Name: Mapowanie całego genomu interakcji lek-DNA w komórkach za pomocą COSMIC (sieciowanie małych cząsteczek w celu izolacji chromatyny) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Poznaj metodę COSMIC do mapowania interakcji lek-DNA w całym genomie komórek. Technika ta mierzy bezpośrednie wiązania ligandów z DNA, dostarczając wgląd w mechanizm działania małych cząsteczek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Ansari i prof. Parameswaranowi Ramanathanowi za pomocne dyskusje. Praca ta była wspierana przez granty NIH CA133508 i HL099773, stypendium wydziału H. I. Romnes, a nagroda W. M. Keck Medical Research Award dla A.Z.A. G.S.E. była wspierana przez stypendium Peterson Fellowship z Wydziału Biochemii i Bionauk Molekularnych Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. był wspierany przez Morgridge Graduate Fellowship oraz Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, a D.B. był wspierany przez grant NSEC z NSF.

1. Sieciowanie w żywych komórkach
<ol>
	<li>Zacznij od ~2,5x107 komórek H1 lub innych hodowanych komórek. 
	UWAGA: Ta liczba komórek H1 odpowiada pięciu 10-centymetrowym szalkom (około 40% konfluencji).</li>
	<li>Hodować komórki w pożywce E8 na szalkach pokrytych powierzchnią, na której znajdują się pluripotencjalne komórki macierzyste (patrz Wykaz materiałów) i inkubować je w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 . Zbieraj komórki enzymatycznie (patrz Lista materiałów). Uwaga: Nie pozwól, aby komórki H1 przekroczyły 90% zbiegu; konfluencja indukuje spontaniczne różnicowanie komórek H1. Aby policzyć komórki, należy wyhodować dodatkowe 10-centymetrowe naczynie komórek, podnieść komórki enzymatycznie, jak opisano w sekcjach 1.8-1.10 i policzyć je za pomocą hemocytometru.
	<ol>
		<li>Przygotować pożywki hodowlane E8 zgodnie z opisem w Chen i wsp.54 Rozdział 54 </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed dodaniem poliamidu należy usunąć zużyte pożywki hodowlane za pomocą pipety Pasteura przymocowanej do pułapki próżniowej. Dodać świeżą pożywkę za pomocą pipety serologicznej i dozownika do pipet (8 ml na 10-centymetrowe naczynie). 
	UWAGA: Dodaj pożywkę z boku naczynia, aby uniknąć uszkodzenia komórek. Od tego momentu należy chronić komórki przed światłem, aby uniknąć przedwczesnego sieciowania foto</li>.
	<li>Dodać poliamid pipetą (8 μl 400 μM poliamidu w DMSO, stężenie końcowe 400 nM) bezpośrednio do pożywki hodowlanej w każdym szalu. Zakręć naczyniem, aby równomiernie rozproszyć poliamid w podłożu. 
	UWAGA: Stężenie może być różne, ale upewnij się, że nie obserwuje się toksyczności komórkowej dla wybranego leczenia.</li>
	<li>Inkubować komórki 24 godziny 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 i upewnić się, że są chronione przed światłem. 
	UWAGA: Czas inkubacji można zmieniać, aby zmierzyć wiązanie poliamidu w czasie.</li>
	<li>Umyj każde 10-centymetrowe naczynie 4 ml PBS (1,05 mM jednozasadowego fosforanu potasu, 155,17 mM chlorku sodu, 2,97 mM dwuzasadowego fosforanu sodu) za pomocą pipety serologicznej i dozownika do pipet. Odessać PBS i dodać 3 ml pożywki hodowlanej E8.</li>
	<li>Przy przyciemnionych światłach zdejmij pokrywkę z 5 naczyń hodowlanych i umieść komórki na płaskiej powierzchni na zewnątrz okapu. Umieść szklany filtr na 5 szalkach hodowlanych, aby odfiltrować światło o λ < 300 nm. Umieść źródło UV na filtrze. Próbki sieciowane 30 min przy napromieniowaniu UV 365 nm (2,4 mW/cm2). 
	UWAGA: Czas sieciowania należy określić empirycznie.</li>
	<li>Przenieś naczynia hodowlane z powrotem do okapu. Zassać pożywkę za pomocą pipety Pasteura przymocowanej do syfonu próżniowego. Umyj każde 10-centymetrowe naczynie 4 ml PBS. Zassać PBS. Dodać 3 ml enzymu do dysocjacji komórek (patrz Lista materiałów) na 10-centymetrowe naczynie, aby zdysocjować komórki. Inkubować 5 minut w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Nie podgrzewaj wstępnie enzymu.</li>
