Name: Test behawioralny do mechanosensacji klonów opartych na MARCM u Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Poznaj test behawioralny do mechanosensacji z użyciem metody MARCM u Drosophila melanogaster. Technika ta pozwala identyfikować mutacje wpływające na mechanorecepcję, które w innym przypadku byłyby śmiertelne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować centrum akcji w Bloomington, Liqun Luo, Charlesowi Zukerowi oraz Lily i Yuh Nung Jan za hojne dzielenie się zasobami much, a także następującym za dofinansowanie: SOMAS-URM (dla JD i SW), Bachelor Ford Faculty Summer Fellowship (dla SW), BD Corporation Summer Research Fellowship (dla CL i DL), The Renee i Anthony M. Marlon, M.D. '63 Letnie stypendium badawcze (do DL)James C. '75 i Jane Colihan Letnie stypendium badawcze (TO) za pośrednictwem Alumni/Parent Summer Research Fund of the College of the Holy Cross i Stransky Foundation Summer Research Fellowship (do TO). Specjalne podziękowania dla Wydziału Biologii i Dziekanatu Kolegium Świętego Krzyża za wsparcie wszystkich prac w laboratorium.

1. Krzyżówki do generowania muchy MARCM
<ol>
	<li>Utrzymuj muchy na pożywce z melasy z mąki kukurydzianej (6,5 g/l agaru; 23,5 g/l drożdży; 60 g/l mąki kukurydzianej; 60 ml/l melasy; 4 ml/l mieszanki kwasów; 0,13% Tegosept) lub standardowej pożywce Drosophila w temperaturze 22 stopni Celsjusza w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność. 
	Uwaga: Niższa niż standardowa temperatura jest używana do utrzymania zapasów MARCM w dobrym stanie. Wydłuża to czas rozwoju między komórką jajową a osiągnięciem dorosłości do 14 dni.</li>
	<li>Należy użyć dziewiczych samic (w wieku około 1 - 8 dni) z materiału gotowego do MARCM, zawierającego niezbędne elementy genetyczne (GFP pod kontrolą sekwencji aktywującej (UAS-GFP), białko represorowe Gal80, czynnik transkrypcyjny Gal4, rekombinaza napędzana szokiem cieplnym i miejsce rekombinacji FRT). 
	Uwaga: Nasze gotowe zapasy MARCM zawierają następujące genotypy: elavGal4, UAS-CD8-GFP, hs-flipase; FRT40A, tubGal80/CyO; tubGal4/TM3Sb. 
	Uwaga: Konkretne miejsce FRT będzie zależało od lokalizacji mutacji w genomie. Na przykład FRT40A jest używany do testowania mutacji w lewym ramieniu chromosomu 2, takich jak NOMPC (więcej informacji na temat protokołów MARCM znajduje się wpunkcie 10).</li>
	<li>Krzyżuj dziewicze samice gotowe do MARCM z samcami, które zawierają mutację będącą przedmiotem zainteresowania i odpowiadające jej miejsce FRT (na przykład w-; NOMPC3, FRT40A/CyO; +/+). Aby kontrolować skuteczną indukcję MARCM, należy ustawić drugą krzyżówkę przy użyciu samców much zawierających to samo miejsce FRT, ale bez mutacji. Użyj przybliżonego stosunku 5 samic: 1 samiec w krzyżówkach.</li>
</ol>
2. Składanie jaj na czas
<ol>
	<li>Po umożliwieniu muchom łączenia się w pary przez co najmniej jedną noc, przenieś dorosłe osobniki do nowych fiolek ze świeżą pożywką. Pozwól muchom złożyć jaja w ciemnym otoczeniu przez około 4 godziny przed ponownym przeniesieniem krzyżówek do nowych fiolek. Zwróć uwagę na czas rozpoczęcia i zakończenia okresu składania jaj. 
	Uwaga: Krótsze odstępy czasu są dopuszczalne, gdy wydaje się, że na pożywce znajduje się duża liczba jaj przed końcem 4-godzinnego odstępu.
	<ol>
		<li>Przechowuj fiolki z wystarczającą liczbą jaj (w przybliżeniu większą niż 20) i przechowuj w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność w temperaturze 22 stopni Celsjusza, aby później doznać szoku cieplnego. 
		Uwaga: Jest mało prawdopodobne, aby fiolki z małą liczbą jaj na pożywce (mniej niż około 20) dostarczyły wystarczającą liczbę dorosłych much do testów behawioralnych i w interesie skuteczności zaleca się, aby nie zatrzymywano ich do dalszych testów. 
		Uwaga: Nasze muchy są wynoszone przy włączonych światłach od 8 rano do 20 wieczorem. Odkryliśmy, że wieczorne punkty czasowe prowadzą do większego zagęszczenia jaj, dlatego zwykle wykonują skrzyżowania czasowe między 16:00 a 20:00 do północy. Muchy składają jaja w RT w ciemnej szafce, a następnie są zwracane do inkubatora następnego dnia, aby nie zakłócać regularnego cyklu światła i ciemności w inkubatorze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wykonaj szok cieplny, aby wywołać rekombinację mitotyczną
<ol>
	<li>Około 85 - 100 godzin po złożeniu jaj umieść fiolki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 1 godzinę. Upewnij się, że poziom wody sięga powyżej wysokości pożywki w fiolkach, ale nie zanurza całkowicie fiolek, aby zapobiec utonięciu larw.</li>
	<li>Wyjąć fiolki z łaźni wodnej i odczekać 1 godzinę na rekonwalescencję w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieść fiolki z powrotem w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 1 godzinę.</li>
	<li>Wyjąć fiolki z łaźni wodnej i przechowywać w inkubatorze w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność w temperaturze 22 stopni Celsjusza aż do eclosion.</li>
</ol>
4. Przygotowanie do testów behawioralnych
<ol>
	<li>Po ekluzji znieczulenie muchy na lodzie. Wyselekcjonowane muchy o genotypach, które zawierają wszystkie elementy genetyczne MARCM i wskazują na klony oznaczone ekspresją GFP, będą prawdopodobnie obserwowane na podstawie obserwowalnych markerów fenotypowych stosowanych w stadach rodzicielskich. Ścinanie głów muchom nożyczkami do irydektomii. 
	Uwaga: Na przykład wybraliśmy muchy bez markerów genetycznych CyO (kręcone skrzydła) i Sb (szczecina ścierniska), aby zidentyfikować muchy, które zawierałyby wszystkie elementy genetyczne niezbędne do stworzenia obszarów mozaiki oznaczonych GFP. 
	Uwaga: Dekapitacja jest konieczna, aby zapobiec odlatywaniu dorosłych po stymulacji.</li>
	<li>Umieść muchy bezgłowe w zamkniętym, wilgotnym środowisku i pozwól na około 10-20 godzin rekonwalescencji. Używaj tylko much, które same się poprawiają, gdy są zaniepokojone do dalszych testów. Test leci w ciągu 30 godzin od dekapitacji.</li>
</ol>
5. Testy behawioralne
<ol>
	<li>Obserwując odcięte głowy muszki pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym, zidentyfikuj homozygotyczne klony oznaczone GFP na szczeciniastych zewnętrznych narządach zmysłów. Zapisz nazwę włosia i lewą lub prawą stronę. Aby wyeliminować wszelkie potencjalne odchylenia, członek laboratorium wykonujący stymulację szczeciny powinien być ślepy na genotyp szczeciny, typ dziki lub zmutowany.</li>
	<li>Wywołaj odruch pielęgnacyjny, odchylając włosie oznaczone GFP w kierunku ciała muchy za pomocą sztywnego włosia lub cienkich kleszczy i obserwuj reakcję nóg. Przyznaj wynik jeden muchom, które podnoszą nogę w odpowiedzi na stymulację szczeciny, a wynik zero muchom, które nie poruszają nogami. 
	Uwaga: Poprzednie badania6,7 charakteryzowały reakcję nóg, która jest wywoływana przez stymulację określonego włosia. Obejmuje to nogę, która reaguje na każde szczecinę i odsetek much, które reagują na stymulację tego konkretnego włosia. Punktowaliśmy tylko za ruchy nogi, które spodziewaliśmy się zareagować na podstawie klasyfikacjiVandervorsta 6.</li>
	<li>Przeprowadź pięć prób w odstępach 2 minut.</li>
</ol>

