Analiza porównawcza ludzkiego hormonu wzrostu w surowicy przy użyciu testów SPRi, Nano-SPRi i ELISA

Ogólnym celem tego badania jest ocena potencjału diagnostycznego bezpośredniego i amplifikowanego obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego (testów SPRi) w wykrywaniu biomarkerów w surowicy i bezpośrednie porównanie go z dostępnym na rynku zestawem do testów immunoenzymatycznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomedycyny, takie jak podkreślenie wczesnego stadium choroby i zapewnienie środków do monitorowania skuteczności terapeutycznej. Główną zaletą SPRi jest to, że umożliwia monitorowanie i wizualizację oddziaływań biomolekularnych w czasie rzeczywistym bez etykietowania poprzez rejestrowanie zmian współczynnika załamania światła w sąsiedztwie powierzchni czujnika.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozy poziomu hGH w surowicy, ponieważ endogenne hGH zostało powiązane z licznymi zaburzeniami medycznymi, które wpływają na wzrost i rozwój człowieka. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy przygotowania chemii powierzchni biochipa są trudne do nauczenia, a każdy błąd może mieć ogromny wpływ na wyniki. Po przygotowaniu roztworów i próbek białek zgodnie z protokołem tekstowym, użyj 120 mililitrów stabilizowanego roztworu piranii do oczyszczenia złotego chipa metodą sonikacji w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 90 minut.

Użyj wody do opłukania chipa i sonikacji w wodzie przez pięć minut. Następnie opłucz chip etanolem i wysusz go strumieniem azotu. Umieść złoty chip w komorze ozonowej UV na 30 minut, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.

Następnie dodaj 150 miligramów kwasu 11-merkaptoundekanowego do 20 mililitrów etanolu w probówce zawierającej plastikową nasadkę, która zapewnia podparcie dla chipa, oraz mieszadło, aby jednorodnie wymieszać roztwór. Umieść chip w probówce i zakryj go. Następnie podgrzewaj rurkę w kuchence mikrofalowej o mocy 50 watów i 50 stopniach Celsjusza przez pięć minut.

Etanolem opłucz frytki i namocz je w etanolu na pięć minut. Użyj wody, aby powtórzyć płukanie i moczyć przez pięć minut. Dodaj 150 miligramów 1-etylo-3-karbodimidu do 20 mililitrów wody w probówce zawierającej mieszadło.

Przenieś chip do probówki i mikrofalj, jak właśnie pokazano. Użyj wody do spłukania frytka i namocz go przez pięć minut w wodzie. Następnie dodaj 150 miligramów N-hydroksysukcynimidu do 20 mililitrów wody w probówce z mieszadłem.

Dodaj chip do probówki, zamknij go nakrętką i kuchenka mikrofalowa. Po spłukaniu i namoczeniu chipa w wodzie jak poprzednio, dodaj 250 mikromolowych glikoli polietylenowych w 20 mililitrach wody do probówki z mieszadłem. Dodaj frytki i kuchenkę mikrofalową, a następnie spłucz i namocz w wodzie jak poprzednio.

Przygotuj 15 mikrogramów na mililitr roztworu przeciwciała anty-rhGH i anty-IgG jako kontroli ujemnej i dodaj 10 mikrolitrów każdego z nich do oddzielnej studzienki na płytce 384-dołkowej. Zaprojektuj wzór plamkowania w mikromacierzy i za pomocą 500-mikrometrowego kołka z teflonową końcówką umieść chip z przeciwciałami. Inkubuj nakrapiany chip w temperaturze pokojowej i wilgotności 75% przez dwie godziny.

Po skonfigurowaniu eksperymentu SPRi i zablokowaniu chipa zgodnie z protokołem tekstowym, przygotuj roztwór rhGH z następującym zestawem stężeń w PBS, zawierającym 10% surowicy i jeden miligram na mililitr BSA. Ważne jest, aby podkreślić rodzaj cząsteczki blokującej wybranej na tym etapie. Ponieważ celem jest zminimalizowanie niespecyficznych interakcji.

Przygotuj roztwór dwa do jednego, dodając jeden mikrolitr sześciu mikromolowych przeciwciał detekcyjnych anty-rhGH znakowanych biotyną do trzech mikrolitrów jednomilimolowych kropek kwantowych w bliskiej podczerwieni pokrytych streptawidyną w 0,5 mililitrowej probówce wirówkowej. Wstrzyknąć 150 mikrolitrów roztworu surowicy ludzkiej z dodatkiem hGH do pętli iniekcyjnej. Po silnym wzroście sygnału nastąpi powolny spadek z niespecyficznie związanego surowicy spłukiwanej z powierzchni.

Gdy sygnał się ustabilizuje, użyj roztworu 450 milimolowego chlorku sodu, dodanego do działającego buforu, aby umyć powierzchnię. Za pomocą uruchomionego buforu rozcieńczyć roztwór przeciwciał detekcyjnych anty-rhGH i kropek kwantowych do stężenia 10 nanomolowych i wstrzyknąć do komory przepływowej. Zaimportuj dane do programu do analizy danych.

Następnie wykreśl sygnał SPRi w funkcji czasu i określ różnicę między plamkami przeciwciał anty-rhGH i przeciwciał kontroli ujemnej po przemyciu o wysokiej zawartości soli. Aby przeprowadzić test ELISA, po przygotowaniu odczynników, studzienek pokrytych przeciwciałami i wzorców, zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować próbki hormonu rhGH w 10% surowicy ludzkiej w następujących stężeniach. Dodaj 50 mikrolitrów każdego wzorca, kontroli i próbki do każdego dołka w trzech egzemplarzach.

Następnie uszczelnij studzienki i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie potrząsając przez noc. Następnego dnia wyjmij płytkę z shakera i pozwól jej osiągnąć temperaturę pokojową. Ogrzej HRP anty-rhGH, bufor sprzężony, bufor do mycia, chromogen tetrametylobenzydyny lub TMB i zatrzymaj odczynnik do temperatury pokojowej.

Aby przygotować odczynniki robocze, należy użyć sprzężonego buforu, aby uzyskać 40-krotne rozcieńczenie anty-rhGH HRP. Użyj wody destylowanej do rozcieńczenia buforu płuczącego 200x. Dodaj 50 mikrolitrów koniugatu anty-rhGH HRP do każdej studzienki.

Zamknij studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut, delikatnie wstrząsając. Zdekantować roztwór ze studzienek, odwrócić płytkę i osuszyć na tkankę chłonną. Dodaj 200 mikrolitrów buforu do płukania do każdej studzienki, a następnie zdekantuj i ponownie wysusz.

Powtórz pranie trzy razy. Ważne jest, aby postukać w 96-dołkową płytkę w celu usunięcia dodatkowych środków, ponieważ poleganie na pipecie nie jest skuteczne. Następnie dodaj 100 mikrolitrów chromogenu do każdej studzienki w ciągu 15 minut po etapie mycia.

Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut, delikatnie wstrząsając. Bezbarwne roztwory zmienią kolor na niebieski. Dodaj 100 mikrolitrów odczynnika zatrzymującego do każdej studzienki.

Roztwory zmienią kolor z niebieskiego na żółty. Użyj czytnika płytek o długości 450 nanometrów, aby natychmiast odczytać absorbancję każdej studzienki. Na koniec wykreślić krzywą wzorcową dla dostarczonych wzorców, a następnie wykreślić gęstość optyczną rhGH w 10% próbkach surowicy w funkcji stężenia każdej próbki.

W tym filmie porównano wydajność SPRi i nano-SPRi z testem ELISA w wykrywaniu rhGH. Liczba ta przedstawia krzywą miareczkowania rhGH-wzbogaconej w 10% ludzkiej surowicy i jest wykreślana w stosunku do uzyskanego OD przy 450 nanometrach. Zaobserwowano dobrą odpowiedź liniową, a granicę wykrywalności określono na jeden nanogram na mililitr.

W tym przypadku wykrywanie rhGH oceniano za pomocą SPRi. Każdy punkt na krzywej gradientu stężeń reprezentuje średnią wartość różnicy współczynnika odbicia obliczoną na podstawie trzech krzywych kinetycznych SPRi dla każdego stężenia. Granica wykrywalności, czyli LoD, została określona na 3,61 nanograma na mililitr.

Aby zwiększyć czułość biosensora SPRi, do czujnika sekwencyjnie wprowadzano nanowzmacniacze. W tym eksperymencie nanowzmacniacze wzmocniły odpowiedź biosensora do 7,9%Jednak przy minimalnej zmianie sygnału do kontroli. Praktyczność biosensora nano-SPRi oceniono, mierząc zakres rhGH od 30 000 do 0,25 pikogramów na mililitr.

LoD obliczono jako 9,2 pikograma na mililitr, a współczynnik zmienności wynosił 20%Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu jednej godziny w przypadku bezpośredniego wykrywania i dwóch godzin w przypadku nano-SPRi, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o optymalizacji warunków dla każdego kroku, a po wykonaniu tej czynności wyniki można łatwo odtworzyć w krótszym czasie. Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak multi-tuff, analiza maspeck, mogą być wykonywane bezpośrednio na chipie po eksperymencie SPRi, aby zapewnić dodatkowe informacje na temat przechwyconej cząsteczki.

Po opracowaniu technika ta powinna utorować drogę naukowcom zajmującym się diagnostyką medyczną do badania możliwości jednoczesnego wykrywania wielu biomarkerów związanych z nowotworami, zaburzeniami neurologicznymi i sercowo-naczyniowymi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować test SPRi, nano-SPRi i ELISA do wykrywania poziomów hGH w ludzkiej surowicy. Nie zapominaj, że praca z odczynnikami może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i okularów ochronnych.