Znakowanie radioaktywne i oznaczanie ilościowe poziomów komórkowych fosfoinozytydów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z przepływem

Ogólnym celem tej procedury jest zmierzenie ilości każdego rodzaju fosfonozytolu w komórkach w różnych warunkach genetycznych i środowiskowych, aby zrozumieć funkcję i regulację fosfoinozytolu. Lipidy fosfoinozytolu kontrolują funkcje komórek, takie jak migracja, replikacja i transport pamięci. Metoda ta identyfikuje warunki genetyczne i środowiskowe, które wpływają na fosfoinozytydy i zwiększa naszą wiedzę na temat ich regulacji i funkcji.

Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na dokładny, jednoczesny pomiar wszystkich fosfoinozytydów wewnątrz komórek. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat regulacji fosfoinozytydów w drożdżach, można ją również zastosować do hodowanych komórek ssaków. Osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z powodu wielu kroków wymaganych do etykietowania, przetwarzania i analizy.

Zalecamy, aby najpierw ćwiczyć bez etykiety radioaktywnej. Na początek wyhoduj 20-mililitrową płynną kulturę szczepu drożdży SEY6210, w kompletnym syntetycznym podłożu w temperaturze 30 stopni Celsjusza z ciągłym wstrząsaniem do połowy fazy logarytmicznej. Następnie przenieś w sumie od 10 do 14 OD komórek drożdży do 12-mililitrowej probówki wirówkowej z okrągłym dnem i wiruj przy 800 razy G przez pięć minut.

Zdekantować pożywkę. I ponownie zawiesić osad w 2 mililitrach podłoża wolnego od inozytolu. Ponownie odwirować komórki.

A następnie ponownie zawiesić osad w 440 mikrolitrach pożywki wolnej od inozytolu. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po inkubacji dodaj 60 mikrolitrów trytu znakowanego mio-inozytolem i hoduj komórki przez dodatkowe godziny do trzech godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu.

Przenieść zawiesinę komórek do probówki mikrowirówkowej zawierającej 500 mikrolitrów 9% kwasu nadchlorowego i 200 mikrolitrów szklanych kulek przemytych kwasem. Wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę, a następnie inkubuj na lodzie przez pięć minut. Następnie wiruj rurkę z maksymalną prędkością przez 10 minut.

Następnie przenieś lizat do nowej probówki mikrowirówki za pomocą końcówki ładującej żel, aby uniknąć zasysania szklanych kulek. Następnie odwirować probówkę i wyrzucić supernatant. Sonikować osad w jednym mililitrze lodowatego 100-milimolowego EDTA, aż do całkowitego rozproszenia, i ponownie odwirować.

Po odwirowaniu odessać EDTA z probówki zawierającej osad znakowany radioaktywnie. Dodaj 50 mikrolitrów wody i sonikacji, aby ponownie zawiesić osad. Przygotować świeży odczynnik deacylacyjny zgodnie z protokołem tekstowym.

Następnie dodaj 500 mikrolitrów odczynnika deacylacyjnego do probówki i poddaj sonicy, aby wymieszać. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie przenieś próbkę do bloku grzewczego o temperaturze 53 stopni Celsjusza na 50 minut.

Następnie umieść próbkę w wirówce próżniowej i pozostaw do wyschnięcia na co najmniej trzy godziny. Ponownie zawiesić osad przez sonikację w 300 mikrolitrach wody i inkubować go w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie należy całkowicie wysuszyć próbkę w wirówce próżniowej przez co najmniej trzy godziny.

Po wysuszeniu dodaj 450 mikrolitrów wody do probówki i ponownie zawiesić osad przez sonikację, aż do całkowitego rozproszenia. Przygotować świeży odczynnik ekstrakcyjny zgodnie z protokołem tekstowym. Dodaj 300 mikrolitrów odczynnika ekstrakcyjnego i wiruj z maksymalną prędkością przez pięć minut.

Odwirować probówkę o temperaturze 18000 razy G przez dwie minuty i ostrożnie odpipetować dolną warstwę wody do nowej probówki. Następnie wysuszyć końcową frakcję wodną przez wirowanie próżniowe przez co najmniej trzy godziny. Następnie całkowicie rozproszyć osad przez sonikację w 50 mikrolitrach wody i przechowywać próbkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Na koniec oznacz radioaktywność próbki, dodając dwa mikrolitry do czterech mililitrów płynu scyntylacyjnego w 6-mililitrowej fiolce scyntylacyjnej z polietylenu. Zapisać CPM fiolki za pomocą licznika scyntylacji cieczy z otwartym okienkiem. Aby skonfigurować system HPLC do separacji glicero-inozytytów znakowanych trytem, należy najpierw przygotować A i B oraz kolumnę chromatograficzną zgodnie z protokołem tekstowym.