<ol><li>Grünert, U., Gnatzy, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K%2B+and+Ca%2B%2B+in+the+receptor+lymph+of+arthropod+cuticular+mechanoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">K+ and Ca++ in the receptor lymph of arthropod cuticular mechanoreceptors.</a> J Comp Physiol A. 161, 329-333 (1987).</li>
<li>Kernan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+auditory+transduction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and auditory transduction in Drosophila.</a> Pflugers Arch. 454, 703-720 (2007).</li>
<li>Gillespie, P. G., Walker, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+mechanosensory+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of mechanosensory transduction.</a> Nature. 413, 194-202 (2001).</li>
<li>Corfas, G., Dudai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+fatigue+of+a+mechanosensory+neuron+in+wild-type+Drosophila+and+in+memory+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adaptation and fatigue of a mechanosensory neuron in wild-type Drosophila and in memory mutants.</a> J Neurosci. 10, 491-499 (1990).</li>
<li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction%3A+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12, 1195-1206 (1994).</li>
<li>Vandervorst, P., Ghysen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+sensory+connections+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic control of sensory connections in Drosophila.</a> Nature. 286, 65-67 (1980).</li>
<li>Corfas, G., Dudai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habituation+and+dishabituation+of+a+cleaning+reflex+in+normal+and+mutant+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila.</a> J Neurosci. 9, 56-62 (1989).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery-based+science+education%3A+functional+genomic+dissection+in+Drosophila+by+undergraduate+researchers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers.</a> PLoS Biol. 3, e59(2005).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila.</a> Nature Protocols. 1, 2583-2589 (2006).</li>
<li>Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+similar+transduction+mechanisms+for+touch+and+hearing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila.</a> J Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).</li>
<li>Walker, R. G., Willingham, A. T., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+mechanosensory+transduction+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Drosophila mechanosensory transduction channel.</a> Science. 287, 2229-2234 (2000).</li>
<li>Yan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+NOMPC+is+a+mechanotransduction+channel+subunit+for+gentle-touch+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation.</a> Nature. 493, 221-225 (2013).</li>
<li>Arnadottir, J., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+Mechanosensitive+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic Mechanosensitive Channels.</a> Annual Review of Biophysics. 39, 111-137 (2010).</li>
<li>Christensen, A. P., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRP+channels+in+mechanosensation%3A+direct+or+indirect+activation%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">TRP channels in mechanosensation: direct or indirect activation?</a> Nature Reviews Neuroscience. 8, 510-521 (2007).</li>
<li>Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+TRP+Channel+NompC+in+Drosophila+Larval+and+Adult+Locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Role of the TRP Channel NompC in Drosophila Larval and Adult Locomotion.</a> Neuron. 67, 373-380 (2010).</li>
<li>Lee, J., Moon, S., Cha, Y., Chung, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+TRPN%28%3DNOMPC%29+channel+localizes+to+the+distal+end+of+mechanosensory+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Drosophila TRPN(=NOMPC) channel localizes to the distal end of mechanosensory cilia.</a> PLoS One. 5, e11012(2010).</li>
<li>Liang, X., Madrid, J., Saleh, H. S., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOMPC%2C+a+Member+of+the+TRP+Channel+Family%2C+Localizes+to+the+Tubular+Body+and+Distal+Cilium+of+Drosophila+Campaniform+and+Chordotonal+Receptor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">NOMPC, a Member of the TRP Channel Family, Localizes to the Tubular Body and Distal Cilium of Drosophila Campaniform and Chordotonal Receptor Cells.</a> Cytoskeleton. 68, 1-7 (2011).</li>
<li>de Vries, S. E., Clandinin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loom-sensitive+neurons+link+computation+to+action+in+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system.</a> Curr Biol. 22, 353-362 (2012).</li>
<li>Jarman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+mechanosensation+using+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Studies of mechanosensation using the fly.</a> Hum Mol Genet. 11, 1215-1218 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół ten wykorzystuje test behawioralny osoby dorosłej do badań przesiewowych pod kątem mutacji, które wpływają na mechanosensację u Drosophila. Ponieważ zbiór mutantów zawiera śmiertelne mutacje elementu p, które wykluczają badania przesiewowe u dorosłych, protokół ten wykorzystuje złożoną technikę genetyczną opisaną po raz pierwszy przez Lee i Luo (1999) i szczegółowo opisaną jako protokół przez Wu i Luo (2006) w celu obejścia śmiertelności dorosłych. MARCM indukuje rekombinację mitotyczną między chromosom...

