Test behawioralny do mechanosensacji klonów opartych na MARCM u Drosophila melanogaster

Ogólnym celem tej procedury jest przetestowanie mutacji, które wpływają na czucie Meno u dorosłych muszek. Metoda ta może pomóc w zidentyfikowaniu kluczowych pytań w dziedzinie czucia Meno, takich jak identyfikacja wrażliwego kanału Meno. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystując zwierzęta mozaikowe, jesteśmy w stanie przesiać mutacje, które w przeciwnym razie byłyby śmiertelne dla organizmu.

Korzystając z mozaiki przesiewowej, jesteśmy w stanie zidentyfikować mutacje, które mogły zostać pominięte przez bardziej tradycyjne badania behawioralne. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie. Etapy testowania behawioralnego są trudne do nauczenia.

Potrzeba pewnej ręki i praktyki, aby zidentyfikować odpowiednie włosie. Aby rozpocząć eksperyment, trzymaj muchy na pożywce z melasy z mąki kukurydzianej i przechowuj je w inkubatorze. Pozyskać dziewicze samice z gotowego stada markum zawierającego niezbędne elementy genetyczne.

Skrzyżuj gotowe dziewicze samice markum z samcami, które zawierają mutację będącą przedmiotem zainteresowania i odpowiadające jej miejsce FRT. Następnie należy skonfigurować drugą krzyżówkę kontrolną przy użyciu samców much zawierających to samo miejsce FRT, ale bez mutacji. W stosunku pięć samic do jednego samca, po umożliwieniu muszkom łączenia się w pary przez co najmniej jedną noc, przenieś dorosłe osobniki do nowych fiolek ze świeżą pożywką.

Pozwól muchom złożyć jaja w temperaturze pokojowej w ciemnej szafce. Gdy muchy złożą jaja, przenieś krzyżówki do nowych fiolek. Udokumentuj czas rozpoczęcia i zakończenia okresu składania jaj.

Zachowaj fiolki, które dają więcej niż 20 jaj na wypadek szoku cieplnego i zwróć je do inkubatora. 85 do 100 godzin po złożeniu jaj umieść fiolki w łaźni wodnej, upewnij się, że poziom wody jest powyżej wysokości pożywki, ale nie zanurza całkowicie fiolek. Po godzinie wyjmij fiolki z łaźni wodnej i zapewnij muszkom okres rekonwalescencji.

Po wyzdrowieniu należy umieścić fiolki z powrotem w łaźni wodnej na jedną godzinę. Wyjąć fiolki z łaźni wodnej i przechowywać je z powrotem w inkubatorze po podaniu znieczulenia. Muchy na lodzie.

Gdy muchy są unieruchomione, wybierz osobniki, które zawierają wszystkie pożądane cechy. Następnie ostrożnie odetnij głowy wybranym muchom nożyczkami do irydektomii, uważając, aby umieścić nożyczki między głową a klatką piersiową. Przetnij połączenie bez nacinania klatki piersiowej.

Umieść muchy bezgłowe w zamkniętym, wilgotnym środowisku i pozwól im dojść do siebie przez 10 do 20 godzin po wyzdrowieniu. Odzyskaj muchy do zbadania. Używaj tylko much, które piszą się same.

W przypadku zaniepokojenia obserwuj zdekapitacowane muchy pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym, aby zidentyfikować homozygotyczne klony oznaczone GFP. Na szczecinie znajdują się zewnętrzne narządy zmysłów. Zapisz nazwę włosia i to, czy znajduje się po lewej, czy po prawej stronie muchy, wywołaj odruch pielęgnacyjny, odchylając włosie oznaczone GFP w kierunku ciała muchy za pomocą sztywnego włosia lub cienkich kleszczy i obserwuj reakcję nóg

Wynik zatokowy równy jeden dla much, które podnoszą nogę w odpowiedzi na stymulację szczeciny, a wynik zatokowy równy zero dla much, które nie poruszają nogami. Jeśli to możliwe. Testujemy muchy, które mają tkankę mozaikową na włosiu po AOR, które dobrze reagują na stymulację za pomocą testu behawioralnego w włosiu po AOR, podczas gdy muchy typu porównano ze znanym mutantem wrażliwym na mechano, który nie ma potencjału receptora mechanicznego C lub NMSI zakłócił reakcję kontrolną na pielęgnację, muchy kontrolne zareagowały na 34% ich stymulacji szczeciny.

Natomiast zwierzęta z włosiem, które było homozygotyczne pod względem NMSI, wykazywały 2% odpowiedź. Po tej procedurze i identyfikacji nowego genu odpowiedzi behawioralnej można zastosować dodatkowe eksperymenty, takie jak elektrofizjologia i lokalizacja białek. Aby dokładniej scharakteryzować rolę tego genu, możemy na przykład odpowiedzieć na pytanie, czy gen jest zaangażowany w transdukcję czucia meno, czy w rozwój neuronów czuciowych menosa.