Name: Badanie kompleksacji rtęci(II) z tetrapeptydami dicysteinylowymi za pomocą spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-08T13:00:01.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Poznaj metodę analizy kompleksów rtęci(II) z tetrapeptydami dicysteinylowymi przy użyciu spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania. Technika ta umożliwia charakterystykę z minimalną fragmentacją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.N-S dziękuje za wsparcie od Narodowej Fundacji Nauki, RUI grant CHE 1011859. Autorzy wyrażają wdzięczność Zakładowi Spektrometrii Mas Triady na Uniwersytecie Karoliny Północnej w Greensboro za korzystanie ze spektrometru masowego Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL. Autorzy dziękują Danielowi Toddowi, Vincentowi Sica i Brandie Erhmann z University of North Carolina w Greensboro za pomocne sugestie i komentarze dotyczące tej pracy.

Uwaga: Proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) przed użyciem. Chlorek rtęci jest toksyczną substancją chemiczną. Podczas przekazywania środków ochrony osobistej (rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny) należy nosić przy jego przekazywaniu oraz wszystkich związanych z nim roztworów. Roztwory należy utylizować w wyraźnie oznaczonych butelkach na odpady chemiczne przeznaczonych do metali ciężkich.
1. Przygotowanie 5 mM odgazowanego buforu mrówczanu amonu, pH 7,5
<ol>
	<li>Rozpuścić 0,1576 g buforu mrówczanu amonu w 450 ml wody o czystości HPLC. Dostosować pH powyższego roztworu za pomocą 1 M kwasu mrówkowego i 1 M wodorotlenku amonu do 7,5. Przenieść ten roztwór do kolby miarowej o pojemności 500 ml i dodać wodę HPLC do linii kalibracyjnej, aby uzyskać 5 mM roztwór mrówczanu amonu.</li>
	<li>Odgazować 5 mM bufor mrówczanu amonu w systemie próżniowym przez 10 minut i przedmuchnąć argonem. Powtórz dwa razy i przechowuj roztwór pod argonem. W dniu użycia przed użyciem przefiltrować roztwór buforowy przez filtr 0,2 mikrona.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów chlorku rtęci(II)
<ol>
	<li>Odważyć 0,2375 g chlorku rtęci(II). Rozpuścić go w 25 ml 5 mM buforu mrówczanu amonu w celu wytworzenia 0,035 M roztworu chlorku rtęci(II).</li>
	<li>Dodać 0,214 ml 0,035 M roztworu chlorku rtęci(II) do 9,785 ml 5 mM buforu mrówczanu amonu, aby uzyskać roztwór o stężeniu 7,5 x 10-4 M. Pokryj 7,5 x 10-4 M roztwór rtęci(II) argonem.</li>
</ol>
3. Przygotowanie roztworu podstawowego CGGC
<ol>
	<li>Rozpuścić 2,0 mg tetrapeptydu dicysteinylu, CGGC, w 0,118 ml acetonitrylu o czystości HPLC, a następnie dodać 1,0647 ml 5 mM mrówczanu amonu o pH 7,5, buforu odgazowanego w argonie w celu uzyskania 5 mM roztworu podstawowego CGGC.</li>
	<li>Dodać 225 μl 5 mM roztworu podstawowego CGGC do 1,275 μl 5 mM buforu do tworzenia amonu o pH 7,5, aby otrzymać roztwór CGGC o stężeniu 7,5 x 10-4 M.</li>
</ol>
4. Przygotowanie różnych mieszanin reakcyjnych rtęci(II) i CGGC
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu rtęci(II) w stosunku 1:0,5
	<ol>
		<li>Umieścić 255 μl 5 mM mrówczanu amonu o pH 7,5 w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 30 μl 7,5 x10-4 M roztworu chlorku rtęci(II) do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej z buforem mrówczanu amonu.</li>
		<li>Wirować roztwór przez 10 sekund. Następnie dodać 15 μl 7,5 x 10-4 M roztworu CGGC do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Wirować roztwór przez 10 sekund. Pozostawić roztwór na 10 minut przed wstrzyknięciem do spektrometru masowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu rtęci(II) i CGGC w stosunku 1:1
	<ol>
		<li>Umieścić 240 μl 5 mM mrówczanu amonu o pH 7,5 w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 30 μl 7,5 x10-4 M roztworu chlorku rtęci(II) do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej z buforem mrówczanu amonu.</li>
		<li>Wirować roztwór przez 10 sekund. Następnie dodać 30 μl 7,5 x 10 -4 M roztworu CGGC do 1,5 ml probówki do mikrowirówki. Powtórzyć czynności w podobny sposób, jak opisano w sekcji 4.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu rtęci(II) i CGGC w stosunku 1:2
	<ol>
		<li>Umieścić 210 μl 5 mM mrówczanu amonu o pH 7,5 w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 30 μl 7,5 x10-4 M roztworu chlorku rtęci(II) do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej z buforem mrówczanu amonu.</li>
		<li>Wirować roztwór przez 10 sekund. Następnie dodać 60 μl 7,5 x 10-4 M roztworu CGGC do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Powtórzyć czynności w podobny sposób, jak opisano w sekcji 4.1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przygotowanie roztworu podstawowego CEEC
<ol>
	<li>Rozpuścić 3,5 mg tetrapeptydu dicysteinylu, CEEC, w 0,145 ml acetonitrylu klasy HPLC w celu rozpuszczenia peptydu. Następnie dodać 13,067 ml 5 mM mrówczanu amonu, buforu o pH 7,5, który został odgazowany w argonie, aby uzyskać 0,5 mM roztworu CEEC.</li>
	<li>Wirować roztwór, aż cały peptyd się rozpuści. Dodać 1,125 ml 0,5 mM roztworu CEEC i 0,375 ml 5 mM mrówczanu amonu, buforu o pH 7,5 do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać roztwór o stężeniu 7,5 x 10-5 M CEEC. Wirować, aż się wymieszają.</li>
</ol>
6. Przygotowanie różnych mieszanin reakcyjnych rtęci(II) i roztworu CEEC
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu rtęci(II) w stosunku 1:0,5 do CEEC
	<ol>
		<li>Umieścić 255 μl 5 mM mrówczanu amonu o pH 7,5 w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 30 μl 7,5 x10-4 M roztworu chlorku rtęci(II) do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej z buforem mrówczanu amonu.</li>
		<li>Wirować roztwór przez 10 sekund. Następnie dodać 15 μl 7,5 x 10-4 M roztworu CEEC do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Powtórzyć czynności w podobny sposób, jak opisano w sekcji 4.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu rtęci(II) i CEEC w stosunku 1:1
	<ol>
		<li>Umieścić 240 μl 5 mM mrówczanu amonu o pH 7,5 w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 30 μl 7,5 x10-4 M roztworu chlorku rtęci(II) do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej z buforem mrówczanu amonu.</li>
		<li>Wirować roztwór przez 10 sekund. Następnie dodać 30 μl 7,5 x 10-4 M roztworu CEEC do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Powtórzyć czynności w podobny sposób, jak opisano w sekcji 4.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu rtęci(II) i CEEC w stosunku 1:2
	<ol>
		<li>Umieścić 210 μl 5 mM mrówczanu amonu o pH 7,5 w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 30 μl 7,5 x10-4 M roztworu chlorku rtęci(II) do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej z buforem mrówczanu amonu.</li>
		<li>Wirować roztwór przez 10 sekund. Następnie dodać 60 μl 7,5 x 10-4 M roztworu CEEC do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Powtórzyć czynności w podobny sposób, jak opisano w sekcji 4.1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Analiza mieszanin reakcyjnych próbek rtęci(II) i CGGC za pomocą spektrometrii mas Orbitrap ESI
<ol>
	<li>Przygotowanie spektrometru masowego ESI16
	<ol>
		<li>Pobrać 100 μl wzorców kalibracyjnych do szklanej strzykawki o pojemności 500 μl.</li>
		<li>Umieścić strzykawkę w uchwycie strzykawki pompy MS, podłączyć rurkę i wstrzyknąć do spektrofotometru masowego.</li>
		<li>Skonfiguruj nazwę pliku dla uruchomienia, wybierając ikonę pliku i wpisując nazwę pliku.</li>
		<li>Wybierz przycisk pobierz dane w module akwizycji danych i zbierz 150 skanów.</li>
		<li>Przeanalizuj chromatogram, aby zweryfikować wzorce kalibracji, otwierając moduł przetwarzania danych w oprogramowaniu. Otwórz moduł, przejdź do menu plików i wybierz "otwórz", a następnie wybierz plik w oknie dialogowym. Sprawdzić, czy piki na chromatogramie są skorelowane ze stosunkami masy do ładunku wzorców.</li>
		<li>Oczyścić szklaną strzykawkę o pojemności 500 μl, pobierając 500 μl metanolu klasy HPLC, a następnie dozować metanol do zlewki.</li>
		<li>Pobrać 500 μl metanolu klasy HPLC do szklanej strzykawki i przepłukać system zgodnie z krokiem 7.1.2.</li>
		<li>Wybierz moduł konfiguracji metody w oprogramowaniu, aby ustawić parametry. Wybierz menu trybu skanowania i zidentyfikuj analizator jako FTMS, a następnie kliknij "OK". Następnie, klikając różne ikony na stronie widma widoku w czasie rzeczywistym, ustaw następujące parametry: Natężenie przepływu gazu w osłonie: 10, Temperatura źródła: 0, Napięcie kapilarne: 37 V, Soczewka rury: 95 V, Napięcie natrysku: 4,20 kV, Natężenie przepływu 10,00 μl/min, Analizator: FTMS, Liczba skanów: 150.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchamianie próbek CGGC na spektrometrze masowym ESI
	<ol>
		<li>Uruchomić 5 mM bufor mrówczanu amonu o pH 7,5.
		<ol>
			<li>Umieścić 500 μl 5 mM buforu mrówczanu amonu w szklanej strzykawce o pojemności 500 μl, umieścić go w kołysce strzykawki pompy MS i podłączyć rurkę.</li>
			<li>Przepuść bufor przez rurkę przez 1-2 minuty.</li>
			<li>Skonfiguruj nazwę pliku dla uruchomienia, wybierając ikonę pliku i wpisując nazwę pliku.</li>
			<li>Wybierz przycisk pobierz dane w module i zbierz 150 skanów.</li>
			<li>Kliknij przycisk Uruchom, aby zatrzymać zbieranie po zebraniu 150 skanów.</li>
			<li>Otwórz moduł przeglądarki danych, a następnie przejdź do menu plików i wybierz "otwórz", a następnie wybierz plik w oknie dialogowym. Sprawdzić, czy w miejscach 483, 683, 1,163 i 1,363 m/z nie występują piki przypominające peptyd lub kompleksy peptyd rtęć (II).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uruchomić roztwór stosunku rtęci(II) do CGGC 1:0,5.
		<ol>
			<li>Umieścić w strzykawce 250 μl proporcji rtęci(II) do CGGC w stosunku 1:0,5 rtęci(II):CGGC.</li>
			<li>Umieścić strzykawkę w uchwycie strzykawki pompy MS, założyć rurkę i zalać aparat.</li>
			<li>Wybierz nazwę pliku do uruchomienia, wybierając ikonę pliku i wpisując nazwę pliku.</li>
			<li>Naciśnij przycisk pobierania danych w module akwizycji danych i zbierz 150 skanów, a następnie kliknij przycisk uruchom, aby zatrzymać zbieranie.</li>
			<li>Otwórz moduł, przejdź do menu plików i wybierz "otwórz", a następnie wybierz plik w oknie dialogowym. Sprawdzić, czy chromatogram zawiera piki, w tym piki samego peptydu CGGC.</li>
			<li>Umyć strzykawkę, zasysając 500 μl buforu mrówczanu amonu, a następnie dozując bufor mrówczanu amonu do zlewki.</li>
			<li>Wybrać przycisk odpływu na MS i trzykrotnie przepłukać rurkę 500 μl buforem mrówczanu amonu.</li>
			<li>Umyć strzykawkę, zasysając ją 500 μl metanolu, a następnie dozując metanol do zlewki.</li>
			<li>Przepłucz rurkę jednorazowo 500 μl metanolu.</li>
			<li>Wybierz przycisk detektora obciążenia na MS.</li>
			<li>Dodać 500 μl buforu mrówczanu amonu do strzykawki.</li>
			<li>Umieścić strzykawkę w uchwycie strzykawki pompy MS, założyć rurkę i zalać aparat.</li>
			<li>Wybierz nazwę pliku dla uruchomienia buforu, wybierając ikonę pliku i wpisując nazwę pliku.</li>
			<li>Naciśnij przycisk pobierania danych i zbierz 150 skanów, a następnie kliknij przycisk zatrzymania uruchamiania.</li>
			<li>Otwórz moduł przeglądarki danych, przejdź do menu plików i wybierz "otwórz", a następnie wybierz plik w oknie dialogowym. Sprawdzić, czy chromatogram jest pozbawiony pików z poprzedniego przebiegu Hg:CGGC.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uruchom roztwór stosunku rtęci(II) do CGGC 1:1.
		<ol>
			<li>Umieścić w strzykawce 250 μl próbki o stosunku rtęci(II) do CGGC w stosunku 1:1.</li>
			<li>Powtórzyć czynności w podobny sposób, jak opisano w krokach od 7.2.2.2 do 7.2.2.15.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uruchom rozwiązanie stosunku rtęci(II) do CGGC 1:2