Ludzie polegają na zdolności do przekształcania bodźców mechanicznych z otoczenia, takich jak dotyk, nacisk, wibracje czy fale dźwiękowe, w informacje sensoryczne, które mogą być przetwarzane przez układ nerwowy, w procesie zwanym mechanotransdukcją. Wiele ogólnych cech mechanistycznych mechanotransdukcji między ludźmi a bezkręgowcami jest takich samych1, co czyni Drosophila użytecznym modelem do badania molekularnych mechanizmów mechanotransdukcji. Drosophila melanogaster zawiera dwa zestawy wyspecjalizowanych narządów zmysłów (typ I i II), które są zdolne do przekształcania bodźców mechanicznych w potencjały czynnościowe. Mechanoreceptory typu I mają neuron z pojedynczym dendrytem lub wyrostkiem czuciowym, otoczony trzema komórkami podporowymi2. Mechanoreceptory typu I obejmują mechanoreceptory szczeciniaste, wrażliwe na słuch narządy strunowe (narząd Johnstona) i czuprynę dzwonkową, które przekazują informacje o uderzeniach skrzydeł3. Szczecinka pokrywająca grzbietową stronę muchy jest najliczniejsza i najłatwiej dostępna z narządów typu I. Podobnie jak środowisko zewnątrzkomórkowe komórek rzęsatych związanych ze słuchem i równowagą u kręgowców, komórki podporowe otaczające neurony mechanowrażliwe much wydzielają endolimfę o wysokiej zawartości potasu, która tworzy niezwykły gradient stężenia potasu1. Neurony mechanowrażliwe, zarówno ssaków, jak i much, wykorzystują ten wysoki poziom pozakomórkowego potasu do depolaryzacji komórki. W odpowiedzi na mechaniczną stymulację szczeciny makroszczetów w kierunku ściany ciała, neurony czuciowe reagują wybuchem potencjałów czynnościowych napędzanych przez tę depolaryzację potasu błony komórkowej4. Neurony czuciowe Drosophila, które unerwiają szczecinę, przypominają mechanowrażliwe komórki innych organizmów, w tym komórek rzęsatych kręgowców, zarówno pod względem struktury, jak i funkcji1,5. Dostępność zewnętrznych narządów zmysłów Drosophila do eksperymentalnych manipulacji oraz obfitość technik genetycznych dostępnych dla badaczy sprawiają, że Drosophila jest doskonałym systemem modelowym do badania molekularnych podstaw mechanosensacji. 
W locie, stymulacja pojedynczego neuronu czuciowego, który unerwia szczecinę, prowadzi do obserwowalnej reakcji behawioralnej. Stymulacja różnych szczecinek wywołuje określone, powtarzalne reakcje behawioralne, w zależności od stymulowanego włosia. Po stymulacji dotykowej, zdekapitowane muchy typu dzikiego wykazują złożony odruch pielęgnacyjny, w którym oczyszczają obszar w pobliżu stymulowanego włosia za pomocą wzorzystego zestawu ruchów nóg5-7. Gdy muchy są homozygotyczne pod względem znanych mutacji jednogenowych, które zakłócają uczenie się7 lub koordynację i aktywność lokomotoryczną5, reagują nieprawidłowo na stymulację mechaniczną. Ten odruch uwodzenia jest zatem użytecznym narzędziem do badania wpływu mutacji pojedynczych genów na określone, powtarzalne zachowanie.
Silna reakcja behawioralna na stymulację pojedynczego szczeciny makroszczetów może pomóc w identyfikacji nowych genów zaangażowanych w mechanotransdukcję. Protokół ten jest używany do testowania kolekcji zmutowanych much pod kątem braku reakcji behawioralnej, aby wskazać, że mutacja zakłóca mechanosensację. W kolekcji mutantów wybranych do badań przesiewowych mutacje powodują śmiertelność przed osiągnięciem dorosłości, a zatem niemożliwe byłoby przetestowanie ich przy użyciu tradycyjnych badań przesiewowych zachowań dorosłych. Pierwotnie, ten zbiór śmiercionośnych p-pierwiastków został połączony z miejscami rekombinacji FRT w celu zbadania defektów wzrostu komórek w klonach. Klony zostały stworzone specjalnie w oku, ponieważ dorosłe muchy mogą przetrwać w warunkach laboratoryjnych bez funkcjonalnegowidzenia. Jednak usunięcie całej mechanosensacji może spowodować, że dorośli będą poważnie nieskoordynowani lub umrą przed zaklozją5. Protokół ten wykorzystuje podejście mozaikowe, aby obejść śmiertelność mutacji i umożliwić testowanie w stadium dorosłym. Technika genetyczna zwana analizą mozaikową z represyjnym markerem komórkowym (MARCM)9 jest stosowana do generowania homozygotycznych zmutowanych komórek w ograniczonej liczbie narządów zmysłów dorosłych much, podczas gdy reszta organizmu pozostaje heterozygotyczna. Te muchy MARCM z łatwością przeżywają do dorosłości, ale szczecina jest homozygotyczne pod względem interesujących ich śmiertelnych genów.
MARCM pozwala na generowanie regionów homozygotycznych zmutowanych komórek i oznaczanie ich przez ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP), podczas gdy reszta organizmu pozostaje heterozygotyczna w tym konkretnym locus i nieoznaczona9. MARCM łączy poszczególne mutacje elementu p z pięcioma wspólnymi elementami genetycznymi: GFP pod kontrolą sekwencji aktywującej (UAS-GFP), białko represorowe Gal80 pod kontrolą ogólnego promotora (tub-Gal80), czynnik transkrypcyjny Gal4 pod kontrolą ogólnego promotora (tub-Gal4), enzym rekombinazy FRT wyrażany przez promotor kontrolowany szokiem cieplnym oraz miejsce rekombinacji FRT10. Kierując rekombinacją mitotyczną poprzez rekombinazę aktywowaną szokiem cieplnym, ograniczona liczba komórek staje się homozygotyczna pod względem mutacji i oznaczana GFP. Ekspresja GFP jest hamowana w komórkach heterozygotycznych przez obecność Gal80 na kopii chromosomu typu dzikiego. 
Protokół szoku cieplnego dla MARCM został zoptymalizowany pod kątem wywołania rekombinacji w zewnętrznych narządach zmysłów włosia muchy, podczas gdy większość organizmu pozostaje heterozygotyczna, a więc nieoznaczona GFP. Muchy mozaikowe wygenerowane za pomocą tego protokołu zawierały mutacje homozygotyczne najczęściej w szczecinkach śródzębnych po alarze lub grzbietowej na powierzchni notum. 
Przetestowaliśmy użyteczność tej kombinacji MARCM i ekranu zachowań uwodzicielskich ze znanym mechanowrażliwym mutantem, NOMPC. Kanał jonowy, brak potencjału mechanoreceptorowego C (NOMPC), jest istotnym składnikiem szlaku mechanotransdukcji u Drosophila5,11-13. NOMPC należy do nadrodziny przejściowego potencjału receptora (TRP) kanałów kationowych5 i spełnia wszystkie kryteria, aby zakwalifikować się jako kanał mechanowrażliwy u Drosophila14,15: 1) NOMPC ulega ekspresji w końcówkach rzęsek neuronów czuciowych typu 1 Drosophila 13,16-18, 2) Larwy zerowe NOMPC nie mają odpowiedzi elektrycznej na stymulację dotykową13, 3) Ektopowa ekspresja NOMPC w komórkach niewrażliwych na dotyk może indukować wrażliwość na stymulację mechaniczną13, 4) heterologiczna ekspresja NOMPC w komórkach Schneidera 2 daje mechanowrażliwy kanał13, oraz 5) dorosłe mutanty NOMPC wykazują defekty w odpowiedzi na stymulację mechaniczną5. Biorąc pod uwagę te dowody, przewidywaliśmy, że zmutowane klony NOMPC będą wykazywać zmienioną lub zahamowaną reakcję pielęgnacyjną w odpowiedzi na mechaniczną stymulację szczeciny.
A MARCM-stock zawierający mutację NOMPC został opracowany do użycia w eksperymencie potwierdzającym zasadność testu groomingowego. Muchy mozaikowe stymulowano na szczecinie makroszczetów zawierających homozygotyczne zmutowane komórki NOMPC. Spodziewaliśmy się zahamowania reakcji pielęgnacyjnej po stymulacji szczeciny makroszczetowej. Odkryliśmy, że tylko 2 z 14 badanych zmutowanych much szczeciniastych dały pojedynczą odpowiedź na powtarzającą się stymulację; Większość z nich nie reagowała na stymulację homozygotycznego zmutowanego włosia. Po potwierdzeniu, że ten test behawioralny oparty na MARCM wytwarza nieprawidłowy odruch uwodzenia u znanego mechanowrażliwego mutanta mozaiki, technika ta może być stosowana w badaniu przesiewowym dla dodatkowych mutacji mechanowrażliwych.

<table><tbody><tr><td>Drożdże piwne (25 funtów)</td><td>MP Biomedicals&nbsp;</td><td>ICN90331225&nbsp;</td><td>Jedzenie dla much</td></tr><tr><td>Kukurydza (25 funtów)</td><td>MP Biomedicals&nbsp;</td><td>ICN90141125&nbsp;</td><td>Jedzenie dla much</td></tr><tr><td>Agar (1 funt)</td><td>MoorAgar Inc.</td><td>41004</td><td>Pokarm na muchy</td></tr><tr><td>Tegosept (5 kg)</td><td>Genesee</td><td>20-259</td><td></td></tr><tr><td>Melasa na muchy (1 galon)</td><td>Marka młyna do cukru - Thomsen Food Service</td><td>0 2625</td><td>Pokarm na muchy</td></tr><tr><td>Kwas propionowy</td><td>Fisher</td><td>A258-500</td><td>Pokarm na muchy</td></tr><tr><td>Kwas fosforowy</td><td>Fisher</td><td>A260-500</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki na muchy Drosophila, wąskie (PS)</td><td>Genesee</td><td>32-109</td><td>Kultury much</td></tr><tr><td>Butelka z kwadratowym dnem 6 uncji (PP)</td><td>Genesee</td><td>32-130</td><td>Kultury much</td></tr><tr><td>Flugs - Plastikowe butelki na muchy</td><td>Genesee</td><td>49-100</td><td>Kulki</td></tr> ze <tr><td>sztucznego jedwabiu</td> do kultur much, duże <td>Genesee</td><td>51-100</td><td>Kultury much</td></tr><tr><td>Droso-Filler, wąskie</td><td>Genesee</td><td>59-168</td><td>Wypełniacz do przygotowywania pokarmu dla much</td></tr><tr><td>Droso, butelki</td><td>Genesee</td><td>59-170</td><td>Pokarm dla much Przygotowanie</td></tr><tr><td>Mieszadło laboratoryjne 8A-C / z napędem zębatym z mocowaniem c-clamp &nbsp; 1/15 KM, zmienna prędkość 700 obr./min, 115 V, 50/60 Hz</td><td>Cleveland Mixer</td><td>8A-C</td><td>Fly Przygotowanie żywności</td></tr><tr><td>Czajnik z płaszczem wodnym Fly</td><td></td><td></td><td>Przygotowanie żywności</td></tr><tr><td>Dobowa komora wzrostu</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td>Kontrolowana temperaturą i cyklem światła/ciemności</td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>VWR</td><td></td><td>Do ciepła </td></tr><tr><td>szok MicroScissors&nbsp;</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>&nbsp; 15000-08</td><td>Do zdejmowania głów</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny Fluroscence</td><td>Zeiss</td><td>SteREO Discovery V8&nbsp;</td><td>Z kostką GFP (KSC295-814D) filtrem pasmowo-przepustowym</td></tr><tr><td>Źródło światła Fluroscence</td><td>Światłowód światłowodowy Zeiss</td><td>X-Cite 120</td><td>sprawia, że jest to łatwe w konfiguracji&nbsp;</td></tr><tr><td>Kamera do lunety</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam ICc1</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do pozyskiwania obrazu</td><td>Zeiss Wiadro</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>na lód</td><td>na zimną anthesję</td></tr><tr><td>Domowa zimna taca</td><td></td><td></td> anthesia <td>do dekapitacji zimnej anthesii</td></tr><tr><td>Plastikowe pudełka</td><td></td><td></td><td>do odzyskiwania zdeptutowanych much w wilgotnym środowisku</td></tr></tbody></table>

test behawioralny do mechanosensacji klonów opartych na marcm u drosophila melanogaster

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Ze względu na strukturalną i funkcjonalną homologię komórek rzęsatych ucha wewnętrznego ssaków, neurony unerwiające zewnętrzne organy zmysłowe Drosophila stanowią doskonały system modelowy do badania mechanosensacji. Protokół ten opisuje proste zachowanie dotykowe u muszek owocowych, które można wykorzystać do identyfikacji mutacji zakłócających mechanosensację. Stymulacja dotykowa szczecina makroszczeta na klatce piersiowej much wywołuje odruch pielęgnacyjny od pierwszej lub trzeciej nogi. Mutacje, które zakłócają mechanotransdukcję (takie jak NOMPC) lub inne aspekty łuku odruchowego, mogą hamować reakcję uwodzenia. Tradycyjne badanie zachowań dorosłych pominęłoby mutanty, które odgrywają istotną rolę podczas rozwoju. Zamiast tego protokół ten łączy ekran dotykowy z analizą mozaiki z represyjnym markerem komórkowym (MARCM), aby umożliwić generowanie tylko ograniczonych regionów homozygotycznych zmutowanych komórek i oznaczanie ich przez ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP). Testując klony MARCM pod kątem nieprawidłowych reakcji behawioralnych, możliwe jest badanie przesiewowe zbioru śmiertelnych mutacji elementu p w poszukiwaniu nowych genów zaangażowanych w mechanosensację, które zostałyby pominięte przez bardziej tradycyjne metody.

Powodzenie niniejszego protokołu zależy w dużej mierze od całkowitej liczby uzyskanego potomstwa muszek nadającego się do badań, skuteczności szoku termicznego w celu indukcji rekombinacji mitotycznej oraz możliwości uzyskania wyraźnej odpowiedzi behawioralnej u muszek stymulowanych w odstępach 2 min. Biorąc pod uwagę, że szacunkowo 12,5% embrionów zawiera niezbędne elementy MARCM, a około 16,67% osobników dorosłych po wykluciu ma potencjał do ekspresji GFP, kluczowe jest uzyskanie dużej ...

Aby zidentyfikować nowe mutacje wpływające na mechanosensację, zaprojektowaliśmy test, który mierzy reakcję behawioralną na stymulację dotykową szczeciny muchy u zmutowanych klonów generowanych metodą MARCM. Połączenie technik pozwala na identyfikację mutacji mechanowrażliwych, które w przeciwnym razie byłyby śmiertelne.

Test behawioralny do mechanosensacji klonów opartych na MARCM u Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Ogólnym celem tej procedury jest testowanie mutacji wpływających na odczuwanie Meno u dorosłych much. Metoda ta może pomóc w zidentyfikowaniu kluczowych pytań w dziedzinie odczuwania Meno, takich jak identyfikacja kanału wrażliwego na Meno. Główną zaletą tej techniki jest to, że dzięki zastosowaniu zwierząt mozaikowych jesteśmy w stanie przesiewać mutacje, które w przeciwnym razie byłyby letalne dla organizmu.Dzięki zastosowaniu przesiewu mozaikowego jesteśmy w stanie zidentyfikować mutacje, które mogły zostać pominięte w ramach bardziej tradycyjnych testów behawioralnych. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa. Kroki testów behawioralnych są trudne do opanowania.Identyfikacja odpowiednich szczecinek wymaga pewnej ręki i praktyki. Aby rozpocząć eksperyment, należy utrzymywać muchy na pożywce kukurydziano-melasowej i przechowywać je w inkubatorze. Należy pozyskać dziewicze samice z gotowego stada Markum zawierającego niezbędne elementy genetyczne.Skrzyżuj gotowe dziewice oznaczone markum z samcami posiadającymi badaną mutację oraz odpowiadające jej miejsce FRT. Następnie przygotuj drugie skrzyżowanie kontrolne, wykorzystując samce zawierające to samo miejsce FRT, ale bez mutacji. W stosunku pięciu samic na jednego samca, po pozostawieniu much do kopulacji przez co najmniej jedną noc, przenieś osobniki dorosłe do nowych fiolek ze świeżą pożywką.Pozostaw muchy w ciemnej szafce w temperaturze pokojowej, aby mogły złożyć jaja. Po złożeniu jaj przenieś krzyżówki do nowych probówek. Odnotuj czas rozpoczęcia i zakończenia okresu składania jaj.Zachowaj fiolki, w których znajduje się więcej niż 20 jaj, do przeprowadzenia szoku termicznego i umieść je z powrotem w inkubatorze. Od 85 do 100 godzin po złożeniu jaj umieść fiolki w łaźni wodnej, upewniając się, że poziom wody znajduje się powyżej wysokości podłoża, ale nie zalewa całkowicie fiolki. Po jednej godzinie wyjmij fiolki z łaźni wodnej i zapewnij muchom okres regeneracji.Po regeneracji umieść probówki z powrotem w kąpieli wodnej na jedną godzinę. Wyjmij probówki z kąpieli wodnej i przenieś je z powrotem do inkubatora po znieczuleniu much na lodzie.Gdy muchy staną się nieruchome, należy wybrać osobniki posiadające wszystkie pożądane cechy. Następnie należy ostrożnie odciąć głowy wybranych much za pomocą nożyczek do irydektomii, uważając, aby umieścić nożyczki między głową a tułowiem. Należy przeciąć połączenie, nie uszkadzając tułowia.Umieść muchy bez głów w zamkniętym, wilgotnym środowisku i pozwól im na regenerację przez 10 do 20 godzin. Odzyskaj muchy w celu przeprowadzenia badania. Wykorzystaj tylko te muchy, które wykażą aktywność.Po pobudzeniu obserwuj zdekapitowane muchy pod fluorescencyjnym mikroskopem dissectingowym, aby zidentyfikować homozygotyczne klony znakowane GFP. W obrębie szczeczkowych zewnętrznych narządów zmysłowych zapisz nazwę szczeczki oraz informację, czy znajduje się ona po lewej, czy po prawej stronie muchy; wywołaj odruch pielęgnacyjny, odchylając znakowaną GFP szczeczkę w stronę ciała muchy za pomocą sztywnego włosa lub precyzyjnej pęsety, a następnie zaobserwuj reakcję odnóży.Muchom, które unoszą odnóże w odpowiedzi na stymulację szczecinek, przypisywano wynik sinus wynoszący jeden, natomiast muchom, które nie poruszały odnóżami, wynik zero. W miarę możliwości badano muchy z tkanką mozaikową na szczecinkach post AOR, które dobrze reagują na stymulację podczas testu behawioralnego szczecinek post AOR, podczas gdy muchy typu dzikiego porównywano z znanym mutantem mechanoreceptorowym o zaburzonym potencjale mechanoreceptora (NMSI), u którego odpowiedź pielęgnacyjna była zniesiona; muchy kontrolne reagowały na 34% stymulacji szczecinek.W przeciwieństwie do nich, zwierzęta z szczecinkami homozygotycznymi pod kątem NMSI wykazały 2% reakcji. Po przeprowadzeniu tej procedury i zidentyfikowaniu nowego genu odpowiedzi behawioralnej można zastosować dodatkowe eksperymenty, takie jak elektrofizjologia i lokalizacja białek. Aby dalej scharakteryzować rolę tego genu, możemy na przykład odpowiedzieć na pytanie, czy gen ten bierze udział w transdukcji czucia meno, czy w rozwoju neuronów sensorycznych meno.

a-behavioral-assay-for-mechanosensation-marcm-based-clones-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Drosophila melanogaster to genetycznie i behawioralnie podatny system modelowy, który od ponad wieku jest wykorzystywany do zrozumienia molekularnych i komórkowych podstaw wielu ważnych procesów biologicznych 1. Drosophila została szeroko wykorzystana w celu uzyskania wglądu w genetyczne podstawy zachowania much.

Metody oceny zachowania Drosophila

Ten film opisuje prostą metodę ilościowego oznaczania lokomocji muchy i pokazuje przeprowadzony test wspinaczki. Test wspinaczki muchowej jest ogólnym testem funkcji motorycznych, który opiera się na negatywnej odpowiedzi geotaksji.

Test wspinaczki muchowej: metoda testowania ogólnej lokomocji u Drosophila melanogaster

W tym artykule wideo opisujemy zautomatyzowany test do pomiaru wpływu głodu lub sytości na zależne od węchu zachowanie związane z poszukiwaniem pokarmu u dorosłej muszki owocowej Drosophila melanogaster.

Test pojedynczej muchy na zachowania żerowe u Drosophila

Przedstawiamy test wyboru, który ma na celu ujawnienie wpływu odorantów na zachowanie Drosophila za pomocą testu Y-labirynt.

Testowanie węchu Drosophila za pomocą testu Y-maze

Opisujemy tutaj konfigurację behawioralną i metodę analizy danych do oceny reakcji węchowych do 100 muszek octowych (Drosophila melanogaster). System ten może być stosowany z pojedynczymi lub wieloma bodźcami węchowymi i może być przystosowany do optogenetycznej aktywacji lub wyciszania podzbiorów neuronów.

Zachowania węchowe oceniane za pomocą komputerowego śledzenia Drosophila w czterokwadrantowym olfaktometrze

Tutaj demonstrujemy nowatorski test do badania zimnej nocycepcji u larw Drosophila. Test ten wykorzystuje specjalnie skonstruowaną sondę Peltiera, zdolną do zastosowania ogniskowego szkodliwego bodźca zimna i skutkuje wymiernymi zachowaniami specyficznymi dla zimna. Technika ta pozwoli na dalszą komórkową i molekularną sekcję zimnej nocycepcji.

Nowy test na zimną nocycepcję u larw Drosophila

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak przeprowadzić ulepszony test mechanicznej nocycepcji u larw Drosophila. Używamy tutaj testu, aby wykazać, że nadwrażliwość mechaniczna (allodynia i hiperalgezja) występuje u larw Drosophila.

Ulepszony test i narzędzia do pomiaru mechanicznej nocycepcji u larw Drosophila

Obecny protokół ocenia aktywność lokomotoryczną Drosophila poprzez śledzenie i analizowanie ruchu much na ręcznie wykonanej arenie za pomocą oprogramowania typu open source Fiji, kompatybilnego z wtyczkami do segmentacji pikseli każdej klatki na podstawie nagrania wideo w wysokiej rozdzielczości w celu obliczenia parametrów prędkości, odległości itp.

Prosta technika oznaczania aktywności lokomotorycznej u Drosophila

Ten artykuł przedstawia metody manipulacji optogenetycznej u Drosophila melanogaster, wykorzystując CsChrimson i GtACR2 do aktywacji i wyciszania określonych neuronów. Opisano cztery eksperymenty wykorzystujące optogenetykę do badania zachowań termotaktycznych i smakowych, dostarczając wglądu w podstawowe mechanizmy neuronalne rządzące tymi procesami.

Testy behawioralne do optogenetycznej manipulacji obwodami neuronalnymi u Drosophila melanogaster

Protokół przedstawia wysokoprzepustową, opłacalną metodę oceny neurotoksyczności u muszki owocowej poprzez kwantyfikację dysfunkcji lokomotorycznej jako alternatywę dla tradycyjnych modeli ssaków. Ma na celu ocenę neurotoksycznego wpływu związków farmaceutycznych, czynników środowiskowych lub modyfikacji genetycznych przy użyciu czułego, powtarzalnego i etycznie korzystnego modelu.

Analiza behawioralna dysfunkcji narządu ruchu u Drosophila melanogaster jako odczyt neurotoksyczności

Ten protokół zapewnia ramy do oceny zmian zachowania wywołanych stresem u Drosophila melanogaster. Łączenie uzupełniających się testów umożliwia ilościową ocenę aktywności, eksploracji i podejmowania decyzji dla poszczególnych much. Podejście to jest elastyczne i może być dostosowane do szerokiej gamy badań dotyczących biologii stresu, metabolizmu i funkcji neurobehawioralnych.

Multimodalowe fenotypowanie behawioralne stanów przypominających depresję indukowanych stresem u Drosophila melanogaster

Poznaj test behawioralny do mechanosensacji z użyciem metody MARCM u Drosophila melanogaster. Technika ta pozwala identyfikować mutacje wpływające na mechanorecepcję, które w innym przypadku byłyby śmiertelne.

Test behawioralny do mechanosensacji klonów opartych na MARCM u Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów