lub podaj dodatkową kroplę tropic aide po rozszerzeniu źrenicy. Ustaw mysz na platformie tak, aby leżała poziomo prostopadle do belki szczelinowej. Lekko obróć mysz tak, aby nie znajdowała się pod kątem około 170 stopni.
Trzymając głowę bliżej operatora laserowego, ustaw mysz jak najbliżej lampy szczelinowej, zachowując stabilność platformy i pozostawiając operatorowi wystarczająco dużo miejsca na wykonywanie precyzyjnych manipulacji motorycznych. Po prawidłowym ustawieniu myszy nałóż jedną kroplę roztworu sztucznego roztworu do łez na szklane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 25 milimetrów na 25 milimetrów. Umieść również jedną kroplę tego roztworu na nieukierunkowanym oku myszy, aby zapobiec odwodnieniu.
Chwyć jeden róg szkiełka nakrywkowego między kciukiem a palcem wskazującym, a pozostałe trzy palce owiń wokół myszy, aby podeprzeć i ustabilizować zarówno zwierzę, jak i rękę operatora. Następnie ostrożnie dociśnij pokrywę. Wsuń na oko myszy, aby spłaszczyć rogówkę.
Umieść szkiełko nakrywkowe prostopadle do ścieżki wiązki laserowej, aby zapobiec rozproszeniu lub odbiciu wiązki. Patrząc przez lampę szczelinową, wolną ręką wyreguluj ostrość, aż siatkówka znajdzie się w polu widzenia. Siatkówka powinna być jasnożółta do czerwonej, z wyraźnymi czerwonymi naczyniami krwionośnymi, powoli i ostrożnie poruszaj głową myszy lub szkiełkiem nakrywkowym, aż zauważysz nerw wzrokowy.
Nerw wzrokowy będzie żółty z wieloma naczyniami krwionośnymi promieniującymi z niego. Następnie włącz wiązkę laserową skupiającą i manewruj nią, aby skupić się na nabłonku barwnikowym siatkówki lub RPE dna oka. Jeśli wiązka ostrości wydaje się być owalna lub nieostra, wyreguluj szczelinę lamp ostrość lub szkiełko nakrywkowe.
Gdy wiązka skupiająca jest odpowiednio wyregulowana, użyj spustu nożnego, aby rozpocząć podawanie lasera. Natychmiast po podaniu lasera powinien powstać pęcherzyk Zmiany z zamglonymi obwódkami lub oczy ze zmianami krwotokowymi należy wykluczyć z analizy. Upewnij się, że obserwujesz tworzenie się pęcherzyków i wyraźny, ostro zarysowany okrągły obszar wskazujący na skupione oparzenie laserem.
Zmiany, które nie wytwarzają pęcherzyków, mogą nie indukować prawidłowo CNV. Twórz dodatkowe zmiany we wszystkich pożądanych pozycjach neowaskularyzacji naczyniówki lub CNV. Przełącz laser w tryb czuwania, gdy nie jest używany, zapisz w notatniku laboratoryjnym lokalizację i wynik każdego podania lasera.
Powtórz podawanie lasera dla drugiego oka myszy, używając świeżego szkiełka nakrywkowego i drugiej ręki, aby ustabilizować mysz. Po wykonaniu wszystkich czynności należy wyłączyć laser i lampę szczelinową, wyrzucić szkiełko nakrywkowe i przyłożyć mysz do zwierzęcia. Cieplej makroskopowo.
Sprawdź oko pod kątem powierzchni rogówki lub urazu zaćmy. Po odzyskaniu zdrowia włóż mysz z powrotem do klatki. CNV oznaczone ilościowo poprzez analizę płasko zamontowanych naczyniówek po barwieniu immunofluorescencyjnym tutaj.
Znakowanie dekstranu Fit c przeprowadzono za pomocą perfuzji bezpośrednio przed uśmierceniem zwierząt. Następnie przeprowadzono kwantyfikację obszaru za pomocą progowania w pośmiertnym barwieniu immunologicznym Image J.Here za pomocą markera komórek śródbłonka. Wykonano selekcjonkę ISO GS IB cztery, a następnie obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Wygenerowano rekonstrukcje 3D zmiany CNV na FOSS i widoku z boku. Obrazowanie metodą optycznej koherentnej tomografii wykorzystano również do wizualizacji zmian CNV in vivo. Tutaj pokazano przekrój poprzeczny siatkówki ze zmianą CNV zakreśloną na żółto.
Pokazany jest również obraz zmiany en FOSS, zakreślony na żółto. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 10 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że zwierzę jest odpowiednio znieczulone i ustawić ręce tak, aby było podparte i stabilne.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zapewnić koncentrację. Laser pali się w celu wywołania CNV, które można następnie badać na różne sposoby.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół indukcji neowaskularyzacji naczyniówkowej (CNV) u myszy, co pozwala na odwzorowanie cech naczyniowych neowaskularnej postaci zwyrodnienia plamki żółtej (AMD). Metoda ta została opracowana tak, aby była powtarzalna i efektywna w różnorodnych badaniach eksperymentalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Okulistyka
- Modele eksperymentalne
Wstęp
- Neowaskularne AMD jest główną przyczyną utraty wzroku.
- Modele zwierzęce są niezbędne do badania mechanizmów choroby.
- Model CNV umożliwia testowanie interwencji genetycznych i farmakologicznych.
- Precyzyjne umiejętności motoryczne są kluczowe dla skutecznej realizacji protokołu.
Cel badania
- Aby odtworzyć cechy charakterystyczne dla nowotworowej postaci AMD w modelu mysim.
- Aby ułatwić badania nad wpływem metod leczenia i czynników genetycznych.
- Aby dostarczyć niezawodną metodę badania progresji choroby.
Zastosowane metody
- Przygotowanie stacji laserowej z określonymi ustawieniami.
- Wykorzystanie lasera i lampy szczelinowej do indukowania CNV.
- Monitorowanie indukowanej neowaskularyzacji.
- Ocena powtarzalności i skuteczności modelu.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie indukuje CNV u myszy.
- Po opanowaniu metoda ta pozwala na szybkie przeprowadzanie eksperymentów.
- Odnotowano zmienność wskaźników sukcesu u mniej doświadczonych użytkowników.
- Model ten może być wykorzystany do badania różnych kierunków badań nad AMD.
Wnioski
- Mysi model CNV jest cennym narzędziem w badaniach nad AMD.
- Opanowanie tej techniki jest niezbędne dla uzyskania powtarzalnych wyników.
- Metoda ta może przyczynić się do lepszego zrozumienia AMD i potencjalnych metod leczenia.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Model mysi z indukowaną laserem nowotworową neowaskularyzacją chrzestową (CNV) stanowi powtarzalny i kosztowo efektywny system do badania neowaskularnej postaci zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD), umożliwiając szybką ocenę interwencji genetycznych i farmakologicznych. Jego użyteczność polega na modelowaniu szlaków angiogennych istotnych dla walidacji celów terapeutycznych i wstępnej oceny ryzyka w przedklinicznych badaniach nad nowymi lekami okulistycznymi. Model ten wspiera badania mechanistyczne oraz przesiewy terapeutyczne, zapewniając ciągłość translacyjną od etapu odkrycia do optymalizacji wiodących związków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie szlaków angiogennych i mechanizmów molekularnych napędzających tworzenie się CNV.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez manipulacje genetyczne i odczyty fenotypowe.
- Wartość strategiczna: Ułatwia testowanie hipotez i biologiczną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów zaangażowanych w dysregulację naczyniową.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie mierzalnych zmian CNV poprzez barwienie immunofluorescencyjne i progowanie w programie ImageJ w celu przeprowadzenia analizy zależności dawka-odpowiedź.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzowaną indukcję zmian z powtarzalnymi parametrami lasera (rozmiar plamki 75 µm, moc 100 mW, czas trwania 100 ms).
- Wartość strategiczna: Umożliwia wysokoprzepustową ocenę wpływu związków na przeciek naczyniowy i neowaskularyzację.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje angiogenezę istotną w przebiegu choroby w celu oceny skuteczności terapeutycznej w żywym organizmie.
- Wartość operacyjna: Kompatybilny z metodami obrazowania, takimi jak optyczna koherentna tomografia (OCT) i mikroskopia konfokalna, w celu monitorowania podłużnego.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez powiązanie modulacji celu z wynikami fenotypowymi w przedklinicznym modelu AMD.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od identyfikacji celu po optymalizację wiodących związków – dostarczając odczytów fenotypowych, które pomagają w podejmowaniu decyzji dotyczących etapu przedklinicznego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnalizacyjnych i walidację celów poprzez indukowane tworzenie CNV u myszy typu dzikiego oraz transgenicznych.
- Przesiewanie: Dostarcza standaryzowane, mierzalne wyniki angiogenne, odpowiednie do przesiewania bibliotek związków.
- Analityka: Umożliwia kwantyfikację obszaru zmiany oraz rekonstrukcję 3D w celu przeprowadzenia analizy porównawczej między warunkami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Łączy interwencje molekularne z patologią naczyniową, wspierając przedkliniczną ocenę zorientowaną na biomarkery.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do iteracyjnych testów genetycznych i farmakologicznych modyfikatorów CNV.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w zakresie angażowania celu poprzez modelowanie odpowiedzi angiogennych in vivo.
- Wartość operacyjna: Oferuje powtarzalność i skalowalność po osiągnięciu biegłości technicznej, co ogranicza zmienność eksperymentalną.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając szybką iterację i wczesne wykrywanie niepowodzeń w programach dotyczących AMD.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie ich wpływu na fenotypy CNV.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w mikrochirurgii, oddziaływaniu lasera z tkanką oraz wizualizacji siatkówki pod kontrolą lampy szczelinowej.
- Zależność od precyzyjnej kalibracji lasera i stabilnego ułożenia zwierzęcia w celu zapewnienia powtarzalności tworzenia zmian.
- Konieczność standaryzacji procedur pomiędzy operatorami w celu zminimalizowania zmienności w indukowaniu i ilościowym określaniu CNV.
- Rozważania dotyczące adaptacji obejmują tła transgeniczne oraz alternatywne punkty końcowe obrazowania dla odczytów specyficznych dla danej ścieżki.
- Ograniczenia praktyczne obejmują ostry, indukowany urazem charakter angiogenezy, który może nie w pełni odzwierciedlać patofizjologię przewlekłego AMD.