		<ol>
			<li>Umieścić w strzykawce 250 μl próbki o stężeniu rtęci(II) w stosunku 1:2</li>.
			<li>Powtórzyć czynności w podobny sposób, jak opisano w krokach od 7.2.2.2 do 7.2.2.15.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Analiza mieszanin reakcyjnych próbek rtęci i CEEC za pomocą spektrometrii mas Orbitrap ESI
<ol>
	<li>Uruchamianie próbek CEEC na spektrometrze masowym ESI
	<ol>
		<li>Powtórzyć procedurę analizy (etapy 7.1–7.2) przy użyciu próbek CEEC i mieszanin reakcyjnych rtęci(II) i CEEC w różnych proporcjach stechiometrycznych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Clifton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mercury+exposure+and+public+health%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Clin.+N.+Am%22%5BJournal%5D)">Mercury exposure and public health.</a> Pediatr. Clin. N. Am. 54, 237-269 (2007).</li>
<li>Andersen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+Recent+Developments+in+Chelation+Treatment+of+Metal+Intoxication%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Principles and Recent Developments in Chelation Treatment of Metal Intoxication.</a> Chem. Rev. 99, 2683-2710 (1999).</li>
<li>Aposhian, H. V., Maiorino, R. M., Gonzalez-Ramirez, D., Zuniga-Charles, M., Xu, Z., Hurlbut, J. M., Junco-Munoz, P., Dart, R. C., Aposhian, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobilization+of+heavy+metals+by+newer%2C+therapeutically+useful+chelating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Mobilization of heavy metals by newer, therapeutically useful chelating agents.</a> Toxicology. 97, 23-38 (1995).</li>
<li>Flora, S. J. S., Pachauri, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chelation+in+Metal+Intoxication%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Environ.+Res.+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Chelation in Metal Intoxication.</a> Int. J. Environ. Res. Public Health. 7, 2745-2788 (2010).</li>
<li>Campbell, J. R., Clarkson, T. W., Omar, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+use+of+2%2C3-dimercaptopropane-1-sulfonate+in+two+cases+of+inorganic+mercury+poisoning%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The therapeutic use of 2,3-dimercaptopropane-1-sulfonate in two cases of inorganic mercury poisoning.</a> JAMA. 256, 3127-3130 (1986).</li>
<li>Rooney, J. P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+thiols%2C+dithiols%2C+nutritional+factors+and+interacting+ligands+in+the+toxicology+of+mercury%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">The role of thiols, dithiols, nutritional factors and interacting ligands in the toxicology of mercury.</a> Toxicology. 234, 145-156 (2007).</li>
<li>Lin, X., Brooks, J., Bronson, M., Ngu-Schwemlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evalution+of+the+association+of+mercury+%28II%29+with+some+dicysteinyl+tripeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evalution of the association of mercury (II) with some dicysteinyl tripeptides.</a> Bioorg. Chem. 44, 8-18 (2012).</li>
<li>Ngu-Schwemlein, M., Lin, X., Rudd, B., Bronson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+ESI+mass+spectrometric+analysis+of+the+association+of+mercury%28II%29+with+multi-cysteinyl+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inorg.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and ESI mass spectrometric analysis of the association of mercury(II) with multi-cysteinyl peptides.</a> J. Inorg. Biochem. 133, 8-23 (2014).</li>
<li>Winther, J. R., Thorpe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+thiols+and+disulfides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et.+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Quantification of thiols and disulfides.</a> Biochimica et. Biophysica Acta. 1840, 838-846 (2014).</li>
<li>D'Agstino, A., Colton, R., Traeger, J. C., Cantry, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electrospray+Mass+Spectrometric+Study+of+Organomercury+%28II%29+and+Mercuric+Interactions+with+Peptides+Involving+Cysteinyl+Ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">An Electrospray Mass Spectrometric Study of Organomercury (II) and Mercuric Interactions with Peptides Involving Cysteinyl Ligands.</a> Eur. Mass Spectrom. , 273-285 (1990).</li>
<li>Hofstadler, S. A., Sannes-Lowery, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+ESI-MS+in+drug+discovery%3A+interrogation+of+noncovalent+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Applications of ESI-MS in drug discovery: interrogation of noncovalent complexes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5, 585-595 (2006).</li>
<li>Rubino, F. M., Verduci, C., Giampiccolo, R., Pulvirenti, S., Brambilla, G., Columbi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Characterization+of+Homo-+and+Heterodimeric+Mercury+%28II%29-bis-thiolates+of+Some+Biologically+Relevant+Thiols+by+Electrospray+Ionization+and+Triple+Quadruple+Tandem+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Molecular Characterization of Homo- and Heterodimeric Mercury (II)-bis-thiolates of Some Biologically Relevant Thiols by Electrospray Ionization and Triple Quadruple Tandem Mass Spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15, 288-300 (2003).</li>
<li>Krupp, E. M., Milne, B. F., Mestrot, A., Meharg, A. A., Feldmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+into+mercury+bound+to+biothiols%3A+structural+identification+using+ESI-ion-trap+MS+and+introduction+of+a+method+for+their+HPLC+separation+with+simultaneous+detection+by+ICP-MS+and+and+ESI-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Investigation into mercury bound to biothiols: structural identification using ESI-ion-trap MS and introduction of a method for their HPLC separation with simultaneous detection by ICP-MS and and ESI-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 390, 1753-1764 (2008).</li>
<li>Schaumlöffel, D., Tholey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+directions+of+electrospray+mass+spectrometry+for+elemental+speciation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Recent directions of electrospray mass spectrometry for elemental speciation analysis.</a> Anal. Bioanal. Chem. 400, 1645-1652 (2011).</li>
<li>Patiny, L., Borel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChemCalc%3A+a+building+block+for+tomorrow%27s+chemical+infrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Inf.+Model%22%5BJournal%5D)">ChemCalc: a building block for tomorrow's chemical infrastructure.</a> J. Chem. Inf. Model. 53, 1223-1228 (2013).</li>
<li>Thermo Scientific. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Xcaibur+Versions+2.1.0-2.3.0+Data+Acquisition+and+Processing+User+Guide.+Revision+E.+United+States%22">Xcaibur Versions 2.1.0-2.3.0 Data Acquisition and Processing User Guide. Revision E. United States</a>. , Thermo Fisher Scientific Inc. (2012).</li>
<li>Falcone, G., Foti, C., Gianguzza, A., Giuffrè, O., Napoli, A., Pettignano, A., Piazzese, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequestering+ability+of+some+chelating+agents+towards+methylmercury%28II%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sequestering ability of some chelating agents towards methylmercury(II).</a> Anal. Bioanal. Chem. 405 (2), 881-893 (2013).</li>
<li>Mah, V., Jalilehvand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+Complex+Formation+with+Mercury%28II%29+in+Aqueous+Solution+at+Physiological+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Glutathione Complex Formation with Mercury(II) in Aqueous Solution at Physiological pH.</a> Chem. Res. Toxicol. 23, 1815-1823 (2010).</li>
</ol>

Nie ujawnia się informacji na temat zgłoszonej pracy.

Hydrofobowy tetrapeptyd dicysteinylowy CGGC (C10H18N4O5S2; MW = 338) (Rysunek 1) tworzy kompleksy z rtęcią(II), co przedstawiono na Rysunku 2 i w Tabeli 1. Ponadto, wraz ze wzrostem ilości peptydów w mieszaninie reakcyjnej, stopniowo tworzą się dimery i trimery peptydowe. Jak wskazują wartości m/z dla związanych dimerów [(2M+H)+ = 677] i trimerów [(3M+H)+ = 1015], grupy tiolowe CGGC nie utleniał...

Obecne kliniczne leki przepisywane do terapii chelatacyjnej zatrucia rtęcią1 zawierają grupę tiolową, która jest/są odpowiedzialne za wiązanie i sekwestrację jonów rtęci2,3. Jednak badania wykazały, że te małe związki tiolowe [kwas dimerkaptobursztynowy (DMSA) i kwas dimerkaptopropanosulfonowy (DMPS)] nie są optymalne dla terapii chelatującej rtęć4-6. W związku z tym istnieje potrzeba zrozumienia powiązań i tendencji do tworzenia kompleksów rtęci z tiolami, aby poprawić racjonalne projektowanie leków na związki tiolowe do chelatacji rtęci. Niedawno informowaliśmy, że tripeptydy n-alkilowe i arylowe dicysteinylowe z grupami ditiolowymi mogą służyć jako skuteczne "podwójne kotwice" do akomodacji miejsc koordynacyjnych rtęci(II) w celu utworzenia kompleksów 1:1 rtęć(II):p eptyd i 1:2 rtęć(II):(peptyd)2 7. Dodatkowo badano wpływ zwiększania reszt cysteinylowych na formacje typu złożonego8. W tym badaniu badamy związek rtęci(II) z dwoma tetrapeptydami dicysteinylu, w których reszty cysteinylowe są oddzielone dwiema resztami aminokwasowymi. W celu oceny wpływu pomocniczych grup wiążących dla rtęci, aminokwasami pośrednimi są albo dwie reszty glicyny (niepodstawionej), albo dwie reszty kwasu glutaminowego (gamma-karboksylowane). 
Reakcja peptydu cysteinylowego z rtęcią(II) wymaga warunków, które zapobiegną utlenianiu grup cysteinylotiolowych do tworzenia wiązań dwusiarczkowych9. Ponadto asocjacja rtęci(II) z peptydami cysteinylowymi w celu utworzenia różnych typów kompleksów rtęć-peptyd zależy od początkowego stosunku rtęci(II) do peptydu w mieszaninie reakcyjnej7,8. Rodzaje kompleksów rtęć-peptyd powstających w tych mieszaninach reakcyjnych można analizować za pomocą spektroskopii mas z miękką jonizacją, która jest czułym narzędziem analitycznym do określania interakcji między pierwiastkami między jonami metali a peptydami10-14. W związku z tym zapewni profil różnych typów adduktów peptydowych rtęci, które powstają w określonych warunkach jonizacji elektronrozpylania. Tutaj pokażemy, w jaki sposób peptydy cysteinylowe i roztwory chlorku rtęci(II) można przygotować w odgazowanym roztworze buforowym mrówczanu amonu pokrytym argonem w celu zminimalizowania utleniania. Reagując różne ekwiwalenty molowe rtęci(II) z tetrapeptydami dicysteinylu, pokażemy, jak początkowy stosunek rtęci(II):p eptydu wpływa na rodzaje powstających kompleksów. Pokażemy również, w jaki sposób spektrometria mas z jonizacją elektronrozpylaną (ESI) może być wykorzystana jako narzędzie do charakteryzacji w celu zapewnienia dokładnej stechiometrii rtęci do peptydu w powstałych kompleksach. Powiązany protokół wideo zademonstruje warunki eksperymentalne przygotowania kompleksów rtęci, procedurę analizy mieszanin reakcyjnych w określonych warunkach jonizacji elektronrozpylania oraz charakterystykę stechiometrii kompleksów rtęć(II)-dicysteinylotetrapeptyd, w oparciu o odrębne wzorce rozkładu izotopów rtęci, przy użyciu programu ChemCal15. Ma on na celu pomóc tym, którzy są zainteresowani wykorzystaniem spektrometrii mas ESI orbitrap do analizy różnych kompleksów utworzonych przez jony metali, które występują w różnych formach izotopowych.

<table><tbody><tr><td>Chlorek rtęci(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>429724</td><td>Wysoce toksyczny</td></tr><tr><td>mrówczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516961</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu</td><td>Fisher</td><td>A512-P500</td><td></td></tr><tr><td>HPLC woda</td><td>Fisher</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Acetonitryl</td><td>Fisher</td><td>BP2405-1</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Metanol</td><td>Fisher</td><td>A452-4</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie kompleksacji rtęci(ii) z tetrapeptydami dicysteinylowymi za pomocą spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania

A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

W tym badaniu oceniliśmy metodę charakterystyki kompleksów, powstałych w różnych względnych proporcjach rtęci(II) do tetrapeptydu dicysteinylu, za pomocą spektrometrii mas z jonizacją electrorozpylaną. Strategia ta opiera się na wcześniejszej udanej charakterystyce kompleksów rtęć-dicysteinyl z udziałem tripeptydów z wykorzystaniem spektrometrii mas i innych technik. Chlorek rtęci(II) i tetrapeptyd dicysteinylu inkubowano w odgazowanym, buforowanym podłożu w różnych proporcjach stechiometrycznych. Powstałe kompleksy były następnie analizowane na spektrometrze mas z elektrorozpylaczem, składającym się z hybrydowego liniowego analizatora mas z jonami i pułapkami. Widma spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania (ESI-MS) uzyskano w trybie dodatnim, a obserwowane piki przeanalizowano następnie pod kątem wyraźnych wzorców dystrybucji izotopów rtęci i związanych z nimi pików monoizotopowych. Praca ta pokazuje, że dokładna stechiometria rtęci i peptydu w kompleksach powstałych w określonych warunkach jonizacji elektronrozpylania może być wyznaczona przy użyciu wysokiej rozdzielczości ESI MS w oparciu o różne wzorce rozkładu izotopów rtęci.

Przeprowadzono badanie w celu scharakteryzowania możliwego składu kompleksów rtęć-peptyd dla dwóch tetrapeptydów, CGGC i CEEC (Rycina 1) przy użyciu spektrometrii mas ESI. Kompleksy rtęci(II) z CGGC lub CEEC badano poprzez reakcję mieszanin roztworów rtęci(II) i peptydów w trzech różnych stosunkach molowych: 1:0,5, 1:1 oraz 1:2 (rtęć(II): peptyd). Stężenie rtęci(II) wynosiło 7,5 x 10-6 M, a stężenie peptydów zmieniano odpowiednio.
<p class="jove_content" fo...

Przedstawiono charakterystykę kompleksów powstałych w różnych względnych proporcjach tetrapeptydów rtęci(II) do tetrapeptydów dicysteinylu za pomocą spektrometrii mas orbitrap z jonizacją elektrorozpylającą.

Badanie kompleksacji rtęci(II) z tetrapeptydami dicysteinylowymi za pomocą spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie kompleksów rtęci i peptydów dicysteinylowych przy różnych stechiometriach reakcji oraz charakterystyka utworzonych kompleksów za pomocą jonizacji rozpylnej i spektrometrii mas Orbitrap. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące tendencji kompleksowania rtęci i związków tiolowych, co usprawni racjonalne projektowanie czynników chelatujących do sekwestracji jonów rtęci. Główną zaletą tej techniki jest ułatwienie analizy kompleksów jonów metali przy pomijalnej fragmentacji.Inne zalety obejmują charakterystyczny wzorzec rozkładu izotopowego rtęci oraz łatwość przypisywania ładunku i analizy nakładających się pików za pomocą tandemowej spektrometrii mas. Chociaż metoda ta dostarcza informacji na temat kompleksów peptydowych rtęci, może być ona również stosowana w przypadku innych kompleksów, szczególnie tych z jonami metali występującymi w różnych formach izotopowych.Odgazuj pięciomilimolowy bufor formatteru amonu w systemie próżniowym przez 10 minut, a następnie przepłucz argonem. Powtórz tę czynność dwukrotnie i przechowuj roztwór pod argonem. W dniu użycia przefiltruj roztwór buforowy przez filtr 0,2 mikrona

a-study-complexation-mercury-ii-with-dicysteinyl-tetrapeptides

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Spektrometria mas okazała się cennym narzędziem do analizy dużych kompleksów białkowych. Metoda ta umożliwia uzyskanie wglądu w skład, stechiometrię i ogólną architekturę wielopodjednostkowych kompleksów. W niniejszej pracy opisujemy krok po kroku, jak przeprowadzić strukturalną analizę spektrometryczną oraz scharakteryzować struktury makromolekularne.

Analiza dużych kompleksów białkowych za pomocą strukturalnej spektrometrii mas

Opisujemy przygotowanie koloidalnych kropek kwantowych o zminimalizowanym rozmiarze hydrodynamicznym do obrazowania fluorescencyjnego pojedynczych cząsteczek. W porównaniu z konwencjonalnymi kropkami kwantowymi, nanocząstki te mają rozmiar zbliżony do białek globularnych i są zoptymalizowane pod kątem jasności pojedynczych cząsteczek, stabilności przeciwko fotodegradacji oraz odporności na nieswoiste wiązanie z białkami i komórkami.

Kompaktowe kropki kwantowe do obrazowania pojedynczych cząsteczek

Opisano metodę oznaczenia kwasowości w fazie gazowej oligopeptydów zawierających cysteinę. Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu potrójnego spektrometru mas kwadrupolowego. Względną kwasowość peptydów zmierzono za pomocą eksperymentów dysocjacji indukowanej zderzeniowo, natomiast kwasowość ilościową wyznaczono z zastosowaniem rozszerzonej kinetycznej metody Cooksa.

Oznaczanie kwasowości w fazie gazowej oligopeptydów

Biofizyczne i biochemiczne badania interakcji między domenami białek osadzonych w błonie napotykają wiele wyzwań technicznych, z których pierwszym jest uzyskanie odpowiedniego materiału do badań. W artykule opisano protokół wytwarzania i oczyszczania stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych, które nadają się do analizy strukturalnej za pomocą roztworu magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i innych zastosowań analitycznych.

Wytwarzanie stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych do badań strukturalnych

Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły dla spektrometrii mas z wymianą amidu i deuteru w stanie stałym (ssHDX-MS) oraz spektrometrii mas znakowania fotolitycznego w stanie stałym (ssPL-MS) dla białek w stałych proszkach. Metody te dostarczają informacji o wysokiej rozdzielczości na temat konformacji i oddziaływań białek w amorficznym stanie stałym, które mogą być przydatne w projektowaniu preparatów.

Podejścia spektrometrii mas do badania struktury i interakcji białek w liofilizowanych proszkach

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Mobilność jonów-spektrometria mas i techniki modelowania molekularnego mogą scharakteryzować selektywną wydajność chelatacji metali zaprojektowanych peptydów wiążących metale oraz peptydu wiążącego miedź metanobaktyny. Opracowanie nowych klas peptydów chelatujących metale pomoże w opracowaniu metod leczenia chorób związanych z nierównowagą jonów metali.

Techniki spektrometrii ruchliwości jonów i mas do określania struktury i mechanizmów rozpoznawania jonów metali i aktywności redoks oligopeptydów wiążących metale

Neutralne klastry SO2 o niskiej energii kinetycznej (&lt; 0,8 eV/składnik) są używane do desorpcji złożonych cząsteczek powierzchniowych, takich jak peptydy lub lipidy, do dalszej analizy za pomocą spektrometrii mas przy użyciu spektrometru masowego z pułapką jonową. Nie jest wymagane specjalne przygotowanie próbki i możliwa jest obserwacja reakcji w czasie rzeczywistym.

Analiza złożonych cząsteczek i ich reakcji na powierzchniach za pomocą spektrometrii mas desorpcji/jonizacji indukowanej klastrami

Syntetazy lantipeptydu katalizują wieloetapowe reakcje podczas biosyntezy naturalnych produktów peptydowych. W tym miejscu opisujemy ciągły, oddolny przepływ pracy spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS), który można wykorzystać do badania dynamiki konformacyjnej syntetaz lantipeptydów, a także innych podobnych enzymów zaangażowanych w biosyntezę naturalnych produktów peptydowych.

Platforma spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS) do badania biosyntetycznych enzymów peptydowych

Prezentowany tutaj jest protokół metody wymiany wodoru i deuteru (HDX) opartej na elektroforezie kapilarnej w połączeniu ze spektrometrią mas z góry na dół. Podejście to charakteryzuje różnicę w strukturach wyższego rzędu między różnymi gatunkami białek, w tym białkami w różnych stanach i różnymi proteoformami, poprzez prowadzenie jednoczesnej różnicowej separacji HDX i elektroforetycznej.

Wymiana wodorowo-deuterowa oparta na elektroforezie kapilarnej do konformacyjnej charakterystyki białek za pomocą spektrometrii mas z góry na dół

Ten artykuł opisuje eksperymentalny protokół wykorzystujący elektrorozpylanie, ruchliwość jonów, spektrometrię mas, półempiryczne obliczenia kwantowe i dysocjację wywołaną zderzeniem progu o rozdzielczości energetycznej do pomiaru względnej termochemii dysocjacji powiązanych kompleksów metali trójskładnikowych.

Badania termochemiczne trójskładnikowych kompleksów Ni(II) i Zn(II) z wykorzystaniem spektrometrii ruchliwości jonów i mas

Poznaj metodę analizy kompleksów rtęci(II) z tetrapeptydami dicysteinylowymi przy użyciu spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania. Technika ta umożliwia charakterystykę z minimalną fragmentacją.

Badanie kompleksacji rtęci(II) z tetrapeptydami dicysteinylowymi za pomocą spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania

Przeglądaj więcej filmów