Następnie załaduj 10 milionów CPM próbki do dwumililitrowej fiolki do wstrzykiwań, wyposażonej w sprężynową wkładkę o pojemności 250 mikrolitrów i dodaj wodę do całkowitej objętości 55 mikrolitrów. Zakryć fiolkę zakrętką wyposażoną w silikonową przegrodę z PTFE i umieścić ją w tacce do automatycznego pobierania próbek systemu HPLC wraz z ślepym zbiornikiem wodnym w podobnej fiolce. Korzystając z oprogramowania w systemie HPLC, zaprogramuj protokół elucji.

Jeden procent buforu B przez pięć minut, jeden do 20 procent B przez czterdzieści minut, 20 do 100 procent B przez dziesięć minut, 100% B przez pięć minut, 100 do jednego procenta B przez dwadzieścia minut, a następnie jeden procent B przez dziesięć minut. Ustaw natężenie przepływu pompy na 1,0 mililitra na minutę przez 90 minut, a limit ciśnienia na 400 barów. Następnie należy skonfigurować protokół wykrywania w scyntylatorze przepływowym, który będzie działał przez 60 minut, z natężeniem przepływu płynu scyntylacyjnego 2,5 na minutę i czasem przebywania 8,57 sekundy.

Następnie zaprogramuj automatyczną sekwencję iniekcji na HPLC, aby rozpocząć od ślepej próby wodnej uruchamiającej protokół równoważenia, a następnie próbki znakowanej radioaktywnie w protokole elucji. Przed zakończeniem protokołu równoważenia należy utworzyć sekwencję wsadową na scyntylatorze przepływowym, aby zmierzyć wszystkie próbki przy użyciu protokołu wykrywania, który jest wyzwalany przez protokół elucji. Aby przeanalizować dane HPLC, najpierw otwórz plik danych surowych dla każdej próbki za pomocą oprogramowania do oceny ilościowej chromatografu.

W zakładce chromatogramy powiększ obraz, aby rozciągnąć mniejsze piki przy zachowaniu rozdzielczości czasowej. Użyj narzędzia Dodaj zwrot z inwestycji, aby wyróżnić każdy pik do analizy, a następnie zidentyfikuj piki na podstawie ich czasu elucji. Użyj karty tabeli regionów, aby zlokalizować i zarejestrować obszar każdego szczytu.

W tym samym czasie zanotuj czas rozpoczęcia i zakończenia każdego szczytu. Następnie wykonaj odejmowanie tła dla każdego szczytu, podświetlając obszar przylegający do szczytu, obejmujący ten sam okres czasu. Korzystając z oprogramowania arkusza kalkulacyjnego, odejmij liczbę zliczeń dla tego regionu od liczby odpowiedniego szczytu.

Znormalizuj obszar każdego piku w stosunku do rodzicielskiego piku inozytolu glicerynowego i zapisz jako procent rodzicielskiego fosfatydyloinozytolu. Następnie znormalizuj każdy z pików w każdym warunku eksperymentalnym w stosunku do warunku kontrolnego i wyraź jako wzrost fałdu końcowego w porównaniu z kontrolą. Wyeksportuj pliki, klikając Plik i Zapisz jako i wybierając format CSV.

Na koniec otwórz plik CSV w programie do obsługi arkuszy kalkulacyjnych, aby wykreślić dane. Analizę znakowanych radioizotopowo fosfoinozytydów drożdży przeprowadzono metodą HPLC. Ponieważ komórki drożdży wytwarzają tylko cztery fosfoinozytydy, rozdzielczość można osiągnąć za pomocą jednogodzinnej metody elucji o podwójnym gradiencie.

Pik glicerynowego inozytolu nawiązujący do ośmiu do dziewięciu minut przyćmił sygnał od wszystkich innych ufosforylowanych gatunków. W związku z tym konieczne jest powiększenie części śladu zawierającej inne piki przed zintegrowaniem sygnałów promieniotwórczych. Szczepy drożdży typu dzikiego, z delecją ATG18 i VAC14 oznaczono pod kątem zmian w fosfatydyloinozytolu 3,5-bisfosforanie przy użyciu tej metody HPLC.

Wykazano, że usunięty mutant ATG18 wytwarza najwięcej fosfatydyloinozytolu 3, 5-bisfosforanu, a mutant z delecją VAC14 wytwarza najmniej. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o optymalizacji warunków wzrostu i znakowania w oparciu o konkretny szczep drożdży lub typy komórek.

Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak bioczujniki ze stopikiem GFP, mogą być stosowane w celu uzupełnienia scyntylacji przepływowej HPLC w celu wykrywania fosfoinozytydów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak znakować radiowo, ekstrahować i mierzyć fosfoinozytydy za pomocą scyntylacji sprzężonej z HPLC. Nie zapominaj, że praca z radioaktywnością i rozpuszczalnikami organicznymi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podjąć środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej i odpowiednie szkolenie.