Badanie kompleksacji rtęci(II) z tetrapeptydami dicysteinylowymi za pomocą spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie kompleksów peptydów rtęci i dicysteinylu w różnych stechiometriach reakcji oraz scharakteryzowanie różnych kompleksów powstałych w wyniku jonizacji elektronrozpylającej i spektrometrii mas oribitrap. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tendencji kompleksowania związków rtęci i tiolu, co poprawi racjonalne projektowanie czynników chelatujących do sekwestracji jonów rtęci. Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia analizę kompleksów jonów metali o znikomym rozdrobnieniu.

Inne obejmują wyraźny wzorzec rozmieszczenia izotopów rtęci. Łatwość przypisywania ładunku i analizowania nakładających się pików za pomocą tandemowej spektrometrii mas. Chociaż metoda ta zapewnia wgląd w kompleksy peptydowe rtęci, może być również stosowana z innymi kompleksami, zwłaszcza z jonami metali, które występują w różnych formach izotopowych.

Odgazować pięciomilimolowy bufor mrówczanu amonu w systemie próżniowym przez 10 minut i przepłukać argonem. Powtórz dwa razy i przechowuj roztwór pod argonem. W dniu użycia przed użyciem przefiltrować roztwór buforowy przez filtr 0,2 mikrona.

Aby przygotować roztwory chlorku rtęci, odważ 0,2375 grama chlorku rtęci. Rozpuścić w 25 mililitrach pięciomilimolowego buforu mrówczanu amonu, aby otrzymać 0,035 molowy roztwór chlorku rtęci. Dodaj 0,214 mililitra roztworu chlorku rtęci do 9,785 mililitra pięciomilimolowego buforu mrówczanu amonu, aby utworzyć 0,75 milimolowy roztwór.

Pokryj powstały roztwór argonem. Następnie dodaj 225 mikrolitrów pięciomilimolowego roztworu podstawowego CGGC do 1,275 mililitra pięciomilimolowego buforu mrówczanu amonu o pH 7,5, aby uzyskać 0,75 milimolowego roztworu CGGC. Następnie przygotuj roztwór rtęci o stosunku 1 do 0,5, umieszczając 255 mikrolitrów pięciomilimolowego buforu mrówczanu amonu o pH 7,5 w 1,5 mililitrowej probówce do mikrowirówki.

Następnie dodaj 30 mikrolitrów 0,75 milimolowego roztworu chlorku rtęci do probówki. Wiruj roztwór przez 10 sekund. Następnie dodaj 15 mikrolitrów 0,75 milimolowego roztworu CGGC do probówki.

Wirować roztwór przez kolejne 10 sekund, a następnie pozostawić roztwór na 10 minut przed wstrzyknięciem do spektrometru masowego. Aby przygotować spektrometr masowy ESI lub MS, należy pobrać 100 mikrolitrów wzorców kalibracyjnych do szklanej strzykawki o pojemności 500 mikrolitrów. Umieścić strzykawkę w uchwycie strzykawki pompy SM.

Podłączyć rurkę i wstrzyknąć do spektrometru masowego. Skonfiguruj nazwę pliku dla uruchomienia, wybierając ikonę pliku i wpisując nazwę pliku. Wybierz przycisk pobierania danych w module akwizycji danych i zbierz 150 skanów.

Przeanalizuj chromatogram, aby zweryfikować wzorce kalibracji, otwierając moduł przetwarzania danych w oprogramowaniu. Następnie przejdź do menu plików i wybierz otwarty, a następnie plik w oknie dialogowym. Sprawdzić, czy piki na chromatogramie są skorelowane ze stosunkami masy do ładunku wzorców.

Wyczyść szklaną strzykawkę o pojemności 500 mikrolitrów, pobierając 500 mikrolitrów metanolu klasy HPLC, a następnie dozując go do zlewki. Pobrać 500 mikrolitrów metanolu klasy HPLC do szklanej strzykawki i przepłukać system. Wybierz moduł konfiguracji metody w oprogramowaniu, aby ustawić parametry.

Wybierz menu trybu skanowania i zidentyfikuj analizatory FTMS, a następnie kliknij OK. Następnie klikaj różne ikony na stronie widma widoku w czasie rzeczywistym, aby skonfigurować parametry zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby uruchomić bufor, umieść 500 mikrolitrów pięciomilimolowego buforu mrówczanu amonu w szklanej strzykawce o pojemności 500 mikrolitrów.

Umieścić go w uchwycie strzykawki pompy MS i odłączyć rurkę. Przepuść bufor przez rurkę przez jedną do dwóch minut. Skonfiguruj nazwę pliku dla przebiegu, wybierając ikonę pliku i wpisując nazwę pliku.

Wybierz przycisk pobierania danych w module i zbierz 150 skanów. Kliknij przycisk zatrzymania uruchamiania, aby zatrzymać zbieranie po zebraniu 150 skanów. Następnie otwórz moduł przeglądarki danych, przejdź do menu plik i wybierz otwórz, a następnie plik w oknie dialogowym.

Sprawdź, czy nie ma pików przy przeładowaniu masy 483, 683, 1163 i 1363, które przypominają kompleksy peptydowe peptydów lub jonów rtęci. Uruchomić roztwór o stosunku rtęci do CGGC od jednego do 0,5, umieszczając 250 mikrolitrów próbki w strzykawce. Umieścić strzykawkę w kołysce strzykawki pompy MS.