	<li>Ugasić enzym za pomocą 3 ml pożywki E8 na naczynie. Przenieś zdysocjowane komórki do jednej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. 
	UWAGA: Od tego momentu umieszczaj komórki na lodzie.</li>
	<li>Odwirować zdysocjowane komórki 5 min, 500 x g w temperaturze 4 °C. Odsysać supernatant w celu usunięcia enzymu i pożywki. 
	UWAGA: Punkt pauzy. Komórki mogą być zamrażane w ciekłym azocie, przechowywane w temperaturze -80 °C w celu późniejszej obróbki.</li>
</ol>
2. Izolacja chromatyny
<ol>
	<li>Dodać 1,2 ml buforu COSMIC (20 mM Tris-HCl [pH 8,1], 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton-X100, 0,1% SDS) i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić osad komórek dla każdej próbki w 1,2 ml buforu KOSMIC.
	<ol>
		<li>Dodać po 133 μl 100 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF), 100 mM benzamidyny i 150 μM inhibitorów proteazy pepstatyny w stanie świeżym do końcowego stężenia 1 mM dla PMSF i benzamidyny oraz 1,5 μM dla pepstatyny. Podziel roztwór lizatu komórkowego na dwie bursztynowe probówki do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sonikacja za pomocą sonikatora przez 35 minut (10 sekund włączenia, 10 sekund wyłączenia, 60% mocy), aby rozdrobnić genom do wartości od 100 do 500 pz.
	<ol>
		<li>Utrzymuj poziom roztworu chromatyny w probówce mikrowirówki równolegle do poziomu wody w zbiorniku. Potwierdź ten poziom poprzez oględziny. 
		UWAGA: Potwierdź, że DNA zostało ścięte 1,5% żelem agarozowym. 55</li> Rozdział
		<li>Zoptymalizuj empirycznie czas sonikacji. Użyj minimalnej ilości lodu w zbiorniku do schłodzenia próbek i upewnij się, że lód nie przeszkadza między próbkami a rogiem kubka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować próbkę 12 000 x g 10 min. Roztwór wodny zawierający rozpuszczalną chromatynę należy zachować przenosząc go do nowej bursztynowej probówki do mikrowirówki za pomocą pipety. Wyrzuć granulkę.</li>
	<li>Przenieś 110 μl (10%) próbki do nowej probówki do mikrowirówki i oznacz ją jako wejściowe DNA. Przechowywać w temperaturze -80 °C. Pozostałą część próbki chromatyny należy zachować na lodzie do wykorzystania w kroku 3.3.</li>
</ol>
3. Wychwytywanie wiązań krzyżowych ligand-DNA
<ol>
	<li>Za pomocą pipety dozować 60 μl kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną w probówce do mikrowirówki. Dodać 1 ml buforu COSMIC i wymieszać na nutatorze przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Umieść kulki magnetyczne na stojaku do separacji magnetycznej na 2 minuty, aby uchwycić koraliki. Usuń bufor COSMIC za pomocą pipety. 
	UWAGA: Nie pozwól, aby koraliki wyschły. Przejdź od razu do następnego kroku.</li>
	<li>Dodać próbkę chromatyny (~1 ml) do kulek (60 μl) i ponownie zawiesić kulki. Inkubować chromatynę z kulkami magnetycznymi pokrytymi streptawidyną przez co najmniej 4 godziny na obracającym się, kołyszącym się mieszadle w temperaturze 4 °C. W razie potrzeby inkubować próbki O/N.</li>
</ol>
4. Izolacja DNA oczyszczonego z powinowactwa
<ol>
	<li>Płukać koraliki w odstępie 7 minut w temperaturze pokojowej za pomocą następujących do mycia, aby usunąć niespecyficzne interakcje. Użyj magnetycznego stojaka separacyjnego, aby wychwycić koraliki po każdym praniu. Ponownie zawieszaj kulki po każdej zmianie bufora myjącego.</li>
	<li>Przed użyciem przygotować do płukania w destylowanej wodzie dejonizowanej i przefiltrować (0,2 μm). 1 i 2 należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy. Codziennie przygotuj świeży bufor do mycia 3. Dodać i usunąć płuczące z próbki za pomocą pipety. W przypadku 2 i 4 dodaj odpowiednio 1 i 3 (5 mM) do prania. Próbki można dodatkowo dwukrotnie przemyć buforem COSMIC (raz 12 godzin, raz 4 godziny) przed podanymi poniżej płukaniami.
	<ol>
		<li>Umyć raz buforem do płukania 1 (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 3% SDS). Przemyć raz buforem płuczącym 2 (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP40, 1% deoksycholan sodu). Przemyć dwukrotnie buforem płuczącym 3 (4 M mocznik, 10 mM Tris-Cl [pH 7,5], 1 mM EDTA, 0,1% NP-40). Przemyć dwukrotnie buforem Tris EDTA (TE) (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawiesić kulki w buforze o pojemności 200 μl TE za pomocą pipety. Ta próbka przechwyconego DNA jest określana jako DNA oczyszczone z powinowactwa (AP).</li>
	<li>Uzupełnij DNA wejściowe i AP 10x buforem odwracającym usieciowanie (100 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 M KOH, 4 mM EDTA) do 1x końcowego stężenia. 56,57 Inkubować 30 min w temperaturze 90 °C. 
	UWAGA: Promieniowanie UV o długości fali 254 nm może być również wykorzystane do odwrócenia wiązania poprzecznego psoralenu,58 ale dimery cyklobutylopirymidyny mogą powstawać z napromieniania na tej długości fali i zakłócać dalsze przetwarzanie DNA.</li>
	<li>W przypadku AP DNA umieścić probówkę mikrowirówki zawierającą próbkę na stojaku do separacji magnetycznej na 2 minuty w temperaturze pokojowej i wyizolować ciecz (DNA) za pomocą pipety. Przenieś DNA AP (które zostało uwolnione z kulek) do nowej bursztynowej probówki do mikrowirówki. 
	UWAGA: Pożądane DNA AP znajduje się w płynie, nie jest już przyczepione do kulek.</li>
	<li>Zneutralizować DNA wejściowe i AP za pomocą stężonego HCl do pH 7, dodając około 1 μl 6 N HCl na 100 μl próbki za pomocą pipety. Potwierdź, że próbki zostały zneutralizowane, dodając pipetą ~0,5 μl na bibułę pH. ostrzeżenie: Skoncentrowany HCl jest silnie kwasem. Postępuj zgodnie z wytycznymi Twojej instytucji dotyczącymi odpowiednich środków ochrony osobistej.</li>
	<li>Dodaj RNazę A (100 mg / ml) do końcowego stężenia 0,2 μg / μl zarówno do DNA, jak i AP. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Dodać proteinazę K (20 mg/ml) do końcowego stężenia 0,2 μg/μl zarówno do wejściowego DNA, jak i AP, dodać. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 55 °C.</li>
	<li>Oczyść DNA za pomocą zestawu do czyszczenia kolumny DNA (patrz Lista materiałów). 55 Elute DNA w 58 μl DNA klasyH2O. Przechowywać próbki wejściowe i AP w temperaturze -20 lub -80 °C</li>
	<li>Analiza DNA AP za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) ze starterami specyficznymi dla locus i/lub sekwencjonowania nowej generacji. Do qPCR należy użyć 2 μl AP DNA na locus o następujących parametrach: 1 cykl 95 °C 10 min i 40 cykli 95 °C 20 sekund, 54 °C lub 56 °C 20 sekund, 72 °C 40 sek. 
	UWAGA: Temperaturę wyżarzania należy modyfikować zgodnie z temperaturą topnienia zastosowanych par podkładów. Wybierz temperaturę wyżarzania, która minimalizuje cykl kwantyfikacji bez niespecyficznego wzmocnienia. 
	UWAGA: W przypadku analizy za pomocą sekwencjonowania nowej generacji należy dążyć do co najmniej 10 milionów zmapowanych odczytów. Liczbę zmapowanych odczytów można zwiększyć, zwiększając ilość DNA AP i łącząc mniej próbek w serię sekwencjonowania. Więcej odczytów poprawia czułość. Standardowe pakiety do analizy ChIP-seq (np. HOMER,59 MACS,60 i SPP61) współpracują z danymi COSMIC-seq. Podobnie jak w przypadku innych metod, które opierają się na sekwencjonowaniu nowej generacji, w tym sekwencjonowania genomu i sekwencjonowania ChIP, powtarzające się regiony powodują niejasności w dopasowaniu i składaniu, a tym samym pozostają wyzwaniem technicznym.</li>
</ol>

A.Z.A. jest wyłącznym właścicielem Vista Motif, LLC i WINStep Forward.

Jednym z głównych wyzwań związanych z konwencjonalnym ChIP jest identyfikacja odpowiednich przeciwciał. ChIP zależy w dużym stopniu od jakości przeciwciała, a większość komercyjnych przeciwciał jest nieakceptowalna dla ChIP. Konsorcjum Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) stwierdziło, że tylko 20% komercyjnych przeciwciał nadaje się do testów na obecność wirusa ChIP. 50 W przypadku COSMIC przeciwciała są zastępowane przez streptawidynę. Ponieważ poliamidy są funkcjonalizowane biotyną, streptawidyna jest stoso...

Informacje niezbędne do wytworzenia każdej komórki w ludzkim organizmie są zakodowane w DNA. Selektywne wykorzystanie tych informacji determinuje los komórki. Czynniki transkrypcyjne (TFs) to białka, które wiążą się ze specyficznymi sekwencjami DNA, aby wyciszyć lub aktywować określoną podgrupę genów w genomie; nieprawidłowe funkcjonowanie czynników transkrypcyjnych wiąże się z wystąpieniem szerokiego spektrum chorób, w tym wad rozwojowych, nowotworów oraz cukrzycy.1,2 Naszym celem było opracowanie cząsteczek zdolnych do selektywnego wiązania się z genomem i modulowania sieci regulacyjnych genów.
Poliamidy składające się z N-metylopirolu i N-metylimidazolu są racjonalnie zaprojektowanymi cząsteczkami, które mogą celować w DNA z specyficznością i powinowactwem dorównującym naturalnym czynnikom transkrypcyjnym.3-6 Cząsteczki te wiążą się ze specyficznymi sekwencjami w małej bruździe DNA.4,5,7-11 Poliamidy były wykorzystywane zarówno do represji, jak i aktywacji ekspresji konkretnych genów.4,12-19 Wykazują one również interesujące właściwości przeciwwirusowe20-24 oraz przeciwnowotworowe12,13,25-30. Atrakcyjną cechą poliamidów jest ich zdolność do dostępu do sekwencji DNA, które są zmetylowane31,32 i owinięte wokół białek histonowych9,10,33.
Aby zmierzyć kompleksową specyficzność wiązania cząsteczek wiążących DNA, nasze laboratorium opracowało metodę identyfikacji miejsc pokrewnych (CSI – cognate site identifier).34-39 Przewidywane występowanie miejsc wiązania na podstawie specyficzności in vitro (tzw. genomescapes) może być wyświetlane na genomie, ponieważ intensywności wiązania in vitro są wprost proporcjonalne do stałych asocjacji (Ka).34,35,37 Mapy genomowe te pozwalają zrozumieć stopień zajętości genomu przez poliamidy, jednak pomiar wiązania poliamidów w żywych komórkach stanowi wyzwanie. DNA jest ściśle upakowane w jądrze komórkowym, co może wpływać na dostępność miejsc wiązania. Dostępność tych chromatynowych sekwencji DNA dla poliamidów pozostaje zagadką.
W ostatnim czasie pojawiło się wiele metod badania oddziaływań między małymi cząsteczkami a kwasami nukleinowymi.40-48 Jedną z takich technik jest chemiczne wychwytywanie powinowactwa i masowo równoległe sekwencjonowanie DNA (chem-seq). Chem-seq wykorzystuje formaldehyd do sieciowania małych cząsteczek z docelowym obszarem genomu oraz biotynilowaną pochodną wybranej małej cząsteczki do wychwycenia oddziaływania ligand–cel.48,49
Sieciowanie formaldehydem prowadzi do pośrednich oddziaływań, które mogą generować wyniki fałszywie dodatnie.50 Opracowaliśmy nową metodę sieciowania małych cząsteczek w celu izolacji chromatyny (COSMIC),51 wykorzystującą fotosiewnik w celu wyeliminowania tak zwanych „widmowych” pików.50 W pierwszej kolejności zaprojektowaliśmy i zsyntetyzowaliśmy trifunkcyjne pochodne poliamidów. Cząsteczki te zawierały poliamid wiążący DNA, fotosiewnik (psoralen) oraz uchwyt powinowactwa (biotynę, Rycina 1). Dzięki zastosowaniu trifunkcyjnych poliamidów możemy kowalencyjnie utrwalić oddziaływania poliamid–DNA za pomocą naświetlania promieniowaniem UV o długości fali 365 nm, która nie uszkadza DNA ani nie indukuje sieciowania niezależnego od psoralenu.51 Następnie fragmentujemy genom i oczyszczamy wychwycone DNA w rygorystycznych, półdenaturujących warunkach, aby zredukować ilość DNA związanego niekowalencyjnie. W związku z tym postrzegamy COSMIC jako metodę powiązaną z chem-seq, ale z bardziej bezpośrednim odczytem celowania w DNA. Co ważne, słabe powinowactwo psoralenu do DNA (Ka 103-104 M-1) nie wpływa w sposób wykrywalny na swoistość poliamidu.51,52 Wzbogacone fragmenty DNA mogą być analizowane za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy51 (COSMIC-qPCR) lub sekwencjonowania nowej generacji53 (COSMIC-seq). Dane te umożliwiają bezstronne, kierowane genomem projektowanie ligandów, które oddziałują z pożądanymi loci genomicznymi i minimalizują efekty poza docelowe.
<img alt="Schemat powstawania adduktów poliamid-DNA obejmujący sekwencjonowanie; analiza genomu za pomocą qPCR, sekwencjonowanie." src="/files/ftp_upload/53510/53510fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Rysunek 1. Bioaktywne poliamidy i schemat COSMIC. (A) Poliamidy w formie spinki do włosów 1–2 celują w sekwencję DNA 5′-WACGTW-3′. Poliamidy liniowe 3–4 celują w 5′-AAGAAGAAG-3′. Pierścienie N-metyloimidazolu zostały pogrubione dla przejrzystości. Puste i wypełnione kółka reprezentują odpowiednio N-metylpirol i N-metyloimidazol. Kwadrat reprezentuje 3-chlorotiofen, a romby reprezentują β-alaninę. Psoralen i biotyna są oznaczone odpowiednio jako P i B. (B) Schemat COSMIC. Komórki są traktowane trifunkcyjnymi pochodnymi poliamidów. Po sieciowaniu za pomocą naświetlania UV o długości fali 365 nm, komórki są lizowane, a DNA genomowe poddawane ścinaniu. Dodaje się magnetyczne kulki pokryte streptawidyną w celu wychwytu adduktów poliamid–DNA. DNA jest uwalniane i może być analizowane za pomocą ilościowego PCR (qPCR) lub sekwencjonowania następnej generacji (NGS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53510/53510fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)</td><td>dowolne źródło</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzamidyna</td><td>dowolne źródło</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepstatyna</td><td>dowolne źródło</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>dowolne źródło</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Life Technologies</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>Można użyć innych źródeł</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Z powodzeniem wypróbowaliśmy innych producentów kolumn DNA.</td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania próbek TruSeq ChIP</td><td>Illumina</td><td>IP-202-1012</td><td>Ten zestaw może być używany do przygotowania COSMIC DNA do sekwencjonowania nowej generacji</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>Służy do powlekania płytek w celu wyhodowania H1 ESC</td></tr><tr><td>Papier pH</td><td>z dowolnego źródła</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bursztynowe probówki</td> wirówkowe <td>dowolne źródło</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>dowolne źródło</td><td></td><td></td></tr><tr><td>filtr pyrex</td><td>dowolne źródło</td><td></td><td>Naczynia do pieczenia Pyrex są odpowiednie</td></tr><tr><td>qPCR master mix</td><td>dowolne źródło</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaza</td><td>dowolne źródło</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl (6 N)</td> <td>dowolne źródło</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10-centymetrowe naczynia do hodowli tkankowych</td><td>dowolne źródło</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne</td><td>dowolne źródło</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td>z dowolnego źródła</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>z dowolnego źródła</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe o pojemności 15 ml z</td><td>dowolnego źródła</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>z dowolnego źródła</td> Mikrowirówka z dowolnym źródłem <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>z dowolnego źródła</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczny stojak separacyjny</td><td>z dowolnego źródła</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Źródło promieniowania UV</td><td>CalSun</td><td>B001BH0A1A</td><td>Można stosować inne źródła promieniowania UV, ale czas sieciowania musi być zoptymalizowany empirycznie</td></tr><tr><td>Misonix Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>S4000 z klaksonem kubkowym 431C1</td><td>Można stosować inne sonicy, ale warunki sonikacji muszą być zoptymalizowane empirycznie</td></tr><tr><td>Nawilżony inkubator CO2</td><td>dowolne źródło</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego z wylotem podciśnienia</td><td>z dowolnego źródła</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapowanie całego genomu interakcji lek-dna w komórkach za pomocą cosmic (sieciowanie małych cząsteczek w celu izolacji chromatyny)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genom jest celem niektórych z najskuteczniejszych chemioterapeutyków, ale większość z tych leków nie ma specyficznej sekwencji DNA, co prowadzi do toksyczności ograniczającej dawkę i wielu niepożądanych skutków ubocznych. Celowanie w genom za pomocą małych cząsteczek specyficznych dla sekwencji może umożliwić uzyskanie cząsteczek o zwiększonym indeksie terapeutycznym i mniejszej liczbie efektów poza celem. Poliamidy N-metylopirolu/N-metyloimidazolu to cząsteczki, które można racjonalnie zaprojektować, aby celować w określone sekwencje DNA z wyjątkową precyzją. W przeciwieństwie do większości naturalnych czynników transkrypcyjnych, poliamidy mogą wiązać się z metylowanym i chromatynowym DNA bez utraty powinowactwa. Specyficzność sekwencji poliamidów była szeroko badana in vitro z identyfikacją miejsc pokrewnych (CSI) oraz tradycyjnymi podejściami biochemicznymi i biofizycznymi, ale badanie wiązania poliamidu z celami genomowymi w komórkach pozostaje nieuchwytne. Tutaj przedstawiamy metodę sieciowania małych cząsteczek w celu wyizolowania chromatyny (COSMIC), która identyfikuje miejsca wiązania poliamidu w całym genomie. COSMIC jest podobny do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), ale różni się na dwa ważne sposoby: (1) stosuje się fotośrodek sieciujący, aby umożliwić selektywne, kontrolowane czasowo wychwytywanie zdarzeń wiązania poliamidu, oraz (2) uchwyt powinowactwa biotyny jest używany do oczyszczania koniugatów poliamid-DNA w warunkach półdenaturacji w celu zmniejszenia DNA, które nie jest kowalencyjnie związane. COSMIC to ogólna strategia, która może być wykorzystana do ujawnienia zdarzeń wiązania całego genomu poliamidów i innych chemioterapeutyków ukierunkowanych na genom.

Aby uwzględnić nierównomierną fragmentację genomu oraz inne zmienne, oczyszczone DNA powinno być zawsze normowane względem referencyjnego DNA wejściowego (Input DNA). Można zastosować primery specyficzne dla badanego locus. Pomocne jest również przeanalizowanie locus, z którym cząsteczka nie powinna się wiązać, w celu zastosowania kontroli negatywnej. Widzimy &gt;100-krotny wzrost zajętości poliamidu po naświetlaniu światłem o długości fali 365 nm (Rysunek 2).
Wzbogacone DNA m...

Identyfikacja bezpośrednich celów cząsteczek ukierunkowanych na genom pozostaje głównym wyzwaniem. Aby zrozumieć, w jaki sposób cząsteczki wiążące DNA angażują się w genom, opracowaliśmy metodę, która opiera się na sieciowaniu małych cząsteczek w celu wyizolowania chromatyny (COSMIC).

Mapowanie całego genomu interakcji lek-DNA w komórkach za pomocą COSMIC (sieciowanie małych cząsteczek w celu izolacji chromatyny)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie profilu wiązania w obrębie całego genomu poliamidów i innych małocząsteczkowych związków celujących w DNA w komórkach. Metoda ta może przyczynić się do rozwoju chemii leków oddziałujących z DNA, wykorzystując genom do kierowania projektowaniem cząsteczek celujących w DNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że mierzone są bezpośrednie oddziaływania ligand-DNA, co pozwala na zrozumienie mechanizmu działania ligandów oddziałujących z genomem.Niektóre z najskuteczniejszych środków terapeutycznych to małe cząsteczki, które wiążą się z DNA i zakłócają transakcje genomiczne. Choć metoda ta została opracowana do badania poliamidów, można ją zastosować również do innych klas cząsteczek ukierunkowanych na DNA. Komórki do tego eksperymentu są hodowane w pożywce E8 na szalkach 10 cm, z powłoką powierzchniową wspierającą pluripotencjalne komórki macierzyste, w temperaturze 37 °C w uwilgotnionej atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla.Przed dodaniem poliamidu usunąć zużytą pożywkę hodowlaną i dodać 8 ml świeżej pożywki na każdą szalkę 10 cm. Od tego momentu chronić komórki przed światłem, aby uniknąć przedwczesnego sieciowania fotochemicznego. Za pomocą pipety dodać poliamid bezpośrednio do pożywki hodowlanej w każdej szalce.Zawirować naczynie, aby równomiernie rozprowadzić poliamid w medium. Inkubować komórki w temperaturze 37°C w nawilżonej atmosferze z 5% CO2 przez 24 godziny, zapewniając ich ochronę przed światłem. Następnego dnia przemyć każdą szalkę 10 cm 4 ml PBS, używając pipety serologicznej i dozownika do pipet.Odssać PBS i dodać 3 ml pożywki hodowlanej E8. Przy przygaszonym świetle umieścić komórki na płaskiej powierzchni poza dygestorium i zdjąć pokrywki z pięciu naczyń hodowlanych. Na naczyniach hodowlanych umieścić filtr szklany, aby odfiltrować światło o długości fali lambda mniejszej niż 300 nanometrów.Umieść źródło UV na filtrze. Przeprowadź sieciowanie próbek przez 30 minut przy użyciu promieniowania UVA o długości fali 365 nanometrów. Po naświetlaniu UVA przenieś szalki hodowlane z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza.Odssać pożywkę za pomocą pipety Pasteura podłączonej do pułapki próżniowej i przemyć każdą szalkę 10 cm 4 ml PBS. Odssać PBS i dodać 3 ml enzymu do dysocjacji komórek na każdą szalkę 10 cm. Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Zneutralizuj działanie enzymu, dodając 3 ml medium E8 na każdą płytkę. Przenieś dysocjowane komórki do jednej probówki stożkowatej o pojemności 15 ml. Od tego momentu utrzymuj komórki w temperaturze 0°C (na lodzie).Odwiruj zdysocjowane komórki przy 500 x g i 4 °C przez pięć minut. Odessaj supernatant, aby usunąć enzym i pożywkę. Aby rozpocząć procedurę izolacji chromatyny, przygotuj bufor cosmic ze świeżymi inhibitorami proteaz.Do podstawowego buforu cosmic dodaj po 12,1 µL inhibitorów proteaz: 100 mM PMSF, 100 mM benzamidyny oraz 150 µM pepstatyny, przygotowanych na świeżo. Dodaj 1,2 ml buforu cosmic do osadu komórkowego i kilkakrotnie pipetuj go w górę i w dół, aby go resuspendować. Następnie podziel zawiesinę komórkową do dwóch bursztynowych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml.Poddaj próbkę sonikacji za pomocą sonikatora, aby pofragmentować genom do rozmiarów od 100 do 500 par zasad. Utrzymuj poziom roztworu chromatyny w probówce do mikrocentryfugi równolegle do poziomu wody w zbiorniku. Potwierdź ten poziom poprzez kontrolę wizualną.Czas sonikacji został zoptymalizowany empirycznie: sonikuj przy mocy 60%, w cyklach 10 sekund pracy i 10 sekund przerwy przez 35 minut. Użyj minimalnej ilości lodu w zbiorniku w celu schłodzenia próbek i upewnij się, że lód nie stanowi bariery między próbkami a końcówką sonikatora. Po zakończeniu sonikacji odwiruj próbkę przy 12 000 g przez 10 minut.Przenieś roztwór wodny zawierający rozpuszczalną chromatynę do nowej bursztynowej probówki do mikrocentryfugi w celu jej zachowania. Odrzuć pellet. Przenieś 110 µL lub 10% próbki do nowej probówki do mikrocentryfugi.Oznacz próbkę jako „input DNA” i przechowuj w temperaturze 80 °C. Pozostałą część próbki chromatyny przechowuj na lodzie do wykorzystania w kolejnych krokach niniejszego protokołu. Aby wyizolować wiązania krzyżowe ligand-DNA, dodaj resztę próbki chromatyny do magnetycznych kulek pokrytych streptawidyną i resuspenduj mieszaninę.Chromatynę inkubować z kuleczkami przez co najmniej cztery godziny na rotacyjnym mieszalniku kołyszącym w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Wymagany bufor do płukania należy przygotować w destylowanej wodzie dejonizowanej i przefiltrować przez filtr 0,2 mikrometra przed użyciem. Bufory 1 i 2 można przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez kilka miesięcy, natomiast Bufor 3 musi być przygotowywany na świeżo każdego dnia.Po zakończeniu inkubacji chromatyny z magnetycznymi kulkami pokrytymi streptawidyną, przemyj próbkę przez siedem minut buforem do przemywania 1. Umieść próbkę w stojaku do separacji magnetycznej, aby uchwycić kulki, a następnie usuń bufor do przemywania 1. Dodaj bufor do przemywania 2 i przemywaj przez kolejne 7 minut.Następnie przemyć dwa razy buforem do mycia 3 przez siedem minut każdego mycia. Na koniec przemyć dwa razy buforem TE. Po ostatnim myciu buforem TE ponownie zawiesić kuleczki w 200 µL buforu TE.Tę próbkę wyizolowanego DNA określa się mianem DNA oczyszczonego metodą powinowactwa (AP DNA). Następnie uzupełnij DNA wejściowe oraz AP DNA 10x buforem do odwracania sieciowania, aby uzyskać stężenie końcowe 1x. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze 90 °C.Umieść probówkę do mikrocentryfugi zawierającą AP DNA na statywie do separacji magnetycznej na dwie minuty w temperaturze pokojowej, a następnie przenieś ciecz zawierającą AP DNA do nowej bursztynowej probówki do mikrocentryfugi. Po zneutralizowaniu Input i AP DNA dodaj RNazę A do obu próbek DNA do stężenia końcowego 0,2 µg/µL. Inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C.Po jednej godzinie do obu próbek DNA wejściowego (Input DNA) oraz DNA z AP (AP DNA) należy dodać Proteinazę K do końcowego stężenia 0,2 µg/µL. Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 55 °C. Następnie DNA wejściowe i DNA z AP należy oczyścić za pomocą zestawu do oczyszczania DNA przy użyciu kolumny i eluować wodą klasy DNA.Przechowywać DNA w temperaturze 20 lub 80 stopni Celsjusza do momentu analizy. DNA oczyszczone metodą powinowactwa powinno być zawsze normalizowane względem referencyjnego DNA wejściowego. Reprezentatywne wyniki ilościowego PCR z zastosowaniem starterów specyficznych dla locus wykazują ponad 100-krotny wzrost zajętości poliamidu po naświetlaniu światłem o długości fali 365 nanometrów.Wzbogacony DNA można również analizować za pomocą sekwencjonowania następnej generacji. Po sekwencjonowaniu surowe odczyty DNA są dopasowywane do genomu, a następnie przygotowywane są ścieżki gęstości. Niniejszy przykład przedstawia ścieżkę gęstości dla Linear Polyamide 4 zaprojektowanego do celowania w powtórzenia AAG.Analiza rozkładu poliamidów w komórkach wykazała, że skupiska miejsc wiązania obejmujące szeroki zakres powinowactwa najlepiej przewidują stopień zajęcia w komórkach. Opracowano algorytm służący do oceny całego genomu pod kątem wiązania z wykorzystaniem danych z in vitro identyfikacji cognatywnych miejsc wiązania. Przedstawione wykresy skrzypcowe pokazują przewidywane wartości dla wiązania Poliamidu 2 oraz Poliamidu 4 w całym genomie.Przedstawiono również reprezentatywne mapy genomowe (genomescapes) dla poliamidu 4. Ta metoda oceny wykazała, że loci z wieloma sekwencjami o niskim i średnim powinowactwie wykazują podobne stopnie zajęcia przez poliamidy, co loci z nielicznymi sekwencjami o wysokim powinowactwie. Po opanowaniu techniki, w przypadku prawidłowego wykonania, można ją zrealizować w ciągu dwóch dni.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o ochronie próbek przed światłem aż do momentu oczyszczenia DNA. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak RT-PCR i RNaza C, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące wpływu wiązania na ekspresję genów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak używać metody cosmic do mapowania profili wiązania poliamidów w całym genomie.

genome-wide-mapping-drug-dna-interactions-cells-with-cosmic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda Hi-C umożliwia bezstronną, genomową identyfikację oddziaływań chromatyny (1). Hi-C łączy ligację bliskościową z sekwencjonowaniem masowo równoległym. Wynikowe dane mogą być wykorzystane do badania architektury genomowej w wielu skalach: wstępne wyniki pozwoliły zidentyfikować takie cechy jak terytoria chromosomowe, segregacja chromatyny otwartej i zamkniętej oraz struktura chromatyny w skali megabazy.

Hi-C: Metoda badania trójwymiarowej architektury genomów.

Test ACT (associated chromosome trap) jest nową, nieobciążoną metodą identyfikacji dalekosiężnych oddziaływań DNA. Charakterystyka dalekosiężnych oddziaływań DNA pozwoli nam określić związek architektury jądra z ekspresją genów zarówno w fizjologii prawidłowej, jak i w stanach chorobowych.

Zintegrowana pułapka chromosomowa do identyfikacji długodystansowych oddziaływań DNA

Opisujemy tutaj test polegający na sprzężeniu identyfikacji metylotransferazy adeninowej DNA (DamID) z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości (DamID-seq). Ta ulepszona metoda zapewnia wyższą rozdzielczość i szerszy zakres dynamiki oraz umożliwia analizowanie danych DamID-seq w połączeniu z innymi danymi sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, takimi jak ChIP-seq, RNA-seq itp.

DamID-seq: Mapowanie interakcji białko-DNA w całym genomie poprzez wysokoprzepustowe sekwencjonowanie fragmentów DNA metylowanych adeniną

Opisujemy endogenne rozszczepienie chromatyny połączone z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChEC-seq), ortogonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie za pomocą białek fuzyjnych nukleazy mikrokokowej (MNazy).

Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Przedstawiamy protokół do identyfikacji funkcjonalnych implikacji wariantów niekodujących zidentyfikowanych przez badania asocjacyjne całego genomu (GWAS) przy użyciu trójwymiarowych interakcji chromatyny.

Mapowanie wariantów choroby Alzheimera do ich docelowych genów przy użyciu obliczeniowej analizy konfiguracji chromatyny

Precyzyjne określenie miejsc wiązania białek w całym genomie jest ważne dla zrozumienia regulacji genów. W tym miejscu opisujemy metodę mapowania genomu, która traktuje DNA immunoprecypitowane chromatyną za pomocą trawienia egzonukleazą (ChIP-exo), a następnie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Metoda ta wykrywa interakcje białko-DNA z rozdzielczością mapowania par zasad bliską i wysokim stosunkiem sygnału do szumu w neuronach ssaków.

Mapowanie w wysokiej rozdzielczości interakcji białko-DNA w neuronach pochodzących z mysich komórek macierzystych przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i egzonukleazy (ChIP-Exo)

Hi-C 3.0 to ulepszony protokół Hi-C, który łączy sieciujące formaldehyd i glutaran disuccinimidylu z koktajlem enzymów restrykcyjnych DpnII i DdeI, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu i rozdzielczość wykrywania interakcji chromatyny.

Rejestrowanie konformacji chromosomów w różnych skalach długości

Protokół mapowania trójwymiarowej organizacji genomu z rozdzielczością nukleosomów przy użyciu metody przechwytywania konformacji chromosomów w całym genomie Micro-C-XL jest przedstawiony tutaj.

Mapowanie interakcji genomu 3D ssaków za pomocą Micro-C-XL

Przedstawiamy szybką i skuteczną metodę wykrywania powszechnych delikatnych pęknięć w miejscu przez natywne γH2A. Immunoprecypitacja chromatyny X (ChIP). Takie podejście znacznie skraca zarówno czas, jak i nakład pracy związany z tradycyjnym γH2A. Testy X ChIP przy zachowaniu wysokiej odtwarzalności i wiarygodności wyników.

Przechwytywanie typowych delikatnych uszkodzeń miejsc za pomocą natywnego γH2A. X ChIP

Poznaj metodę COSMIC do mapowania interakcji lek-DNA w całym genomie komórek. Technika ta mierzy bezpośrednie wiązania ligandów z DNA, dostarczając wgląd w mechanizm działania małych cząsteczek.

Mapowanie całego genomu interakcji lek-DNA w komórkach za pomocą COSMIC (sieciowanie małych cząsteczek w celu izolacji chromatyny) (Wideo) | JoVE Journal

Mapowanie całego genomu interakcji lek-DNA w komórkach za pomocą COSMIC (sieciowanie małych cząsteczek w celu izolacji chromatyny)

Przeglądaj więcej filmów