Podłącz rurki i zalej urządzenie. Pobierając 150 skanów danych, otwórz moduł przeglądarki, przejdź do menu plik i wybierz otwórz. Następnie wybierz plik w oknie dialogowym.

Sprawdzić, czy chromatogram zawiera piki, w tym piki samego peptydu CGGC. Krytycznym aspektem tej procedury jest zapewnienie, że anality z poprzedniego cyklu są całkowicie usuwane przed każdą analizą mieszaniny reakcyjnej. Minimalizacja zanieczyszczenia próbki przeniesionymi analitami jest zapewniona dzięki dokładnemu oczyszczeniu linii iniekcyjnej.

Umyć strzykawkę, zasysając 500 mikrolitrami buforu mrówczanu amonu, a następnie dozując bufor do zlewki. Następnie wybierz przycisk odpływu na MS i trzykrotnie przepłucz rurkę 500 mikrolitrami buforu mrówczanu amonu. Następnie umyć strzykawkę, odsysając 500 mikrolitrów metanolu i dozując do zlewki.

Przepłucz rurkę jednorazowo 500 mikrolitrami metanolu. Następnie wybierz przycisk detektora obciążenia na MS. Po dodaniu do strzykawki 500 mikrolitrów buforu mrówczanu amonu, umieścić strzykawkę w uchwycie strzykawki pompy MS. Podłącz rurki i zalej urządzenie.

Wybierz nazwę pliku dla uruchomienia bufora tak jak poprzednio, i uzyskaj 150 skanów przed kliknięciem przycisku zatrzymania uruchamiania. Otwórz moduł przeglądarki danych, aby sprawdzić, czy chromatogram jest pozbawiony pików z poprzedniego przebiegu rtęci do CGGC. Powtórzyć procedurę analizy dla pozostałych próbek CGGC.

Aby przygotować stosunek rtęci do 0,5 do 0,5 roztworu CEEC, umieść 255 mikrolitrów pięciomilimolowego buforu mrówczanu amonu o pH 7,5 w 1,5 mililitrowej probówce do mikrowirówki. Dodać 30 mikrolitrów 0,75 milimolowego roztworu chlorku rtęci do probówki. Po wirowaniu roztworu przez 10 sekund dodaj do probówki 15 mikrolitrów 0,75 milimolowego roztworu CEEC.

Wiruj roztwór przez kolejne 10 sekund. I odstawić roztwór na 10 minut przed wstrzyknięciem spektrometru masowego. Powtórzyć procedurę analizy, używając próbek CEEC i mieszanin reakcyjnych jonów rtęci i CEEC.

Pokazane jest reprezentatywne widmo masowe. Po 10 minutach widoczne są różne typy kompleksów peptydowych rtęci dla mieszaniny reakcyjnej od jednego do 0,5 rtęci do CGGC, wraz z pikiem peptydu 339,08 i dimerem peptydu 677,15. Jak zaobserwowano w poprzednim widmie, mieszanina reakcyjna jeden do jednego rtęci i CGGC zawiera kilka podobnych pików.

Na przykład szczyt 539.03 wskazuje na kompleks jeden do jednego rtęci i peptydu. Powiększony widok przedstawia charakterystyczny wzór izotopowy rtęci odpowiadający siedmiu głównym naturalnie występującym izotopom rtęci. Zaobserwowano również jeden do dwóch kompleksów rtęci do CGGC, jak wcześniej doniesiono dla tripeptydu dicysteinylu rtęci.

Kompleks ten występuje we wszystkich trzech mieszaninach reakcyjnych rtęci i CGGC. Został on łatwo przeanalizowany przez wyraźny wzór izotopowy rtęci z monoizotopowym pikiem na poziomie 877. Jeśli jednak rtęć jest w nadmiarze, jak w mieszaninie reakcyjnej rtęci do CGGC od jednego do 0,5, wykrywa się dodatkowe dwa do dwóch kompleksów rtęci do CGGC.

Ta sygnatura izotopowa rtęci odpowiada dwóm kompleksom rtęci obliczonym przy użyciu programu chemicznego. Teoretyczna protonowana masa monoizotopowa odpowiada wartości przeciążenia masy wynoszącej 1077, co jest dziewiątym pikiem w obserwowanej gromadzie izotopowej. Pokazano reprezentatywne widmo pokazujące różne kompleksy rtęci w Europie Środkowo-Wschodniej.

Interesujące są nakładające się piki związane z adduktami rtęci do CEEC w ładunku plus jeden, pokazujące pik monoizotopowy na poziomie 883. A w plus dwa ładunki, z obliczoną monoizotopową wartością piku 1765. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż dwie godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o odgazowaniu i dokładnym wypłukaniu linii, aby uniknąć przeniesienia analitów. Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego protonów, węgla-13 i rtęci-199 lub potencjometria, mogą być wykorzystane w celu dokładniejszego określenia kompleksów zawartości w fazie roztworu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie przeanalizować różne kompleksy rtęci i ich wyraźne wzorce rozkładu izotopów rtęci oraz formacje ładunku za pomocą spektrometrii mas orbitrap z jonizacją elektrorozpylającą, a także rozróżnić nakładające się piki za pomocą tandemowej analizy MS.

Nie zapominaj, że praca z roztworami rtęci może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej.